JPS60248621A - 一本鎖組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−の安定化方法 - Google Patents
一本鎖組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−の安定化方法Info
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- JPS60248621A JPS60248621A JP59102708A JP10270884A JPS60248621A JP S60248621 A JPS60248621 A JP S60248621A JP 59102708 A JP59102708 A JP 59102708A JP 10270884 A JP10270884 A JP 10270884A JP S60248621 A JPS60248621 A JP S60248621A
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- G—PHYSICS
- G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
- G03C—PHOTOSENSITIVE MATERIALS FOR PHOTOGRAPHIC PURPOSES; PHOTOGRAPHIC PROCESSES, e.g. CINE, X-RAY, COLOUR, STEREO-PHOTOGRAPHIC PROCESSES; AUXILIARY PROCESSES IN PHOTOGRAPHY
- G03C1/00—Photosensitive materials
- G03C1/005—Silver halide emulsions; Preparation thereof; Physical treatment thereof; Incorporation of additives therein
- G03C1/04—Silver halide emulsions; Preparation thereof; Physical treatment thereof; Incorporation of additives therein with macromolecular additives; with layer-forming substances
- G03C1/047—Proteins, e.g. gelatine derivatives; Hydrolysis or extraction products of proteins
- G03C2001/0471—Isoelectric point of gelatine
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、−木調組織プラスミノーゲンアクのである。
（従来技術）
従来、プラスミノーゲンアクチベーターとしては、人尿
または腎臓細胞の組織培養液よシ抽出精製したウロキナ
ーゼが使用されている。しかし、ウロキナーゼは、その
プラスミノーゲンアクチベーター活性によって血栓溶解
作用を示す以外に、血中のフィブリノーゲン、α宜−プ
ラスミンインヒビター、プラスミノーゲンを低下させる
ために、これを血中に投与すると、出血や過耐性（ｔａ
ｃｈｙｐｈｙｌａｘｉｓ ）を起す欠点がある０寸た、
ウロキナーゼはフィブリンに対する親和性をもたないの
で、治療に際し、必要な効果を得るには大量に投与する
場合が多く、内出血等の副作用が発現することが知られ
ている。
または腎臓細胞の組織培養液よシ抽出精製したウロキナ
ーゼが使用されている。しかし、ウロキナーゼは、その
プラスミノーゲンアクチベーター活性によって血栓溶解
作用を示す以外に、血中のフィブリノーゲン、α宜−プ
ラスミンインヒビター、プラスミノーゲンを低下させる
ために、これを血中に投与すると、出血や過耐性（ｔａ
ｃｈｙｐｈｙｌａｘｉｓ ）を起す欠点がある０寸た、
ウロキナーゼはフィブリンに対する親和性をもたないの
で、治療に際し、必要な効果を得るには大量に投与する
場合が多く、内出血等の副作用が発現することが知られ
ている。
すなわち、ウロキナーゼによって循環血液中で生成され
るプラスミンは、血中のプラスミンインヒビタ−と結合
して速やかに失活するため、治療効果をあげるためには
、これらを大量に投与して、血中のグラスミンインヒビ
ターのｆｔｅ上回るプラスミンを生成する必要がある。
るプラスミンは、血中のプラスミンインヒビタ−と結合
して速やかに失活するため、治療効果をあげるためには
、これらを大量に投与して、血中のグラスミンインヒビ
ターのｆｔｅ上回るプラスミンを生成する必要がある。
しかし、大量のプラスミンが生成さ名るとフィブリノー
ゲンを分解して、出血傾向という副作用を引き起すこと
になる。これに対しフィブリンに親和性が高く、フィブ
リン上でプラスミンを生成することができれば、循環血
液中のプラスミンインヒビクーの影響を受けることなく
、少量でフィブリンを分解することができ、循環血液中
のフィブリノーゲンを分解する作用も弱くなる。かかる
実情からフィブリン親和性が高く、少量でかつ血栓溶解
活性が高く、副作用の少ない血栓溶解剤が望まれている
。 − このようなプラスミノーゲンアクチベーターとして、大
または動物の子宮、腎、肺、小腸、包皮、血管壁などの
組織、これら組織由来の正常細胞培養液または腫瘍細胞
培養液中に存在する組線プラスミノーゲンアクテベータ
−（以下ｒｔ−ｐＡＪと称する）が注目され、血栓溶解
剤としての開発が期待されている。
ゲンを分解して、出血傾向という副作用を引き起すこと
になる。これに対しフィブリンに親和性が高く、フィブ
リン上でプラスミンを生成することができれば、循環血
液中のプラスミンインヒビクーの影響を受けることなく
、少量でフィブリンを分解することができ、循環血液中
のフィブリノーゲンを分解する作用も弱くなる。かかる
実情からフィブリン親和性が高く、少量でかつ血栓溶解
活性が高く、副作用の少ない血栓溶解剤が望まれている
。 − このようなプラスミノーゲンアクチベーターとして、大
または動物の子宮、腎、肺、小腸、包皮、血管壁などの
組織、これら組織由来の正常細胞培養液または腫瘍細胞
培養液中に存在する組線プラスミノーゲンアクテベータ
−（以下ｒｔ−ｐＡＪと称する）が注目され、血栓溶解
剤としての開発が期待されている。
ｔ−ＰＡは免疫学的活性およびフィブリンに対する親和
性の点でウロキナーゼと相違している。
性の点でウロキナーゼと相違している。
そして、ｔ−ＰＡはウロキナーゼに対する抗体とは反応
せず、フィブリンと強固に結合し、また、血中において
フィブリンの存在下でアクチベーターとしての強い活性
を発現するものである○したがって、ｔ−ＰＡはウロキ
ナーゼと異なシ、上述の如き副作用がなく、少量で充分
な血栓溶解活性を有する、ウロキナーゼに代わる医薬品
としての期待が太きいものである。
せず、フィブリンと強固に結合し、また、血中において
フィブリンの存在下でアクチベーターとしての強い活性
を発現するものである○したがって、ｔ−ＰＡはウロキ
ナーゼと異なシ、上述の如き副作用がなく、少量で充分
な血栓溶解活性を有する、ウロキナーゼに代わる医薬品
としての期待が太きいものである。
本発明に用いるｔ−ＰＡは、人または動物由来の組織ま
たはこれら組織由来の組織培養液、あるいは遺伝子操作
法によりｔ−ＰＡ産生能を有する哺乳動物細胞捷たは微
生物の培養物から抽出精製することができる。そのよう
な例を挙げれば、ｔ−ＰＡ産生能を有する細胞、たとえ
ば、人胎児の腎、腸、肺、心臓、輸尿管、皮膚、包皮お
よび全胎児由来の正常二倍体細胞、人の胎盤由来の細胞
、あるいは人の腎、腸、肺、甲状腺、心臓、輸尿管、皮
屑由来の正常二倍体細胞、人黒色腫細胞または類似の性
質を有する腫瘍細胞等、特に好ましくは、人胎児の腎、
肺または包皮由来の正常二倍体細胞を用いた組織培養液
を用いることができる。代表的な培養方法については、
参考例に例示する。
たはこれら組織由来の組織培養液、あるいは遺伝子操作
法によりｔ−ＰＡ産生能を有する哺乳動物細胞捷たは微
生物の培養物から抽出精製することができる。そのよう
な例を挙げれば、ｔ−ＰＡ産生能を有する細胞、たとえ
ば、人胎児の腎、腸、肺、心臓、輸尿管、皮膚、包皮お
よび全胎児由来の正常二倍体細胞、人の胎盤由来の細胞
、あるいは人の腎、腸、肺、甲状腺、心臓、輸尿管、皮
屑由来の正常二倍体細胞、人黒色腫細胞または類似の性
質を有する腫瘍細胞等、特に好ましくは、人胎児の腎、
肺または包皮由来の正常二倍体細胞を用いた組織培養液
を用いることができる。代表的な培養方法については、
参考例に例示する。
人体に投与するｔ−ＰＡとしては、人の正常細胞由来の
ｔ−ＰＡが望捷しい。
ｔ−ＰＡが望捷しい。
本発明に用いるｔ’−ＰＡの精製法の例とし、ては、Ｉ
フィブリンを結合させたセファロースを用いるフィブリ
ンセファロースカラムクロマトグラフィー、カルボキシ
メチル基を結合させたセファロースを用いるＣＭセファ
ロースカラムクロマトグラフィー、リジンを結合させた
セファロースを用いるリジンセファロースカラムクロマ
トグラフィー、亜鉛キレートセファロースを用いＩる配
位子交灼クロマトグラフィー、コンカナバリンＡを結合
させたセファロースを用いるレクチンカラムクロマトグ
ラフィー、本発明物質と特異的に結合する抗体を結合し
た抗体アフィニティークロマトグラフィー、架橋したデ
キストラン粒子を用いるゲル濾過を挙げることができる
。
フィブリンを結合させたセファロースを用いるフィブリ
ンセファロースカラムクロマトグラフィー、カルボキシ
メチル基を結合させたセファロースを用いるＣＭセファ
ロースカラムクロマトグラフィー、リジンを結合させた
セファロースを用いるリジンセファロースカラムクロマ
トグラフィー、亜鉛キレートセファロースを用いＩる配
位子交灼クロマトグラフィー、コンカナバリンＡを結合
させたセファロースを用いるレクチンカラムクロマトグ
ラフィー、本発明物質と特異的に結合する抗体を結合し
た抗体アフィニティークロマトグラフィー、架橋したデ
キストラン粒子を用いるゲル濾過を挙げることができる
。
その具体的な分離精製法の一例を挙げれば、人胎児の腎
、肺捷たは包皮由来の正常二倍体細胞を用いた組織培養
液を硫酸アンモニウムを加えて、生ずる沈殿を酢酸緩衝
液で溶解し、同一の緩衝液で透析してカルボキシメチル
セファロースカラムに吸着させる。これを塩化ナトリウ
ムの濃度を上げて溶出させ、限外沢過にて濃縮し、トリ
ス塩酸緩衝液にて透析してリジンセファロースカラムに
吸着させる。これをε−アミノカプロン酸を溶出溶媒と
して用いて得られる溶出液を、再び限外沖過にて濃縮す
る。濃縮液を七フアクリルＳ−２００（ファルマシア社
登録商標）を用いてゲル濾過をすることにより、本発明
に用いるプラスミノーゲンアクチベーターが得られる。
、肺捷たは包皮由来の正常二倍体細胞を用いた組織培養
液を硫酸アンモニウムを加えて、生ずる沈殿を酢酸緩衝
液で溶解し、同一の緩衝液で透析してカルボキシメチル
セファロースカラムに吸着させる。これを塩化ナトリウ
ムの濃度を上げて溶出させ、限外沢過にて濃縮し、トリ
ス塩酸緩衝液にて透析してリジンセファロースカラムに
吸着させる。これをε−アミノカプロン酸を溶出溶媒と
して用いて得られる溶出液を、再び限外沖過にて濃縮す
る。濃縮液を七フアクリルＳ−２００（ファルマシア社
登録商標）を用いてゲル濾過をすることにより、本発明
に用いるプラスミノーゲンアクチベーターが得られる。
かくして得られるｔ−ＰＡは、ポリペブタイド鎖が一本
鎖のものと、精製の過程で蛋白質分解酵素の作用を受け
てポリペブタイド鎖が二本鎖になっているものとの混合
物で得られる場合が多い。一本領ｔ−ＰＡから二本鎖ｔ
−ＰＡへの変換が起ると、Ｂｏｃ −Ｐｈｅ −８ｅｒ
−Ａｒｇ ＭＣＡなどの合成基質分解活性が著しく上
昇する。二本鎖ｔ−ＰＡは天然型一本領ｔ−ＰＡが分解
して生じた生成物であるから、人体に投与するには好ま
しくなく、。
鎖のものと、精製の過程で蛋白質分解酵素の作用を受け
てポリペブタイド鎖が二本鎖になっているものとの混合
物で得られる場合が多い。一本領ｔ−ＰＡから二本鎖ｔ
−ＰＡへの変換が起ると、Ｂｏｃ −Ｐｈｅ −８ｅｒ
−Ａｒｇ ＭＣＡなどの合成基質分解活性が著しく上
昇する。二本鎖ｔ−ＰＡは天然型一本領ｔ−ＰＡが分解
して生じた生成物であるから、人体に投与するには好ま
しくなく、。
血栓治療薬として用い名湯合は、生体内に存在する天然
型−木調ｔ−ＰＡが望オしい。
型−木調ｔ−ＰＡが望オしい。
−木調ｔ−ＰＡを得るには、前述の精製各工程にアプロ
チニン等の蛋白分解酵素阻害剤を添加して操作を行えば
よい。
チニン等の蛋白分解酵素阻害剤を添加して操作を行えば
よい。
（発明が解決しようとする問題点）
前記のように、二本鎖ｔ−ＰＡは人体に投与するには好
ましくなく、血栓治療薬として用いる場合は、生体内に
存在する天然型一本頓ｔ −ＰＡが望にし、いのである
が、一本鎖ｔ−ＰＡは製剤化する１県の熱処理などによ
って、二本鎖ｔ−ＰＡへの変換が進行するので、この変
換を防止して、安定に保持できるようにすることが要求
される。
ましくなく、血栓治療薬として用いる場合は、生体内に
存在する天然型一本頓ｔ −ＰＡが望にし、いのである
が、一本鎖ｔ−ＰＡは製剤化する１県の熱処理などによ
って、二本鎖ｔ−ＰＡへの変換が進行するので、この変
換を防止して、安定に保持できるようにすることが要求
される。
（問題を解決するための手段）
本発明者らにＬ、前記の問題点を解決するために鋭意研
究を行なった結果、精製ゼラチンを添加すれば、プラス
ミノーゲンアクチペーター活性に影響を及ぼすことなく
、−木調ｔ−ＰＡの変換を防止できることを見出し、本
発明に到達した○ 本発明で用いる精製ゼラチンは、日本薬局方に記載の注
射用の精製ゼラチンであシ、酸処理を行なって精製した
もの、アルカリ処理を行なって精製したもののいずれを
用いてもよいが、よシ少ない使用量で効果を発揮する、
等電点７．０〜９．０を有する酸処理ゼラチンが好まし
く、人体に投与する場合には、抗原性の問題を回避する
ために、低分子のものが望ましく、平均分子量の範囲が
３，０００〜５０，０００、より好捷しくに４．０００
〜２０，０００のものが望ましい。
究を行なった結果、精製ゼラチンを添加すれば、プラス
ミノーゲンアクチペーター活性に影響を及ぼすことなく
、−木調ｔ−ＰＡの変換を防止できることを見出し、本
発明に到達した○ 本発明で用いる精製ゼラチンは、日本薬局方に記載の注
射用の精製ゼラチンであシ、酸処理を行なって精製した
もの、アルカリ処理を行なって精製したもののいずれを
用いてもよいが、よシ少ない使用量で効果を発揮する、
等電点７．０〜９．０を有する酸処理ゼラチンが好まし
く、人体に投与する場合には、抗原性の問題を回避する
ために、低分子のものが望ましく、平均分子量の範囲が
３，０００〜５０，０００、より好捷しくに４．０００
〜２０，０００のものが望ましい。
ゼラチンの使用量は、−木調ｔ−ＰＡの活性、蛋白質量
等に関係なく、一定量添加すれば安定化効果が得られる
ので、種々の濃度で設定できるが、通常、−重鎖ｔ−Ｐ
ＡＩＯ〜５０．０００単位を含む溶液中に、０．０５〜
１０ ％ （ｗ／ｖ ）の範囲で使用すれば、本発明の
効果を達成することができる。
等に関係なく、一定量添加すれば安定化効果が得られる
ので、種々の濃度で設定できるが、通常、−重鎖ｔ−Ｐ
ＡＩＯ〜５０．０００単位を含む溶液中に、０．０５〜
１０ ％ （ｗ／ｖ ）の範囲で使用すれば、本発明の
効果を達成することができる。
一本領ｔ−ＰＡは凍結乾燥によシ粉末化し製品とされる
が、この場合においても、ゼラチンを添加しておくこと
により、活性の低下は殆んどみられない。ゼラチンの添
加量は、最終投与時の混入濃度を考慮して、通常、製剤
当り、０．５〜５係（ｗ／ｖ ）が好捷しい。
が、この場合においても、ゼラチンを添加しておくこと
により、活性の低下は殆んどみられない。ゼラチンの添
加量は、最終投与時の混入濃度を考慮して、通常、製剤
当り、０．５〜５係（ｗ／ｖ ）が好捷しい。
かくして得られた一本＠ｔ−ＰＡ製剤は、長期間保存し
ても一本領ｔ−ＰＡから二本鎖ｔ−ＰＡへの変換は進行
せず極めて安定である。
ても一本領ｔ−ＰＡから二本鎖ｔ−ＰＡへの変換は進行
せず極めて安定である。
なお、ｔ−ＰＡの力価測定は次の方法で行なった（以下
の実験についても同じ）。
の実験についても同じ）。
９５係凝固フイブリノーゲン（プラスミノーゲン含量約
５０カゼイン単位／ｆ凝固蛋白）を原料として作製した
寒天加フィブリン平板を用い、ウロキナーゼを標準品と
するプレート法で測定した。本発明に用いるｔ−ＰＡ浴
溶液、１％ゼラチン、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０
．１係窒化ナトリウムを含む０．０６７Ｍ）リス塩酸緩
衝液（ＰＩ（８，０）で希釈し、フィブリン平板上で１
０１Ｕ／ｒｎｌのウロキナーゼと同じ溶解窓を示す本発
明に用いるｔ−ＰＡ浴溶液濃度を１０１Ｊ／ｍｌとした
。
５０カゼイン単位／ｆ凝固蛋白）を原料として作製した
寒天加フィブリン平板を用い、ウロキナーゼを標準品と
するプレート法で測定した。本発明に用いるｔ−ＰＡ浴
溶液、１％ゼラチン、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０
．１係窒化ナトリウムを含む０．０６７Ｍ）リス塩酸緩
衝液（ＰＩ（８，０）で希釈し、フィブリン平板上で１
０１Ｕ／ｒｎｌのウロキナーゼと同じ溶解窓を示す本発
明に用いるｔ−ＰＡ浴溶液濃度を１０１Ｊ／ｍｌとした
。
また、合成基質に対する氷解活性は、次の方法で測定し
、た。すなわち、本発明に用いるｔ−ＰＡ（１００Ｕ／
ｍｅ ） ５０ ｔｔｔに、０．１Ｍ塩化ナトリウムを
含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）４５０
ｐ Ｌに溶解した合成基質（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−８ｅｒ
−Ａｒｇ−ＭＣＡ ） ０．１ ｍＭを加え、３７℃で
１５分間反応させる。２０％酢酸０．５ ｍｌを加え反
応を停止させ、これを励起波長３７０ｎｍ、スリット幅
５ｎｍ％螢光波長４６０ ｎ ｍ ％スリット幅５ｎｍ
で生ずるアミノメチルクマリン（ＡＭＣ）を測定し、氷
解活性をめた。
、た。すなわち、本発明に用いるｔ−ＰＡ（１００Ｕ／
ｍｅ ） ５０ ｔｔｔに、０．１Ｍ塩化ナトリウムを
含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）４５０
ｐ Ｌに溶解した合成基質（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−８ｅｒ
−Ａｒｇ−ＭＣＡ ） ０．１ ｍＭを加え、３７℃で
１５分間反応させる。２０％酢酸０．５ ｍｌを加え反
応を停止させ、これを励起波長３７０ｎｍ、スリット幅
５ｎｍ％螢光波長４６０ ｎ ｍ ％スリット幅５ｎｍ
で生ずるアミノメチルクマリン（ＡＭＣ）を測定し、氷
解活性をめた。
参考例
ヒト胎児肺細胞を５００−容スビナーフラスコに１０５
ｃｅ］、１ｓ／ｍＪの密度で２−５ ”？／ｍｅ濃度の
サイトデツクスＩ（細胞培養用ビーズ担体、ファルマシ
ア社登録商標）と共に植え込み、３７℃、５チ炭酸ガス
を含む空気中で、成育培地として１０チウシ胎児血清を
含むメジウム■χを３００ｔｎｅ添加し、６０ ｒｐｍ
の回転数で攪拌しながら懸濁培養する。８日間培養し、
細胞を充分増殖させた後、生理食塩水で細胞が接着した
ビーズ担体を洗浄し、血清を含１ない０５係ラクトアル
ブミン氷解物を含むメジウム１９０３００ｍ／！におき
かえ、６０ ｒｐｍの回転数で攪拌しながら培養する。
ｃｅ］、１ｓ／ｍＪの密度で２−５ ”？／ｍｅ濃度の
サイトデツクスＩ（細胞培養用ビーズ担体、ファルマシ
ア社登録商標）と共に植え込み、３７℃、５チ炭酸ガス
を含む空気中で、成育培地として１０チウシ胎児血清を
含むメジウム■χを３００ｔｎｅ添加し、６０ ｒｐｍ
の回転数で攪拌しながら懸濁培養する。８日間培養し、
細胞を充分増殖させた後、生理食塩水で細胞が接着した
ビーズ担体を洗浄し、血清を含１ない０５係ラクトアル
ブミン氷解物を含むメジウム１９０３００ｍ／！におき
かえ、６０ ｒｐｍの回転数で攪拌しながら培養する。
５日目毎に、この培地を交換しながら２５日培養し、−
水銀ｔ−ＰＡを含む培養液を回収する。
水銀ｔ−ＰＡを含む培養液を回収する。
得られた培養液１．５１を抗つロキナーゼＩｇ−Ｇセフ
ァロースカラム通過後、フィブリンセファロースカラム
（１，’５”φＸ １２ ｃｍ ）に吸着させる００．
１％ツイン８０および２５ ＫＩＵ／ｍｌアプロチニン
を含む０．５ Ｍ塩化ナトリウム溶液で充分洗浄後、０
゜１係ツイン８０および２５ ＫＩＵ／ｄアプロチニン
を含む０．５ Ｍアルギニン溶液で溶出し、ｔ−ＰＡの
活性を有する部分の溶液６５ｍｅを集める。ｔＰＡの活
性ｉ−１： ６８ Ｕ／ｍ１．、比活性は１０２０Ｕ／
Ａ２８０であった。
ァロースカラム通過後、フィブリンセファロースカラム
（１，’５”φＸ １２ ｃｍ ）に吸着させる００．
１％ツイン８０および２５ ＫＩＵ／ｍｌアプロチニン
を含む０．５ Ｍ塩化ナトリウム溶液で充分洗浄後、０
゜１係ツイン８０および２５ ＫＩＵ／ｄアプロチニン
を含む０．５ Ｍアルギニン溶液で溶出し、ｔ−ＰＡの
活性を有する部分の溶液６５ｍｅを集める。ｔＰＡの活
性ｉ−１： ６８ Ｕ／ｍ１．、比活性は１０２０Ｕ／
Ａ２８０であった。
この溶液を０．１％ツイン８０および２５ ＫＩＵ／ｍ
７！アプロチニンを含む生理食塩水に透析後、コンカナ
バリンＡセファロースカラム（１φ×２５ ｃｍ ）に
吸着させ、１Ｍ塩化ナトリウム、０．１；゛４ツイン８
０および２５ ＫＩＵ／ｄアプロチニンを含む０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄後、当該溶液から
０．４Ｍメチルマンノシド、２Ｍロダンアンモニウム、
０．１％ツイン８０および２５ＫＩＴ、レトフアプロチ
ニンを含む０．０］、Ｍリン酸緩衝液（’ ｐＪｉ ７
． Ｏ）まで直線的に濃度を変え、ｔ −ＰＡケ溶出す
る。得られた溶液は液量３ｌ−１ｔ−ＰＡの活性は１０
２ Ｕ／ｍ（！、比活性ば６５ｏ ｏ Ｕ／Ａ ２８０
であった。得られた溶液を限外済過で濃縮し、セファデ
ックスＧ−１５０でゲル濾過して、活性を有する部分を
１５ｍ／！回収した。活性は１５１Ｕ肩、比活性は１３
１００ Ｕ／Ａ ２８０であった。
７！アプロチニンを含む生理食塩水に透析後、コンカナ
バリンＡセファロースカラム（１φ×２５ ｃｍ ）に
吸着させ、１Ｍ塩化ナトリウム、０．１；゛４ツイン８
０および２５ ＫＩＵ／ｄアプロチニンを含む０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄後、当該溶液から
０．４Ｍメチルマンノシド、２Ｍロダンアンモニウム、
０．１％ツイン８０および２５ＫＩＴ、レトフアプロチ
ニンを含む０．０］、Ｍリン酸緩衝液（’ ｐＪｉ ７
． Ｏ）まで直線的に濃度を変え、ｔ −ＰＡケ溶出す
る。得られた溶液は液量３ｌ−１ｔ−ＰＡの活性は１０
２ Ｕ／ｍ（！、比活性ば６５ｏ ｏ Ｕ／Ａ ２８０
であった。得られた溶液を限外済過で濃縮し、セファデ
ックスＧ−１５０でゲル濾過して、活性を有する部分を
１５ｍ／！回収した。活性は１５１Ｕ肩、比活性は１３
１００ Ｕ／Ａ ２８０であった。
得られたｔ−ＰＡはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動
による分析で、１係ドデシル硫酸ナトリウム、１チβ−
メルカプトエタノールおよび２０チグリセリン存在下、
１００℃５分間の還元処理で分解しないことから、−水
銀であることが確められた。
による分析で、１係ドデシル硫酸ナトリウム、１チβ−
メルカプトエタノールおよび２０チグリセリン存在下、
１００℃５分間の還元処理で分解しないことから、−水
銀であることが確められた。
（発明の効果）
後記実施例の結果から明らかなように、本発明によれば
、−水銀ｔ−ＰＡから二本鎖ｔ−ＰＡへの変換が防止さ
れ、安定に保持される。
、−水銀ｔ−ＰＡから二本鎖ｔ−ＰＡへの変換が防止さ
れ、安定に保持される。
（実施例）
実験例
（１）ゼラチンの種類による効果
０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％ツイン８゜を含
む水溶液に、−水銀ｔ ＰＡＩ ＯＯＵ／ｍｇとなるよ
うに添加する。この溶液に安定化剤として種々のゼラチ
ンを添加し、３７℃でインキュベートし、０日、２日、
５日にフィブリン平板法にて活性残存率を測定し、１だ
、合成基質Ｂｏｃ−Ｐｈｅ −８ｅｎ Ａｎｇ ＭＣＡ
に対する水解活性を測定した。
む水溶液に、−水銀ｔ ＰＡＩ ＯＯＵ／ｍｇとなるよ
うに添加する。この溶液に安定化剤として種々のゼラチ
ンを添加し、３７℃でインキュベートし、０日、２日、
５日にフィブリン平板法にて活性残存率を測定し、１だ
、合成基質Ｂｏｃ−Ｐｈｅ −８ｅｎ Ａｎｇ ＭＣＡ
に対する水解活性を測定した。
結果を第１表に示す。
七４プ １ 表
※ １μＭＡＭＣ＝１００チとして算出※※ 精製ゼラ
チン（１）：等電点７〜９ 分子ｆｔ ７，０００±２
．０００ ※※※ １チアルブミン含有 （２） （１，）と同様に調製した溶液に、０．１係ま
たは１条の安定化剤を添加し、４℃に保存し、０日、１
０日、２０日にＰＡ活性および合成基質氷解活性を（１
）と同様にして測定した。
チン（１）：等電点７〜９ 分子ｆｔ ７，０００±２
．０００ ※※※ １チアルブミン含有 （２） （１，）と同様に調製した溶液に、０．１係ま
たは１条の安定化剤を添加し、４℃に保存し、０日、１
０日、２０日にＰＡ活性および合成基質氷解活性を（１
）と同様にして測定した。
なお、コントロールは無添加、比較としてアルブミンを
添加したものを用いた。
添加したものを用いた。
結果を第２表に示す。
第２表
以上の結果から、一本領ｔ＝ＰＡに精製ゼラチンを添加
することに」：す、二本鎖への変換が防止され、安定に
保持されていることがわかる。
することに」：す、二本鎖への変換が防止され、安定に
保持されていることがわかる。
一方、安定化剤として知られているアルブミンにけ、こ
の変換防止効果はなかった。寸だ、ｔ−ＰＡのＰＡ活性
に対しては影響しないことが明らかである。
の変換防止効果はなかった。寸だ、ｔ−ＰＡのＰＡ活性
に対しては影響しないことが明らかである。
製剤例
組織プラスミノーゲンアクチベークー
２４．０００単位
酸処理ゼラチン ２０Ｔｎ９
アンニトール １ｏｏ＋＋ｖ
塩化ナトリウム ７，８ｑ
リン酸ナトリウム １５．４哩
上記成分を注射用蒸留水２ ｍｌに溶解し、無菌バイア
ルに入れ、−３０℃〜−４０℃で２時間予備凍結し、−
３０℃〜＋２０℃、真空度０．０５〜０． Ｉ Ｔｏｒ
ｒで３５時間、−次乾燥し、次いで、３０℃、真空度０
．０１〜０．０５ Ｔｏｒｒで５時間、二次乾燥して、
注射用バイアルを製造した。
ルに入れ、−３０℃〜−４０℃で２時間予備凍結し、−
３０℃〜＋２０℃、真空度０．０５〜０． Ｉ Ｔｏｒ
ｒで３５時間、−次乾燥し、次いで、３０℃、真空度０
．０１〜０．０５ Ｔｏｒｒで５時間、二次乾燥して、
注射用バイアルを製造した。
Claims (1)
- 一本鎖組織プラスミノーゲンアクチベーターに精製ゼラ
チンを添加す、ることを特徴とする一本鎖組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターノ安定化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59102708A JPS60248621A (ja) | 1984-05-23 | 1984-05-23 | 一本鎖組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−の安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59102708A JPS60248621A (ja) | 1984-05-23 | 1984-05-23 | 一本鎖組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−の安定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60248621A true JPS60248621A (ja) | 1985-12-09 |
| JPH0527607B2 JPH0527607B2 (ja) | 1993-04-21 |
Family
ID=14334765
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59102708A Granted JPS60248621A (ja) | 1984-05-23 | 1984-05-23 | 一本鎖組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−の安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60248621A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62292729A (ja) * | 1986-06-12 | 1987-12-19 | Toyobo Co Ltd | ヒト子宮組織由来プラスミノ−ゲン活性化因子製剤 |
| WO2011149016A1 (ja) * | 2010-05-26 | 2011-12-01 | 公立大学法人奈良県立医科大学 | 血栓溶解酵素含有複合体 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58224687A (ja) * | 1982-06-24 | 1983-12-27 | Toubishi Yakuhin Kogyo Kk | プラスミノ−ゲン活性化酵素剤及びその新規製造方法 |
-
1984
- 1984-05-23 JP JP59102708A patent/JPS60248621A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58224687A (ja) * | 1982-06-24 | 1983-12-27 | Toubishi Yakuhin Kogyo Kk | プラスミノ−ゲン活性化酵素剤及びその新規製造方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62292729A (ja) * | 1986-06-12 | 1987-12-19 | Toyobo Co Ltd | ヒト子宮組織由来プラスミノ−ゲン活性化因子製剤 |
| WO2011149016A1 (ja) * | 2010-05-26 | 2011-12-01 | 公立大学法人奈良県立医科大学 | 血栓溶解酵素含有複合体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0527607B2 (ja) | 1993-04-21 |
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