JP2014508159A - インヒビターを保有するまたは保有しない血友病ａまたはｂを治療するためのｇｌａドメイン欠失因子ｘａ - Google Patents

Abstract

本発明は、インヒビターを保有するまたは保有しない血友病ＡまたはＢの患者における出血性アクシデントを予防または治療するための、改変第Ｘａ因子（ＧＤＸａ）を含む医薬組成物であって、前記改変ＧＤＸａが非血栓形成性であり、ＴＦＰＩに結合することはできるがリン脂質に結合することはできない医薬組成物に関する。
【選択図】図５

Description

本発明は、改変第Ｘ因子によって血友病ＡまたはＢの患者における出血性アクシデントを予防または治療するための医薬組成物に関する。

血友病Ａには、血友病Ｂと同様、２種類の血友病、体質性血友病および後天性血友病が含まれる。

Ａ型の体質性血友病は、ＦＶＩＩＩ遺伝子の異常によって生じるＦＶＩＩＩの量的または質的不全を特徴とする出血性疾患である。Ｂ型の体質性血友病も出血性疾患であるが、ＦＩＸ遺伝子の異常によって生じるＦＩＸの量的または質的不全を特徴とする。

ＡまたはＢ型の後天性血友病は、前記ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに特異的な自己抗体の出現によって定義される。

血友病は、出血に対する応答における血液凝固不全にあらわれる。未治療のＡまたはＢ型血友病は、症状、例えば、傷害時の過剰な出血、時には突発性出血も有する。

第ＶＩＩＩまたは第ＩＸ因子の生物学的活性は、正常レベルのパーセントとして評価する。正常な個体は、１００％活性を有すると見なされる。活性が検出できない場合（１％未満）は重症の血友病であり、活性が１〜５％の場合、この血友病は中等症と言われ、５％を上回り３０％までは軽症の血友病である。

血友病ＡおよびＢの患者は、それぞれＦＶＩＩＩまたはＦＩＸを含む濃縮物で治療することができ、それらは血漿派生物または遺伝子操作によって生じた生成物であることができる。これらの濃縮物は、各出血時に投与することができ、この場合、最初の徴候があらわれたら、可能な限り迅速に治療を開始することが望ましい。この治療はまた予防的に、出血を予防するために定期的に週２〜３回投与することができる。しかし、この治療は、インヒビターと呼ばれるＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに特異的な抗体の出現を引き起こすことがある。前記抗体の存在は、その後、第ＶＩＩＩまたはＩＸ因子の投与を無効にする。これらの抗体は、Ｇ型イムノグロブリン、主にＩｇＧ４である。抗体は最初の投与の後まもなくして、多くの場合１０日経つ前に出現する。患者の中には、弱レスポンダー（抗体力価＜１０ＢＵ）を維持する人もいるが、強レスポンダーと呼ばれるその他の人たちは、対応する凝固因子ではもはや治療することができないことを意味する力価に達している。

本発明の時点では、インヒビターを保有する血友病ＡまたはＢの患者における出血の危険性の存在を十分に予防および／または治療することができる治療法は存在しない。実際に、利用可能な生成物は、無効であることがあるか（ＦＳＧについて、Ａｓｔｅｒｍａｒｋ Ｊ、Ｄｏｎｆｉｅｌｄ ＳＭ、ＤｉＭｉｃｈｅｌｅ ＤＭ、Ｇｒｉｎｇｅｒｉ Ａ、Ｇｉｌｂｅｒｔ ＳＡ、Ｗａｔｅｒｓ Ｊ、Ｂｅｒｎｔｏｒｐ Ｅ「インヒビターを併発した血友病におけるバイパス剤の無作為の比較（A randomized comparison of bypassing agents in hemophilia complicated by an inhibitor）」：ｔｈｅ ＦＥＩＢＡ ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ（ＦＥＮＯＣ）Ｓｔｕｄｙ．Ｂｌｏｏｄ．２００７；１０９：５４６〜５１）、またはそれらの生成物の投与は、血栓形成事象によって複雑化することがある（Ａｌｅｄｏｒｔ ＬＭ．「組換え第ＶＩＩａ因子対第ＶＩＩＩ因子インヒビターバイパス活性物質の注入後の血栓形成事象発生率の比較（Comparative thrombotic event incidence after infusion of recombinant factor VIIa versus factor VIII inhibitor bypass activity.）」Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００４；２：１７０９）。

したがって、既存の治療法の代替となる治療法が必要であることが知られている。しかし、このような治療の開発は非常に困難であることがわかっており、なぜならば、
出血を止めることができ、
血栓症を引き起こさず、
抗ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ抗体の存在下でも、出血性アクシデントの治療または予防を可能にしなければならないからである。

本発明はこの必要性に応える。本発明は、血友病ＡまたはＢの患者における出血性アクシデントを予防または治療するための改変活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）を含む医薬組成物に関しており、前記改変ＦＸａ（ＧＤＸａ）は血栓形成性を有さず、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に結合することはできるが、リン脂質結合部位を有さない。

本発明による組成物はまた、抗第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）または第ＩＸ因子（ＦＩＸ）抗体を示す血友病における出血性アクシデントを予防または治療するために使用することができる。抗体は、第ＦＶＩＩＩもしくはＦＩＸ因子による治療後または自然発生的に、例えば後天性血友病において出現した。

本発明はまた、血友病ＡまたはＢの患者における出血性アクシデントを予防または治療するために企図された医薬品生成物を調製するための改変第Ｘａ因子（ＧＤＸａ）を含む医薬組成物の使用に関し、前記患者は抗ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ抗体を保有するかまたは保有しない。

本発明はまた、改変第Ｘａ因子（ＧＤＸａ）の投与によって血友病ＡまたはＢの患者における出血性症候群を予防的に治療する方法に関する。

本発明はまた、改変第Ｘａ因子（ＧＤＸａ）の投与によって血友病ＡまたはＢの患者における出血性アクシデントを治療する方法に関する。

本発明の文脈において、第ＦＸａ因子という場合、血漿中において天然に存在する、または元の無修飾の形態で単離された状態の、天然の第Ｘ因子の活性化によって得られた活性化第Ｘ因子を意味する。この用語には、血漿から単離されたＦＸが含まれるが、組換えによって生成された、または化学合成法によって得られた活性化されたＦＸも含まれる。第Ｘａ因子または天然の第Ｘａ因子（ＦＸａ）とは、本発明の文脈では、血液凝固に関与したセリンプロテアーゼ型のタンパク質のことで、不活性化形態、第Ｘ因子（ＦＸ）で生成される。

凝血第Ｘ因子の活性化は、血液凝固および出血の阻止において重要なステップである。その活性化は、血液凝固の伝播および増幅のステップに必要である。その活性化はまた、ＴＦＰＩとの相互作用によって、血液凝固の活性化を阻止するのに必要である。

ＦＸは、活性化した第ＩＸ因子およびその補因子、活性化した第ＶＩＩＩ因子または活性化した第ＶＩＩ因子およびその補因子、組織因子（ＴＦ）の何れかによって活性化される。ＦＸａはプロトロンビナーゼ複合体を形成し、これが活性化した第Ｖ因子を有する膜に結合し、プロトロンビナーゼ複合体中の活性成分となり、それがプロトロンビンからトロンビンへの変換を触媒する。次に、トロンビンがフィブリノーゲンからフィブリンへの変換を触媒し、これが血液中の凝血の形成および出血の阻止を導く。ＦＸａの活性は、「血液凝固促進活性」と呼ぶことができる。

Ｌｅｙｔｕｓら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８６、２５：５０９８〜５１０２）およびＶｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕら（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００２、８２：１１９０〜１２０６）は、第Ｘ因子およびこのポリペプチド中に存在する様々なドメインについて記載している。重鎖の触媒的切断は、ＦＸからＦＸａへの活性化を可能にする。ＦＸａは軽鎖（その１例は配列識別子配列番号１によって表される）および重鎖（その１例は配列識別子配列番号２によって表される）を含む。

本発明の文脈では、改変ＦＸａという用語は、もはやリン脂質に結合できないか、もはや血液凝固促進活性を有さないか、または血液凝固促進活性が低下したＦＸａを表す。本発明の文脈では、このような因子をＧＤＸａと呼ぶ。「血液凝固促進活性」は、血液凝固または凝血の形成を引き起こす因子の能力と定義される。低下した血液凝固促進活性とは、活性が、天然のＦＸａの活性と比較して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは９５％より多く低下していることを示す。

本発明による改変第Ｘａ因子、ＧＤＸａは、リン脂質に結合するためのγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインが欠如している。軽鎖の最初の４３個のアミノ酸（配列番号１の残基１〜４３）は、１１個の翻訳後修飾残基（γ−カルボキシグルタミン酸）を含有しているので、Ｇｌａドメインを表している。キモトリプシンで消化すると、残基１〜４３の抑制が可能で、リン脂質に結合するドメインが欠如したＦＸａまたはＧＤＸａ（ＧｌａドメインのないＦＸａ）を生成することが可能になる。前記ＧＤＸａはまた、Ｇｌａドメインが存在しないことに加えて、その他の改変を含むことができる。前記改変ＦＸａは、第Ｖａ因子に対する結合特性を保存しているが、血液凝固促進活性は有さない。ＧＤＸａの１例は、軽鎖については配列識別子配列番号７または配列番号３によって重鎖については配列番号２によって表される。この血液凝固促進活性を有さないことは、組織因子が存在しない血漿に添加したとき、血液凝固を活性化することができないことによって確認することができ、これによって天然の第Ｘａ因子と区別される。

ＧＤＸａは、キモトリプシンによって制御されたタンパク質分解および通常の方法の１つ、例えば、Ｓｋｏｇｅｎら（１９８４）によって記載された方法による特異的プロテアーゼによる活性化によって、第Ｘ因子の切断によって得ることができる。活性化前のＧＤＸの１例は、核酸配列については配列識別子配列番号２０によって、アミノ酸配列については配列番号２８によって表すことができる。

ＧＤＸａは、化学合成によって、１本の配列の形態、または後で一緒に結合するいくつかの配列の形態の何れかで生成することができる。この合成は、固相または溶液中で実施することができる。これらの技術は、ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐａｒｄによって「固相ペプチド合成（Solid phase peptide synthesis）」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ、１９８９）およびＨｏｕｂｅｎｗｅｙｌ（Ｅ．Ｗｕｎｓｃｈによって刊行された「有機化学における方法（Methoden der organischen Chemie）［Methods in Organic Chemistry］」Ｖｏｌ．１５−１および１１、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、１９７４）ならびに以下の論文：Ｐ．Ｅ．Ｄａｗｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４；２６６（５１８６）、ｐｐ７７６〜７７９）；Ｇ Ｇ Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒら（１９９９；３（６）、ｐｐ６６５〜６７１）；Ｐ Ｅ Ｄａｗｓｏｎら（２０００、６９、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ｐｐ９２３〜９６０）によってより詳細に記載されている。

ＧＤＸａは血栓形成性を有さず、血液凝固促進活性を有さないことは、トロンビン生成を測定するアッセイによって確認することができる（Ｈｅｍｋｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ．１９９３；７０：６１７〜６２４、例４参照）。

ＧＤＸａがＴＦＰＩに結合する能力は、当業者に周知の任意のアッセイを使用して確認する。このようなアッセイは例１に記載されており、ＴＦＰＩによるＦＸａおよびＧＤＸａのパーセント阻害の測定を可能にする発色基質を使用する。

本発明の別の側面では、ＧＤＸａはＧｌａドメインを欠如しているが、ドメインＥＧＦ１（上皮増殖因子１）も欠如している。本発明のこのような適用は、軽鎖については配列番号４によって、重鎖については配列番号２によって表されるＧＤＸａを含む組成物によって表すことができる。

本発明の別の側面では、ＧＤＸａはＧｌａドメインを欠如しているが、ドメインＥＧＦ２（上皮増殖因子２）も欠如している。このようなＧＤＸａの１例は、軽鎖については配列識別子配列番号５、重鎖については配列番号２によって表される。

本発明の別の側面では、ＧＤＸａはドメインＧｌａを欠如しているが、ドメインＥＧＦ１およびＥＧＦ２も欠如している。このようなＧＤＸａの１例は、軽鎖については配列識別子配列番号６、重鎖については配列番号２によって表される。

本発明の別の側面によれば、ＧＤＸａは、ＦＸａの重鎖のみから構成される。本発明の特定の態様によれば、このようなＦＸａは配列識別子配列番号２によって表される。

さらに別の異なる側面では、ＧＤＸａは変異を有する分子変種から構成される。したがって、トロンビン生成活性を維持し、変異体の小ペプチド基質に対する酵素活性を減少させることができる様々な変異を、ＧＤＸａをコードする遺伝子に導入した。これらの変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、製造元の推奨に従い、刊行物ＷａｎｇおよびＭａｌｃｏｌｍ（１９９９）−ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２６：６８０〜６８２に準じて導入することができる。これらの変異は、ＧＤＸａの重鎖のアルギニン１４２（配列番号２に従って番号付けしている）に関することができ、このアルギニンは任意のその他のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニン（例えば、配列番号１０）、グリシン（例えば、配列番号１１）、イソロイシン（例えば、配列番号１２）またはチロシン（例えば、配列番号１３）にするために変異させることができる。この変異は、ヒトＦＸａ Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（重鎖の１３９〜１４３）のペプチド配列の、ウシＦＸａ：Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ（例えば配列番号２６）から得られた同等の配列との置きかえに関することができる。同様に、重鎖のリシン８２（配列番号２に従って番号付けしている）はまた、アミノ酸、例えば、チロシン（例えば、配列番号９）に置きかえることができる。

ＧＤＸａをコードするヌクレオチド配列は、化学的に合成することができる（Ｙｏｕｎｇ ＬおよびＤｏｎｇ Ｑ．、２００４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、Ａｐｒ １５；３２（７）、Ｈｏｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．およびＬｕｂｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．２００２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３０、Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ Ａら、２００６．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｊｕｎ ６；７：２８５）。ＧＤＸａをコードするヌクレオチド配列はまた、ＰＣＲによって適切なプライマーを使用して増幅することができる。

ＧＤＸＡはまた、当業者に周知の遺伝子操作技術によって生成することができる。ヒト第Ｘ因子をコードするヌクレオチド配列は、こうして発現ベクターにクローニングすることができ、すなわち、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列、プロペプチドおよびドメインＧｌａの一部を削除し、シグナルペプチド、例えば、ＴＩＭＰ−１のシグナルペプチド（Ｃｒｏｍｂｅｚら、２００５）を融合させる。こうして生成された改変第Ｘ因子は、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体またはアルギニン２３４とイソロイシン２３５（スイスプロット：Ｐ００７４２．２に従って番号付けしている）との結合を切断する任意のその他の酵素の何れかによって活性化することができる。あるいは、ＧＤＸａは、フューリンまたは任意のその他の細胞内酵素によって認識される切断配列を、イソロイシン２３５のすぐ上流に挿入することによって直接生成することができる。すなわち、これらのアミノ酸、例えば、アルギニン−リシン−アルギニンをコードする配列は、フューリンによる切断を可能にする（Ｎａｋａｙａｍａら、１９９７）。切断を改善するために、配列アルギニン−リシン−アルギニン−アルギニン−リシン−アルギニンを導入することができる。前記改変ＦＸをコードするＤＮＡは、発現プラスミドに挿入され、それらを生成するための特別な細胞系（例えば、ＨＥＫ−３９３Ｅ系）に挿入され、こうして生成されたタンパク質は次にクロマトグラフィーによって精製される。

これらの技術は、参照マニュアル：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、３版、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ編（２００１）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７）に詳細に記載されている。

したがって、ＧＤＸａはまた、前記で述べたＧＤＸａをコードするヌクレオチド配列によって表すことができ、このような配列は、以下の配列識別子：軽鎖については配列番号８、配列番号１６〜配列番号１９、重鎖については配列番号１５または配列番号２１〜２５および配列番号２７によって表される。

この種の改変因子は先行技術から周知である（ＭｏｒｉｔａおよびＪａｃｋｓｏｎ、１９８６；Ｓｋｏｇｅｎら、１９８４、Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎら、１９９３．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３２：９４７〜９６６または米国特許出願公開第２００９／２２９８１１９号）。

本発明による医薬組成物は、投与に必要な任意の剤形として製剤化することができる。特に、全身投与の場合、本発明による組成物は、注射用に滅菌した凍結乾燥粉末の形態で製剤化することができる。本発明による医薬組成物はまた、経鼻的または非経口的に投与することができる。したがって、本発明の医薬組成物は、活性成分に加えて、当業者には公知であり、所望する形態の医薬組成物を調製するために必要な任意の薬剤として許容される製剤添加物、特に、すぐに注射するために水性溶液で再構成した後、凍結乾燥したタンパク質ＧＤＸａを安定化することができる任意の賦形剤を含むことができる。

出血性アクシデントの場合、本発明による医薬組成物は、組換えＦＶＩＩａ（Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ（登録商標））よりも１０〜２０倍低い濃度で投与することができ、これは、投与用量当たり９０〜２７０μｇ／ｋｇの範囲の薬量に従って投与される。したがって、別の側面によれば、本発明はまた、インヒビターを保有していてもいなくても血友病ＡまたはＢの患者に投与用量当たり４．５〜２７μｇ／ｋｇを投与するために、ＴＦＰＩに結合することはできるが、リン脂質には結合できない血栓形成性を有さないＧＤＸａを含む医薬組成物に関する。前記投与は全身、経鼻または非経口経路によることができる。

本発明を以下の例によって例示する。

［実施例］
例１
材料および方法
材料：
正常な患者の凍結血漿のプールおよび血友病Ａまたは血友病Ｂの患者の個々の血漿、リン脂質ＴＧＴ、Ｐｒｉｏｎｅｘ、コーントリプシンインヒビター（ＣＴＩ）、発色基質ＰＮＡＰＥＰ １０２５、ヒト第Ｘａ因子、ヒトＧＤＸａおよびヒツジ抗ヒトトロンビン抗体はＣｒｙｏｐｅｐ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。ヒト組換えＴＦＰＩは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｃａｌ Ｉｎｃ．（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）から入手した。再脂質化組換えヒト組織因子（ＴＦ、Ｉｎｎｏｖｉｎ）は、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｐｕｔｅａｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）製である。トロンビン標準物質、ＦｌｕＣａＫｉｔおよびＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ（Ａｓｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）製の丸底９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ、Ｕ型底のプレート）は、トロンビン生成試験用に使用した。酵素実験用に、平底９６ウェルマイクロタイタープレートはＧｒｅｉｎｅｒ（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から、ヒツジ抗ＴＦＰＩ抗体はＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｓａｎｄｈｉｌｌ Ｄｒｉｖｅ、Ｃａｎａｄａ）から入手する。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＵＳＡ）製のＴＦＰＩ活性のＡｃｔｉｃｈｒｏｍアッセイは、ＴＦＰＩ活性を測定するために使用した。アンチトロンビン活性アッセイ（ＳＴＡ−Ｓｔａｃｈｒｏｍ アンチトロンビン ＩＩＩ）は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ＳＴＡＧＯ製である。酵素的計算は、ＰＲＩＳＭ ５．０を用いて実施した。

方法
１）トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）
トロンビン生成の測定は、Ｈｅｍｋｅｒ’ｓ法によって、血液凝固の活性のために組織因子（ＴＦ）１ｐＭを使用して、インキュベーション期間中の血液凝固の接触相の活性化を阻害するためにＣＴＩ３０μｇ／ｍｌの存在下で実施した（ｖａｎ Ｖｅｅｎ ＪＪ、Ｇａｔｔ Ａ、Ｃｏｏｐｅｒ ＰＣ、Ｋｉｔｃｈｅｎ Ｓ、Ｂｏｗｙｅｒ ＡＥ、Ｍａｋｒｉｓ Ｍ．「蛍光発生トロンビン生成測定法において、コーントリプシンインヒビターは低濃度の組織因子においてのみ必要とされ、第ＶＩＩＩ因子血液凝固活性とトロンビン生成試験（thrombogram）パラメータとの関係に影響を及ぼす（Corn trypsin inhibitor in fluorogenic thrombin-generation measurements is only necessary at low tissue factor concentrations and influences the relationship between factor VIII coagulant activity and thrombogram parameters.）」Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．２００８ Ａｐｒ；１９（３）：１８３〜９）。簡単に説明すると、ＴＦ２０μｌ、リン脂質４μＭおよび血漿８０μｌの混合液を３連ずつマイクロタイタープレートにピペットで注入した。血漿８０μｌを有するトロンビン標準物質２０μｌも、３連ずつプレートにピペットによって入れた。次に、プレートをＶａｒｉｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）に挿入し、励起波長を３９０ｎｍ、発光波長４６０ｎｍおよびパスバンド１０ｎｍに設定した。ＦｌｕＣａＫｉｔ２０μｌ（蛍光発生基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ、ＺＧＧＲ−ＡＭＣ）２．５ｍＭおよびＣａＣｌ₂０．１Ｍ）を全てのウェルに注入し、こうして反応を開始した。蛍光シグナルは２０秒ごとに６０分間読み取る。蛍光強度に関する生データは、既に記載されている３波長法を使用して数学的に計算するためにＳｉｇｍａｐｌｏｔ（登録商標）９．０にエクスポートした（Ｄｅ Ｓｍｅｄｔ Ｅ．Ａｄｖａｎｃｅｄ ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｙ：ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ；２００７）。

以後、
ＥＴＰは内因性トロンビン産生能を示し、曲線下面積に対応する。

ＰＨはピークの高さを示し、ピークのトロンビンレベルに対応する。

ＬＴは潜伏時間を示し、トロンビン２ｎＭに達する時間に対応する。

ＰＴはピークの時間であり、ＰＨが得られる時間に対応する。

様々な因子ＧＤＸａ、ＸａまたはＮｏｖｏｓｅｖｅｎ（登録商標）は、Ｐｒｉｏｎｅｘ１％、ＨＥＰＥＳ１８ｍＭ、塩化ナトリウム１３５ｍＭを含む緩衝液Ａ、ｐＨ７．３５で希釈し、様々な濃度のＣＴＩで前処理した血友病性血漿に添加する。

２）特異的抗体によるアンチトロンビンおよびＴＦＰＩの中和
アンチトロンビンを中和するために、重症血友病Ａ血漿に様々な濃度のヒツジＩｇＧ抗ヒトアンチトロンビン抗体（１．８、３、５および７．５ｇ／ｌ）を加え、ＴＧＡで試験する前に１時間２５℃でインキュベートした。併行して、アンチトロンビン活性はＳＴＡＲ血液凝固計（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）でアンチトロンビンＩＩＩ ＳＴＡ−Ｓｔａｃｈｒｏｍ試薬を用いて測定した。

ＴＦＰＩを中和するために、ＴＧＡで試験する前に、同じ血友病Ａ血漿を、様々な濃度のヒツジ抗ヒトＴＦＰＩイムノグロブリン（２．５、５、１０および５０ｍｇ／ｌ）と接触させた。併行して、ＴＦＰＩの活性は、Ａｃｔｉｃｈｒｏｍ ＴＦＰＩ活性アッセイによって製造元の指示に従って測定した。簡単に説明すると、２０倍に希釈した血漿２０μｌを３７℃でＴＦ／ＦＶＩＩａ２０μｌの存在下で３０分間インキュベートした。次に、第Ｘ因子（ＦＸ）を添加し、ＥＤＴＡおよびＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＸａを添加する前に、全体を３７℃で１５分間インキュベートした。反応は、氷酢酸を添加することによって５分後に停止し、吸収を４０５ｎｍで読み取った。

３）色素原の測定
３．１） ＧＤＸａおよびＸａの動力学的定数の測定
ＧＤＸａまたはＦＸａ活性を測定するために、酵素０．３ｎＭを、Ｐｒｉｏｎｅｘ１％、ＨＥＰＥＳ１８ｍＭ、塩化ナトリウム１３５ｍＭを含む緩衝液、ｐＨ８．４中で５分間３７℃でインキュベートする。次に、発色基質ＰＮＡＰＥＰ １０２５を０．３３、０．５０、１、１．５および２．０ｍＭの濃度で添加し、吸収の変動を４０５ｎｍで記録する。

３．２） アンチトロンビン（ＡＴ）の酵素的阻害
ＸａまたはＧＤＸａ（１．２５ｎＭ）は、緩衝液Ａ中で、濃度を増加させたアンチトロンビン（０〜５００ｎＭ）の存在下で３７℃でインキュベートする。混合液２００マイクロリットルの一部を様々な時間間隔で９０分まで採取する。次に、発色基質ＰＮＡＰＥＰ １０２５ ５０μｌ−６ｍＭを添加し、吸収の変化を記録する。

３．３）ＴＦＰＩの酵素的阻害
ＴＦＰＩによるＧＤＸａまたはＦＸａの活性の阻害は、酵素を０．２５ｎＭで３時間２５℃で緩衝液Ａ中において、濃度を増加させたＴＦＰＩ（ＧＤＸａについては０〜３０ｎＭおよびＦＸａについては０〜１０ｎＭ）の存在下で、最終容量２００μｌでインキュベートすることによって分析した。次に、発色基質ＰＮＡＰＥＰ １０２５ ２．５ｍＭ ５０μｌを添加し、吸収の変化を記録した。Ｋｉ^*は、前記で記載したように測定した（Ｂｕｎｃｅ ＭＷ、Ｔｏｓｏ Ｒ、Ｃａｍｉｒｅ ＲＭ．酵素原様第Ｘａ因子変種はトロンビン生成を回復させ、インビトロにおける内因性経路を効果的にバイパスする（Zymogen-like factor Ｘａ variants restore thrombin generation and effectively bypass the intrinsic pathway in vitro）Ｂｌｏｏｄ．２０１１ Ｊａｎ ６；１１７（１）：２９０〜８；Ｂａｕｇｈ ＲＪ、Ｂｒｏｚｅ ＧＪ，Ｊｒ．、Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ Ｓ．組織因子経路インヒビターによる外因性経路第Ｘａ因子形成の調節（Regulation of extrinsic pathway factor Xa formation by tissue factor pathway inhibitor.）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３（８）：４３７８〜８６）。

３．４）ＧＤＸａおよびＸａの血漿内半減期の測定
ＧＤＸａまたはＸａの血漿内半減期は、正常血漿にＧＤＸａまたはＸａ５０ｎＭを添加することによって測定した。次に、混合物を３７℃でインキュベートした。少量を０〜６０分に採取し、緩衝液Ａで２５倍にすぐに希釈してから、既に記載したように、発色基質ＰＮＡＰＥＰ １０２５ １．５ｍＭを添加し、残存するアミド分解活性を測定した。

例２
改変第Ｘａ因子の調製
プラスミドｐＴＴ５は、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ酵素で消化することによって開裂させ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位を備えたＴＩＭＰ１のシグナルペプチドならびにＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を備えＧｌａドメインが欠如したＦＸをコードする遺伝子を挿入し、プラスミドｐＴＴ５−ＴＩＭＸ（ｐＴＴ５ ｓｐＴＩＭＰ１ ｇｌａ欠損ＦＸ）を生成する。ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を備え、Ｇｌａドメインが欠如した本発明によるＦＸをコードする配列は、化学合成によって得られた（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。次に、フューリンの認識部位を重鎖のＮ末端イソロイシンの上流に導入し、精製のために培地中に直接ＧＤＸａが分泌することを可能にした。生成したＧＤＸａは、軽鎖については配列識別子配列番号３、重鎖については配列番号２の配列によって表される。

例３
ＧＤＸａおよびＦＸａの動力学的パラメータの測定
トロンビン生成に対するＧＤＸａの効果を分析する前に、発色基質ＰＮＡＰＥＰ １０２５の切断を使用してＧＤＸａおよびＦＸａを特徴付けた。ＧＤＸａは、ＦＸａ（Ｋｍ＝０．６４±０．０３ｍＭ）と類似の親和性（Ｋｍ＝０．７５±０．０５ｍＭ）、および類似の触媒特性：ＧＤＸａはｋｃａｔ＝２９０±５ｓ−１でＦＸａはｋｃａｔ＝３７５±８ｓ−１を示した（表１）。これらの結果は、発色基質Ｓ２２２２で得られた以前の報告（Ｓｋｏｇｅｎ ＷＦ、Ｅｓｍｏｎ ＣＴ、Ｃｏｘ ＡＣ．「プロトロンビナーゼの会合における第Ｘａ凝固因子およびｄｅｓ−（１−４４）第Ｘａ因子の比較（Comparison of coagulation factor Xa and des-(1-44)factor Xa in the assembly of prothrombinase）」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８４；２５９（４）：２３０６〜１０）と一致する。

示した結果は、発色基質ＰＮＡＰＥＰ １０２５を使用して３連で実施した２種類の独立した測定に対応する。

例４
トロンビン生成に対するＧＤＸａまたはＦＸａの影響
１ｐＭの濃度では、図１Ａの点線によって示されるように、ＴＦは重症血友病性血漿Ａにおいてトロンビンの生成を誘導することができない。しかし、ＧＤＸａ５０ｐＭの存在下では、トロンビン生成の明らかな回復が認められた（図１Ｂ）。ＧＤＸａは、トロンビン生成に関与する全パラメータ、例えば、内因性トロンビン産生能（ＥＴＰ）、潜伏時間、ピークの高さ、ピークの時間を正常に戻す（図１Ｂ、表４）。トロンビンはＴＦなしでは生成されなかったので、観察されたトロンビン生成は、血漿に対するＧＤＸａの直接的な効果ではなかった（図１Ｂ、点線）。これは試験した血友病性血漿全てにおいて認められた。さらに、ＧＤＸａとは対照的に、ＦＸａは、プロトロンビンをトロンビンに直接変換することができるので、ＴＦがなくてもトロンビン生成を誘発した（図１Ｃ）。ＧＤＸａによる基質ＺＧＧＲ−ＡＭＣの直接的切断による干渉の可能性を定量するために、レピルジン（トロンビンインヒビター）の飽和量（６ｐｇ／ｍｌ）の存在下で酵素の量を増加させて添加した。図１Ｄに示したように、生の蛍光シグナルはレピルジンの存在下で完全に消去された。これらの条件下で、ＧＤＸａは濃度に比例して基質ＺＧＧＲ−ＡＭＣを切断した。５０ｎＭの濃度で、最終シグナルはレピルジンなしで生成した蛍光の８％に対応し、２５０ｎＭの濃度で、シグナルは全蛍光の約４０％を示した。しかし、このシグナルは直線状なので、トロンビン濃度の曲線を計算するために使用した３波長法における複合体α２−マクログロブリン−トロンビンのシグナルに数学的に含まれ、トロンビン生成の結果に影響を及ぼさない（Ｄｅ Ｓｍｅｄｔ Ｅ．Ａｄｖａｎｃｅｄ ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｙ：ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ；２００７）。

重症血友病Ａの患者の血漿中におけるトロンビン生成を回復させることができるＧＤＸａの最小量を評価した。２０ｎＭの濃度のＧＤＸａは、正常血漿で認められたもの（図１Ａ）と類似のこの血漿中におけるトロンビン生成曲線を与えた（図１Ｅ）。さらに、１０ｎＭのＧＤＸａは２００ｎＭのｒＦＶＩＩａの存在下で得られるよりもやや高いシグナルを生じた（図１Ｆ）。

例５
トロンビン生成に対する抗アンチトロンビンおよび抗ＴＦＰＩ抗体の効果
抗アンチトロンビン抗体は、動力学的パラメータにはほとんど影響を与えずに、ＥＴＰを大きく増加させることができる（表２および図２Ａ）。抗アンチトロンビン抗体７．５ｇ／ｌ（残存アンチトロンビン活性９％）では、ＥＴＰは２７１６ｎＭ．分に上昇し、ＰＨは７６ｎＭに達した。これは、動力学的パラメータに対する効果（ＬＴ＝６．６分、ＰＴ＝３１．３分）とは対照的である。さらに、Ｅｒｈａｒｄｔｓｅｎらによって既に示されたように（「組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）をブロックすると、抗体誘導性血友病Ａのウサギにおける出血時間が短縮する（Blocking of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) shortens the bleeding time in rabbits with antibody induced hemophilia A.）」Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ．１９９５；６（５）：３８８〜９４）、抗ＴＦＰＩ抗体はまた、血友病性血漿において血液凝固を回復させることができた。１０ｍｇ／ｌを上回る濃度の抗ＴＦＰＩ抗体（残存ＴＦＰＩ活性＜３０％）では、この血友病性血漿中において全ＴＧＡパラメータは正常化した（表２）。１０ｍｇ／ｌ（表２および図２Ｂ）では、ＥＴＰは２０９から７６２ｎＭに、ＰＨは８から７９ｎＭにそれぞれ増加した。ＬＴは１３．６から３．５分に、ＰＴは２５．９から７．２分にそれぞれ減少した。

様々な濃度のヒトアンチトロンビン抗体または抗ヒトＴＦＰＩ抗体を、トロンビン生成アッセイ前に重症血友病Ａの患者の血漿に添加した。

ＨＰ：血友病性血漿；
ＮＰ：正常血漿。

アンチトロンビンおよびＴＦＰＩ残存活性は、材料および方法で記載した方法に従って測定した。

ＧＤＸａ：ＧＤＸａ５０ｎＭを有する血友病性血漿。

抗ＡＴＩｇＧの濃度はｇ／ｌで表す。

抗ＴＦＰＩ抗体の濃度はｍｇ／ｌで表す。

例６
ＴＦＰＩおよびアンチトロンビンによるＧＤＸａおよびＦＸａの酵素的阻害
アンチトロンビンによる不可逆的な酵素的阻害については、ＧＤＸａ（１．５０±０．０４×１０３Ｍ^-1．ｓ^-1、図２Ｂ）およびＸａの阻害の特性は同一であった（ｋ２＝１．５７±０．０８×１０３Ｍ^-1．ｓ^-1、図２Ａ）。ＴＦＰＩはＦＸａのゆっくりした固定のインヒビターであり（２６、２７）、低濃度では、ＧＤＸａの弱いインヒビターである（２８〜３０）。したがって、ＦＸａおよびＧＤＸａの阻害を比較した（表１）。ＧＤＸａはＦＸａ（Ｋｉ^*＝０．１７±０．０３ｎＭ、図２Ｃ）と比較してＴＦＰＩに対して低い親和性を示した（Ｋｉ^*＝０．３１±０．０４ｎＭ、図２Ｄ）。さらに、この実験における平衡達成は、１８時間インキュベーションした後の滴定曲線を確認することによって示された。

例７
ＧＤＸａおよびＸａの血漿内半減期
ＴＦＰＩおよびアンチトロンビンによるＧＤＸａの阻害を考慮して、血漿にＧＤＸａまたはＦＸａ５０ｎＭを３７℃で添加した後の残存活性を評価した。図４Ａに示したように、血漿中における活性は迅速に減少し、約１分３０秒の半減期が認められ、ＦＸａで既に示したように（Ｂｕｎｃｅ ＭＷ、Ｔｏｓｏ Ｒ、Ｃａｍｉｒｅ ＲＭ．「酵素原様第Ｘａ因子変種はトロンビン生成を回復させ、インビトロにおける内因性経路を効果的にバイパスする（Zymogen-like factor Xa variants restore thrombin generation and effectively bypass the intrinsic pathway in vitro）」Ｂｌｏｏｄ．２０１１ Ｊａｎ ６；１１７（１）：２９０〜８）、ＧＤＸａまたはＦＸａでは２０分後にプラトーに達した。それにも関わらず、トロンビン生成に対する効果は、時間が経過しても維持され、例えば、１時間後、ＧＤＸａの残存活性は最初の活性の約１０％で（図４Ｂ）、トロンビン生成の回復は維持されていた。１分間インキュベーションした後、ＥＴＰは０〜６１０ｎＭに増加し、６０分後でもまだ４７８ｎｍであった（表３）。類似の正常化はまた、最大ピークの高さ（１分で７５ｎＭ、６０分で３８ｎＭ）ならびにシフトおよびピーク時間についても認められた（表３）。

ＧＤＸａ５０ｎＭを重症血友病性血漿に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。トロンビン生成を測定するため、少量をすぐおよび１時間後に採取した。

例８
インヒビターを保有するおよび保有しない重症血友病Ａの患者ならびに重症血友病Ｂの患者におけるトロンビン生成に対するＧＤＸａの影響
トロンビン生成は、インヒビターの力価が５０ベセスダ単位と測定された１ドナーを含む重症血友病Ａの５人の異なるドナーの血漿試料および重症血友病Ｂの患者の１血漿において評価した。トロンビン生成は、６つの血漿では、血液凝固をＴＦ１ｐＭによって誘発したときはほとんど検出できなかったが、ＧＤＸａ２０および５０ｎＭの存在下では回復した。表４は、血漿全ておよびトロンビン生成に関連したパラメータ全てについて、正常化が様々な程度で認められることを示している。ＧＤＸａ２０ｎＭの存在下で、観察されたＥＴＰは３７４±１２８ｎＭで、ＰＨは２２±１１ｎＭであった。ＬＴは５．０±１．５、ＰＴは１３．９±３．８分にそれぞれ減少した。

さらに、用量効果が認められ、ＧＤＸａ５０ｎＭを添加したとき、値は、ＥＴＰでは５３３±１３２ｎＭに、ＰＨでは４６±２０ｎＭに増加した。ＬＴは２．８±０．７、ＰＴは９．２±２．７分にそれぞれ減少した。

ＧＤＸａ２０または２０ｎＭを様々な血漿に添加し、すぐにトロンビン生成についてアッセイした。

Ｐｘ：血漿ｘ
ＨＡ：血友病Ａ
ＨＡ＋Ｉ：インヒビターを保有する血友病Ａ（インヒビター５０ＢＵを保有する血友病Ａ）
ＨＢ：血友病Ｂ
例９
血友病Ａの対象におけるトロンビン生成に対する本発明によるＧＤＦＸａと第ＶＩＩａ因子（ｒＶＩＩａ、Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ（登録商標））との比較
図５は、ＧＤＸａがｒＶＩＩａ（Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ（登録商標））よりもずっとトロンビン生成の正常化に効果的であることを示している。

「ＡＬＪＡＭＡＬＩ ＭＮ、ＫＪＡＬＫＥ Ｍ、ＨＥＤＮＥＲ Ｕ、ＥＺＢＡＮ Ｍ、ＴＲＡＮＨＯＬＭ Ｍ．「血友病状態を模倣した再構成細胞をベースにしたモデルにおけるｒＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））およびＮＮ１７３１によって誘導されたトロンビン生成および血小板活性化（Thrombin generation and platelet activation induced by rFVIIa (NovoSeven^(R)) and NN1731 in a reconstituted cell-based model mimicking hemophilia conditions.）」Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．２００９；１５：１３１８〜２６」によると、少なくとも５００ｎＭのｒＶＩＩａが正常化に必要である。

トロンビンの生成に対するＧＤＸａまたはＦＸａの影響を示す図。

（Ａ）正常血漿のプール（実線）および重症血友病Ａ血漿のプール（点線）におけるリン脂質およびＴＦの存在下でのトロンビンの生成試験。（Ｂ）リン脂質の存在下でＴＦを有する（実線）およびＴＦを有さない（点線）ＧＤＸａに富んだ（５０ｎＭ）血友病性血漿。（Ｃ）リン脂質の存在下でＴＦを有する（実線）およびＴＦを有さない（点線）ＦＸａに富んだ（５０ｎＭ）血友病性血漿。（Ｄ）ＧＤＸａによる基質ＺＧＧＲ−ＡＭＣの切断。リン脂質およびＴＦの存在下で、レピルジン６ｐｇ／ｍｌを有するおよび有さない（対照曲線Ａ）、ＧＤＸａの非存在下（曲線Ｂ）または様々な濃度の存在下（曲線Ｃ〜Ｅ）で試験したＣＴＩ前処理正常血漿。（Ｅ）ＧＤＸａ１０ｎＭ（実線）または２０ｎＭ（点線）に富んだ、および（Ｆ）ｒＦＶＩＩａ４０ｎＭ（太線）または２００ｎｍ（点線）に富んだ血友病性血漿中における、リン脂質およびＴＦの存在下でのトロンビンの生成。

データは、様々な重症Ａ型血友病の少なくとも３種類の異なる血漿で実施した実験を表している。
血友病の血漿中におけるトロンビン生成に対する抗ＡＴおよび抗ＴＦＰＩ抗体の影響を示す図。

様々な濃度の抗ヒトアンチトロンビン（Ａ）または抗ヒトＴＦＰＩ（Ｂ）抗体を重症血友病性血漿Ａに添加して、その後トロンビン生成のために放置した。抗体濃度は、抗アンチトロンビン抗体はｇ／ｌで表し、抗ＴＦＰＩ抗体はｍｇ／ｌで表す。ＧＤＸａの濃度はｎＭである。ＨＰは、血友病性血漿を示し、ＮＰは正常血漿を示す。

（Ａ）曲線Ａは、血友病性血漿を示し、曲線Ｂ〜Ｄは、血友病性血漿に添加した様々な濃度のアンチトロンビン抗体を示し、曲線Ｅは、血友病性血漿に添加したＧＤＸａ５０ｎＭの添加を示し、曲線Ｆは正常血漿を示す。（Ｂ）曲線Ａは、血友病性血漿を示し、曲線Ｂ〜Ｄは、血友病性血漿に添加した様々な濃度の抗ＴＦＰＩ抗体を示し、曲線Ｅは、血友病性血漿に添加したＧＤＸａ５０ｎＭの添加を示し、曲線Ｆは正常血漿を示す。
ＴＦＰＩまたはアンチトロンビンによるＧＤＸａおよびＦＸａの酵素的阻害を示す図。

（Ａ−Ｂ）アンチトロンビンの阻害について、１．２５ｎＭのＦＸａ（Ａ）または（Ｂ）ＧＤＸａを、濃度を増加させたアンチトロンビン（ＡＴ：０（曲線Ａ）〜５００ｎＭ（曲線Ｆ））の存在下で３７℃でインキュベートした。少量を様々な時点（０〜９０分）で採取し、発色基質ＰＮＡＰＥＰ １０２５に添加した。（Ｃ−Ｄ）ＴＦＰＩによるＦＸａ（Ｃ）またはＧＤＸａ（Ｄ）の活性阻害は、緩衝液Ａの中で、濃度を増加させたＴＦＰＩの存在下で（ＧＤＸａ０〜３０ｎＭおよびＦＸａ０〜１０ｎＭ）、酵素０．２５ｎＭと２５℃で３時間インキュベーションすることによって分析した。

データは、２つの異なる実験を表す。
血漿中におけるＧＤＸａおよびＦＸａの薬物動態特性の測定を示す図。

５０ｎＭのＦＸａ（Ａ）またはＧＤＸａ（Ｂ）を正常血漿に添加し、全体を３７℃でインキュベートした。少量を異なる時間間隔で採取し、残存活性を測定するために緩衝液Ａですぐに２５倍に希釈した。半減期はＦＸａが１．４±０．１分で、ＧＤＸａで１．８±０．１分であった。

データは、２つの異なる実験の平均値である。
ｒＶＩＩａおよびＧＤＸａによるトロンビン生成の正常化を示す図。

ＧＤＸａ（曲線ＣおよびＤ）またはｒＶＩＩａを様々な濃度で（曲線ＥおよびＦ）血友病性血漿（ＨＰ、曲線Ｂ）に添加。ＮＰ：正常血漿（曲線Ａ）。

Claims (8)

1. インヒビターを保有するまたは保有しない血友病ＡまたはＢの患者における出血性アクシデントを予防または治療するための、改変第Ｘａ因子（ＧＤＸａ）を含む医薬組成物であって、前記ＧＤＸａはＧｌａドメインが欠如したＦＸａである医薬組成物。
2. 前記ＧＤＸａは、ＥＧＦ１ドメインの欠損、ＥＧＦ２ドメインの欠損、またはＥＧＦ１およびＥＧＦ２ドメインの欠損を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＧＤＸａは完全な状態の重鎖を有することを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記ＧＤＸａは、軽鎖については配列番号７または配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６によって表され、重鎖については配列番号２、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号２６によって表されることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
5. 前記ＧＤＸａは、軽鎖については配列番号８、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９の核酸配列によってコードされ、重鎖については配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２７の核酸配列によってコードされることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
6. インヒビターを保有するまたは保有しない血友病ＡまたはＢの患者に、全身的な、経鼻の、または非経口的な経路によって投与するための、ＧＤＸａを４．５〜２７μｇ／ｋｇ含む請求項１〜５の何れか一項に記載の医薬組成物。
7. 改変第Ｘａ因子（ＧＤＸａ）または請求項１〜５の何れか一項に記載の医薬組成物を投与することによる、血友病ＡまたはＢの患者における出血性症候群を予防的に治療する方法。
8. 改変第Ｘａ因子（ＧＤＸａ）または請求項１〜５の何れか一項に記載の医薬組成物を投与することによる、血友病ＡまたはＢの患者における出血性アクシデントを治療する方法。