JPH0195774A

JPH0195774A - 修飾スーパーオキサイド・ジスムターゼ

Info

Publication number: JPH0195774A
Application number: JP25161787A
Authority: JP
Inventors: Kazuhide Yoshikawa; 和秀吉川
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1987-10-07
Filing date: 1987-10-07
Publication date: 1989-04-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、化学修飾されることにより疎水性の増した新
規スーパーオキサイド・ジスムターゼ（以下ＳＯＤと略
記する）に関するものである。

ＳＯＤは酸素分子が一電子還元をうけて生じるスーパー
オキサイド・ラジカル（０２−）の不均化反応、つまり０−＋Ｏ＋２Ｈ＋→Ｏ＋Ｈ０を触媒する酵素であって広く生物界に存在することが知
られている。近年このＳＯＤの薬理作用に注目か向けら
れ、自己免疫性疾患において生じる炎症などに効果を有
し、慢性リュウマチ、放射線療法における副作用の治療
、防止剤等として開発が進められている。

（従来の技術）しかし、上記のような薬理効果が期待できるにもかかわ
らずＳＯＤを単独で血中投与した際の体内半減期はわず
か４〜６分と短く、速やかに腎から尿中に排泄されてし
まうためその薬理効果はほとんど有効に発現できないの
が現状である。僅かに、関節腔内への直接注入等の局所
的な治療でのみ効果が認められているにすぎない。その
ため従来よりＳＯＤの体内半減期を長くするため多くの
試みがなされてきた。

例えばポリエチレングリコールによる化学修飾［イー・
ボッチュ、ジー中ピー・ベロー、エフ・エム・ベロネー
ズ（Ｅ、Ｂｏｃｃｕ、Ｇ、Ｐ、Ｖｅｌｏ、　Ｐ、Ｍ、Ｖ
ｅｒｏｎｅｓｅ　）　＋　ファーマコロジカル　リサー
チ　アンドコミュニケーション（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、
Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、）。

１４巻　１１３ページ（１９ｇ２）、特公昭６１−２４
９３８８号公報］、疎水性物質との結合［生化学　５８
巻　５９２ページ　（１９８６）　１等の例が報告され
ている。

また血中では、親水性低分子化合物（低分子のタンパク
質など）は速やかに腎糸球体濾過により尿中に排泄され
るのに比べ、疎水性を合せ持つ両親媒性化合物（胆汁酸
など）は低分子であっても腎糸球体濾過をうけにくい。

その理由が水に対する溶解度の低い両親媒性化合物は、
血中ではアルブミンに結合することにより見掛上高分子
化されて運ばれるためであることが知られており［ティ
ー・ベーター（Ｔ、Ｐｅｔｅｒ　）　、　ジャーナル　
オブアドパンスト　クリニカル　ケミストリー（Ｊ、Ａ
ｄｖ、ｃｌｉｎ、ｃｈｅｍ、）　、　　１３巻　３７ペ
ージ　（１９７０）］、これを利用し、ＳＯＤと疎水性
物質とを結合した例も報告されている。

（発明が解決しようとする問題点） −船釣にポリエチレングリコールによる修飾法では５０
％近くの酵素活性が失われてしまう。またポリアルキレ
ングリコール又はその誘導体の両末端にＳＯＤが結合し
た化合物は、修飾による活性低下がないとされているが
、高分子架橋化することにより分子量に大きく幅か生じ
るという問題がある。また分子量が数１０万の高分子体
を生成するため、特に静脈注射を行う場合には、血管閉
塞等を起こす恐れがある。これを防ぐためには、低分子
量のＳＯＤであることが好ましいが、前記したようにＳ
ＯＤ単独で血中投与した際の体内半減期は短く、速やか
に尿中に排泄されるため有効な効果がみられない。

（問題点を解決するための手段）本発明者はＳＯＤ活性の低下がなくかつ血中安定性の期
待できる修飾ＳＯＤを開発すべく鋭意研究を重ねた結果
、高級脂肪酸により化学修飾されたＳＯＤが安定でかつ
修飾による活性低下もほとんどないことを見出だし本発
明を完成するに至った。すなわち本発明は、ＳＯＤを高
級脂肪酸で化学修飾してなる修飾ＳＯＤを提供するもの
である。

本発明における修飾ＳＯＤは、分子量３５０００〜４０
０００であり修飾後に活性は９０％以上を保持しかつＳ
ＯＤ１分子当たりが結合している脂肪酸の数は１〜１５
程度である。

本発明で用いる高級脂肪酸としては、炭素数３から３０
の範囲の天然物から得られる一価の脂肪酸または合成脂
肪酸で、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ス
テアリン酸、オレイン酸。

ヤシ油脂肪酸、牛脂脂肪酸などの脂肪酸又はその塩が用
いられる。

ＳＯＤと高級脂肪酸との結合反応は脂肪酸を塩化チオニ
ル、五塩化リン、三塩化リン等により脂肪酸クロリドと
し活性化した後、通常のショツテン−バウマン反応（Ｓ
ｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎｍ反応）を行ないＳＯＤ分
子中に存在する一級及び二級アミンと反応しアミド結合
を生成する。塩素に代えて臭素、ヨウ素など他のハロゲ
ン化物でも同様な脂肪酸ハライドを合成し得るが、塩化
物が最も一般的である。また、市販の脂肪酸ハライドを
使用しても本発明においてなんら問題はない。これら酸
ハライドによるアシル化は常温常圧、弱アルカリ性水溶
液中で行なうことができ、かつ高価な縮合剤などを使用
する必要もないので本発明のような用途には好ましい。

また高濃度での反応が容易であるのもこの方法の特徴で
ある。具体的には水又はｐＨ６，８〜１１．０、好まし
くはｐＨ８，０〜１０．０の緩衝液に対し、ＳＯＤを０
．０１〜１０．０重量％、好ましくは０．１〜５．０重
量％になるよう溶解した後撹拌しつつ脂肪酸ノ＼ライド
を徐々に滴下する。その量には特に限定はないが反応溶
液に対し０．１〜５．０容量％程度が好ましい。この除
用いる緩衝液の種類は特に限定されないか、例えばＯ，
１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。また脂肪酸ハライ
ドを滴下し、反応が進行するにつれ徐々にｐＨが低下す
るので初期のｐＨを維持するために水酸化ナトリウム水
溶液などの希アルカリを適宜加える。

反応時間は特に限定しないか、操作」二、より簡便であ
るという点において１〜６０分程度か良い。

反応終了後、該反応溶液よりアシル化ＳＯＤを精製する
方法としては、通常用いられているタンパク質の精製法
かそのまま利用できるが、疎水性が増していることに注
意しなければならない。具体的には、アセトンやエタノ
ール等の有機溶媒を添加し、沈澱としてアシル化ＳＯＤ
を集めた後カラムクロマトグラフィーにより生成する方
法などがある。本発明に使用されるＳＯＤはヒト、牛、
豚等の動物組織や赤血球又は酵母等の微生物又はＳＯＤ
の構造遺伝子をベクターにより導入された大腸菌、酵母
等の菌体等より精製されたＳＯＤいずれでも良くその由
来に限定されるものではない。

（発明の効果）本発明における修飾ＳＯＤは、修飾による活性低下かな
く、かっ血中安定性が高いので医薬剤等として有用であ
る。

（実施例）以下実施例により本発明の詳細な説明するが、本発明は
これら実施例により限定されるものではない。

実施例１牛赤血球由来のスーパーオキサイド・ジスムターゼ５．
（１ｍｇ（東ソー（株）製、比活性３０００Ｕ　／　ｍ
ｇ　）を０６１Ｍリン酸水索二ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９，０）５０ｍｇに溶解した。溶液の温度を２０°Ｃに
保ちながら撹拌しつつラウロイルクロライド（平井薬品
社製）４００μｍを徐々に滴下した。この際ｐＨを９．
０に保つため１規定ＮａＯＨを滴下しつつ行なった。滴
下終了後４０℃で１時間撹拌し、その後１５０ｍ１の冷
アセトンに反応溶液を滴下した。生じた沈澱を遠心分離
により集め、純水１０．０ｍｇに再溶解させた。不溶物
を遠心分離により除去した後、純水に対して透析し、ラ
ウロイル５ＯＤ４．５ｍｇを得た。活性回収率は９５％
、ＳＯＤ比活性は３０００　Ｕ／ｍｇ。

アミノ基の修飾率は８０％であった。

実施例２ヒト赤血球由来のスーパーオキサイド・ジスムターゼ５
　、　０　ｍｇ　（Ｓｉｇｍａ社製、比活性２５００Ｕ
／　ｍｇ　）を０．１Ｍリン酸酸水素ナナトリウム緩衝
液ｐＨ９，０）５０ｍｇに溶解した。溶液の温度を２０
°Ｃに保ちながら撹拌しつつ、ラウロイルクロライド（
平井薬品社製）４００μｍを徐々に滴下した。この際ｐ
Ｈを９．０に保つため１規定ＮａＯＨを滴下しつつ行な
った。滴下終了後４０’Ｃで１時間撹拌し、その後１５
０ｍ１の冷アセトンに反応溶液を滴下した。生じた沈澱
を遠心分離により集め、純水１０．０ｍｇに再溶解させ
た。不溶物を遠心分離により除去した後、純水に対して
透析しラウロイル５ＯＤ４．５ｍｇを得た。活性回収率
は９５％、ＳＯＤ比活性は２０００　Ｕ／ｍｇ、アミノ
基の修飾率は８５％であった。

実施例３ラウロイルクロライドの代わりにバルミトイルクロライ
ド（東京化成社製）を用いる以外は実施例１と同様の方
法により、バルミトイルＳＯＤ　　　　・４．０ｍｇを
得た。活性回収率は９５％、ＳＯＤ比活性は３０００　
Ｕ／ｍｇ、アミノ基の修飾率は８０％であった。

実施例４ラウロイルクロライドの代わりにカプリル酸クロライド
（東京化成社製）を用いる以外は実施例１と同様の方法
により、カプロイル５ＯＤ４．０［Ｉｌｇを得た。活性
回収率は９５％、ＳＯＤ比活性は３０００　Ｕ／ｍｇ、
アミノ基の修飾率は８０％であった。

本実施例において、ＳＯＤの活性はチトクロムＣ法によ
り測定し、チトクロムＣの還元が５０％阻害されるとき
のＳＯＤ活性を１単位とした［ジエイ・エム・マコード
、アイ・フリドヴイッチ（Ｊ、Ｍ、ＭｃＣｏｒｄ、１．
Ｐｒ１ｄｏｖｉｃｈ）　、ジャーナル　オブバイオロジ
カル　ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２
４４，６０４９．　　（１９６９）］　。タンパク濃度
はＰｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｋｉｔ　　（Ｂｉｏ−
ｒａｄ社製）を用い、ウシ血清アルブミンを標準タンパ
ク質として測定した。

また、アミノ基修飾率は、試料溶液０．５ｍｌに対し４
％Ｎ　ａ　ＨＣＯａ水溶液０．５ｍｌ　０．１％トリニ
トロベンゼンスルホン酸水溶液０．２ｍｌを加え、３７
℃で２時間インキュベートした後、２％ラウリル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）を含む１規定塩酸０．５ｍｌを加え
、３３５ｎｍにおける吸光度を測定し、未反応のＳＯＤ
に対する値と比較することにより求めた。

特許出願人　　　東ソー株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）スーパーオキサイド・ジスムターゼを高級脂肪酸
で化学修飾してなる修飾スーパーオキサイド・ジスムタ
ーゼ。
（２）高級脂肪酸が、炭素数３〜３０の脂肪酸である特
許請求の範囲第１項記載の修飾スーパーオキサイド、ジ
スムターゼ。
（３）スーパーオキサイド・ジスムターゼ１分子あたり
が結合している高級脂肪酸の数が１〜１５である特許請
求の範囲第１項記載の修飾スーパーオキサイド・ジスム
ターゼ。