JPS61249388A - 安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ - Google Patents

安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ

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JPS61249388A
JPS61249388A JP60090605A JP9060585A JPS61249388A JP S61249388 A JPS61249388 A JP S61249388A JP 60090605 A JP60090605 A JP 60090605A JP 9060585 A JP9060585 A JP 9060585A JP S61249388 A JPS61249388 A JP S61249388A
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昭 矢吹
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、安定化された新規スーパーオキサイドジスム
ターゼ（以下、ｌ’−８ＯＤＪと略記する。）に関し、
抗炎症剤、虚血性疾患症治療剤、心筋梗塞治療剤、放射
線障害治療剤等の医薬としての使用が期待される。
従来の技術 ＳＯＤは、生体内での酸素に起因する毒性を除去するも
のとして、前記の医薬としての使用が可能である。
しかし、　ＳＯＤを血流中へ投与した場合のＳＯＤの血
流内半減期はわずか６分であり、急速に血中から失われ
てしまうため、その薬理活性を充分に発揮することがで
きない。
このため、　ＳＯＤの血流内寿命を延長させるため多く
の化学修飾が行なわれている。化学修飾ＳＯＤの血流内
半減期（Ｔ−５０）は、化学修飾ＳＯＤの分子量とほぼ
比例関係が成）立つため、高分子量の化学修飾ＳＯＤが
望まれる（文献■Ｅ、　Ｂｏｃｃａ　、　Ｇ、Ｐ。
Ｖｅｌｏ　、　Ｆ＠Ｍ、　Ｖ＠ｒｏｎｅｓ＠、　Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ、　Ｒｅｓ　、　Ｃｏｍｍｕｎ。
１４１１３１９８２年；文献■Ｅ、Ｂｏｃｅｕ　、　Ｒ
，Ｌａｒｇａｊｏｌｌｉ＋Ｆ、Ｍ、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ、
　　Ｚ、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇ　　３８９４　
１９８３年入こ０ため１例えば片端がメトキシ化された
ポリエチレングリコールを数多く結合させる等の手段が
とられている（文献■９文献■；文献■ｐ、ｓ。
Ｐｙａｔａｋ　＠ｔ　ａｌ　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、Ｃ
ｈｅｍ、Ｐａｔｈｏｌ、Ｐｈａｒｍ。
皿１１３　（１９８０）　） しかし、フィコール、ラットアルブミンによる修飾法、
Ｐ、８．Ｐｙａｔａｋらのメトキシポリエチレングリコ
ールによる修飾法では、ＳＯＤ酵素活性が５０チと低い
という欠点をもつ。
一方ｓ　Ｂｏｃｃ′ｕらの方法によるメトキシポリエチ
レングリコール修飾法（文献■２文献■）では。
医薬目的を達成できる程度に高い酵素活性保持率を有し
かつ長い血流内半減期を有する物質は得られていない。
問題点を解決するための手段 発明者は、ＳＯＤ活性が維持され、かつ血流内半減期の
長いＳＯＤ　（以下、安定化ＳＯＤという。）を開発す
べく鋭意検討した結果、ポリアルキレングリコ−／Ｉ／
（その両端が化学修飾されたものをも含む。）で化学修
飾されたＳＯＤにおいて／　ＩＪアルキレングリコール
分子の両末端Ｋ　ＳＯＤが結合した骨格を有するＳＯＤ
が安定でかつ化学修飾による活性の低下もなく安定性が
高い事を確認し、上記目的を達することを見出し１本発
明を完成するに到った。
本発明による安定化ＳＯＤは、分子量７〜５０万望まし
くは、１０〜４０万分子量を有し、かつ、その活性保持
率は８５〜１００チと高い活性を有する。修飾するポリ
アルキレングリコールはＳＯＤ分子１個当り、０．５〜
１０．好ましくは１〜６程度である。
修飾に用するポリアルキレングリコール誘導体は、例え
ば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコー
ル、エチレンオキサイド−プロピレンオキサイド共重合
体が採用される。その分子量は４００〜１００００程度
のものであればよい。
反応に際しては、これらのポリアルキレングリコールの
両末端にカルボキシル基を付加したものを用いればよい
。
その両末端の形としては、例えば （１）　−ＣＨ２−０−Ｃ（−ＣＨ２）、−ＣｏｏＨ，
（２）　−ＣＨ２−０（−ＣＨ２＋１ＣＯＯＨ。
（３）　−ＣＨ２−Ｎ−Ｃ（−ＣＨ２＋１ＣＯＯＨ等で
示される構造（ｍは　ＩＩ １〜１２の整数を表もず。）を有するものいずれでもよ
いが、結合の安定性の点で（２）及び（３）の形が望ま
しい。
両末端にカルボキシル基を有するポリアルキレングリコ
ール誘導体の製造法としては、（２）の形では１例えば
、白金、パラジウム等の酸化触媒下でｌリアルキレング
リコールを酸化する方法、またモノハロダン化カル♂ン
酸、ジアゾカルボン酸を両端のＯＨ基と反応させて得る
方法等がある。
（３）の形では、両末端ＯＨ基にトシルクロリド及びヒ
ドラゾンを反応させてアミノ基に変換した後（Ｍ、　Ｍ
ｕｔｔ＠ｒ、　Ｔｓｔｒａｈｓｄｒ／　　Ｌ＠ｔｔｅｒ
ｓ　　１９７８　。
２８３９参照。）ジカル？ン酸を反応しアミド結合を形
成させることにより得ることができる。
本発明の安定化ＳＯＤは上記ポリアルキレングリコール
の両末端にＳＯＤが結合した骨格を有する分子を含有す
るものであればどのようなものであってもよく、従って
例えば次の分子を例示することができる。
（１）ｑγ〜ＣＤ（２））Ω〜℃Ｄ （３）〕美り、ＩＤ　　（４）””ＣＩＤ”てｒ（５）
　’２１又囚Ｄ（６）ズ「て瞠 ：ｆ！Ｉ）アルキレングリコール鎖 前記のようにして得られたポリアルキレングリコール（
その誘導体をも含む。）とＳＯＤをアミド結合にょシ結
合させ１本発明の安定化ＳＯＤを得ることができる。
包含するものである。
アミド結合を形成する方法としては、ジシクロへキシル
カル−ジイミド等の縮合剤を用いる方法。
また、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ｐ−二トロフェ
ノール等の通常のペプチド合成におけるカル？ン酸活性
化剤により活性エステルとし、これと８０Ｄを反応させ
アミド交換することもできる。
活性保持率を高く得るためＫは、後者の活性エステルを
介して反応を行なう方が望ましい。
反応に際しては、水、または、ｐＨ６，５〜１０．０好
ましくは、−７，２〜＆５になるよう調製した緩衝［Ｋ
ＳＯＤヲ０．１〜１０　％好ましくは、０．５〜３チの
濃度で溶解した後、活性化させたポリアルキレングリー
−ル誘導体をＳＯＤ　１モルに対し、１〜１００倍モル
、好ましくは２〜１５倍モルを添加　、して反応せしめ
る。その際ＳＯＤの濃度と添加する活性化ポリアルキレ
ングリコールとＳＯＤのモル比によ多安定化ＳＯＤの分
子量をコントロールすることが可能である。
またＳＯＤと４リアルキレツグリコ一ル誘導体活性エス
テルを反応させる際グリシンやリジンなどのアミノ酸や
モノエタノールアミン等のアミン類を共存させて反応を
行なわせることにより、得られる安定化ＳＯＤの分子量
分布を好ましい範囲（分子量が７０，０００〜５００，
０００）にすることが可能となる。特にＳＯＤ濃度を２
．５−以上で反応を行なわしめる場合に分子量を目的の
範囲にコントロールするのに有効である。
なお１本発明の安定化ＳＯＤは、前記単一分子のみなら
ず各種の分子種の組成物をも含むが、必要に応じて好ま
しい構成比メのものを調製できる。
前述の例示だけには限られず、より多量体の分子種も数
多くあり、　ＳＯＤとポリアルキレングリコールの結合
様式も多様である。
このようにして製造した安定化ＳＯＤは単一分子ではな
く混合物の形で含まれ、当然本発明の範囲内に含まれる
。さらに、原料物質、ポリアルキレングリコール分子の
両末端にＳＯＤが結合する骨格を一切有しない非架橋体
等不純物を一部混入したものも含まれる。このような場
合も前記物性（分子量等）を有する限り本発明の範囲内
に含まれる。
なお本発明の製造原料であるＳＯＤとしてはヒト火 由来、牛、ウマ等の補乳動物由来、夫腸菌等微生物由来
のもの、遺伝子工学的手法によって微生物。
酵母等から産出されたもの等、その由来に制限はない。
実施例 以下、実施例により本発明の詳細な説明する。
実施例１゜ 特開昭５３−１４１２１９号明細書に記載された方法に
従りて、白金ノ臂ラジウム炭素触媒により両末端が酸化
し得られたカル？キシ泥基を有するポリエチレングリコ
ール誘導体（平均分子量４０００　）４．０１１（０，
００１モル）、Ｎ−ヒドロキシコノ−り酸イミド０．４
６１１（０，００４モル）を３００−のＮ、Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドに溶解した後、ジシクロへキシルカルデ
ジイミド０．８４　Ｎ　（０，００４モル）を添加し、
室温で一夜攪拌した。
生成したジシクロヘキシル尿素を濾過し、Ｆ液にエチル
エーテル６００＋ｄを加え、生成したサクシイミジル誘
導体の結晶を濾過し、エーテルでよく洗浄し、乾燥して
活性化誘導体の白色結晶４．２ｇを得た。
市販の牛血液由来ＳＯＤ　（東洋紡製３０００単ＶＭ９
）１００■（０，００３ミリモル）をｐＨ７，４に調整
した０、１モルリン酸す）　ＩＪウム緩衝液４ｍに溶解
し、上記で得られた活性化誘導体３７　＃　（０，００
９ミＩＪモル）を加えた。
添加後、水冷下３時間攪拌した。
反応中、安定化ＳＯＤの分子量は１反応開始後１時間以
降でほとんど変化は見られず、３時間後には反応の大部
分は終了していた。反応終了後のＳＯＤ活性を測定した
が１反応前に比較し、活性保持率は、９５±５％（全活
性２８５０００単位）であった。
反応液は１分子量阻止３万の限外濾過膜により限外濾過
をくり返し、未反応の活性エステルまたは、その分解物
を除去することにより、修飾ＳＯＤ溶液を得た。
このものの「ＴＳＫ　Ｇ　３０００　ＳＷＪ　（東洋曹
達■製）カラムを使用したＨＰＴ、Ｃによる分子量分布
を図１に示す。このものを凍結乾燥して１０７１１Ｆの
安定化ＳＯＤを得た。
蛋白収率８３チ　全活性２３６０００単位（活性保持率
９５チ） 酵素１モル当たシの平均ポリエチレングリコール付加モ
ル数　　　　　　　　　　２．４実施例２ 市販の人赤血球由来ＳＯＤ　（シグマ社製２３００単Ｖ
ｑ＞ｔ　ｒセファデックスＧ−１００スーパーフアイン
」（ファルマシア製）を使用してグル濾過を行ない。
分子量３２０００付近の画分を集めて得た精製人５ＯＤ
（３０５０単位／ダ）５０ダ（０，００１５ミリモル）
をｐＨ７，４に調製した０、　１　Ｍリン酸“ナトリウ
ム緩衝液２．５−に溶解して、実施例１で得られた活性
化ポリエチレングリコール誘導体３０　＃　（０，００
７５ミリモル）を加え、水冷下で３時間攪拌し、その後
分子量分画３０，０００の限外濾過を繰り返した後。
凍結乾燥を行い６０９の安定化ＳＯＤを得た。
分子量分布を図２に示す。
蛋白収率８５チ　酵素活性保持率　９４±５％ＳＯＤ酵
素酵素１当ル当の平均ポリエチレングリコール結合数　
　　　　　　　３．５ 実施例３゜ オキシエチレン−オキシプロピレン共重合体（平均分子
量２７５０　ＢＡＳＦ社製［プルロニックＰ−９４Ｊ）
１１．２＃（４ミリモル）、γ−プロモーｎ−酪酸エチ
ルエステル７．８１１（４０ミリモル）を、充分脱水操
作を行なったＮ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド３００−
に溶解し、酸化銀１５１１を加え、５０〜６０℃で２４
時間攪拌を行なった後１反応液を戸別して固形物を除い
た。
得られたＦ液をエチルエーテル２．０１中へ加え、目的
物を沈殿させた。沈殿物を更にエチルエーテルで充分に
洗浄した後、乾燥し、水２００ｔＲｔＫ再度溶解した。
再溶解液を４０〜５０℃に加温した後、溶液の水素イオ
ン濃度を測定しながら、攪拌下で徐々に２規定の水酸化
す）　ＩＪウム水溶液を滴下し、ｐＨ１１〜１２の範囲
に調整する。
−が一定となった後、２時間攪拌を続けた。
その後１規定塩酸によりμ値を６に調整した反応液ヲロ
ータリーエパポレーターで水を蒸発させる。得られた固
形物を再［Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド１００−に
溶解させ、不溶物を濾過して除いた後、エチルエーテル
１１中に加え、析出した結晶を濾過し、エチルエーテル
で充分洗浄した後。
乾燥し、白色結晶を１０．５．９を得た。
得られた白色結晶を０．０５　Ｍのリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７，４）２００−に溶解し、同じ緩衝液で平
衡化した隘イオン交換樹脂「ＢＩＯ−ＲＡＤ　ＩＸ２」
（バイオラット社製樹脂容量３００ｍ）に通液し、末端
カルゲキシル基を有するプルロニック誘導体を樹脂に吸
着させた。その後０．０５モルの塩酸水溶液により吸着
したプルロニック誘導体を溶出した。得られた溶液を凍
結乾燥することにより７．２ｇの白色固体を得た。
その後、実施例１の方法によりプルロニック誘導体の活
性エステルを得た。牛ＳＯＤ　５０　＃　（東洋紡製３
０００単位／ＩＩｇ　０．００１５ミリモル）を０．１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐｉ（７，４）５ｍに溶解
し。
水冷下上記活性エステル３３．５１９（０，０１０５１
モル）を添加し、３時間反応させることにより、安定化
ＳＯＤ　５５ηを得た。
ＳＯＤ　１分子当たりの共重合体の平均結合数　５．３
活性保持率　　　８５％ 分子量分布図　図３ 実施例４゜ ポリエチレングリコール（平均分子量１０００）の両末
端を実施例１に記載した方法で酸化した？リエチレング
リコール誘導体４．０．９（４ミリモル）。
パラニトロフェノ−／Ｌ／１．６６１　（１２ミリモル
）をＮ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド１５０−に溶解し
、２．４８．９（１２ミリモル）のジシクロへキシルカ
ルゲジイミドを添加し、室温にて、−夜反応させた。
反応終了後生成したジシクロヘキシル尿素を戸別し、ｐ
液にエチルエーテル２ノを加えて、析出した結晶をエー
テルでよく洗浄した後、乾燥して白色結晶３．８ｇを得
た。
牛ＳＯＤ　６０■（東洋紡製３０００単位／Ｍ９．０．
０Ｏｔ８ミリモル）とグリシン１．１！（０，０１５ミ
リモル）を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐｉ（＆２）２−に
溶解した後。
上記で得られたポリエチレングリコール誘導体の活性エ
ステル１７Ｍｐ（０，０１４ミリモル）を加え水冷下３
時間反応を行ない安定化ＳＯＤ　６２ダを得た。
ＳＯＤ　１分子当たりの平均ポリエチレングリコール結
合数　　　　　　　４．５ 活性保持率　　　９０±５チ 分子量分布　　　　　　図４ 実施例５゜ ポリエチレングリコール（平均分子量３８００　）から
Ｍ、Ｍｕｔｔｅｒの方法（ＴｅｔｒａｈＩｄ備Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ２８３９（１９７Ｂ））　Ｋよって得られた両末
端アミン型のポリエチレングリコール誘導体（両末端が
０−０Ｍ２−ＣＩ（２−Ｎ）Ｉ２）　５　Ｎ　（１，６
７ミリモル）を充分脱水操作を行なったジオキサン１０
０ｔＲｔに溶解させ、２．５Ｍｌ・（、２，５ミリモル
）の無水；ハク酸を加えた後、室温で２００時間反応せ
た。反応液をエチルエーテル１！中に加え１両末端にカ
ルゲキシル基を有するポリエチレングリコール誘導体４
．８Ｉを得た。
上記で得られたポリエチレングリコール誘導体を実施例
１に記した方法で活性化した活性化ポリエチレングリコ
ール誘導体を製造した。
次に牛ＳＯＤ　（東洋紡製３０００単位／ダ）５０■（
０，００１５ミリモル）を０．１Ｍリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７，５）２．５−に溶解し、上記の活性エステ
ル２８ダ（０，０Ｏ１ｌＪモル）を加え、水冷下で３時
間攪拌し１反応させ安定化ＳＯＤを得た。
ＳＯＤ　１分子当たりの平均Ｉリエチレングリコール結
合数　　　　　４．２ 活性保持率　　　８８チ 分子量分布　　　　図５ なお前記実施例において製造した修飾体のポリアルキレ
ンの結合モル数の決定は以下の方法で行なった。
凍結乾燥で得られた修飾ＳＯＤの重量を測定し。
数多になるように水溶液とし、その６５０−７００ｎｍ
（牛ＳＯＤ　６８０　ｎｍ　、人ＳＯＤ　６５５ｎｍ）
の吸光度から含まれる原料のＳＯＤの量を決定する（牛
５ＯＤＥ＝３００　、　　人ＳＯＤ　Ｅ＝３５０）　　
以上の如く得られた修飾体及び非修飾体の重量比より結
合する？リアルキレングリコールの量を決定する。
また活性保持率は１次の如くして求めた。原料ＳＯＤお
よび上記で得られた修飾ＳＯＤを適量の緩衝液に溶解し
、その酵素活性をマコードらの方法（Ｊ、Ｍ、Ｍｃｃｏ
ｒｄ　ａｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　２４４
ｓ６０４９＋１９６９年参照）により測定し、また各々
の酵素濃度を上記の吸光度法により決定し１反応後の比
活性の変化から活性保持率を決定した。
以上実施例で得られた安定化ＳＯＤの活性保持率と参照
文献の分子量及び活性保持率を表１に示した。
表　　１
【図面の簡単な説明】
図１〜５は、それぞれ実施例１〜５で得られた修飾ＳＯ
Ｄの分子量分布を示したものである。なお、縦軸は、２
８０ｎｍにおける吸光度を表わす。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ポリアルキレングリコールで化学修飾されたスーパ
    ーオキサイドジスムターゼにおいて、ポリアルキレング
    リコール分子の両末端にスーパーオキサイドジスムター
    ゼが結合した骨格を有することを特徴とする安定化スー
    パーオキサイドジスムターゼ。 ２、ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコー
    ル、ポリプロピレングリコールおよびエチレンオキサイ
    ド−プロピレンオキサイド共重合体より成る群より選択
    された高分子である特許請求の範囲第１項記載の化合物
    。 ３、ポリアルキレングリコールの両末端がカルボキシル
    基を有する特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ４、ポリアルキレングリコールの両末端が下記式で示さ
    れる構造を有するものである特許請求の範囲第３項記載
    の化合物。 −ＣＨ＿２−Ｏ−（ＣＨ＿２）＿ｍ−ＣＯＯＨ（ただし
    、ｍは１〜１２の整数を表わす。）５、ポリアルキレン
    グリコール分子の両末端が下記式で示される構造を有す
    るものである特許請求の範囲第３項記載の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ただしｍは１〜１２の整数を表わす。） ６、スーパーオキサイドジスムターゼ分子一個当りポリ
    アルキレングリコールの結合分子数が０．５〜１０であ
    る特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ７、ポリアルキレングリコールの分子量が４００〜１０
    ．０００である特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ８、主たる分子量が７０、０００〜５００、０００の範
    囲内にある特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ９、両末端にカルボキシル基を有するポリアルキレング
    リコールとスーパーオキシドジスムターゼを反応させる
    ことを特徴とする安定化スーパーオキシドジスムターゼ
    の製造方法。 １０、反応系内にアミノ酸又はアミンが存在する特許請
    求の範囲第９項記載の製造方法。 １１、アミノ酸が天然アミノ酸である特許請求の範囲第
    １０項記載の製造方法。
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