CN1329503A - 治疗血小板减少性紫癜和溶血性尿毒综合征的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用C蛋白治疗血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)和溶血性尿毒综合征(HUS)的方法。要求保护的本发明为潜在的严重衰弱性疾病提供需要的治疗方法,同时避免了血浆置换或目前采用的抗凝剂的并发症如出血倾向、毒性反应和全身性副作用。

Description

治疗血小板减少性紫癜和溶血性尿毒综合征的方法

本申请要求1998年12月10日申请的临时申请序号60/111,770的优先权。

本发明涉及医学科学，具体地说涉及用C蛋白治疗血栓形成性血小板减少性紫癜和溶血性尿毒综合征。

C蛋白是一种维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶和天然抗凝剂，其通过使凝血级联过程中的因子Va和VIIIa失活从而在止血调节中起作用。人C蛋白以二链酶原的形式循环，但通过含有细胞表面膜蛋白(凝血调节蛋白)复合物中的凝血酶的限制性蛋白水解作用将其转化为活化C蛋白(aPC)后，该蛋白在内皮和血小板表面起作用。

结合其它蛋白，aPC可作为凝血过程中最重要的负调节物发挥作用从而产生抵抗血栓形成的防护。aPC除了抗凝作用之外，还通过抑制细胞因子(例如肿瘤坏死因子和白细胞介素-1)的产生发挥抗炎作用，另外还具有纤维蛋白原溶解特性(profibrinolytic property)，例如对纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)的抑制作用，这有助于溶解凝血块。因此，C蛋白酶系统是抗凝、抗炎和纤维蛋白溶解的主要生理机制。

将血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)和溶血性尿毒综合征(HUS)定义为血栓形成性微血管病，其特征为微血栓堵塞小动脉和毛细血管、血小板减少、神经功能受损以及进行性肾衰。已将TTP定义为多系统疾病，其特征为发热、中枢神经系统异常波动、肾功衰竭、微血管病溶血性贫血以及血小板减少。HUS的特征为与红细胞碎片有关的血管内溶血性贫血、血小板减少以及末端器官(end-organ)受损，这种末端器官受损的证据有(a)血栓形成性微血管病病变的组织学根据(最常见的是肾)或(b)无任何其它疾病或可能的发病因素下，该种损害的临床根据[Neild，G.，Kidney Intemational 53(Suppl.64)：s-45-s-49，1998]。

相信引起TTP/HUS病理生理学改变的因素是内皮细胞受损和原发性血小板聚集[Moake，Seminars in Hematology，34(2)：83-89，1997]。内皮细胞受损导致大量冯·维勒布兰德氏因子(UL vWF)多聚体异常释放，冯·维勒布兰德氏因子多聚体本身又引起血小板聚集。机体纤维蛋白溶解系统的抑制导致纤维蛋白性血栓在血小板性血栓上堆积。发现HUS和TTP患者的纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)水平增高而C蛋白活性水平降低。

TTP与巴尔通氏体属(Bartonella sp.)的细菌感染有关，也与人类免疫缺陷性病毒(HIV)和内脏卡波氏肉瘤有关[Avery等，AmericanJournal of Hematology，58：148-149，1998]。TTP还与许多药物例如噻氯匹定、FK506、高剂量的皮质类固醇、他莫昔芬(tamoxiphen)或环孢菌素A的应用有关[Gordon等，Seminars in Hematology，34(2)：140-147，1997]。

HUS与许多细菌感染有关，例如大肠杆菌O157：H7菌株(E.coli)、志贺氏菌属(Shigella)、肺炎球菌属(Pneumococci)、溶血性链球菌(hemolytic Streptococci)或耶尔森氏菌属(Yersinia)的感染。HUS也与病毒感染例如HIV、柯萨奇病毒(Coxsackie)或腺病毒(adenovirus)的感染有关。此外，HUS与许多药物(与上述列于TTP的相同)的应用有关[Gordon等，1997]。TTP和HUS两者均与怀孕期间的并发症有关[Egerman等，Am J Obstet Gynecol，175：950-956，1996]。

血栓形成性微血管病的临床发现包括微血管病溶血性贫血(MAHA)、急性肾功能衰竭、血小板减少症和TTP的急性神经学改变。如果不治疗，TTP和HUS的预后不良，其死亡率达90％。存活患者经常发展为晚期(end-stage)肾病。具有良好结果的唯一治疗方法是用新鲜冷冻血浆进行血浆替换(PE)[Hollenbeck等，Nephrol DialTransplant 13：76-81，1998]。然而，仍会发生死亡并且尽管应用PE法治疗，许多患者仍长期罹患并发症。因此，需要更有效的治疗TTP和/或HUS的方法。

本发明首次描述用C蛋白治疗TTP和/或HUS。将具有抗凝和纤维蛋白原溶解活性(profibrinolytic activity)以及使PAI-1失活的能力的C蛋白用于治疗TTP和HUS患者微血栓引起的小动脉和毛细血管堵塞。

发明概述

本发明提供了治疗罹患血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)患者的方法，该方法包括给予所述患者药学有效剂量的C蛋白。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗罹患溶血性尿毒综合症(HUS)患者的方法，该方法包括给予所述患者药学有效剂量的C蛋白。

在另外一个实施方案中，本发明为需要这种治疗的血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)患者提供了治疗方法，该方法包括给予所述患者药学有效剂量的活化C蛋白，使这种活化C蛋白的血浆水平达到约2ng/ml到约300ng/ml。

在又一个实施方案中，本发明为需要这种治疗的溶血性尿毒综合症(HUS)患者提供了治疗方法，该方法包括给予所述患者药学有效剂量的活化C蛋白，使这种活化C蛋白的血浆水平达到约2ng/ml到约300ng/ml。

发明详述

对本文公开和要求保护的本发明来说，如下定义下述术语。

C蛋白是指具有抗凝、抗炎和纤维蛋白原溶解特性的依赖维生素K的丝氨酸蛋白酶，它包括但不限于得自血浆的C蛋白和重组产生的C蛋白。尽管C蛋白也包括其它类型C蛋白或具有C蛋白的蛋白水解活性、酰胺分解活性(amidolytic)、酯水解活性和生物学(抗凝、纤维蛋白原溶解及抗炎)活性的衍生物，但是C蛋白包括并优选人类C蛋白。Gerlitz等(美国专利第5,453,373号)和Foster等(美国专利第5,516,650号)描述了C蛋白衍生物的实例，其全部内容通过引用结合到本文中。

酶原-一种蛋白水解酶的无酶活性前体。本文使用的C蛋白酶原是指分泌的、无活性形式的C蛋白，无论是单链或是双链。

活化的C蛋白或aPC是指通过限制性蛋白水解已将其转化为活化形式的C蛋白酶原。尽管aPC也包括其它类型aPC或具有C蛋白的蛋白水解活性、酰胺分解活性、酯水解活性和生物学(抗凝或纤维蛋白原溶解)活性的衍生物，但是aPC包括并优选为人类C蛋白。在上述C蛋白的描述中指出了C蛋白衍生物的实例。

HPC-人C蛋白酶原。

r-hPC-重组人C蛋白酶原。

r-aPC-通过体外活化r-hPC或由原核细胞、真核细胞和转基因动物或植物直接分泌的活化形式C蛋白产生的重组人活化C蛋白，包括例如由人肾293细胞分泌酶原，然后通过本领域技术人员已知的技术纯化和活化，这在Yan的美国专利第4,981,952号和Cottingham的WO97/20043中得到证实，其全部内容通过引用结合到本文中。

血浆衍生的活化C蛋白-按照Eibl在美国专利第5,478,558号中的描述，通过活化血浆HPC产生的活化C蛋白，所述文献全部内容通过引用结合到本文中。

连续输注-在规定的一段时间内基本上持续不断地向静脉内输入溶液。

快速浓注(bolus injection)-在大约120分钟时间内注射入规定剂量(称为一个药团，bolus)的药物。

给药的合适形式-适合作为治疗药物给予的冻干剂或溶液。

单位剂型-指用于人体接受者的、适当单位剂量的不连续物理单位，每一单位剂型含有经计算可产生期望的治疗效果的预定量的活性物质以及合适的药用赋形剂。

药学有效量-表示能抑制人体败血症的本发明化合物的量。当然，给予本发明所述化合物的具体剂量将由主治医师根据对所述病例具体情况的评估而决定。

本发明提供用C蛋白治疗血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)和溶血性尿毒综合征(HUS)。已将TTP定义为多系统性疾病，其特征为发热、波动性中枢神经系统异常、肾损害、微血管病溶血性贫血和血小板减少。HUS的特征为与红细胞碎片有关的血管内的溶血性贫血；血小板减少和末端器官(end-organ)受损，这种末端器官受损的证据有：(a)血栓形成性微血管病病变的组织学根据(最常见的是肾)，或(b)无任何其它疾病或可能的发病因素下，该种损害的临床根据。可将具有抗凝和纤维蛋白原溶解活性以及使PAI-1灭活的能力的C蛋白用于治疗TTP和HUS患者微血栓引起的小动脉和毛细血管的闭塞。

根据本发明给予的C蛋白可通过本领域已知的任何方法或按照美国专利号4,981,952和美国专利号5,550,036(通过引用结合到本文)描述的方法生产和/或分离。例如，本发明提供由细胞产生并分泌全长可溶性C蛋白或C蛋白的生物学活性多肽变异体的方法，该方法包括(a)构建含有编码C蛋白的DNA的载体；(b)用所述载体转染所述细胞；以及(c)在可使全长可溶性C蛋白或C蛋白的生物学活性多肽变异体分泌的培养条件下培养该转染细胞。此外，所述细胞为真核细胞，例如哺乳动物细胞如金黄仓鼠AV12细胞、人胚胎293细胞或幼仓鼠肾细胞。

可按照制备药学上有用组合物的已知方法配制用于治疗TTP/HUS的C蛋白。例如，一种需要的制剂形式往往是高纯度稳定冻干制品，该冻干品含有增量剂(如蔗糖)、盐(如氯化钠)、缓冲剂(如柠檬酸钠)和C蛋白或aPC。

为保证所述C蛋白以有效形式传送到血流中，可通过大约1小时到约240小时持续输注注入合适的剂量，不经肠道地给予所述C蛋白。

本领域技术人员根据良好的医学实践和患者个体的临床状况可容易地确定含有C蛋白的治疗性组合物的最佳药学有效剂量和给药方案。通常，给予的C蛋白量约5.0μg/kg/小时到约250μg/kg/小时。用于治疗TTP/HUS的C蛋白优选活化的C蛋白。给予的aPC量约1.0μg/kg/小时到约96μg/kg/小时。给予的aPC量更优选从约1.0μg/kg/小时到约50μg/kg/小时。同时给予的aPC量更优选从约1.0μg/kg/小时到约35μg/kg/小时。甚至更优选给予的aPC量从约5.0μg/kg/小时到约30μg/kg/小时。甚至再更优选给予的aPC量约15μg/kg/小时-30μg/kg/小时。还可以更进一步优选给予的aPC量从约20μg/kg/小时到30μg/kg/小时。给予的aPC量最优选约24μg/kg/小时。给予的合适剂量aPC将减少TTP和HUS患者微血栓引起的小动脉和毛细血管闭塞。

给予所述量aPC获得的血浆范围为约2ng/ml到约300ng/ml。优选血浆范围为约2ng/ml到约200ng/ml。最优选的血浆范围为约30ng/ml到约150ng/ml，甚至更优选为约100ng/ml。

另一方面，如下给予所述aPC：把每小时合适剂量的1/3快速浓注，然后将每小时剂量的剩余的2/3量在一小时内持续输入，然后在23小时内连续输入合适的剂量，这样使得在24小时内给予合适剂量。此外，所述快速浓注将通过静脉内的袋式滴注泵或注射泵以正常速率的大约2倍的速度给予约10到20分钟，随后以正常速率的大约1.5倍的速度给予40到50分钟。然后以正常速率连续输入240小时，正常速率为决定给予每个时间周期的合适剂量水平的所述治疗药物的速率适于。

本发明介绍的应用C蛋白治疗TTP/HUS将为潜在的严重并使人衰弱的疾病提供需要的治疗。C蛋白的应用是有效的并可避免目前采用的用新鲜冷冻血浆进行的血浆置换的治疗方法或其它目前采用的抗凝剂的并发症如毒性反应和全身性副作用。

提供的下述实施例仅为进一步说明本发明。不能把本发明的范围解释为仅限于下述实施例构成的范围。

制备1

人C蛋白的制备

应用本领域技术人员已知的技术(如Yan在美国专利号4,981,952中列出的那些技术，其全部技术内容通过引用结合到本文中)以人肾293细胞生产重组人C蛋白(r-hPC)。编码人C蛋白的基因由Bang等在美国专利号4,775,624中公开并要求保护(其全部技术内容通过引用结合到本文中)。在293细胞中用于表达人C蛋白的质粒是pLPC质粒，该质粒由Bang等在美国专利号4,992,373中公开(其全部技术内容通过引用结合到本文中)。欧洲专利公告第0 445 939号中以及Grinnell等在Bio/Technology 5：1189-1192，1987中也介绍了PLPC质粒的构建，所述文献内容亦通过引用结合到本文中。简要地说，将所述质粒转染到293细胞中，然后鉴定稳定的转化体，使之在无血清培养基中传代培养。发酵后，通过微量过滤收集无细胞的培养基。

应用改进的Yan在美国专利号4,981,952中的技术，将人C蛋白从所述培养基中分离出来。用4mM EDTA制备澄清培养基，然后使其吸附到阴离子交换树脂(Fast-Flow Q，Pharmacia)上。在用4个柱体积的20mM的Tris、200mM的氯化钠、pH7.4和2个柱体积的20mM的Tris、150mM的氯化钠、pH7.4洗涤后，用20mM的Tris、150mM的氯化钠、10mM氯化钙、pH7.4洗脱结合的重组人C蛋白酶原。洗脱后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳判断，所述洗脱蛋白的纯度大于95％。

所述蛋白的进一步纯化如下：用3M氯化钠配制所述蛋白，然后使其吸附到用20mM Tris、3M氯化钠、10mM氯化钙、pH7.4平衡的疏水作用树脂(Toyopearl Phenyl 650M，TosoHaas)上。在用2个柱体积无氯化钙的平衡缓冲液洗涤后，用20mM的Tris、pH7.4洗脱所述重组人C蛋白。

制备所述洗脱蛋白，用以通过去除残余钙进行活化。将所述重组人C蛋白通过金属亲和柱(Chelex-100，Bio-Rad)以除去钙，并使蛋白再次结合到阴离子交换柱(Fast Flow Q，Pharmacia)上。将这两个柱串联排列并用20mM的Tris、150mM的氯化钠、5mM的EDTA、pH7.4平衡。在上样所述蛋白后，用1个柱体积的相同缓冲液洗涤所述Chelex-100柱后，使其从所述串联连接中分离开。用3个柱体积的平衡缓冲液洗涤所述阴离子交换柱后，用0.4M的氯化钠、20mM的Tris-醋酸盐、pH6.5洗脱所述蛋白。用UV 280nm消光(分别为E0.1％＝1.81或1.85)测定重组人C蛋白和重组活化C蛋白溶液的蛋白浓度。

制备2

重组人C蛋白的活化

在50mM的HEPES、pH7.5存在时，于4C将牛凝血酶偶合到Activated CH-Sepharose 4B(Pharmacia)上。在已将树脂填充到柱上后，用大约5000单位凝血酶/ml树脂进行所述偶合反应。将所述凝血酶溶液在该柱中循环约3小时后，加入2-氨基-乙醇(MEA)至循环溶液的浓度为0.6ml/L。将所述含有MEA的溶液再循环10-12小时以确保树脂上未反应的胺被完全封闭。封闭之后，用10个柱体积的1M的氯化钠、20mM的Tris、pH6.5洗涤所述凝血酶-偶合的树脂，以除去所有的非特异性结合蛋白质，并将该凝血酶树脂用活化缓冲液平衡后用于活化反应中。

用5mM EDTA(以螯合任何残余钙)制备纯化的r-hPC并用20mM的Tris、pH7.4或20mM的Tris-醋酸盐、pH6.5稀释至浓度为2mg/ml。将该物质通过凝血酶柱(该柱于37℃用50mM的氯化钠和20mM的Tris、pH7.4或20mM的Tris-醋酸盐、pH6.5平衡)。将流速调节至r-hPC和凝血酶树脂之间的接触时间大约为20分钟。收集流出物并立即测定其酰胺分解活性。如果所述物质没有与建立的C蛋白标准品相似的比活性(酰胺分解活性)，则将其在所述凝血酶柱上重新循环以完全活化所述r-hpC为止。然后用20mM上述缓冲液(pH可为7.4或6.5)按1∶1稀释所述物质以使所述C蛋白在进行下一步骤处理之前保持较低的浓度。

用150mM的氯化钠将所述C蛋白结合到用活化缓冲液(20mM的Tris、pH7.4或20mM的Tris-醋酸盐、pH6.5)平衡的阴离子交换树脂(Fast Flow Q，Pharmacia)上，达到从所述C蛋白物质中除去滤去的凝血酶的目的。在这些条件下，凝血酶不与所述阴离子交换树脂互相作用，仅仅是通过该柱子进入加样的样品流出物。当将所述C蛋白加入到所述柱子上时，用2-6个柱体积的20mM的平衡缓冲液洗涤后，用溶于5mM的Tris-醋酸盐、pH6.5或20mM的Tris、pH7.4的0.4M氯化钠经梯度洗脱将结合的C蛋白洗脱下来。洗涤柱子的体积越大越有利于完全除去十二肽(dodecapeptide)。从所述柱子上洗脱下来的物质可以冷冻液(-20℃)保存或以冻干粉保存。

通过测定活化部分凝血激酶时间(APTT)凝固试验的凝固时间的延长来测定活化的C蛋白的抗凝活性。用稀释缓冲液(1mg/ml放射免疫测试级牛血清白蛋白[BSA]、20mM的Tris、pH7.4、150mM的氯化钠、0.02％的叠氮钠)配制C蛋白(浓度范围为125-1000ng/ml)并绘制标准曲线，同时将样品在这个浓度范围内制备成几个稀释度。在每个样品的小杯中加入50μl冷的马血浆和50μl复制的活化部分凝血激酶时间试剂(APTT试剂，Sigma)，并将其于37℃孵育5分钟。孵育后，在每个小杯中加入50μl适当的样品或标准品。用稀释缓冲液替换样品或标准品以测定基础凝固时间。在每个样品或标准品中加入37℃的30mM的氯化钙50μl后立即启动纤维蛋白测定仪(fibrometer)(Coa Screener Hemostasis Ahalyzer，American Labor)的计时器。根据标准曲线的线性回归方程计算样品的活化C蛋白浓度。本文报道的凝固时间是至少三个重复样品的平均值，包括标准曲线样品。

上述描述可使本领域中有相当技术的人员制备用于治疗血栓形成性血小板减少性紫癜和溶血性尿毒综合征的C蛋白。

制备3

活化的C蛋白的制剂

通过包括将含有约2.5mg/ml活化的C蛋白、约15mg/ml的蔗糖、约20mg/ml的氯化钠和pH大于5.5但小于6.5的柠檬酸钠缓冲液的溶液冻干的步骤而制备活化的C蛋白的稳定冻干制剂。此外，活化C蛋白的稳定冻干制剂包括将含有约5mg/ml活化的C蛋白、约30mg/ml的蔗糖、约38mg/ml的氯化钠和pH大于5.5但小于6.5的柠檬酸钠缓冲液的溶液冻干。

C蛋白∶盐∶增量剂(w∶w∶w)的比例是适宜冻干工艺制剂的重要因素。根据C蛋白的浓度、选择的盐和浓度以及选择的增量剂和浓度，所述比例可不同。具体地说，优选比例为约1份活化的C蛋白∶约7.6份盐∶约6份增量剂。

通过将活化的C蛋白、氯化钠、蔗糖和柠檬酸钠缓冲液混合而制备适于连续输注给药的活化C蛋白单位剂量制剂。混合后，将4ml所述溶液转到单位剂量的容器内并冻干。将含有大约5mg到约20mg活化C蛋白(适合对需要这种治疗的患者给予约0.01mg/kg/小时到约0.05mg/kg/小时的剂量)的所述单位剂量容器封闭并保藏备用。

实施例1

重组活化C蛋白(r-aPC)在治疗

血栓形成性微血管病中的安慰剂-对照的双盲随机试验

溶血性尿毒综合征(HUS)和血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)是两种类型血栓形成性微血管病，它们的主要致病原因均为内皮受损。在这两种疾病状况时，内皮细胞或者因为感染微生物如大肠杆菌(E.coli)O157：H7和志贺氏菌属(Shigella)产生的Vero细胞毒素、药物如FK506和噻氯匹定或自身抗体而受损。内皮受损导致大量的冯·维勒布兰德氏因子多聚体的异常释放，冯·维勒布兰德氏因子多聚体本身又引起血小板聚集。对机体纤维蛋白溶解系统的抑制导致纤维蛋白性血栓在血小板性血栓上堆积。发现HUS和TTP的纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)水平升高而C蛋白活性水平降低。血栓形成性微血管病的临床发现包括微血管病溶血性贫血(MAHA)、急性肾功能衰竭、血小板减少、以及在TTP的急性神经病学改变。

本试验的首要目的是为了证实，与安慰剂相比，输注r-aPC可使对所述疾病的缓解时间有统计学意义的显著减低。第二个目的是为了证实，输注r-aPC可使肾功能衰竭的天数、所需要的输注量和抽搐发作的次数有统计学意义的显著降低。本试验的首要安全性目的是为了证实，与安慰剂比较，r-aPC确实不会引起临床上的明显出血次数具有统计学意义的明显增加。

进行此试验的患者准入标准为存在血栓形成性微血管病，血栓形成性微血管病由存在以下情况定义：1)血小板数＜80×109/L定义的血小板减少；2)外周血涂片每视野＞2个裂红细胞、直接和间接Coomb’s试验阴性以及血红蛋白(Hgb)＜10g/dl定义的微血管病溶血性贫血(MAHA)；3)患者基础血清肌酐增高1倍定义的急性肾功不全或由排尿量＜0.5ml/kg/小时定义的少尿；以及4)正常的凝固时间(PT、PTT和纤维蛋白原)。如果患者接受了抗凝剂或一种研究药物，则将患者从所述试验中剔除。本研究还剔除了有呼吸道或胃肠道活动性出血的患者。

将符合所有准入标准和非剔除标准的患者随机安排接受安慰剂或接受96小时内输入剂量最高为48μg/kg/小时的r-aPC，先前已证实该剂量可使aPTT比基础值增高2倍。在研究期间收集下述数据：血红蛋白、血小板计数、血清肌酐、24小时排尿量、抽搐发作的次数和输注浓集红细胞的次数。在不输注血小板时，持续2天血小板计数＞100×10⁹细胞/L定义分析的初步终点，即疾病缓解的时间。

因此，用具有抗凝和纤维蛋白原溶解活性以及使PAI-1灭活能力的r-aPC的治疗方法可用于治疗TTP和HUS患者发生的血栓形成性微血管病。

Claims (10)

1.治疗血栓形成性血小板减少性紫癜和溶血性尿毒综合征的方法，该方法包括给予所述患者药学有效剂量的C蛋白。

2.权利要求1的方法，其中所述C蛋白是人C蛋白酶原。

3.权利要求1的方法，其中所述C蛋白是活化的人C蛋白。

4.权利要求3的方法，其中所述活化的人C蛋白的量为约1μg/kg/小时到约96μg/kg/小时。

5.权利要求4的方法，其中所述活化的人C蛋白通过约1小时到约240小时的连续输注给予。

6.治疗需要这种治疗的血栓形成性血小板减少性紫癜和溶血性尿毒综合征患者的方法，该方法包括给予所述患者药学有效剂量的活化C蛋白，这样使活化C蛋白的血浆水平达到约2ng/ml到约300ng/ml。

7.权利要求6的方法，其中所述活化的C蛋白以快速浓注给予。

8.权利要求6的方法，其中所述活化的C蛋白通过约1到约240小时的连续输注给予。

9.权利要求6的方法，其中所述活化的C蛋白首先以快速浓注给药，然后再以连续输注的方式给予。

10.权利要求9的方法，其中将活化C蛋白的血浆水平范围达到约为2ng/ml到约300ng/ml所需要的所述活化C蛋白的1/3量快速浓注给予，随后将所述活化C蛋白剩余的2/3量连续输注给予。