KR20140033010A - 저해인자를 수반하거나 수반하지 않는 a형 또는 b형 혈우병을 치료하기 위한 ｇｌａ-도메인이 결여된 인자 ｘａ - Google Patents

Abstract

본 발명은, 저해인자를 수반하거나 수반하지 않는 A형 또는 B형 혈우병 환자에서 출혈을 예방 또는 치료하기 위한, 변형된 Xa 인자 (GDXa)를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로서, 상기 변형된 GDXa는 혈전을 형성하지 않으며(non-thrombogenic), TFPI에는 결합할 수 있지만 인지질에는 결합하지 못한다.

Description

저해인자를 수반하거나 수반하지 않는 A형 또는 B형 혈우병을 치료하기 위한 ＧＬＡ-도메인이 결여된 인자 ＸＡ{GLA-DOMAINLESS FACTOR XA FOR TREATING HAEMOPHILIA A OR B WITH OR WITHOUT INHIBITOR}

본 발명은 변형된 인자 X를 이용해 A형 또는 B형 혈우병 환자에서 출혈을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

B형 혈우병과 마찬가지로 A형 혈우병도 2가지 유형의 혈우병, 즉 체질성 혈우병 및 후천성 혈우병을 포함한다.

A형 체질성 혈우병은 FVIII 유전자의 이상 (abnormality)으로 인한 FVIII의 양적 또는 질적 결함을 특징으로 하는 출혈성 질환이다. B형 체질성 혈우병 또한 출혈성 질환이지만, 이는 FIX 유전자의 이상으로 인한 FIX의 양적 또는 질적 결함을 특징으로 한다.

A형 또는 B형의 후천성 혈우병은 상기 FVIII 또는 FIX에 대한 자가항체의 출현에 의해 규정된다.

혈우병은 출혈에 대해 혈액 응고가 잘 되지 않는 것이다. 치료를 받지 않은 A형 또는 B 혈우병 환자들은 다칠 경우 과다 출혈 및 때로는 심지어 자발적인 출혈과 같은 증상을 겪게 된다.

인자 VIII 또는 IX의 생물학적 활성은 정상 수준에 대한 백분율로서 평가된다. 정상 개체는 100%의 활성을 가지는 것으로 간주한다. 상기 활성이 검출불가능한 경우 (1% 미만), 중증 혈우병이며, 상기 활성이 1% 내지 5%일 경우, 상기 혈우병은 중등도 (moderate)이며; 5% 이상 30% 이하일 경도 혈우병이다.

A형 및 B형 혈우병 환자는 FVIII 또는 FIX를 각각 포함하는, 유전자 조작 산물 또는 혈장 유도체일 수 있는 농축물로 치료할 수 있다. 이들 농축물은 각 출혈 발생 시 투여할 수 있으며, 이 경우 처음 증상이 나타났을 때 가능한 한 신속하게 치료를 시작하는 것이 바람직하다. 치료는 또한, 예방차원에서 일주일에 2회 내지 3회 정기적으로 시술하여, 출혈을 예방할 수 있다. 그러나, 이러한 치료는 저해인자로 지칭되는 FVIII 또는 FIX에 대한 항체의 출현을 야기할 수 있다. 상기 항체가 존재하게 되면, 인자 VIII 또는 IX의 투여를 무력하게 한다. 이들 항체는 G형 면역글로불린으로, 대개는 IgG4이다. 이들은 최초 투여 직후, 대개는 10차 투여 전에 생성된다. 일부 환자들은 반응 불량인 상태를 유지하지만 (항체 역가 < 10 BU), 강력한 반응자로 지칭되는 다른 환자들은 더 이상 해당 인자를 이용한 치료를 받을 수 없음을 의미하는 역가에 도달하기도 한다.

본 발명의 시점에, 저해인자를 가진 A형 또는 B형 혈우병 환자들을 출혈 위험의 존재로부터 만족할만한 수준으로 예방 및/또는 치료할 수 있는 어떠한 치료법도 존재하지 않는다. 사실상, 이용가능한 제품은 효력이 없을 수 있거나 (Astermark J, Donfield SM, DiMichele DM, Gringeri A, Gilbert SA, Waters J, Berntorp E, for the FSG. A randomized comparison of bypassing agents in hemophilia complicated by an inhibitor: the FEIBA NovoSeven Comparative (FENOC) Study. Blood. 2007; 109: 546-51) 또는 이의 투여로 혈전 현상들에 의한 합병증이 발생할 수 있다 (Aledort LM. Comparative thrombotic event incidence after infusion of recombinant factor VIIa versus factor VIII inhibitor bypass activity. J Thromb Haemost. 2004; 2: 1709.).

즉, 기존의 치료법에 대한 치료적 대안의 필요성은 인지하고 있다. 그러나, 이러한 치료법의 개발은 하기와 같은 이유로 매우 어려운 것으로 판명되었다:

- 출혈을 중지시킬 수 있어야 함,

- 혈전증을 야기하지 않아야 함,

- 항-FVIII 항체 또는 항-FIX 항체가 존재하더라도 출혈을 치료 또는 예방할 수 있어야 함.

본 발명은 이러한 요구에 대한 답을 제시하는데; 본 발명은 A형 또는 B형 혈우병 환자에서 출혈을 예방 또는 치료하기 위한, 변형된 활성화된 인자 X (FXa)를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로서, 상기 변형된 FXa (GDXa)는 혈전을 만들지 않으며 (nonthrombogenic), 조직 인자 경로 저해인자 (tissue factor pathway inhibitor; TFPI)에 결합할 순 있지만 인지질 결합 부위를 가지진 않는다.

본 발명에 따른 조성물은 항-인자 VIII (FVIII) 항체 또는 항-인자 IX (FIX) 항체를 나타내는 혈우병 환자에서 출혈을 예방 또는 치료하는 데 사용할 수도 있다. 상기 항체는 인자 FVIII 또는 FIX로 치료한 이후에 또는 후천성 혈우병에서와 같이 자발적으로 나타난다.

본 발명은 또한, A형 또는 B형 혈우병 환자에서 출혈의 예방 또는 치료용 의약품을 제조하기 위한, 변형된 인자 Xa (GDXa)를 포함하는 약학 조성물의 용도에 관한 것으로서, 상기 환자는 항-FVIII 항체 또는 항-FIX 항체를 가지거나 또는 가지지 않는다.

본 발명은 또한, 변형된 인자 Xa (GDXa)를 투여함으로써, A형 또는 B형 혈우병 환자에서 출혈성 증후군을 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 변형된 인자 Xa (GDXa)를 투여함으로써, A형 또는 B형 혈우병 환자에서 출혈을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 맥락에서, 인자 FXa는, 혈장에 천연적으로 존재하거나 또는 본래의 비변형된 형태로 분리된 상태로 존재하는 천연 인자 X의 활성화에 의해 수득되는 활성화된 인자 X를 지칭한다. 용어는, 혈장으로부터 분리된 FX들 뿐만 아니라 재조합에 의해 생산되거나 또는 활성화된 화학적 합성에 의해 수득되는 FX들을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 인자 Xa 또는 천연 인자 Xa (FXa)는 응고에 참여하며 불활성 형태인 인자 X (FX)로 생성하는 세린 프로테아제계 단백질을 지칭한다.

응고 인자 X의 활성화는 혈액 응고 및 출혈의 중지에 있어서 중요한 단계이다. 이의 활성화는 응고의 전파 및 증폭 단계에 필수적이다. 이의 활성화는 또한, TFPI와의 상호작용을 통한 응고의 활성화를 중지하는 데에도 필수적이다.

FX는 활성화된 인자 IX 및 이의 보조인자인 활성화된 인자 VIII, 또는 활성화된 인자 VII 및 이의 보조인자인 조직 인자 (TF)에 의해 활성화된다. FXa는 활성화된 인자 V와 함께 막에 결합된 프로트롬비나제 복합체 (complex prothrombinase)를 형성하며, 상기 프로트롬비나제 복합체의 활성 성분으로, 프로트롬빈의 트롬빈으로의 변환을 촉매한다. 즉, 트롬빈은 피브리노겐의 피브린으로의 변환을 촉매하여, 혈중 혈전 생성과 출혈 중지를 야기한다. 이러한 FXa 활성을 "응혈원 활성 (procoagulant activity)"이라 칭할 수 있다.

Leytus 등 (Biochemistry, 1986, 25: 5098-5102) 및 Venkateswarlu 등 (Biophysical Journal, 2002, 82: 1190-1206)은, 이러한 폴리펩타이드에 존재하는 여러 가지 도메인들과 인자 X를 기술하고 있다. 중쇄의 촉매적 절단으로 FX를 FXa로 활성화할 수 있다. FXa는 경쇄 (이의 예는 서열 식별자 (sequence identifier)에 의해 서열 번호 1로 표시됨)와 중쇄 (이의 예는 서열 식별자에 의해 서열 번호 2로 표시됨)를 포함한다.

본 발명의 맥락에서, 변형된 FXa라는 용어는 더 이상 인지질에 결합할 수 없으며, 더 이상 응혈원 활성을 가지지 않거나 또는 응혈원 활성이 감소된 FXa를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 이러한 인자를 GDXa라고 한다. "응혈원 활성"은 혈액 응고 또는 응혈 형성을 야기하는, 인자의 능력으로서 정의된다. 응혈원 활성 감소는, 상기 활성이 천연 FXa의 활성에 비해 50% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상 감소된 것을 의미한다.

본 발명에 따른 변형된 인자 Xa인 GDXa는, 인지질과 결합하기 위한 γ-카르복시글루탐산 (Gla) 도메인이 결여되어 있다. 경쇄의 처음 43개 아미노산 (서열 번호 1의 잔기 1-43)은, 번역후 변형된 잔기 11개 (γ-카르복시글루탐산)를 포함하므로 Gla 도메인이다. 키모트립신으로 절단하면, 상기 잔기 1-43을 억제할 수 있게 되어, 인지질과 결합하는 도메인이 결여된 FXa 또는 GDXa (Gla 도메인이 결여된 FXa)를 제조할 수 있다. 상기 GDXa는 또한, 이의 Gla 도메인의 부재 외에도 다른 변형들을 포함할 수 있다. 상기 변형된 FXa는 인자 Va과 결합하는 특성은 보존하고 있지만 응혈원 활성은 가지지 않는다. GDXa에 대한 예로, 서열 식별자 경쇄는 서열 번호 7 또는 서열 번호 3으로, 이의 중쇄는 서열 번호 2로 표시된다. 상기 응혈원 활성의 부재는, 조직 인자의 부재 하에 혈장에 첨가하였을 때 응고를 활성화하지 못하는 능력으로 규명될 수 있으며, 이는 천연 인자 Xa와 구별된다.

GDXa는 키모트립신에 의해 조절되는 단백분해에 의한 인자 X의 절단, 및 Skogen 등 (1984)에 의해 기술된 것과 같은 통상의 방법들 중 한가지 방법에 따른 특이적인 프로테아제에 의한 활성화에 의해 수득할 수 있다. 활성화하기 전의, GDX에 대한 예는 서열 식별자에 의해, 이의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 20, 및 이의 아미노산 서열은 서열 번호 28로 표시할 수 있다.

GDXa는 단일 서열 형태, 또는 나중에 함께 결합되는 여러 개의 서열 형태로, 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 합성은 고상 또는 액상에서 수행될 수 있다. 이들 기술은 보다 특히 Atherton and Shepard in "Solid phase peptide synthesis" (IRL Press Oxford, 1989) 및 Houbenweyl (in "Methoden der organischen Chemie" [Methods in Organic Chemistry] published by E.Wunsch Vol. 15-1 and 11, Stuttgart, 1974), 뿐만 아니라 하기 논문들: P. E. Dawson et al. (Science 1994; 266(5186), pp776-779); G G Kochendoerfer et al. (1999; 3(6), pp 665-671); P E Dawson et al. (2000, 69, Annu. Rev. Biochem., pp 923-960)에 기술되어 있다.

GDXa는 비응혈성이며; 이의 응혈원 활성의 부재는 트롬빈 생성을 측정하는 분석법에 의해 확인될 수 있다 (Hemker et al., Thrombosis and Haemostasis. 1993; 70: 617-624, cf. example 4).

TFPI에 대한 GDXa의 결합력은 당해 기술분야의 당업자에게 잘 공지된 분석법을 이용해 확인한다. 이러한 분석법은 TFPI에 의한 FXa 및 GDXa의 저해 백분율을 측정할 수 있는 발색 기질을 이용하며 실시예 1에 기술되어 있다.

본 발명의 다른 측면에서, GDXa는 Gla 도메인 뿐만 아니라 도메인 EGF1 (표피 성장 인자 1)도 결여되어 있다. 본 발명의 이러한 예는 경쇄가 서열 번호 4이고 중쇄가 서열 번호 2인 GDXa를 포함하는 조성물일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, GDXa는 Gla 도메인 뿐만 아니라 도메인 EGF2 (표피 성장 인자 2)도 결여되어 있으며; 이러한 GDXa의 예는 서열 식별자에 의해 이의 경쇄가 서열 번호 5로 이의 중쇄가 서열 번호 2로 표시된다.

본 발명의 다른 측면에서, GDXa는 Gla 도메인 뿐만 아니라 도메인 EGF1 및 EGF2도 결여되어 있으며; 이러한 GDXa의 예는 서열 식별자에 의해 이의 경쇄가 서열 번호 6으로 이의 중쇄가 서열 번호 2로 표시된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, GDXa는 FXa의 중쇄로만 이루어져 있다. 본 발명의 특정 실시 양태에 따르면, 이러한 FXa는 서열 식별자에 의해 서열 번호 2로 표시된다.

또 다른 측면에서, GDXa는 돌연변이된 분자 변이체들로 이루어진다. 따라서, 트롬빈 생성 활성은 유지시킬 수 있고 돌연변이체의 소형 (small) 펩타이드 기질에 대한 효소 활성을 감소시키는 여러 가지 돌연변이가 GDXa를 코딩하는 유전자에 도입되었다. 이들 돌연변이는 QuickChange 키트 (Stratagene)를 사용해 제조업체의 권장 프로토콜과 공개문헌 Wang & Malcolm (1999) - BioTechniques, 26: 680-682에 따라 도입할 수 있다. 이들 돌연변이는, 임의의 다른 아미노산, 바람직하게는 페닐알라닌 (예를 들어 서열 번호 10), 글리신 (예를 들어 서열 번호 11), 이소루신 (예를 들어 서열 번호 12) 또는 티로신 (예를 들어 서열 번호 13)으로 돌연변이될 수 있는, GDXa 중쇄 (서열 번호 2에 따라 넘버링됨)의 142번 아르기닌에 관한 것일 수 있다. 이러한 돌연변이는 인간 FXa의 펩타이드 서열: Arg-Gln-Ser-Thr-Arg-Leu (중쇄의 139-143)을 소(bovine) FXa에서 수득되는 대응 서열: Arg-Leu-Ser-Ser-Thr-Leu (예를 들어 서열 번호 26)로 치환하는 것에 관한 것일 수 있다. 유사하게는, 중쇄 (서열 번호 2에 따라 넘버링됨)의 82번 라이신이 또한, 티로신 (예를 들어 서열 번호 9)과 같은 아미노산으로 치환될 수 있다.

GDXa를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 화학적으로 합성할 수 있다 (Young L and Dong Q., 2004, Nucleic Acids Res., Apr 15; 32(7), Hoover, D.M. and Lubkowski, J. 2002. Nucleic Acids Res., 30, Villalobos A, et al., 2006. BMC Bioinformatics, Jun 6; 7: 285). GDXa를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한, 적절한 프라이머를 사용한 PCR로 증폭시킬 수 있다.

GDXA는 또한, 당해 기술분야의 당업자에게 잘 공지되어 있는 유전자 조작 기법으로 제조할 수 있다. 즉, 인간 인자 X를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터에 클로닝할 수 있으며; 신호 펩타이드, 프로펩타이드 및 도메인 Gla를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 부분을 제거하고, TIMP-1과 같은 신호 펩타이드는 융합시킨다 (Crombez et al., 2005). 그렇게 해서 생성된 변형된 인자 X는, TF-FVIIa 복합체나, 또는 234번 아르기닌과 235번 이소루신 (Swiss-Prot: P00742.2에 따른 넘버링) 간의 결합을 절단하는 다른 효소에 의해 활성화될 수 있다. 다른 예로, GDXa는 푸린(furin) 또는 세포내 다른 효소에 의해 인지되는 절단 서열을 235번 이소루신의 바로 위에 삽입함으로써 직접 만들거나; 아르기닌-라이신-아르기닌과 같은 이들 아미노산을 코딩하는 서열을 푸린으로 절단할 수 있다 (Nakayama et al., 1997). 절단을 개선하기 위해, 아르기닌-라이신-아르기닌-아르기닌-라이신-아르기닌 서열을 도입할 수 있다. 상기 변형된 FX를 코딩하는 DNA를 발현 플라스미드에 삽입하여, 이의 생산을 위한 ad hoc 세포주 (예를 들어 HEK-393E 세포주)에 삽입하며, 생산된 단백질을 크로마토그래피로 정제한다.

이들 기술은 참조 문헌인 Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition- Sambrook and Russel eds., (2001) 및 Current Protocols in Molecular Biology - Ausubel et al. eds (2007)에 상세히 기술되어 있다.

따라서, GDXa는 또한, 전술한 GDXa를 코딩하는 이들의 뉴클레오티드 서열로 표시될 수 있으며, 이러한 서열은 하기 서열 식별자로 표시된다: 경쇄는 서열 번호 8, 서열 번호 16 내지 서열 번호 19, 및 중쇄는 서열 번호 15 또는 서열 번호 21 내지 25 및 서열 번호 27임.

이러한 유형의 변형된 인자는 선행 기술에 잘 공지되어 있다 (Morita and Jackson, 1986; Skogen et al., 1984, Padmanabhan et al., 1993. J. Mol. Biol., 232: 947-966 또는 US2009/2298119).

본 발명에 따른 약학 조성물은 이의 투여에 필요한 투약 형태(dosage form)로 제형될 수 있다. 특히, 전신 투여의 경우, 본 발명에 따른 조성물은 멸균 동결건조된 주사용 분말 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 또한 코로 또는 비경구로 투여할 수 있다. 따라서, 이들은 활성 성분 외에도, 당해 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며 약학 조성물을 원하는 형태로 제조하는 데 필요한 임의의 약학적으로 허용가능한 제형 첨가제, 및 특히 이를 이후에 주사하기 위해 수계 용액으로 재구성한 후 동결건조된 단백질 GDXa를 안정화시킬 수 있는 임의의 부형제를 포함할 수 있다.

출혈이 발생한 경우, 본 발명에 따른 약학 조성물은 재조합 FVIIa (Novoseven^®)보다 10배 내지 20배 낮은 농도로 투여할 수 있으며, 약량학에 따라 1회 투여 당 90 ㎍/㎏ 내지 270 ㎍/㎏의 범위로 투여한다. 따라서, 다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한, 저해인자가 존재하거나 존재하지 않는 A형 또는 B형 혈우병 환자에게 1회 투여 당 4.5 ㎍/㎏ 내지 27 ㎍/㎏으로 투여하기 위한, TFPI에는 결합할 수 있지만 인지질에는 결합하지 못하는, 비응혈성 GDXa를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 투여는 전신, 코 또는 비경구 경로에 의해 수행할 수 있다.

도 1: 트롬빈의 생성에 대한, GDXa 또는 FXa의 영향
(A) 정상 혈장의 풀 (pool) (실선) 및 중증 A형 혈우병의 혈장 풀 (점선)에 인지질 및 TF가 존재하는 경우, 트롬빈 생성 테스트. (B) 인지질 및 TF의 존재 하 (실선) 및 TF의 부재 하에 (점선), GDXa (50 nM)가 첨가된 혈우병 환자의 혈장. (C) TF가 있는 (실선) 및 TF가 없는 경우 (점선), 인지질의 존재 하에 FXa (50 nM)가 첨가된 혈우병 환자의 혈장. (D) GDXa에 의한 기질 ZGGR-AMC의 절단. 레피루딘 (lepirudin)의 부재 (Ctrl-곡선 A), GDXa의 부재 하에 레피루딘 6 pg/ml의 존재 (곡선 B), 또는 여러 가지 농도의 GDXa의 존재 하에 레피루딘 6 pg/ml의 존재 (곡선 C 내지 E) 하에, 인지질 및 TF의 존재 하에 시험된, CTI-전처리된 정상 혈장. (E) GDXa 10 nM (실선) 또는 20　nM (점선)이 첨가된 혈우병 환자의 혈장에서 인지질 및 TF의 존재 하에 트롬빈의 생성, 및 (F) rFVIIa 40 nM (실선) 또는 200　nM (점선)이 첨가된 혈우병 환자의 혈장에서 인지질 및 TF의 존재 하에 트롬빈의 생성.
데이터는 서로 다른 중증 A형 혈우병 환자에서 수득한 3가지 이상의 서로 다른 혈장을 이용해 수행한 실험을 나타낸 것이다.
도 2: 혈우병 환자의 혈장에서의 트롬빈 생성에 대한, 항-AT 항체 및 항-TFPI 항체의 영향
서로 다른 농도의 항-인간 항트롬빈 항체 (A) 또는 항-인간 TFPI 항체 (B)를 중증 혈우병 환자의 혈장 A에 첨가한 다음, 트롬빈을 생성하도록 방치하였다. 항체 농도는 항-항트롬빈 항체의 경우 g/ℓ로, 항-TFPI 항체의 경우 ㎎/ℓ로 표현한다. GDXa의 농도는 nM로 나타낸다. HP는 혈우병 환자의 혈장을 지칭하며; NP는 정상 혈장을 지칭한다.
(A) 곡선 A는 혈우병 환자의 혈장을 나타내며, 곡선 B 내지 D는 서로 다른 농도의 항트롬빈 항체가 첨가된 혈우병 환자의 혈장을 나타내며; 곡선 E는 50 nM의 GDXa가 첨가된 혈우병 환자의 혈장의 혈장을 나타내며, 곡선 F는 정상 혈장을 나타낸다. (B) 곡선 A는 혈우병 환자의 혈장을 나타내며, 곡선 B 내지 D는 서로 다른 농도의 항-TFPI 항체가 첨가된 혈우병 환자의 혈장을 나타내며; 곡선 E는 50 nM의 GDXa가 첨가된 혈우병 환자의 혈장의 혈장을 나타내며, 곡선 F는 정상 혈장을 나타낸다.
도 3: TFPI 또는 항트롬빈에 의한 GDXa 및 FXa의 효소적 저해
(A-B) 항트롬빈에 의한 저해를 위해, 37℃에서 항트롬빈의 농도를 증가시키면서 (AT: 0 (곡선 A) 내지 500 nM (곡선 F)), 1.25 nM의 FXa (A) 또는 GDXa (B)를 첨가하였다. 서로 다른 시점에서 분취물을 취해 (0분 내지 90분), 발색 기질 PNAPEP 1025에 첨가하였다.
(C-D) TFPI에 의한 FXa (C) 또는 GDXa (D)의 활성의 저해를, TFPI의 농도를 증가시키면서 (GDXa의 경우 0 nM 내지 30 nM, 및 FXa의 경우 0 nM 내지 10 nM), 25℃에서 3시간 동안 완충액 A에서 0.25 nM의 효소를 인큐베이션함으로써 분석하였다.
데이터는 2가지 서로 다른 실험을 나타낸 것이다.
도 4: 혈장에서 GDXa 및 FXa의 약동학적 특성의 측정
50 nM FXa (A) 또는 GDXa (B)를 정상 혈장에 첨가하고, 전체를 37℃에서 인큐베이션하였다. 시간 간격을 다르게 해서 분취물을 취하고, 즉시 완충액 A에서 25배로 희석하여, 잔여 활성을 측정하였다. 반감기는 FXa의 경우 1.4 ± 0.1분이고, GDXa의 경우 1.8 ± 0.1분이었다.
데이터는 2가지 서로 다른 실험의 평균값이다.
도 5: rVIIa 및 GDXa에 의한 트롬빈 생성의 보정
혈우병 환자의 혈장 (HP, 곡선 B)에 서로 다른 농도의 GDXa (곡선 C 및 D) 또는 rVIIa (곡선 E 및 F)를 첨가. NP: 정상 혈장 (곡선 A).
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시될 것이다.

실시예 1: 재료 및 방법

재료:

정상 환자의 동결된 혈장 및 A형 혈우병 또는 B형 혈우병 환자의 개별 혈장의 풀, 인지질 TGT, Prionex, Corn Trypsin 저해인자 (CTI), 발색 기질 PNAPEP 1025, 인간 인자 Xa, 인간 GDXa, 및 양(sheep) 항-인간 트롬빈 항체를 Cryopep (Montpellier, France)에서 입수하였다. 인간 재조합 TFPI는 Sino Biolocal Inc. (Beijing, China)에서 입수하였다. 지질재처리된 (relipidized) 재조합 인간 조직 인자 (TF, Innovin)는 Siemens Healthcare Diagnostics (Puteaux, France) 사 제품이다. 트롬빈 생성 시험을 위해, Diagnostica Stago (Asnieres, France) 사의 트롬빈 캘리브레이터, FluCaKit 및 둥근바닥 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (Immulon 2HB, 바닥이 U-형인 플레이트)를 사용하였다. 효소 실험을 위해, 평판 96-웰 마이크로타이터 플레이트는 Greiner (Frickenhausen, Germany) 사 제품이었으며; 양 항-TFPI 항체는 Affinity Biologicals (Sandhill Drive, Canada) 사 제품이다. American Diagnostica (Stamford, USA) 사의 Actichrom TFPI 활성 분석법은 TFPI 활성을 측정하는 데 사용하였다. 항트롬빈 활성 분석법 (STA-Stachrom 항트롬빈 III)은 Diagnostica STAGO 사 제품이다. 효소 계산은 PRISM 5.0을 이용해 수행하였다.

방법

1) 트롬빈 생성 분석법 ( TGA )

응고를 활성화하기 위한 조직 인자 (TF) 1 pM, 및 인큐베이션 동안 응고의 접촉상 (contact phase)의 활성화를 저해하기 위한 CTI 30 ㎍/㎖의 존재 하에, 헴커 방법 (Hemker's method)에 의해 트롬빈 생성을 측정하였다 (van Veen JJ, Gatt A, Cooper PC, Kitchen S, Bowyer AE, Makris M. Corn trypsin inhibitor in fluorogenic thrombin-generation measurements is only necessary at low tissue factor concentrations and influences the relationship between factor VIII coagulant activity and thrombogram parameters. Blood Coagul Fibrinolysis. 2008 Apr; 19(3): 183-9). 간략하게는, TF 20 ㎕, 4 μM 인지질, 및 혈장 80 ㎕의 혼합물을 마이크로타이터 플레이트에 3웰 중복으로 파이펫팅하였다. 혈장 80 ㎕와 함께 트롬빈 캘리브레이터 20 ㎕를 또한, 파이펫을 이용해 상기 플레이트에 3웰 중복으로 첨가하였다. 그 후, 상기 플레이트를 390　nm로 설정된 여기 파장, 460　nm의 방출 파장 및 10　nm의 패스 밴드 (pass band)의 Varioskan (Thermofisher, Illkirch, France)에 넣었다. FluCaKit (0.1 M의 CaCl₂가 포함된 2.5 mM 형광 기질　(Z-Gly-Gly-Arg-AMC, ZGGR-AMC)) 20 ㎕를 모든 웰에 주입하여, 반응을 개시하였다. 형광 신호는 60분 동안 20초 마다 판독한다. 전술한 3-파 방법 (3-wave method)을 이용해 수학적으로 계산하기 위해 형광 강도에 대한 원 (raw) 데이터를 Sigmaplot^® 9.0으로 이출 (export)하였다 (De Smedt E. Advanced thrombinoscopy: PhD thesis, University Maastricht; 2007).

이하:

ETP는 내인성 트롬빈 퍼텐셜을 나타내며, 곡선 하 면적에 해당한다;

PH는 피크 높이를 나타내며, 피크 트롬빈 농도에 해당한다;

LT는 잠복 시간으로, 2 nM의 트롬빈에 도달하는데 걸리는 시간에 해당한다;

PT는 피크 시간으로, PH를 수득하는 데 걸리는 시간에 해당한다.

여러 가지 인자인 GDXa, Xa 또는 Novoseven^®은 1% Prionex, 18　mM HEPES, 135　mM 염화나트륨, pH 7.35를 포함하는 완충제 A에서 희석하며, 여러 가지 농도의 CTI로 전처리한 혈우병 환자의 혈장에 첨가한다.

2) 특이적 항체에 의한 항트롬빈 및 TFPI 의 중화

항트롬빈의 중화의 경우, 중증 A형 혈우병 혈장에 서로 다른 농도의 양 IgG 항-인간 항트롬빈 항체 (1.8 g/ℓ, 3 g/ℓ, 5 g/ℓ, 및 7.5　g/ℓ)를 첨가하고, 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, TGA를 시험하였다. 마찬가지로, 항트롬빈 활성은 항트롬빈 III STA-Stachrom 시약을 이용해 STAR 혈액응고측정기 (Diagnostica Stago)에서 측정하였다.

TFPI의 중화의 경우, 동일한 A형 혈우병 혈장을 서로 다른 농도의 양 항-인간 TFPI 면역글로불린 (2.5 ㎎/ℓ, 5 ㎎/ℓ, 10 ㎎/ℓ 및 50　㎎/ℓ)과 접촉시킨 후, TGA를 시험하였다. 마찬가지로, Actichrom TFPI 활성 분석법을 제조업체의 지시에 따라 이용하여 TFPI의 활성을 측정하였다. 간략하게는, 20배로 희석한 혈장 20 ㎕를 20 ㎕ TF/FVIIa의 존재 하에 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 인자 X (FX)를 첨가하고, 전체를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, EDTA 및 Spectrozyme FXa를 첨가하였다. 5분 후, 빙초산을 첨가하여 반응을 중지시키고, 405　nm에서 흡광도를 판독하였다.

3) 크로모겐의 측정

3.1) GDXa 및 Xa의 카이네틱 상수의 측정

GDXa 또는 FXa 활성의 측정을 위해, 0.3 nM의 효소를 1% Prionex, 18　mM HEPES, 135　mM 염화나트륨, pH 8.4를 포함하는 완충제에서 37℃에서 5분 동안 인큐베이션한다. 그 후, 발색 기질 PNAPEP 1025를 0.33 mM, 0.50 mM, 1 mM, 1.5 mM, 및 2.0　mM의 농도로 첨가하고, 405　nm에서 흡광도의 변화(variation)를 기록한다.

3.2) 항트롬빈 (AT)의 효소적 저해

Xa 또는 GDXa (1.25 nM)를 항트롬빈의 농도를 증가시키면서 (0 nM 내지 500 nM), 완충제 A에서 37℃에서 인큐베이션한다. 혼합물 중 200 ㎕의 분취물을 90분까지 시간 간격을 다르게 해서 취한다. 그 후, 50 ㎕의 발색 기질 PNAPEP 1025 - 6　mM을 첨가하고, 흡광도 변화를 기록한다.

3.3) TFPI의 효소적 저해

TFPI에 의한 GDXa 또는 FXa의 활성 저해는, 200 ㎕의 최종 부피에서 TFPI의 농도를 증가시키면서 (GDXa의 경우 0 nM 내지 30 nM, 및 FXa의 경우 0 nM 내지 10 nM), 25℃에서 3시간 동안 완충제 A에서 0.25 nM로 효소를 인큐베이션시켜서 분석하였다. 그 후, 50 ㎕의 발색 기질 PNAPEP 1025　2.5　mM을 첨가하고, 흡광도 변화를 기록하였다. Ki^*는 전술한 바와 같이 측정하였다 (Bunce MW, Toso R, Camire RM. Zymogen-like factor Xa variants restore thrombin generation and effectively bypass the intrinsic pathway in vitro. Blood. 2011 Jan 6; 117(1): 290-8; Baugh RJ, Broze GJ, Jr., Krishnaswamy S. Regulation of extrinsic pathway factor Xa formation by tissue factor pathway inhibitor. J Biol Chem. 1998; 273(8): 4378-86).

3.4) GDXa 및 Xa의 혈장 반감기 측정

GDXa 또는 Xa의 혈장 반감기는 정상 혈장에 50 nM의 GDXa 또는 Xa를 첨가함으로써 측정하였다. 그 후, 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하였다. 분취물을 0분 내지 60분에서 취하고, 즉시 완충제 A에서 25배 희석한 후, 발색 기질 PNAPEP 1025　1.5　mM을 첨가하고, 전술한 바와 같이 잔여 아미도분해 활성 (amidolytic activity)을 측정하였다

실시예 2: 변형된 인자 Xa 의 제조

플라스미드 pTT5를 HindIII - BamHI 효소를 이용한 절단에 의해 개방하고, HindIII 및 NheI 제한효소 부위가 있는 TIMP1의 신호 펩타이드, 및 NheI 및 BamHI 제한효소 부위가 있는 Gla 도메인이 결여된 FX를 코딩하는 유전자를 삽입하여, 플라스미드 pTT5-TIMX (pTT5 spTIMP1 gla less FX)를 생성하였다. NheI 및 BamHI 제한효소 부위가 있는 본 발명에 따른 Gla 도메인이 결여된 FX를 코딩하는 서열은 화학적 합성에 의해 수득하였다 (GenScript Corporation). 다음, 푸린 인지 부위를 중쇄의 N-말단 이소루신의 상류에 도입하여, 정제용 배양 배지에서 GDXa가 직접 분비되게 하였다. 생성된 GDXa는 서열 식별자에 의해 이의 경쇄가 서열 번호 3로 표시되고, 이의 중쇄가 서열 번호 2로 표시된다.

실시예 3: GDXa 및 FXa 의 카이네틱 파라미터의 측정

트롬빈 생성에 대한 GDXa의 효과를 분석하기 전에, 발색 기질 PNAPEP 1025의 절단을 이용해 GDXa 및 FXa를 특징지었다. GDXa는 FXa (K_m = 0.64 ± 0.03　mM)와 유사한 친화성 (K_m = 0.75 ± 0.05　mM) 및 유사한 촉매 특성을 나타내었다: GDXa의 경우 k_cat = 290 ± 5 s^-1, 및 FXa의 경우 k_cat = 375 ± 8 s^-1 (표 1). 이들 결과는 발색 기질 S2222를 이용해 수득한 이전의 관찰들과 일치한다 (Skogen WF, Esmon CT, Cox AC. Comparison of coagulation factor Xa and des-(1-44)factor Xa in the assembly of prothrombinase. J Biol Chem. 1984; 259(4): 2306-10).

			항트롬빈	TFPI
	Km (mM)	kcat (s-1)	k2 ± SD (10　3.M-1.s-1)	Ki* ± SD (nM)
Xa	0.65 ±	368 ±	1.50 ± 0.04	0.17 ± 0.031
GDXa	0.71 ±	269 ±	1.57 ± 0.08	0.31 ± 0.04

표 1: GDXa 및 FXa 의 효소 특성

나타낸 결과는, 발색 기질 PNAPEP 1025를 사용해 3개 중복으로 수행한 2가지 독립적인 측정들에 해당한다.

실시예 4: 트롬빈 생성에 대한, GDXa 또는 FXa 의 영향

1 pM의 농도에서, TF는 도 1A에서 점선으로 나타낸 바와 같이 중증 혈우병 환자의 혈장 A에서 트롬빈의 생성을 유도할 수 없다. 그러나, 50 pM GDXa의 존재 하에, 트롬빈 생성이 확실히 복구된 것이 관찰되었다 (도 1B). GDXa는 내인성 트롬빈 퍼텐셜 (ETP), 잠복 시간, 피크 높이, 및 피크 시간을 비롯하여 트롬빈 생성과 연관된 파라미터를 모두 정상화한다 (도 1B, 표 4). TF의 부재 하에서는 트롬빈이 생성되지 않았으므로, 관찰된 트롬빈 생성은 혈장에 대한 GDXa의 직접적인 효과가 아니었다 (도 1B, 점선). 이는, 시험한 혈우병 환자의 혈장 모두에서 관찰되었다. 아울러, GDXa와는 달리, FXa는 프로트롬빈을 트롬빈으로 직접 전환시킬 수 있기 때문에, TF의 부재하에서도 트롬빈 생성을 유도하였다 (도 1C).

GDXa에 의한 기질 ZGGR-AMC의 직접적인 절단으로 인해 발생할 수 있는 간섭을 정량화하기 위해, 포화량 (6 pg/ml)의 레피루딘 (트롬빈 저해인자)의 존재 하에, 효소를 그 양을 증가시키면서 첨가하였다. 도 1D에서 나타낸 바와 같이, 원 (raw) 형광 신호는 레피루딘의 존재 하에 완전히 사라졌다. 이들 조건에서, GDXa는 이의 농도에 비례하여 기질인 ZGGR-AMC를 절단하였다. 50 nM의 농도에서, 최종 신호는 레피루딘의 부재 하에 생성된 형광의 8%에 해당하였으며; 250 nM의 농도에서, 상기 신호는 총 형광의 약 40%를 나타내었다. 그러나, 상기 신호가 선형이기 때문에, 이는 트롬빈 농도의 곡선을 계산하는 데 사용된 3-파 방법에 α2-마크로글로불린-트롬빈 복합체의 신호에 수학적으로 포함되었으며, 트롬빈 생성의 결과에 영향을 미치지 않는다 (De Smedt E. Advanced thrombinoscopy: PhD thesis, University Maastricht; 2007).

중증 A형 혈우병 환자의 혈장에서 트롬빈 생성을 복구할 수 있는 GDXa의 최소량을 조사하였다. 20 nM 농도의 GDXa가 이 혈장에서 (도 1E), 정상 혈장에서 관찰된 것과 유사한 혈장 생성 곡선 (도 1A)을 제공하였다. 아울러, 10 nM GDXa는 200 nM의 rFVIIa의 존재 하에 수득된 것보다 약간 더 높은 신호를 생성하였다 (도 1F).

실시예 5: 트롬빈 생성에 대한, 항- 항트롬빈 항체 및 항- TFPI 항체의 효과

항-항트롬빈 항체는 카이네틱 파라미터에는 거의 영향을 미치지 않으면서 ETP를 크게 증가시킬 수 있다 (표 2 및 도 2A). 항-항트롬빈 항체 7.5　g/ℓ(잔여 항트롬빈 활성 9%)에서, ETP는 2716 nM.min으로 상승하였고, PH는 76 nM에 도달하였다. 이는 카이네틱 파라미터에 대한 효과와 대조된다 (LT = 6.6 분, PT = 31.3 분). 아울러, Erhardtsen 등 (Blocking of tissue factor pathway inhibitor (TFPI) shortens the bleeding time in rabbits with antibody induced hemophilia A. Blood Coagul Fibrinolysis. 1995; 6(5): 388-94)에서 전술한 바와 같이, 항-TFPI 항체는 또한 혈우병 환자의 혈장에서 응고를 복구할 수 있었다. 10　㎎/ℓ 이상의 농도의 항-TFPI 항체 (잔여 TFPI 활성 <30%)에서, 모든 TGA 파라미터는 이 혈우병 혈장에서 보정되었다 (표 2). 10　㎎/ℓ에서 (표 2 및 도 2B), ETP 및 PH는 각각 209 nM.min에서 762 nM.min으로, 8 nM에서 79 nM로 증가하였다. LT 및 PT는 각각 13.6분에서 3.5분으로, 25.9분에서 7.2분으로 감소하였다.

	NP	HP	GDXa 50 nM
AT 활성 (%)	-	97	-
TFPI 활성 (%)	-	98	-
ETP (nM.min-1)	643	209	629
PH (nM)	42	7.7	43
LT (분)	4.9	13.6	3.4
PT (분)	11.3	25.9	8.6
항-AT IgG 농도 (g/ℓ)	항-AT IgG 7.5	항-AT IgG 5	항-AT IgG 3	항-AT IgG 1.8
AT 잔여 활성 (%)	9	24	47	66
ETP (nM.min-1)	2716	1279	502	360
PH (nM)	76	41.4	22.5	15.5
LT (분)	6.6	7.2	9.4	9.8
PT (분)	31.3	24.8	21.5	23.8
항-TFPI Ig 농도 (㎎/ℓ)	항-TFPI Ig 50	항-TFPI Ig 10	항-TFPI Ig 5	항-TFPI Ig 2.5
TFPI 잔여 활성 (%)	<20	29	53	80
ETP (nM.min-1)	732	762	593	383
PH (nM)	69.5	78.8	31.9	16.5
LT (분)	3.5	3.5	5	7.7
PT (분)	7.5	7.2	12.7	20.3

표 2: 트롬빈 생성에 대한, 항- 트롬빈 항체 및 항- TFPI 항체의 영향

트롬빈 생성 분석법 전에, 여러 가지 농도의 인간 항-트롬빈 항체 또는 항-인간 TFPI 항체를 중증 A형 혈우병 환자의 혈장에 첨가하였다.

HP: 혈우병 환자의 혈장;

NP: 정상 혈장.

항트롬빈 및 TFPI 잔여 활성을 재료 및 방법에서 기술한 방법에 따라 측정하였다.

GDXa: 50 nM GDXa가 포함된 혈우병 환자의 혈장.

항-AT IgG의 농도는 g/ℓ로 표현한다.

항-TFPI 항체의 농도는 ㎎/ℓ로 표현한다.

실시예 6: TFPI 및 항트롬빈에 의한, GDXa 및 FXa 의 효소적 저해

항트롬빈에 의한 비가역적 효소적 저해의 경우, GDXa (1.50 ± 0.04 x 10³ M^-1.s^-1, 도 3B) 및 Xa의 저해 프로파일은 동일하였다 (k2 = 1.57 ± 0.08 x 10³ M^-1.s^-1, 도 3A). TFPI는 FXa의 느린 고정 (slow fixation)의 저해인자이며 (26, 27), 저농도에서는 GDXa의 약한 저해인자이다 (28-30). 결과적으로, FXa 및 GDXa의 저해를 비교하였다 (표 1). GDXa는 FXa (Ki^* = 0.17 ± 0.03 nM, 도 3C)에 비해 TFPI (Ki^* = 0.31 ± 0.04 nM, 도 3D)에 대해 더 낮은 친화성을 나타내었다. 아울러, 이 실험에서 평형의 획득은 18시간 동안 인큐베이션 한 후의 적정 곡선의 일치성에 의해 제안되었다.

실시예 7: GDXa 및 Xa 의 혈장 반감기

TFPI 및 항트롬빈에 의한 GDXa의 저해를 고려하여, 37℃에서 혈장에 50 nM의 GDXa 또는 FXa를 첨가한 후 잔여 활성을 조사하였다. 도 4A에서 나타낸 바와 같이, 상기 혈장 내 상기 활성은 급속히 저하되었으며, 약 1분 30초의 반감기가 관찰되었고, FXa에 대해 전술한 바와 같이 20분 후 GDXa 또는 FXa에 대해 정체기 (plateau)에 도달하였다 (Bunce MW, Toso R, Camire RM. Zymogen-like factor Xa variants restore thrombin generation and effectively bypass the intrinsic pathway in vitro. Blood. 2011 Jan 6; 117(1): 290-8). 그럼에도 불고하고, 트롬빈 생성에 대한 효과는 시간이 경과한 후, 예컨대 GDXa의 잔여 활성이 초기 활성의 약 10%가 되는 때인 1시간째에도 유지되었으며 (도 4B), 트롬빈 생성의 복구도 유지되었다. 1분 동안 인큐베이션한 후, ETP는 0 nM에서 610 nM로 증가하였으며 60분 후에도 여전히 478　nM이었다 (표 3). 최대 피크 높이 뿐만 아니라 이동 (shift) 및 피크 시간에서도 유사한 보정을 관찰하였다 (각각 1분 및 60분째에 75 nM 및 38 nM) (표 3).

	1 분	60 분
ETP (nM.min)	610	478
PH (nM)	75	38
PT (s)	6.6	8.8
LT (s)	1.4	2.1

표 3: 37℃에서 1분 및 1시간 인큐베이션한 후, 중증 혈우병 환자의 혈장에 대한 GDXa 의 효과

50 nM의 GDXa를 중증 혈우병 환자의 혈장 A에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 트롬빈 생성을 측정하기 위해, 즉시 그리고 1시간 후에 분취물을 취하였다.

실시예 8: 저해인자를 가진 및 가지지 않는 중증 A형 혈우병 환자, 및 중증 B형 혈우병 환자에서 , 트롬빈 생성에 대한 GDXa 의 영향

50 베테스다 단위 (Bethesda unit)에서 적정된 저해인자를 가진 한 명의 공여자를 포함해 중증 A형 혈우병을 가진 5명의 서로 다른 공여자의 혈장 샘플, 및 중증 B형 혈우병을 가진 1명의 환자의 혈장 샘플에서 트롬빈 생성을 조사하였다. 1 pM의 TF에 의해 응고가 유도된 경우, 6개의 혈장에서 트롬빈 생성은 거의 검출불가능하였던 반면, 20 nM 및 50 nM GDXa의 존재 하에서는 복구되었다. 표 4는, 트롬빈 생성과 연관된 모든 파라미터 및 모든 혈장에 대해 보정을 여러 가지 정도로 관찰한 것을 나타낸다. 20 nM GDXa의 존재 하에, 관찰된 ETP는 374 ± 128 nM이었으며, PH는 22 ± 11 nM이었다. LT 및 PT는 각각 5.0 ± 1.5분, 및 13.9 ± 3.8분으로 감소하였다.

아울러, 투여량 효과를 관찰하였으며, 그 값은 50 nM GDXa를 첨가하였을 때, ETP의 경우 533 ± 132 nM로, PH의 경우 46 ± 20 nM로 증가하였다. LT 및 PT는 각각 2.8 ± 0.7분 및 9.2 ± 2.7분으로 감소하였다.

ETP (nM.min)	GDXa 0 nM	GDXa 20 nM	GDXa 50 nM
NP	611	-	-
P1 (HA)	0	536	530
P2 (HA)	0	268	420
P3 (HA)	0	207	330
P4 (HA)	0	466	610
P5 (HA)	215	331	629
P6 (HA + I)	254	425	539
P7 (HB)	282	546	668
평균 ± SD	125 ± 139	374 ± 128	533 ± 132
PH (nM)	GDXa 0 nM	GDXa 20 nM	GDXa 50 nM
NP	43	ND	ND
P1 (HA)	0	33	40
P2 (HA)	0	15	26
P3 (HA)	0	13	25
P4 (HA)	0	41	78
P5 (HA)	8	14	43
P6 (HA + I)	15	28	55
P7 (HB)	13	23	46
평균 ± SD	6 ± 7	22 ± 11	46 ± 20
LT (분)	HP	GDXa 20 nM	GDXa 50 nM
NP	5.7	ND	ND
P1 (HA)	0	3.1	2.3
P2 (HA)	ND	5.7	3.0
P3 (HA)	ND	4.5	2.9
P4 (HA)	ND	2.7	1.6
P5 (HA)	16	7.3	3.4
P6 (HA + I)	8	4.5	2.5
P7 (HB)	17	5.5	3.3
평균 ± SD	ND	5.0 ± 1.5	2.8 ± 0.7
PT (분)	GDXa 0 nM	GDXa 20 nM	GDXa 50 nM
NP	12.3	ND	ND
P1 (HA)	0	13.3	11.1
P2 (HA)	ND	17.6	14.1
P3 (HA)	ND	12.9	10.4
P4 (HA)	ND	8.6	7.3
P5 (HA)	30.3	18.9	8.6
P6 (HA + I)	24.4	12.4	7.4
P7 (HB)	28.9	12.8	7.3
평균 ± SD	ND	13.9 ± 3.8	9.2 ± 2.7

표 4: 저해인자를 가진 또는 가지지 않은 중증 A형 혈우병 환자의 5개의 서로 다른 혈장, 및 중증 B형 혈우병 환자 1명의 혈장에서, 트롬빈 생성에 대한 GDXa 의 영향

20 nM 또는 20 nM의 GDXa를 여러 가지 혈장에 첨가하고, 즉시 트롬빈 생성에 대해 분석하였다.

Px: 혈장 x

HA: A형 혈우병

HA+I: 저해인자를 가진 A형 혈우병 (50 BU의 저해인자를 가진 A형 혈우병)

HB: B형 혈우병

실시예 9: A형 혈우병 환자에서 트롬빈 생성에 대한, 본 발명에 따른 GDFXa 와 인자 VIIa ( rVIIa , Novoseven ^® ) 간의 비교

도 5는, 트롬빈 생성을 보정하는 데 있어서 GDXa가 rVIIa (Novoseven^®)보다 훨씬 더 효과적임을 나타낸다.

500 nM 이상의 rVIIa가 하기에 따른 보정에 요구된다: ALJAMALI MN, KJALKE M, HEDNER U, EZBAN M, TRANHOLM M. Thrombin generation and platelet activation induced by rFVIIa (NovoSeven^®) and NN1731 in a reconstituted cell-based model mimicking hemophilia conditions. Haemophilia. 2009; 15: 1318-26.

SEQUENCE LISTING <110> Joseph FOURIER University (GRENOBLE 1) CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE [National Centre for Scientific Research] <120> A novel procoagulant molecular decoy for treating haemophilia A or B with or without inhibitor <130> BR074169 <150> FR11/51637 <151> 2011-03-01 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu 20 25 30 Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly 50 55 60 Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn 65 70 75 80 Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys 85 90 95 Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala 100 105 110 Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly 115 120 125 Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Arg Lys Arg 130 135 140 <210> 2 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu 20 25 30 Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys 35 40 45 Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly 50 55 60 Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe 65 70 75 80 Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr 85 90 95 Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg 100 105 110 Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser 115 120 125 Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys 130 135 140 Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser 145 150 155 160 Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys 165 170 175 Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg 180 185 190 Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly 195 200 205 Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe 210 215 220 Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala 225 230 235 240 Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 245 250 <210> 3 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys 1 5 10 15 Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe 20 25 30 Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp 35 40 45 Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val 50 55 60 Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys 65 70 75 80 Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Arg 85 90 95 Lys Arg <210> 4 <211> 59 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe 1 5 10 15 Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr 20 25 30 Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro 35 40 45 Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Arg Lys Arg 50 55 <210> 5 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys 1 5 10 15 Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe 20 25 30 Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly 35 40 45 Lys Gln Thr Leu Glu Arg Arg Lys Arg 50 55 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Arg Lys 1 5 10 15 Arg <210> 7 <211> 353 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly 1 5 10 15 Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly 20 25 30 Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu 35 40 45 Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val 50 55 60 Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala 65 70 75 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aaggagacct atgacttcga catcgccgtg ctccggctca agacccccat caccttccgc 600 atgaacgtgg cgcctgcctg cctccccgag cgtgactggg ccgagtccac gctgatgacg 660 cagaagacgg ggattgtgag cggcttcggg cgcacccacg agaagggccg gcagtccacc 720 aggctcaaga tgctggaggt gccctacgtg gaccgcaaca gctgcaagct gtccagcagc 780 ttcatcatca cccagaacat gttctgtgcc ggctacgaca ccaagcagga ggatgcctgc 840 cagggggaca gcgggggccc gcacgtcacc cgcttcaagg acacctactt cgtgacaggc 900 atcgtcagct ggggagaggg ctgtgcccgt aaggggaagt acgggatcta caccaaggtc 960 accgccttcc tcaagtggat cgacaggtcc atgaaaacca ggggcttgcc caaggccaag 1020 agccatgccc cggaggtcat aacgtcctct ccattaaag 1059 <210> 9 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu 20 25 30 Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys 35 40 45 Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly 50 55 60 Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile 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accaggctca agatgctgga ggtgccctac gtggaccgca acagctgcaa gctgtccagc 480 agcttcatca tcacccagaa catgttctgt gccggctacg acaccaagca ggaggatgcc 540 tgccaggggg acagcggggg cccgcacgtc acccgcttca aggacaccta cttcgtgaca 600 ggcatcgtca gctggggaga gggctgtgcc cgtaagggga agtacgggat ctacaccaag 660 gtcaccgcct tcctcaagtg gatcgacagg tccatgaaaa ccaggggctt gcccaaggcc 720 aagagccatg ccccggaggt cataacgtcc tctccattaa ag 762 <210> 16 <211> 297 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 tacaaagatg gcgaccagtg tgagaccagt ccttgccaga accagggcaa atgtaaagac 60 ggcctcgggg aatacacctg cacctgttta gaaggattcg aaggcaaaaa ctgtgaatta 120 ttcacacgga agctctgcag cctggacaac ggggactgtg accagttctg ccacgaggaa 180 cagaactctg tggtgtgctc ctgcgcccgc gggtacaccc tggctgacaa cggcaaggcc 240 tgcattccca cagggcccta cccctgtggg aaacagaccc tggaacgcag gaagagg 297 <210> 17 <211> 177 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 ttcacacgga agctctgcag cctggacaac ggggactgtg accagttctg ccacgaggaa 60 cagaactctg tggtgtgctc ctgcgcccgc gggtacaccc tggctgacaa cggcaaggcc 120 tgcattccca cagggcccta cccctgtggg aaacagaccc tggaacgcag gaagagg 177 <210> 18 <211> 171 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 aaagatggcg accagtgtga gaccagtcct tgccagaacc agggcaaatg taaagacggc 60 ctcggggaat acacctgcac ctgtttagaa ggattcgaag gcaaaaactg tgaattattc 120 cccacagggc cctacccctg tgggaaacag accctggaac gcaggaagag g 171 <210> 19 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 cccacagggc cctacccctg tgggaaacag accctggaac gcaggaagag g 51 <210> 20 <211> 1233 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tacaaagatg gcgaccagtg tgagaccagt ccttgccaga accagggcaa atgtaaagac 60 ggcctcgggg aatacacctg cacctgttta gaaggattcg aaggcaaaaa ctgtgaatta 120 ttcacacgga agctctgcag cctggacaac ggggactgtg accagttctg ccacgaggaa 180 cagaactctg tggtgtgctc ctgcgcccgc gggtacaccc tggctgacaa cggcaaggcc 240 tgcattccca cagggcccta cccctgtggg aaacagaccc tggaacgcag gaagaggtca 300 gtggcccagg ccaccagcag cagcggggag gcccctgaca gcatcacatg gaagccatat 360 gatgcagccg acctggaccc caccgagaac cccttcgacc tgcttgactt caaccagacg 420 cagcctgaga 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21 atcgtgggag gccaggaatg caaggacggg gagtgtccct ggcaggccct gctcatcaat 60 gaggaaaacg agggtttctg tggtggaacc attctgagcg agttctacat cctaacggca 120 gcccactgtc tctaccaagc caagagattc aaggtgaggg taggggaccg gaacacggag 180 caggaggagg gcggtgaggc ggtgcacgag gtggaggtgg tcatcaagca caaccggttc 240 acatacgaga cctatgactt cgacatcgcc gtgctccggc tcaagacccc catcaccttc 300 cgcatgaacg tggcgcctgc ctgcctcccc gagcgtgact gggccgagtc cacgctgatg 360 acgcagaaga cggggattgt gagcggcttc gggcgcaccc acgagaaggg ccggcagtcc 420 accaggctca agatgctgga ggtgccctac gtggaccgca acagctgcaa gctgtccagc 480 agcttcatca tcacccagaa catgttctgt gccggctacg acaccaagca ggaggatgcc 540 tgccaggggg acagcggggg cccgcacgtc acccgcttca aggacaccta cttcgtgaca 600 ggcatcgtca gctggggaga gggctgtgcc cgtaagggga agtacgggat ctacaccaag 660 gtcaccgcct tcctcaagtg gatcgacagg tccatgaaaa ccaggggctt gcccaaggcc 720 aagagccatg ccccggaggt cataacgtcc tctccattaa ag 762 <210> 22 <211> 762 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 atcgtgggag gccaggaatg caaggacggg gagtgtccct 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tggtggaacc attctgagcg agttctacat cctaacggca 120 gcccactgtc tctaccaagc caagagattc aaggtgaggg taggggaccg gaacacggag 180 caggaggagg gcggtgaggc ggtgcacgag gtggaggtgg tcatcaagca caaccggttc 240 acaaaggaga cctatgactt cgacatcgcc gtgctccggc tcaagacccc catcaccttc 300 cgcatgaacg tggcgcctgc ctgcctcccc gagcgtgact gggccgagtc cacgctgatg 360 acgcagaaga cggggattgt gagcggcttc gggcgcaccc acgagaaggg ccggcagtcc 420 accggactca agatgctgga ggtgccctac gtggaccgca acagctgcaa gctgtccagc 480 agcttcatca tcacccagaa catgttctgt gccggctacg acaccaagca ggaggatgcc 540 tgccaggggg acagcggggg cccgcacgtc acccgcttca aggacaccta cttcgtgaca 600 ggcatcgtca gctggggaga gggctgtgcc cgtaagggga agtacgggat ctacaccaag 660 gtcaccgcct tcctcaagtg gatcgacagg tccatgaaaa ccaggggctt gcccaaggcc 720 aagagccatg ccccggaggt cataacgtcc tctccattaa ag 762 <210> 24 <211> 762 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 atcgtgggag gccaggaatg caaggacggg gagtgtccct ggcaggccct gctcatcaat 60 gaggaaaacg agggtttctg tggtggaacc attctgagcg agttctacat cctaacggca 120 gcccactgtc tctaccaagc caagagattc aaggtgaggg taggggaccg gaacacggag 180 caggaggagg gcggtgaggc ggtgcacgag gtggaggtgg tcatcaagca caaccggttc 240 acaaaggaga cctatgactt cgacatcgcc gtgctccggc tcaagacccc catcaccttc 300 cgcatgaacg tggcgcctgc ctgcctcccc gagcgtgact gggccgagtc cacgctgatg 360 acgcagaaga cggggattgt gagcggcttc gggcgcaccc acgagaaggg ccggcagtcc 420 accatactca agatgctgga ggtgccctac gtggaccgca acagctgcaa gctgtccagc 480 agcttcatca tcacccagaa catgttctgt gccggctacg acaccaagca ggaggatgcc 540 tgccaggggg acagcggggg cccgcacgtc acccgcttca aggacaccta cttcgtgaca 600 ggcatcgtca gctggggaga gggctgtgcc cgtaagggga agtacgggat ctacaccaag 660 gtcaccgcct tcctcaagtg gatcgacagg tccatgaaaa ccaggggctt gcccaaggcc 720 aagagccatg ccccggaggt cataacgtcc tctccattaa ag 762 <210> 25 <211> 762 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 atcgtgggag gccaggaatg caaggacggg gagtgtccct ggcaggccct gctcatcaat 60 gaggaaaacg agggtttctg tggtggaacc attctgagcg agttctacat cctaacggca 120 gcccactgtc tctaccaagc caagagattc aaggtgaggg taggggaccg gaacacggag 180 caggaggagg gcggtgaggc ggtgcacgag gtggaggtgg tcatcaagca caaccggttc 240 acaaaggaga cctatgactt cgacatcgcc gtgctccggc tcaagacccc catcaccttc 300 cgcatgaacg tggcgcctgc ctgcctcccc gagcgtgact gggccgagtc cacgctgatg 360 acgcagaaga cggggattgt gagcggcttc gggcgcaccc acgagaaggg ccggcagtcc 420 acctacctca agatgctgga ggtgccctac gtggaccgca acagctgcaa gctgtccagc 480 agcttcatca tcacccagaa catgttctgt gccggctacg acaccaagca ggaggatgcc 540 tgccaggggg acagcggggg cccgcacgtc acccgcttca aggacaccta cttcgtgaca 600 ggcatcgtca gctggggaga gggctgtgcc cgtaagggga agtacgggat ctacaccaag 660 gtcaccgcct tcctcaagtg gatcgacagg tccatgaaaa ccaggggctt gcccaaggcc 720 aagagccatg ccccggaggt cataacgtcc tctccattaa ag 762 <210> 26 <211> 254 <212> PRT <213> Bovide <400> 26 Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu 20 25 30 Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys 35 40 45 Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly 50 55 60 Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe 65 70 75 80 Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr 85 90 95 Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg 100 105 110 Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser 115 120 125 Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Leu Ser Ser Thr Leu Lys 130 135 140 Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser 145 150 155 160 Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys 165 170 175 Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg 180 185 190 Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly 195 200 205 Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe 210 215 220 Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala 225 230 235 240 Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 245 250 <210> 27 <211> 765 <212> DNA <213> Bovine 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Pro Cys Gln Asn Gln Gly 1 5 10 15 Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly 20 25 30 Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu 35 40 45 Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val 50 55 60 Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala 65 70 75 80 Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg 85 90 95 Arg Lys Arg Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly Glu Ala Pro 100 105 110 Asp Ser Ile Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu Asp Pro Thr 115 120 125 Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln Pro Glu Arg 130 135 140 Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Arg Lys Arg Arg Lys Arg Ile Val Gly 145 150 155 160 Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile 165 170 175 Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe 180 185 190 Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys 195 200 205 Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala 210 215 220 Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu 225 230 235 240 Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr 245 250 255 Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala 260 265 270 Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly 275 280 285 Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu 290 295 300 Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile 305 310 315 320 Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp 325 330 335 Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp 340 345 350 Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg 355 360 365 Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp 370 375 380 Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His 385 390 395 400 Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 405 410

Claims (8)

1. 저해인자를 가지고 있거나 가지고 있지 않은 A형 또는 B형 혈우병 환자에서 출혈을 예방 또는 치료하기 위한, 변형된 인자 Xa (GDXa)를 포함하는 약학 조성물로서,
   상기 GDXa는 Gla 도메인이 결여된 FXa인, 약학 조성물.
2. 제1 항에 있어서,
   상기 GDXa가 EGF1 도메인의 결여, EGF2 도메인의 결여, 또는 EGF1 및 EGF2 도메인의 결여를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
3. 제1 항 또는 제2 항에 있어서,
   상기 GDXa가 온전한 중쇄(intact heavy chain)를 가지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 GDXa는 이의 경쇄가 서열 번호 7 또는 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시되고, 이의 중쇄가 서열 번호 2, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13 또는 서열 번호 26으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
5. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 GDXa는 이의 경쇄가 서열 번호 8, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18 또는 서열 번호 19로 표시되고, 이의 중쇄가 서열 번호 15, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25 또는 서열 번호 27인 핵산 서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   저해인자를 가지고 있거나 가지고 있지 않은 A형 또는 B형 혈우병 환자에게 전신, 코, 또는 비경구 경로로 투여하기 위해 GDXa를 4.5 ㎍/㎏ 내지 27 ㎍/㎏으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
7. 변형된 인자 Xa (GDXa) 또는 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을 투여함으로써, A형 또는 B형 혈우병 환자에서 출혈성 증후군을 예방하는 방법.
8. 변형된 인자 Xa (GDXa) 또는 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을 투여함으로써, A형 또는 B형 혈우병 환자에서 출혈을 치료하는 방법.

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