FR3064917A1 - Facteur x mute - Google Patents
Facteur x mute Download PDFInfo
- Publication number
- FR3064917A1 FR3064917A1 FR1753060A FR1753060A FR3064917A1 FR 3064917 A1 FR3064917 A1 FR 3064917A1 FR 1753060 A FR1753060 A FR 1753060A FR 1753060 A FR1753060 A FR 1753060A FR 3064917 A1 FR3064917 A1 FR 3064917A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- fxa
- mutated
- factor
- mutation
- use according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
Abstract
La présente invention concerne un Facteur Xa (FXa) muté pour l'utilisation dans la prévention ou le traitement d'un accident hémorragique chez un patient atteint d'hémophilie A ou B.
Description
Titulaire(s) : UNIVERSITE GRENOBLE ALPES Etablissement public,CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - CNRS Etablissement public, CENTRE HOSPITALIER UNIVERSITAIRE DE GRENOBLE Etablissement public.
Mandataire(s) : CABINET PLASSERAUD / GROUPEMENT 280.
164/ FACTEUR X MUTE.
16/) La présente invention concerne un Facteur Xa (FXa) muté pour l'utilisation dans la prévention ou le traitement d'un accident hémorragique chez un patient atteint d'hémophilie A ou B.
FR 3 064 917 - A1
ι
FACTEUR X MUTÉ
Domaine technique de l’invention
La présente invention a pour objet un facteur X muté pour la prévention ou le traitement d'un accident hémorragique chez un patient atteint d'hémophilie A ou B.
État de la technique de l’invention
L'hémophilie A comme l'hémophilie B regroupe deux types d'hémophilie, l'hémophilie constitutionnelle et l'hémophile acquise.
L'hémophilie constitutionnelle de type A est une maladie hémorragique caractérisée par un déficit quantitatif ou qualitatif en FVIII résultant d'une anomalie du gène du FVIII. L'hémophilie constitutionnelle de type B est également une maladie hémorragique mais caractérisée par un déficit quantitatif ou qualitatif en FIX résultant d'une anomalie du gène du FIX.
L'hémophilie acquise de type A ou B se définit par l'apparition d'auto anticorps dirigés contre ces FVIII ou FIX.
L'hémophilie se traduit par un déficit de la coagulation sanguine responsable d’une hémorragie. Les hémophiles de type A ou B non traités présentent des symptômes tels que des saignements excessifs en cas de blessure et même des hémorragies spontanées.
Les patients atteints d'hémophilie A et B peuvent être traités par des concentrés comprenant respectivement du FVIII ou du FIX qui peuvent être des dérivés plasmatiques ou des produits issus du génie génétique. Ces concentrés peuvent être administrés à l'occasion de chaque hémorragie, dans ce cas, il convient de commencer le traitement le plus rapidement possible, à l'apparition des premiers signes. Le traitement peut également être administré de façon prophylactique, régulièrement 2 à 3 fois par semaine de façon à prévenir les hémorragies. Cependant, le traitement peut donner lieu à l'apparition d'anticorps dirigés contre le FVIII ou le FIX appelés inhibiteurs. La présence de tels anticorps rend alors inefficace les administrations de facteurs VIII ou IX. Ces anticorps sont des immunoglobulines de classe G.
Ils se développent tôt dès les premières administrations, souvent avant la dixième. Certains patients restent de faibles répondeurs (titre d'anticorps < 5 U.B), d'autres appelés forts répondeurs atteignent des titres qui ne permettent plus de les traiter avec le facteur correspondant.
Les traitements disponibles pouvant être inefficaces (Astermark J, Donfield SM, DiMichele DM, Gringeri A, Gilbert SA, Waters J, Berntorp E, for the FSG. A randomized comparison of bypassing agents in hemophilia complicated by an inhibitor: the FEIBA NovoSeven Comparative (FENOC) Study. Blood. 2007; 109: 546-51) ou leur administration compliquée d'accidents thrombotiques (Aledort LM. Comparative thrombotic event incidence after infusion of recombinant factor Vlla versus factor VIII inhibitor bypass activity. J Thromb Haemost. 2004; 2: 1709.), des alternatives thérapeutiques aux traitements existants ont donc été proposés afin de prévenir et ou traiter de façon satisfaisante l'existence d'un risque hémorragique chez les patients atteints d'hémophilie A ou B et présentant ou non un inhibiteur.
WO2012117203 Al propose par exemple une composition pharmaceutique comprenant un facteur X activé (FXa) modifié, ledit FXa modifié pouvant se lier à l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI) mais étant non thrombogène car ne possédant pas de site de liaison aux phospholipides (domaine γ-carboxyglumatic acide (Gla)).
Le FXa intervient dans l’activation de la prothrombine (facteur II) en thrombine (facteur Ha), notamment lorsqu’il est complexé avec le co-facteur V activé pour former le complexe prothrombinase. Ce facteur est un élément essentiel dans la cascade de la coagulation.
Le Tissue factor pathway inhibitor (TFPI ou inhibiteur de la voie du facteur tissulaire ou extrinsic pathway inhibitor (EPI)) est une protéine intervenant dans la régulation de la coagulation sanguine. Son rôle principal est l’inhibition, essentielle pour le maintien de l’équilibre hémostatique de base, de l’activité coagulante de petites quantités de facteur tissulaire. Le TFPI inhibe le complexe Facteur tissulaire - facteur Vlla ainsi que le FXa et régule donc négativement la coagulation sanguine.
Le FXa modifié proposé dans WO2012117203 Al agit comme leurre moléculaire ciblant le TFPI et permet de lever l’inhibition qu’exerce le TFPI et donc de prévenir ou de traiter un accident hémorragique chez un patient atteint d'hémophilie A ou B.
En revanche, Le FXa est sujet à une protéolyse en son C-terminal, dû à sa propre activité enzymatique, ce qui affecte sa stabilité. Il est donc souhaitable d’améliorer la stabilité du FXa. Cette protéolyse est néfaste au rendement lorsque le FXa est produit dans le surnageant de cellules en culture.
Un besoin subsiste donc pour un traitement ayant une stabilité améliorée permettant le traitement ou la prévention de l’accident hémorragique même en présence d'anticorps anti FVIII ou FIX de manière sûre pour les patients (ne provoquant pas de thromboses).
Des FXa modifiés ont aussi été proposés non pas comme leurres moléculaires ciblant le TFPI mais comme antidotes des anticoagulants oraux directs ciblant le FXa, par exemple :
WO2014202916Al propose un procédé de production d’un FXa modifié comme antidote des anticoagulants oraux directs ciblant le FXa, ledit FXa modifié (appelé GPAD-FXa) étant dépourvu de domaine Gla.
WO2013123087A1 propose des cellules en culture utiles pour la production améliorée de dérivés de FXa jouant le rôle d’antidote aux anticoagulants ciblant le FXa.
WO2013123087A1 décrit une mutation du site actif du FXa, une telle mutation pouvant inhiber l’activité catalytique du FXa. A la date de la présente invention, une telle mutation du site actif de FXa n’était pas envisageable pour une utilisation du FXa comme leurre moléculaire ciblant le TFPI puisque selon un dogme bien établi depuis les années 80, pour que la liaison entre le TFPI et le FXa s’établisse, ledit FXa doit être catalytiquement actif. Voir à ce propos:
Rao LV, Rapaport SI. Studies of a mechanism inhibiting the initiation of the extrinsic pathway of coagulation. Blood 1987; 69: 645-51, notamment le résumé et page 650 colonne 1, dernier paragraphe à colonne 2, deuxième paragraphe.
Broze GJ Jr. The rediscovery and isolation of TFPI. J Thromb Haemost 2003; 1: 1671-5, notamment page 1674 colonne 1, lignes 18 à 20 «[...] il a été démontré qu’un FXa catalytiquement actif était nécessaire pour le fonctionnement de l’inhibiteur » et lignes 24 à « [...] des études ultérieures ont montré que l’inhibiteur purifié interagissait directement avec le site actif de FXa ».
Pourtant, et contre toute attente, les inventeurs ont mis en évidence un FXa catalytiquement inactif pouvant répondre aux besoins cités précédemment.
Exposé de l’invention
La présente invention a donc pour objet un Facteur Xa (FXa) muté, dépourvu de domaine Gla, non thrombogène, capable de se lier à l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI) et comprenant une mutation de son site actif supprimant son activité protéasique - pour l'utilisation dans la prévention ou le traitement d'un accident hémorragique chez un patient atteint d'hémophilie A ou B.
Le FXa muté selon l'invention peut également être utilisé pour la prévention ou le traitement d'un accident hémorragique chez des patients hémophiles présentant des anticorps anti-facteur VIII (FVIII) ou facteur IX (FIX). Les anticorps sont apparus soit à la suite d'un traitement par des facteurs FVIII ou FIX, ou spontanément, comme dans l'hémophilie acquise.
Le FXa est sujet à une protéolyse en son C-terminal, dû à sa propre activité enzymatique, donnant lieu à la forme beta qui possède encore une activité catalytique (Mertens K, Bertina RM. Pathways in activation of coagulation factor , Biochem J. (1980), 185, voir notamment figure p657). Ladite mutation du site actif dudit FXa muté supprime tout risque d'autoprotéolyse en C-terminal, ce qui augmente considérablement la stabilité dudit FXa muté pendant son temps de production dans le surnageant des cellules, ainsi que sa stabilité sous forme purifiée. De plus, l’absence d’auto-protéolyse en C-terminal permet d’utiliser un tag pour la purification du FXa muté et donc d’obtenir une pureté importante, ce qui n’est pas possible avec la forme beta obtenue en l’absence de mutation. Un tag, par exemple HPC4 peut être ajouté en C-terminal, permettant la purification sur une colonne d’anticorps monoclonal en présence de Calcium suivi d’une élution par l’EDTA. Le FXa muté peut donc être produit en grandes quantités. De plus, lorsque le procédé de fabrication décrit dans WO2014202916Al où le peptide d’activation est remplacé par un linker comportant un double site furine (représentée par la SEQ ID NO :8), la protéine est produite sous forme correctement processée grâce à l’action des furines cellulaires qui coupent entre les deux chaînes.
Enfin, le fait d’avoir un FXa catalytiquement inactif sans aucune activité résiduelle le rend parfaitement sûr pour son application en clinique, c’est-à-dire ne présentant pas de risques de déclencher des thromboses.
Un FXa selon l’invention est représenté par l'identifiant de séquence SEQ ID NO:7 ou SEQ IDNO:8.
Légendes des figures
FIG. 1 : Mesure de l’activité chromogénique du FXa muté selon l’invention (« GD-FXa S195A ») comparée à celle du FXa natif (« Facteur Xa »).
FIG. 2 : Mesure de génération de thrombine du FXa muté selon l’invention.
Présentation détaillée de l’invention
Le facteur X, appelé également facteur de Stuart-Prower, est codé par le gène F10 et se réfère à la sérine protéase EC3.4.21.6. Le facteur X est composé d’une chaîne lourde, de 306 acides aminés, et d’une chaîne légère, de 142 acides aminés. Le facteur X est une protéine de 488 acides aminés, constitué d’un peptide signal, d’un propeptide, et des chaînes légère et lourde. La séquence du facteur X humain peut être trouvée dans UniProtKB sous le numéro d’accession P00742.
L'activation du facteur X de la coagulation est une étape clef dans la coagulation du sang et l'arrêt des hémorragies. Son activation est nécessaire pour les étapes de propagation et d'amplification de la coagulation. Son activation est également nécessaire pour l'arrêt de l'activation de la coagulation par l'intermédiaire de son interaction avec le TFPI. Le FX est activé soit par le facteur IX activé et son cofacteur, le facteur VIII activé ou par le facteur VII activé et son cofacteur, le facteur tissulaire (FT). Le FXa forme avec le facteur V activé le complexe prothrombinase, lequel est lié aux membranes. Le facteur Xa est le composant actif dans le complexe prothrombinase qui catalyse la conversion de la prothrombine en thrombine. La thrombine catalyse quant à elle, la conversion du fibrinogène en fibrine qui conduit à la formation des caillots dans le sang et à l'arrêt des saignements. Leytus et al.,(Biochemistry, 1986, 25:5098-5102) ainsi que Venkateswarlu et al., (Biophysical Journal, 2002, 82:1190-1206) décrivent le facteur X et les différents domaines présents dans ce polypeptide. A partir du FX monocaténaire, un double clivage permet l’élimination du peptide d’activation par l’action de la protéase Furine à son extrémité N-terminale, générant la chaîne lourde. La chaîne lourde est alors clivée à nouveau pour donner le FXa. Celui-ci comporte alors une chaîne légère SEQ ID NO:5 et une chaîne lourde dont un exemple est représenté par l'identifiant de séquence SEQ ID NO:6. Les deux chaînes sont liées par un pont disulfure.
Le FXa muté selon l'invention, est dépourvu de son domaine γ-carboxyglumatic acide (Gla) de liaison aux phospholipides et de son peptide d’activation (SEQ ID NO:3). De ce fait, le FXa muté est non thrombogène (voir WO2012117203A1, en particulier l’exemple 4).
Les 42 premiers acides aminés de la chaîne légère (résidus 1-42 de SEQ ID NO:5) représentent le domaine Gla, car il contient 11 résidus modifiés de façon post traductionnelle (acide γ-carboxyglutamique). Une digestion par la chymotrypsine permet de supprimer les résidus 1-42 permettant de générer enzymatiquement un FX dépourvu de son domaine de fixation aux phospholipides. Alternativement cette molécule peut être aussi exprimée directement sans ce domaine Gla par génie génétique.
Un FXa non thrombogène est incapable d’activer la coagulation quand il est ajouté à du plasma en absence de facteur tissulaire, ce qui le différencie du FXa natif. Cela peut être mis en évidence par un test mesurant la génération de thrombine en l’absence de facteur tissulaire et/ou de phosphoplipides selon une modification du test de génération de thrombine (Hemker et al, Thrombosis and Haemostasis. 1993 ; 70 : 617-624 ; voir WO2012117203A1, exemple 4)·
Le FXa muté selon l'invention possède en outre une mutation de son site actif supprimant son activité protéasique. L’ « activité protéasique » est définie comme la capacité d’une enzyme, ici le FXa, à cliver des protéines ou des peptides en hydrolysant leurs liaisons peptidiques. Le FXa fait partie de la famille des sérines protéases, ce nom se réfère au résidu de sérine de la triade catalytique du site actif. Dans le cadre de la présente invention, une activité protéasique supprimée signifie que ladite activité du FXa muté est inhibée ou ne dépasse pas 1% par rapport à l’activité du FXa natif.
Cette mutation du site actif peut être sélectionnée dans le groupe constitué d’une mutation de l’histidine, de l’acide aspartique ou de la sérine de la triade catalytique ou d’une combinaison de celles-ci. Dans le cadre de la présente invention, le terme « triade catalytique » désigne les trois résidus d'acides aminés qui interviennent ensemble dans le site actif du Facteur X, à savoir l’histidine, l’acide aspartique et la sérine.
De préférence, ladite mutation du site actif est une mutation par substitution de l’acide aspartique de la triade catalytique en asparagine. La mutation de l’acide aspartique en asparagine diminue l’activité catalytique d’un facteur 1000 chez la Trypsine, ce résultat peut être extrapolé au FXa (Hedstrom L. Serine protease mechanism and specificity, Chem. Rev. (2002), 102, p. 4507 paragraphe 1).
Plus préférablement, ladite mutation du site actif est une mutation par substitution de la sérine de la triade catalytique en alanine. La mutation de la sérine en alanine inhibe l’activité protéasique du FXa muté.
Le FXa muté peut être obtenu par génie génétique (ou synthèse chimique) du fait de la nécessité de l’introduction de la mutation du site actif par utilisation par exemple de la méthode QuickChange (Agilent) et en suivant les recommandations du fabricant et selon la publication Wang & Malcolm (1999) - BioTechniques, 26 : 680-682.
Un exemple de FX avant son activation peut être représenté par l'identifiant de séquence SEQ ID NO:4. Le FXa peut être produit par génie génétique, soit sous la forme d'une seule séquence, soit sous la forme de deux séquences qui sont ensuite liées les unes aux autres par un pont disulfure.
Ledit FXa muté selon l’invention peut être représenté par la SEQ ID NO:7 lorsqu’il est constitué uniquement de sa chaîne lourde. Ledit FXa muté selon l’invention peut aussi être représenté par la SEQ ID NO:8 qui correspond à une seule chaîne polypeptidique qui se trouve clivée par les furines cellulaires au niveau du site Furine (SEQ ID NO:9).
La capacité de liaison au TFPI du FXa est définie à l'aide de tout test bien connu de l'homme du métier. Il met en œuvre un substrat chromogénique permettant de déterminer le pourcentage d'inhibition du FXa et du FXa muté par le TFPI. Cependant dans le cas d’un FXa à activité protéasique supprimée, il ne peut être mis en œuvre. On peut alors se tourner vers un test direct d’interaction entre deux protéines, comme par exemple la Surface Plasmon Résonance (SPR) (voir exemple 3).
Ledit FXa muté peut également comprendre d'autres modifications en plus de l'absence de son domaine Gla et de la mutation de son site actif, notamment un Tag pour la purification, par exemple le Tag HPC4 représenté par la séquence SEQ ID NO: 10.
Le FXa muté peut être constitué de variants moléculaires présentant d’autres mutations que celles de son site actif. Ces autres mutations peuvent être introduites par utilisation par exemple de la méthode QuickChange (Agilent) et en suivant les recommandations du fabricant et selon la publication Wang & Malcolm (1999) - BioTechniques, 26 : 680-682. Ces autres mutations peuvent porter par exemple sur les acides aminés 82 et 138 de la chaîne lourde du FXa muté (numérotation selon SEQ ID NO:7) qui peuvent être mutées pour donner tout autre acide aminé, déterminé par des études structurales et de modélisation, et visant à améliorer l’affinité du FXa muté pour le TFPI. Par exemple les mutations K82Y et RI38F, Y, G, I ont été proposées (WO2014202916Al).
II existe différentes nomenclatures de numérotation de mutations. Les mutations décrites cidessus sont numérotées par rapport à la chaîne lourde. Une autre nomenclature par homologie avec la chymotrypsine est utilisée dans cette présente demande avec l’avantage que la numérotation des résidus de la triade catalytique est inchangée. Dans cette nomenclature chymotrypsine, K82 devient K96 et RI38 devient RI 50.
Les séquences décrites dans la présente demande peuvent être résumées dans le tableau 1 cidessous:
Tableau 1
| SEQ ID NO : | Protéine |
| 1 | Chaîne lourde de facteur X humain (306 acides aminés), comprenant le peptide d’activation |
| 2 | Peptide signal et chaîne légère de facteur X humain (182 acides aminés) |
| 3 | Peptide d’activation de la chaîne lourde (52 acides aminés) |
| 4 | Facteur X humain non activé (448 acides aminés) |
| 5 | Chaîne légère de facteur X humain (142 acides aminés) |
| 6 | Chaîne lourde du FXa humain natif après coupure du peptide d’activation (254 acides aminés)* |
| 7 | Chaîne lourde du FXa mutée sur la serine catalytique selon l’invention (254 acides aminés) ** |
| 8 | FXa muté sur la sérine catalytique selon l’invention (357 acides aminés) *** |
| 9 | Linker avec double site Furine (6 acides aminés) |
| 10 | Tag HPC4 avec linker (19 acides aminés) |
* Remarque : dans cette numérotation, la Serine catalytique a le numéro 185.
** Remarque : dans cette numérotation, l’Alanine qui remplace la Serine catalytique a le numéro 185.
*** Remarque : dans cette numérotation, l’Alanine qui remplace la Serine catalytique a le numéro 288.
L’invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant le FXa muté selon l’invention pour une administration par voie systémique, nasale ou parentérale tel que décrit dans la demande W02012117203A1 au patient atteint d'hémophilie A ou B avec ou sans anticorps dirigés contre le facteur VIII ou le facteur IX. La composition pharmaceutique selon la présente invention peut être formulée sous toute forme galénique nécessaire à son administration. En particulier, s'agissant d'administration par voie systémique, la composition selon l'invention peut être formulée sous forme de poudre lyophilisée stérile pour injection. Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention peuvent également être administrées par voie nasale ou parentérale. Elles pourront donc comprendre, en plus des principes actifs, tout adjuvant de formulation pharmaceutiquement acceptable, connu de l'homme du métier et qui est nécessaire à la préparation de la composition pharmaceutique sous la forme souhaitée et notamment tout excipient capable de stabiliser le FXa muté lyophilisée après reconstitution par une solution aqueuse pour son injection ultérieure.
L’invention concerne aussi un procédé de purification dudit FXa muté comprenant les étapes suivantes :
a. Purification du FXa muté sur colonne d’échange de cations ;
b. ajout d’un tag, de préférence HPC4, en C-terminal du FXa muté ; et
c. purification sur une colonne d’anticorps monoclonal anti-HPC4 en présence de Calcium.
La technique de purification sur une colonne d’anticorps (Anti Protein C Affinity Matrix, Roche) utilise un anticorps monoclonal dirigé contre un épitope conformationnel de la Protéine C. La solution à purifier est traitée par 1 mM CaCE et passée à plusieurs reprises sur la colonne fournie par le fabricant contenant la résine équilibrée. Après une série de lavages, la protéine fixée est éluée par un tampon contenant 5 mM EDTA.
Les exemples suivants sont donnés en vue d'illustrer divers modes de réalisation de l'invention.
ίο
Exemples
Exemple 1 : Préparation du FXa muté
Matériel :
Les facteurs X plasmatiques humains activé ou non (FXa/FX), les substrats chromogéniques pNAPEP 1025 et le plasma d’hémophile A proviennent de Haematologic Technologies (Cryopep Montpellier, France).
Le facteur VIII recombinant de contrôle (Factane) provient de LFB SA. Les plasmas déficients en FVIII proviennent de chez Stago.
Méthodes :
Production de l’ADNc de FXa muté
L’ADNc codant pour un facteur X dénué du domaine gamma-carboxyglutamique est obtenue auprès de la compagnie Genscript après optimisation, de façon optionnelle cet ADNc est en outre étiqueté en C-terminal par la séquence HPC4 séparée par un linker (SEQ ID No. 10). La mutagénèse de l’ADNc est réalisée avec la méthode Quickchange (Agilent) et l’enzyme pFU Ultra.
Production du FXa muté en cellules S2
La veille de la transfection, les cellules S2 de drosophile (Life Technologies) sont repiquées à une concentration cellulaire de 1 X 106 vc/ml. La densité cellulaire et la viabilité des cellules sont déterminées le jour de la transfection. Le volume de culture correspondant à 20 X 107 cellules est traité par le complexe plasmide-agent de transfection (Freestyle Max Reagent) pendant 25 minutes à 27°C. Un complexe agent de transfection / ADN en rapport 2:1 est formé. L’agent de transfection (et l’ADN correspondant au vecteur contenant une des séquences du FXa muté sont préparés dans du milieu OptiMEM (Invitrogen) de la façon suivante:
- Ajout de 1 pg d'ADN dans 50 μΐ d'OptiMEM (pour 106 cellules volumes à multiplier en conséquence)
- Ajout de 1,3 μΐ de Freestyle Max Reagent pour 106 cellules dans 50 μΐ d'OptiMEM (pour 106 cellules volumes à multiplier en conséquence).
Ces deux préparations sont incubées séparément pendant 5 minutes à température ambiante puis la solution contenant l'agent de transfection est ajoutée à celle contenant l'ADN. Le mélange est incubé pendant 25 minutes à température ambiante avant d'être ajouté aux 200 ml de cellules S2. Les cellules sont alors incubées à 27°C.
Un vecteur exprimant la GFP (Green Fluorescent Protein ; témoin positif de transfection) est également transfecté dans les mêmes conditions. L'efficacité de transfection est déterminée 24h post-transfection par microscopie à fluorescence en établissant le rapport du nombre de cellules exprimant la GFP sur le nombre total de cellules. Les cellules sont maintenues en culture durant 6 jours. Le 7eme jour, les cellules sont centrifugées à 3000g pendant 15 minutes. Le culot cellulaire est éliminé et le surnageant cellulaire contenant le FXa muté est utilisé le jour même ou congelé à -20°C. Les surnageants sont filtrés en 0,22 pm.
Visualisation des protéines suivant une séparation en SDS-PAGE
Pour chaque gel au moins un témoin de masse moléculaire approprié est utilisé. Une quantité identique de protéine à détecter est ensuite chargée dans chaque puits en tampon de charge 6X concentré (Tris HCl IM pH 6,8; 20% SDS; 20% glycérol ; 0,1% bleu bromophénol). Les échantillons réduits sont traités par du tampon de charge en présence de 100 mM dithithreitol. Le tampon de migration (Biorad) est utilisé pour la migration. Les échantillons sont laissés à migrer à 30mA durant 40 minutes dans un gel Stain free any kDa (Biorad).
Lorsque l'électrophorèse est terminée, les protéines séparées sur le gel sont détectées après activation des tryptophanes aux UV (protocole Stain-Free, Biorad) en utilisant un Imageur Chemidoc XRS+(Biorad).
Exemple 2 : Mesure de l’activité chromogénique du FXa
Les mesures de l’activité du FXa et FXa muté ont été étudiées à 37°C dans le tampon FXa (18 mM Hepes pH 7,35 135 mM NaCl, 1% BSA, 2,5 mM CaCh). L’activité chromogénique du FXa à 4 microg/ml a été suivie dans le temps par la mesure de l’hydrolyse du substrat chromogénique PNAPEP1015 (0,5 mM final) à 405 nm. L’insert est un zoom sur l’activité du mutant et le bruit de fond de l’expérience (blanc).
Résultats (voir FIG.1) : on observe en FIG.1 l’absence d’hydrolyse du substrat chromogénique PNAPEP 1025 par le GD-FXa muté, comme on pouvait s’y attendre. Les valeurs d’absorbance observées sont identiques au bruit de fond de l’expérience.
Exemple 3 : Comparaison de la liaison du FXa muté et d’un FXa natif dépourvu de domaine Gla (« GD-FXa ») sur le TFPI par SPR (Biacore)
Le TFPI recombinant (produit en cellules S2 de drosophile) a été immobilisé sur une sensorchip CM5 (GE Healthcare) et des concentrations variables de FXa muté ou de FXa natif dépourvu de domaine Gla disponible dans le commerce («WT GD-FXa ») (0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 16 nM) ont été injectées sur la surface de TFPI. Les constantes cinétiques d’association et de dissociation sont calculées à l’aide du logiciel Biaeval (GE Healthcare) et présentées dans le Tableau 2 suivant :
Tableau 2
| k3 (mV) | kd (s1) | KD = kd/k3 (M) | |
| WT GD-FXa (Cryopep) | 3,81E+05 +/- 5,33E+04 | 5,32E-04 +/- l,18E-04 | l,05E-09 +/- l,13E-10 |
| FXa muté (S2) | 3,06E+05 +/- 6,32E+04 | 5,44E-04 +/- 1,47 E-05 | l,84E-9 +/- l,76E-10 |
On observe dans le tableau 2 ci-dessus que les données cinétiques obtenues par SPR sont très proches entre le FXa muté et le FXa natif dépourvu de domaine Gla («WT GD-FXa »). En conclusion, le FXa muté se lie au TFPI de façon similaire au FXa natif.
Exemple 4 :Mesure de génération de thrombine du FXa muté :
Le fluorimètre CAT (Stago), tous les réactifs après reconstitution et les échantillons sont préchauffés à 37°C. Les réactifs 1 pM FT/8 μΜ PL (PPP-reagent low, Stago, concentration finale) seront utilisés comme inducteurs de la réaction. Le réactif « Thrombin Calibrator » (Diagnostica Stago) est utilisé systématiquement comme contrôle des essais. Chaque échantillon à tester est dilué dans 80 μΐ de plasma déficient en Facteur VIII (Stago) en présence de 20 μΐ du mélange FT/PL. Le substrat fluorogénique (20 pL ; FluCa Kit (Diagnostica Stago) est alors ajouté et l’apparition de thrombine est suivie par une excitation à 390 nm et une émission à 460 nm durant 60 min. Les résultats sont ensuite analysés grâce au logiciel Thrombinoscope (Stago, Asnières, France).
Le FXa muté est ajouté aux concentrations finales indiquées sur du plasma déficient en
Facteur VIII (Stago). Les points sont réalisés en triplicats. Le contrôle positif est le plasma déficient supplémenté par le réactif Factane (Facteur VIII obtenu à partir du plasma (LFB SA) ramené à sa valeur plasmatique normale (lU/ml). Le contrôle négatif est le plasma déficient non supplémenté.
Résultats (voir Fig.2) : le FXa muté est capable de restaurer la génération de thrombine sur un plasma déficient en facteur VIII. L’utilisation de plusieurs concentrations de FXa muté (10, 20 et 50 nM) permet de mettre en évidence une relation dose-réponse. A noter que les résultats sont identiques à ceux obtenus avec le FXa natif dépourvu de domaine Gla disponible dans le commerce («WT GD-FXa »).
Claims (7)
- REVENDICATIONS1. Facteur Xa (FXa) muté, dépourvu de domaine Gla, non thrombogène, capable de se lier à l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI) et comprenant une mutation de son site actif sélectionnée dans le groupe constitué d’une mutation de l’histidine, de l’acide aspartique ou de la sérine de la triade catalytique ou d’une combinaison de celles-ci - pour l'utilisation dans la prévention ou le traitement d'un accident hémorragique chez un patient atteint d'hémophilie A ou B.
- 2. FXa muté pour l’utilisation selon la revendication 1, dans lequel ladite mutation de son site actif est une mutation par substitution de l’acide aspartique de la triade catalytique en asparagine.
- 3. FXa muté pour l’utilisation selon la revendication 1, dans lequel ladite mutation de son site actif est une mutation par substitution de la sérine de la triade catalytique en alanine.
- 4. FXa muté pour futilisation selon la revendication 1 dans lequel ledit FXa muté est représenté par la SEQ ID No. 7 ou la SEQ ID No. 8.
- 5. FXa muté pour l’utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes, chez un patient hémophile présentant des anticorps anti-facteur VIII (FVIII) ou facteur IX (FIX).
- 6. Composition pharmaceutique comprenant le FXa muté pour l’utilisation selon l’une quelconque des revendications précédentes.
- 7. procédé de purification du FXa muté selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 comprenant les étapes suivantes :a. Purification du FXa muté sur colonne d’échange de cations ;b. ajout d’un tag, de préférence HPC4, en C-terminal du FXa muté ; etC. purification sur une colonne d’anticorps monoclonal anti-HPC4 en présence de Calcium.1/1600 -Blanc GD-FXaS195A Facteur Xa-100
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1753060A FR3064917A1 (fr) | 2017-04-07 | 2017-04-07 | Facteur x mute |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1753060A FR3064917A1 (fr) | 2017-04-07 | 2017-04-07 | Facteur x mute |
| FR1753060 | 2017-04-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR3064917A1 true FR3064917A1 (fr) | 2018-10-12 |
Family
ID=60138414
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR1753060A Pending FR3064917A1 (fr) | 2017-04-07 | 2017-04-07 | Facteur x mute |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR3064917A1 (fr) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100255000A1 (en) * | 2007-09-28 | 2010-10-07 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
| WO2012117203A1 (fr) * | 2011-03-01 | 2012-09-07 | Universite Joseph Fourier (Grenoble 1) | Facteur xa depourvu de domaine gla pour le traitement des hemophilies a ou b avec ou sans inhibiteur |
| WO2013123087A1 (fr) * | 2012-02-14 | 2013-08-22 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Procédé de fabrication d'antidote recombinant à inhibiteur du facteur xa |
| WO2014116275A1 (fr) * | 2013-01-24 | 2014-07-31 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Inhibition d'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire à l'aide de dérivés de facteur xa |
| WO2014202916A1 (fr) * | 2013-06-21 | 2014-12-24 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Facteur x depourvu de domaine gla |
-
2017
- 2017-04-07 FR FR1753060A patent/FR3064917A1/fr active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100255000A1 (en) * | 2007-09-28 | 2010-10-07 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
| WO2012117203A1 (fr) * | 2011-03-01 | 2012-09-07 | Universite Joseph Fourier (Grenoble 1) | Facteur xa depourvu de domaine gla pour le traitement des hemophilies a ou b avec ou sans inhibiteur |
| WO2013123087A1 (fr) * | 2012-02-14 | 2013-08-22 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Procédé de fabrication d'antidote recombinant à inhibiteur du facteur xa |
| WO2014116275A1 (fr) * | 2013-01-24 | 2014-07-31 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Inhibition d'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire à l'aide de dérivés de facteur xa |
| WO2014202916A1 (fr) * | 2013-06-21 | 2014-12-24 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies | Facteur x depourvu de domaine gla |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CONNOLLY STUART J ET AL: "Andexanet Alfa for Acute Major Bleeding Associated with Factor Xa Inhibitors", NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE, vol. 375, no. 12, September 2016 (2016-09-01), pages 1131 - 1141, XP029856644 * |
| ERSAYIN A ET AL: "A modified FXa as a TFPI trap: structure-function relationships", FEBS JOURNAL, vol. 283, no. Suppl. 1, Sp. Iss. SI, September 2016 (2016-09-01), & 41ST CONGRESS OF THE FEDERATION-OF-EUROPEAN-BIOCHEMICAL-SOCIETIES (FEBS) ON MOLECULAR AND SYSTEMS BIOLOGY FOR A BETTER LIFE; KUSADASI, TURKEY; SEPTEMBER 03 -08, 2016, pages 228, XP055449768 * |
| ERSAYIN ATANUR ET AL: "Catalytically inactive Gla-domainless factor Xa binds to TFPI and restores ex vivocoagulation in hemophilia plasma.", HAEMATOLOGICA DEC 2017, vol. 102, no. 12, December 2017 (2017-12-01), pages e483 - e485, XP055449762, ISSN: 1592-8721 * |
| MARLU RAPHAEL ET AL: "Gla-domainless factor Xa: molecular bait to bypass a blocked tenase complex", HAEMATOLOGICA-THE HEMATOLOGY JOURNAL, vol. 97, no. 8, August 2012 (2012-08-01), pages 1165 - 1172, XP055026544 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2828789C (fr) | Facteur xa depourvu de domaine gla pour le traitement des hemophilies a ou b avec ou sans inhibiteur | |
| US20210000930A1 (en) | Compositions and methods for counteracting factor xa inhibition | |
| CN102325880B (zh) | 丝氨酸蛋白酶衍生物及其在凝血功能障碍的预防或治疗中的用途 | |
| FR2831170A1 (fr) | Proteines c modifiees activables directement par la thrombine | |
| Gailani | Gene Targeting in Hemostasis, Factor XI | |
| JP2019050819A (ja) | 第ｘ因子変異体 | |
| FR2841904A1 (fr) | Analogues de facteurs x clivables par la thrombine | |
| FR2889534A1 (fr) | Anticorps anti-idiotypique neutralisant l'activite inhibitrice d'un anticorps inhibiteur du facteur viii | |
| ESMON et al. | zyxwvutsrqponm | |
| WO2002100337A2 (fr) | Variantes antithrombotiques de la thrombine | |
| Louvain-Quintard et al. | Thrombin-activable factor X re-establishes an intrinsic amplification in tenase-deficient plasmas | |
| FR3064917A1 (fr) | Facteur x mute | |
| EP2123670B1 (fr) | Polypeptide anticoagulant | |
| EP3010533B1 (fr) | Facteur x depourvu de domaine gla | |
| CA2678190C (fr) | Nouveaux facteurs viii pour le traitement des hemophiles de type a | |
| FR3069540B1 (fr) | Proteine modifiee avec demi-vie amelioree | |
| EP0424498B1 (fr) | Procede de preparation de la proteine c activee | |
| Juang | Novel mechanisms and strategies to modulate blood coagulation: the roles of coagulation factor XII and fibrinogen | |
| Monteiro et al. | Hematophagy and inhibition of the extrinsic and intrinsic tenase complexes | |
| Tchaikovsky et al. | Dawn: for two part chorus of women's voices: op. 46, no. 6 P. Tschaikowsky; poem by J. Surikow; English version by Kurt Schindler. | |
| DeAngelis | The Mechanisms for Catalytic Inactivation of FVIIIa by APC and Factor Xa |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PLSC | Publication of the preliminary search report |
Effective date: 20181012 |