DE3853493T2

DE3853493T2 - Superoxid-Dismutase-Derivate, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel.

Info

Publication number: DE3853493T2
Application number: DE3853493T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Maeda; Tatsuya Oda; Fujio Suzuki
Original assignee: Kuraray Co Ltd
Current assignee: Kuraray Co Ltd
Priority date: 1987-05-28
Filing date: 1988-05-26
Publication date: 1995-07-27
Anticipated expiration: 2008-05-27
Also published as: EP0292964B1; KR880014100A; EP0292964A2; US5137820A; CN1017449B; ATE120647T1; CN1030426A; EP0292964A3; DE3853493D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Superoxid-Dismutase- Derivate, ein Verfahren zu deren Herstellung, medizinische Anwendungen für diese Derivate und diese Derivate enthaltende Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung.
Es ist bekannt, daß Superoxid-Dismutase (nachstehend kurz als SOD bezeichnet) in den lebenden Geweben von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen allgegenwärtig ist und ein Enzym ist, das Superoxid zersetzt, das für lebende Organismen schädlich ist. In letzter Zeit sind Versuche unternommen worden, isolierte SOD als entzündungshemmendes Mittel zu verwenden (FARUMASHIA, 17, 411, 1981 und Current Therapeutic Research, 16, 706, 1974).
Es ist auch bekannt, daß, wenn SOD intravenös verabreicht wird, ihre Plasmahalbwertszeit so kurz wie 4 bis 6 Minuten ist und daß die verabreichte SOD schnell ausgeschieden wird. Zur Verlängerung der Plasmahalbwertszeit von SOD wurde ein Versuch unternommen, SOD mit Ficoll, Polyethylenglykol, Rattenalbumin oder Inulin (JP-A-32826/83) zu modifizieren.
EP-A-0 200 467 offenbart eine mit Poly(alkylenoxid) chemisch modifizierte SOD, die eine längere Halbwertszeit im Blutkreislauf aufweist als unveränderte SOD.
In GB-A-2 158 078 ist ein Konjugat aus Anthracyclin und anionischem Polymer beschrieben, das ein Cyclopolymer aus Divinylether und Maleinsäureanhydrid in Polycarboxylatform umfaßt.
Es ist berichtet worden, daß die SOD-Wirksamkeit der mit Ficoll oder Polyethylenglykol modifizierten SOD deutlich geringer ist als die unveränderter SOD, während mit Rattenalbumin modifizierte SOD antigen ist. Es ist auch gefunden worden, daß mit Inulin modifizierte SOD eine um einiges geringere enzymatische Aktivität aufweist als SOD.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein neues Superoxid- Dismutase-Derivat bereitzustellen, das im Vergleich zu SOD eine außergewöhnlich verlängerte Plasmahalbwertszeit aufweist, während die enzymatische Aktivität von SOD im wesentlichen unverändert beibehalten wird.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein neues Superoxid-Dismutase-Derivat bereitzustellen, das pharmakologische Wirkungen, wie entzündungshemmende Wirkung usw., aufweist und sicher ist.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung dieses Superoxid-Dismutase-Derivats bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, medizinische Anwendungen dieses Superoxid-Dismutase-Derivats, zum Beispiel als entzündungshemmender Arzneistoff, bereitzustellen.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, Zusammensetzungen bereitzustellen, die zur oralen Verabreichung dieses Superoxid-Dismutase-Derivats geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Superoxid-Dismutase-Derivat der allgemeinen Formel Cu,Zn-[sOD][Z]n bereit, in der [SOD] eine Superoxid-Dismutase darstellt, die an Stelle von Aminogruppen 1 bis 22 oder 24 Reste aufweist, die jeweils durch Entfernen eines Wasserstoffatoms von einer Aminogruppe abgeleitet sind, [Z] einen monovalenten Copolymerrest darstellt, der als Struktureinheiten einen Rest der Formel
aufweist, in der R¹, R², R³ und R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Rest darstellen, der durch Entfernen einer Hydroxylgruppe aus einem Alkanol mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einem Ethylenglykolmonoalkylether, der eine Alkyleinheit aus 1 bis 4 Kohlenstoffatomen enthält, oder einem Glycerindialkylether, der Alkyleinheiten aus 1 bis 4 Kohlenstoffatomen enthält, abgeleitet wird, mit der Maßgabe, daß entweder R¹ oder R² und entweder R³ oder R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom darstellen und einen Rest aufweist, der aus dem Rest der vorstehend erwähnten Formel durch Entfernen eines Rests OR¹, OR², OR³ oder OR&sup4; aus einem seiner Reste CCOR¹, COOR², COOR³ und COOR&sup4; abgeleitet wird (wobei die Bindung am Kohlenstoffatom der Carbonylgruppe an [SOD] gebunden ist), wobei dieser monovalente Copolymerrest ein mittleres Molekulargewicht von 500 bis 200000 aufweist, und n eine ganze Zahl von 1 bis 22 oder 24 darstellt, die der Zahl der Reste entspricht, die in der [SOD] jeweils durch Entfernen eines Wasserstoffatoms von einer Aminogruppe abgeleitet sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung des vorstehenden Superoxid-Dismutase-Derivats (nachstehend kurz als SOD bezeichnet) oder des pharmazeutisch verträglichen Salzes davon bereit, das die Umsetzung von Superoxid-Dismutase mit einem Copolymer, das Struktureinheiten aufweist, die:
(a) ein Rest der allgemeinen Formel
in der R¹, R², R³ und R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Rest darstellen, der durch Entfernen einer Hydroxylgruppe aus einem Alkanol mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einem Ethylenglykolmonoalkylether, der eine Alkyleinheit aus 1 bis 4 Kohlenstoffatomen enthält, oder einem Glycerindialkylether, der Alkyleinheiten aus 1 bis 4 Kohlenstoffatomen enthält, abgeleitet wird, mit der Maßgabe, daß entweder R¹ oder R² und entweder R³ oder R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom darstellen, und (b) ein Rest sind, der aus der Klasse ausgewählt ist, bestehend aus einem Rest der Formel
in der R¹ bzw. R² wie vorstehend definiert sind, einem Rest der Formel
in der R³ bzw. R&sup4; wie vorstehend definiert sind, und einem Rest der Formel
wobei das Copolymer ein mittleres Molekulargewicht von 500 bis 200000 aufweist (nachstehend kurz als Copolymer bezeichnet), in Gegenwart einer basischen wäßrigen Lösung vom pH-Wert 7 -11 umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein Arzneimittel, wie ein entzündungshemmendes Mittel, das das SOD-Derivat oder ein Salz davon als Wirkstoff enthält, und ein Verfahren zur Behandlung entzündlicher und anderer Erkrankungen bereit, das die Verabreichung einer wirksamen Menge des SOD-Derivats oder des Salzes davon umfaßt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel zur oralen Verabreichung, das das SOD- Derivat oder ein Salz davon und ein mittleres/höheres Fettsäureglycerid umfaßt, und ein Arzneimittel zur oralen Verabreichung bereit, das das SOD-Derivat oder ein Salz davon, ein mittleres/höheres Fettsäureglycerid und ein amphiphiles Mittel und/oder ein niederes Alkanol umfaßt.
Abb. 1 zeigt die Wirkung des SOD-Derivats und der SOD auf mit einem Grippevirus infizierte Mäuse.
Abb. 2 ist ein Ultraviolettabsorptionsspektrum des in Synthesebeispiel 1 hergestellten SOD-Derivats;
Abb. 3 ist ein Infrarotabsorptionsspektrum des in Synthesebeispiel 2 hergestellten SOD-Derivats;
Abb. 4 (i) ist ein Densitogramm, wie es durch Polyacrylamid-Elektrophorese des in Synthesebeispiel 2 verwendeten SOD- Ausgangsmaterials gemessen wird und
Abb. 4 (ii) ist ein Densitogramm, wie es durch Polyacrylamid-Elektrophorese des in Synthesebeispiel 2 hergestellten SOD-Derivats gemessen wird.

(a) Verfahren zur Herstellung des SOD-Derivats

(a-1) Umsetzung von SOD mit dem Copolymer

Die Umsetzung von SOD mit dem Copolymer wird im allgemeinen durch Auflösen von SOD in einer wäßrigen Lösung eines Salzes, wie Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat, Natriumacetat, Natriumphosphat, usw., und Zugeben des Copolymers, entweder in Pulverform oder in einem organischen Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid, gelöst, zu der erhaltenen Lösung durchgeführt. Es ist notwendig, daß der pH-Wert der Lösung während der Umsetzung im Bereich von 7 bis 11 gehalten wird. Falls der pH-Wert unter 7 ist, wird die Löslichkeit des Copolymers vermindert, wodurch der Ablauf der Umsetzung beeinträchtigt wird. Falls der pH-Wert höher als 11 ist, wird die SOD so inaktiviert, daß kein wirksames SOD-Derivat erhalten werden kann. Die Umsetzungstemperatur ist vorzugsweise etwa 3 bis 50ºC und für noch bessere Ergebnisse im Bereich von 3 bis 40ºC. Obwohl die Umsetzungsdauer von der Umsetzungstemperatur und vom Zugabeverfahren des Copolymers abhängig ist, ist sie im allgemeinen im Bereich von 10 Minuten bis 3 Stunden. Das Verhältnis des Copolymers ist im Bereich von etwa 0,5 bis 30 mol zu 1 mol SOD. Durch Ändern dieses Verhältnisses kann die Zahl der Copolymermoleküle, die an SOD gebunden sein sollen, eingestellt werden.
Das erhaltene Umsetzungsgemisch enthält nicht nur das SOD-Derivat, sondern auch nicht umgesetztes SOD und Copolymer, usw. Deshalb wird das Umsetzungsgemisch filtriert und das Filtrat wird einer Gelfiltration unterworfen. Das erhaltene Filtrat, das das SOD-Derivat enthält, wird nötigenfalls einer Hydrophobchromatographie und einer Ultrafiltration unterworfen. Das so erhaltene Konzentrat wird gefriergetrocknet, wobei das SOD-Derivat als festes Produkt erhalten wird.
Als Ergebnis der vorstehend beschriebenen Umsetzung werden die Aminogruppen der SOD an die Maleinsäureanhydrideinheiten des Copolymers gebunden, wobei das SOD-Derivat erhalten wird. Zum Beispiel enthält SOD vom Human-Typ 22 (Human-Erythrozyten-SOD oder gentechnologisch durch Hefe hergestellte SOD vom Human-Typ ) oder 24 (gentechnologisch durch Escherichia coli hergestellte SOD vom Human-Typ) Aminogruppen pro Molekül. In der vorstehenden Umsetzung setzt sich eine bestimmte Aminogruppe von SOD mit einer der Maleinsäureanhydrideinheiten des Copolymers um, wobei schließlich ein SOD-Derivat erhalten wird, das 1 bis 22 oder 24 Copolymermoleküle pro SOD- Molekül enthält. Das Ausgangscopolymermaterial enthält im allgemeinen Maleinsäureanhydridringe, wie sie später beschrieben sind. Wenn einer dieser Maleinsäureanhydridringe an eine Aminogruppe von SOD gebunden ist, setzt sich der verbleibende Maleinsäureanhydridring nicht merklich mit einer anderen Aminogruppe um, sondern neigt dazu, sich mit Wasser umzusetzen, wodurch ein von Maleinsäure abgeleiteter Rest der Formel
gebildet wird. Es ist möglich, daß sich ein Copolymermolekül mit einer großen Anzahl SOD-Molekülen umsetzt, wobei eine Nebenproduktverbindung erhalten wird, in der die jeweiligen SOD-Moleküle an ihre Aminogruppen mehrere Maleinsäureanhydridringe eines Copolymermoleküls gebunden haben, aber es ist nicht störend, das SOD-Derivat einschließlich eines kleinen Anteils eines solchen Nebenprodukts in der Praxis der Erfindung zu verwenden. Jedoch in Anbetracht der Tatsache, daß ein Wirkstoff eines pharmazeutischen Erzeugnisses wünschenswerterweise eine Verbindung mit einer einzigen chemischen Struktur ist, ist es vorzuziehen, das nebenproduktreiche SOD-Derivat durch ein geeignetes Verfahren, wie Gelfiltration, zu reinigen, um so das Nebenprodukt zu entfernen. Außerdem sollte selbstverständlich sein, daß das durch die vorstehende Umsetzung erhaltene SOD-Derivat tatsächlich ein Gemisch aus Verbindungen ist, die unterschiedliche Mengen an Copolymermolekülen enthalten, das soll heißen, die Zahl der an SOD gebundenen Copolymermoleküle ist bei den jeweiligen SOD-Derivatverbindungen nicht einheitlich. Deshalb bedeutet in der vorstehenden allgemeinen Formel, die das SOD-Derivat darstellt, n die durchschnittliche Zahl Copolymermoleküle, die an ein SOD- Molekül gebunden sind. Wenn es jedoch wünschenswert ist, ein SOD-Derivat zu erhalten, in dem die Zahl der an SOD gebundenen Copolymermoleküle einheitlich ist, kann das durch das vorstehende Verfahren erhaltene SOD-Derivat darüberhinaus einem geeigneten fraktionierten Reinigungsverfahren, wie Gelfiltration, unterworfen werden, wobei das gewünschte SOD-Derivat erhalten wird.

(a-2) Das SOD-Ausgangsmaterial

Die als Ausgangsmaterial verwendete SOD kann eine sein, die aus dem lebenden Gewebe eines Tiers (Mensch, Rind, usw.), einer Pflanze oder eines Mikrorganismus durch das übliche Verfahren extrahiert wird, oder eine, die durch ein gentechnologisches Verfahren erhalten wird. Die chemische Struktur (koordinierendes Metal, Molekulargewicht, Aminosäuresequenz, usw.) von SOD ist mittlerweile recht gut aufgeklärt worden. So ist SOD in die drei Haupttypen Fe-koordinierende SOD, Mn-koordinierende SOD und Cu Zn-koordinierende SOD eingeteilt worden und weist in Abhängigkeit von dem biologischen Gewebe, in dem sie auftritt, ein Molekulargewicht im Bereich von 30000 bis 80000 auf. Obwohl die Aminosäuresequenz von SOD auch ein wenig mit den unterschiedlichen biologischen Geweben, in denen sie enthalten ist, schwankt, kann ausführliche Information über diesen Bereich aus der folgenden Literatur erhalten werden: Yoshihiko Oyanagi: Superoxide and Medicine, 74-90 (Kyoritsu Shuppan, 25. Mai 1981); Journal of Biological Chemistry, 246, 2875-2880 (1971) und 250, 6107-6112 (1975); Proceedings of the National Academy of Sciences, 70, 3725-3729 (1973); Archives of Biochemistry and Biophysics, 179, 243-256 (1977) usw. Das SOD-Ausgangsmaterial ist vorzugsweise eine Cu Zn-koordinierende SOD vom Human-Typ. Die Cu Zn-koordinierenden SODs vom Rinder- und Pferde-Typ sind auch für die Zwecke der Erfindung geeignet. Diese Art von SOD weist ein Molekulargewicht von etwa 33000 auf und enthält 20, 22 oder 24 Aminogruppen in ihrem Molekül. Die SOD vom Human-Typ kann zum Beispiel isoliert werden, indem Menschenblut nacheinander einer Wärmebehandlung, einem Ionenaustausch und einer Gelfiltration unterworfen wird, oder durch ein gentechnologisches Verfahren.

(a-3) Das Copolymerausgangsmaterial

Das Copolymer als weiteres Ausgangsmaterial kann erhalten werden, indem ein Divinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymer einer partiellen Hydrolyse (Hydrolysegrad der Maleinsäureanhydridringe: 30 - 90%) unterworfen wird oder indem das Copolymer einer partiellen Halbveresterung (Halbveresterungsgrad der Maleinsäureanhydridringe: 30 - 90%) unterworfen wird. Als Beispiele des Esters können Methylester, Ethylester, Propylester, n-Butylester, n-Pentylester, Isopentylester, n-Hexylester, n-Heptylester, n-Octylester, Methoxyethylester, Ethoxyethylester, Propoxyethylester, 2-Butoxyethylester, 1,3-Dimethoxy-2-propylester, 2,3-Dimethoxy-1-propylester, 1,3-Diethoxy-2-propylester, 2-Ethoxy-3-methoxy-1-propylester, 1,3-Dipropoxy-2-propylester, 1,3-Dibutoxy-2-propylester, Benzylester, usw. erwähnt werden.
Das Copolymerausgangsmaterial weist, wie vorstehend erwähnt, ein massegemitteltes Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 200000 auf. Angesichts der Übertragungskinetik des End-SOD-Derivats auf die beabsichtigte Stelle in vivo ist das massegemittelte Molekulargewicht des Copolymers vorzugsweise nicht über 10000. Es gibt keine besondere Beschränkung für die Molekulargewichtsverteilung des Copolymers. So kann ein Copolymer (dessen Verhältnis massegemitteltes Molekulargewicht/zahlengemitteltes Molekulargewicht etwa 2,0 oder höher ist), das durch Radikalcopolymerisation von Divinylether mit Maleinsäureanhydrid synthetisiert und direkt einer partiellen Hydrolyse oder partiellen Halbveresterung ohne vorherige Fraktionierung oder nach Fraktionierung zur Eingrenzung seiner Molekulargewichtsverteilung unterworfen wird, erfolgreich als Copolymerausgangsmaterial eingesetzt werden.

(b) Das pharmazeutisch verträgliche Salz des SOD-Derivats und ein Verfahren zur Herstellung des Salzes

Als Beispiele des vorstehend erwähnten pharmazeutisch verträglichen Salzes des SOD-Derivats können die Salze des Derivats mit Alkalimetallen, wie Natrium, Kalium, usw., Salze mit Erdalkalimetallen, wie Magnesium, Calcium, Barium, usw., das Ammoniumsalz und Salze mit tertiären Aminen, wie Pyridin, Triethylamin, Tri-n-butylamin, usw., erwähnt werden.
Das pharmazeutisch verträgliche Salz des SOD-Derivats kann leicht aus dem SOD-Derivat und der gewünschten Basenart durch die Routinesalzbildungsreaktion hergestellt werden.

(c) Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung

Das mittlere/höhere Fettsäureglycerid, das zur Herstellung der Zusammensetzung zur oralen Verabreichung gemäß der Erfindung verwendet wird, ist das Mono-, Di- oder Triglycerid einer 6 bis 20 Kohlenstoffatome enthaltenden gesättigten oder ungesättigten Fettsäure. Typische Beispiele eines solchen Fettsäureglycerids umfassen die Mono-, Di- und Triglyceride von Caprylsäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure oder dergleichen. Diese Fettsäureglyceride können einzeln oder in Kombination verwendet werden.
Das Fettsäureglycerid kann eine in der Natur vorkommende Verbindung oder eine synthetische oder halbsynthetische Verbindung sein. Normalerweise ist es angebracht, ein natürliches Pflanzenöl einzusetzen. Die Pflanzenöle, die mit Vorteil in der Praxis der Erfindung eingesetzt werden können, umfassen unter anderem Olivenöl (Ölsäure 70-80%, Linolsäure 4-12%, Palmitinsäure 7-15%), Maisöl (Linolsäure 40-60%, Palmitinsäure 25-45%), Sesamöl (Ölsäure 35-46%, Linolsäure 35-48%), Kamelienöl, Kokosöl (Laurinsäure 45-52%, Caprinsäure 4-12%, Caprylsäure 6-10%) und Palmöl. Handelsprodukte können als solche verwendet werden. So können zum Beispiel im Handel erhältliche mittlere Fettsäuretriglyceride, wie Panasate 875, 810 und 800 (Nippon Oil and Fats Co., Ltd.; Caprylsäuregehalt 10- 100%), ODD (Nissin Seiyu K.K.; Caprylsäuregehalt 67%), usw., verwendet werden. Als Beispiel eines käuflichen mittleren Fettsäuremonoglycerids kann Homoteks PT (Kao Corporation; Caprinsäuregehalt 60%) erwähnt werden. Als Beispiel eines mittleren Fettsäuremono- und -diglyceridgemischs kann Witafrol (Dinamit Novel Corporation) erwähnt werden. Als höheres Fettsäuretriglycerid können käufliche Speiseöle, wie Olivenöl von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. und Linolsäure von Nippon Oil and Fats Co., Ltd., verwendet werden.
Das vorstehend erwähnte amphiphile Mittel ist ein ungiftiges Mittel, das sowohl Hydrophilie als auch Lipophilie aufweist. Typische Beispiele eines solchen amphiphilen Mittels umfassen natürliche amphotere Tenside, Polyglycerinfettsäureester, Polyoxyethylensorbitanfettsäureester (Tween-Reihe), Sorbitanfettsäureester (Span-Reihe) und Polyethylenglykol. Bevorzugte amphotere Tenside sind Sojabohnenphospholipid, Dotterlecithin und deren verwandte Stoffe, wie käufliches Phosphatidylcholin, Dotterlecithin, Sojabohnenlecithin, Phosphatidylethanolamin, usw., erhältlich bei Nippon Oil and Fats Co., Ltd. Der Polyglycerinfettsäureester kann zum Beispiel Unigli (Nippon Oil and Fats Co., Ltd.) sein. Als Beispiel des Polyoxyethylensorbitanfettsäureesters kann Tween 20 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) erwähnt werden. Der Sorbitanfettsäureester kann zum Beispiel Span 20 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) sein, während das Polyethylenglykol zum Beispiel PEG 6000 sein kann. Abgesehen vom Vorstehenden können auch anionische Tenside, wie Natriumlaurylsulfat, und kationische Tenside, wie Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid, Eison (Nelson Research & Development Co., USA), usw., eingesetzt werden.
Das vorstehend erwähnte Alkanol kann zum Beispiel Ethanol, Propanol, Isopropylalkohol, Butanol oder dergleichen sein.
Bei der Herstellung einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung wird ein gefriergetrocknetes Produkt aus einer wäßrigen Lösung des SOD-Derivats oder seines pharmazeutisch verträglichen Salzes (nachstehend zusammen als SOD-Derivat bezeichnet), die auf einen geeigneten pH-Wert eingestellt ist, gleichmäßig in dem Fettsäureglycerid, das das amphiphile Mittel und/oder das niedere Alkanol enthält oder nicht enthält, dispergiert oder alternativ wird ein Gemisch aus einer Lösung des SOD-Derivats in wäßriger Ammoniumcarbonatlösung und einer wäßrigen Lösung des amphiphilen Mittels und/oder des niederen Alkanols gefriergetrocknet und das gefriergetrocknete Produkt wird gleichmäßig in dem mittleren/höheren Fettsäureglycerid dispergiert.
Das Verhältnis des Fettsäureglycerids ist etwa 0,1 bis 100 ml pro mg SOD-Derivat und vorzugsweise etwa 0,5 bis 5 ml auf derselben Basis. Die Zugabe des amphiphilen Mittels und/oder des niederen Alkanols ist optional, aber diese Mittel tragen zu einer gesteigerten Benetzbarkeit mit dem Öl und zu einer erhöhten Dispergierbarkeit oder Löslichkeit darin bei, sodaß eine stabile Zusammensetzung mit einem zusätzlichen Effekt gesteigerter Absorption nach oraler Verabreichung erhalten wird. Der richtige Zugabeanteil des amphiphilen Mittels schwankt mit dessen verschiedenen Arten. Im allgemeinen ist es jedoch in bezug auf 1 mg SOD-Derivat angemessen, 0,01 bis 0,1 ml einzusetzen, wenn das amphiphile Mittel eine Flüssigkeit ist, oder 0,05 bis 5 mg, wenn es ein festes Mittel ist. Der Zugabeanteil des niederen Alkanols kann etwa 1 bis 15 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, sein. Die Zugabe eines solchen niederen Alkanols führt zu einer verbesserten Homogenität der Lösung.
Die Zusammensetzung gemäß der Erfindung ist eine klare Flüssigkeit, die physikalisch und chemisch stabil ist. So wurde, wenn die Zusammensetzung 15 Minuten bei Raumtemperatur bei 5000 U/min zentrifugiert oder 1 Monat bei 37ºC stehengelassen wurde, keine Bodenkörperbildung beobachtet. Außerdem zeigte die Zusammensetzung der Erfindung, wenn sie im Dunkeln bei 4ºC oder bei Raumtemperatur gelagert wurde, mindestens 3 Monate keine makroskopische Veränderung. Außerdem wurde keine makroskopische Veränderung beobachtet, selbst nachdem die Zusammensetzung 10 Temperaturänderungszyklen von 4ºC auf Raumtemperatur in 24-Stunden-Intervallen unterworfen wurde, und ihr Titer blieb unbeeinflußt.

(d) Pharmakologisches Profil des SOD-Derivats

Das SOD-Derivat gemäß der Erfindung bringt im Vergleich zu SOD eine außergewöhnlich verlängerte Plasmahalbwertszeit, während die enzymatische Aktivität von SOD im wesentlichen unverändert beibehalten wird, und besitzt außerdem eine geringe Toxizität. Deshalb ist das SOD-Derivat der Erfindung als entzündungshemmendes Mittel und als Mittel für ischämische Erkrankungen wertvoll.
Die folgenden Tierversuche veranschaulichen die Wirkungen des SOD-Derivats und der Zusammensetzung der Erfindung.

(I) Entzündungshemmende und antivirale Versuche

(1) Wirkung auf Lungengewebsverfestigung (entzündliche Sklerose) bei grippeinfizierten Mäusen

Verfahren:

ddY-Mäuse, die 5 - 6 Wochen alt waren und etwa 22 g wogen, wurden mit einem Grippevirus [A2/Kumamoto (H&sub2;N&sub2;)] in der 100-fachen LD&sub5;&sub0;-Dosis von Mäusen durch Inhalation eines Virusaerosols infiziert und dann wurde das Prüfmittel in vorher festgelegten Dosen einmal am Tag 6 Tage hintereinander ab dem Tag der Infektion oral verabreicht. Die Mäuse wurden in Gruppen von 30 verwendet. Die Mäuse wurden fortlaufend 3, 4 und 5 Tage nach der Infektion getötet und die Punktbewertungen der Mäuselungengewebsverfestigung wurden durch das Verfahren von Horsfall (Journal of Experimental Medicine, 95, 135-145, 1952) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Punktbewertungen der Verfestigung in der Tabelle wurden folgendermaßen bestimmt. Physiologische Kochsalzlösung wurde direkt in das Mäuseherz injiziert, um die Lunge gründlich zu waschen, und die Lunge wurde dann beobachtet. Die krankhafte Gewebsveränderung wurde unter Verwendung der folgenden Punktbewertungsskala bewertet. Punktbewertung der Verfestigung Prozentsatz der Verfestigung im Lungenfeld Tod aufgrund Infektion Tabelle 1 Prüfmittel Zeit (in Tagen) nach Infektion mit einem Grippevirus Physiologische Kochsalzlösung (Kontrolle) ODO allein (Kontrolle) SOD-Derivat des Synthesebeispiels 1 * (2000 Einheiten/mg) Zusammensetzung des Formulierungsbeispiels 6 ** (2000 Einheiten/mg) * Eine wäßrige Lösung ** Eine ölige Zusammensetzung

(2) Wirkung auf virusinfizierte Mäuse

Verfahren:

ddY-Mäuse, die 5 - 6 Wochen alt waren und etwa 22 g wogen, wurden mit einem Grippevirus [A2/Kumamoto (H&sub2;N&sub2;)] in der zweifachen LD&sub5;&sub0;-Dosis von Mäusen durch Inhalation eines Virusaerosols infiziert und dann wurde das SOD-Derivat des Synthesebeispiels 1 (2000 Einheiten/mg) oder Rindererythrozyten-SOD (2000 Einheiten/mg) in einer Dosis von 200 Einheiten/Maus einmal am Tag 4 Tage hintereinander ab dem 5. Tag nach der Infektion intravenös verabreicht.
Abb. 1 zeigt % Überleben aufgetragen gegen Tage nach der Infektion. Der Überlebensprozentsatz war 95% in der Gruppe mit dem SOD-Derivat und 0% in der Gruppe mit SOD und in der Kontrollgruppe (infizierte und nicht behandelte Mäuse). In einem weiteren Test wurde die SOD in einer Dosis von 2000 Einheiten/Maus in der gleichen Weise wie vorstehend verabreicht, und es wurde nur eine geringfügige Wirkung beobachtet.
Es ist aus den Ergebnissen offensichtlich, daß das SOD- Derivat eine ausgezeichnete Wirkung auf mit einem Grippevirus infizierte Mäuse aufweist.

(3) Wirkung auf Albuminverlust am Ort einer Brandwunde

Verfahren:

Evan's Blau wurde in physiologischer Kochsalzlösung zu einer Endkonzentration von 0,2 Gew.-% gelöst und 0,18 ml (10 mg/kg) der Lösung wurden intravenös ddY-Mäusen verabreicht, die 8 - 10 Wochen alt waren und etwa 30 g wogen. Die Mäuse wurden in Gruppen von 10 verwendet. Nach Verabreichung wurde der Kopf (12 mm Durchmesser) eines in einem Wasserbad auf 70ºC vorgewärmten Eisennagels gegen den Bauch der Maus gepreßt, um eine Brandwunde zu verursachen, und das Prüfmittel wurde umgehend oral verabreicht. Zwei Stunden nach Verabreichung des Prüfmittels wurden die Mäuse getötet und die Haut am Ort der Brandwunde wurde entfernt und 48 Stunden in Formamid bei 60ºC eingetaucht. Die Konzentration an extrahiertem Evan's Blau wurde mittels der Extinktion bei 620 nm bestimmt. Die Konzentration des Evan's Blau-Albumin-Komplexes wurde aus den Daten abgeschätzt und der Prozentsatz der Hemmung des Albuminverlusts am Ort der Brandwunde aufgrund des Prüfmittels wurde berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Prüfmittel Dosierung (Einheiten/Maus) Konzentration des Evan's Blau-Albumin-Komplexes (ug/g Protein) Prozent Hemmung Physiologische Kochsalzlösung (Kontrolle) ODO allein (Kontrolle) SOD-Derivat des Synthesebeispiels 1 * (2000 Einheiten/mg) Zusammensetzung des Formulierungsbeispiels 6 ** (2000 Einheiten/mg) * Eine wäßrige Lösung ** Eine ölige Zusammensetzung
Der vorstehende Versuch wurde wiederholt, nur daß die Mäuse 6 Stunden nach Verabreichung getötet wurden. Dann wurde in der gleichen Weise wie vorstehend die Konzentration des Evan's Blau-Albumin-Komplexes bestimmt. Der Prozentsatz der Hemmung des Albuminverlusts am Ort der Brandwunde war 0% in der Gruppe mit ODO allein, 50,0% in der Gruppe mit dem SOD- Derivat (Synthesebeispiel 1) und 56,5% in der Gruppe mit der SOD-Zusammensetzung (Formulierungsbeispiel 6).
Das gleiche Ergebnis wurde mit dem SOD-Derivat gemäß Synthesebeispiel 2 erhalten.
Aus den vorstehenden Ergebnissen wird offensichtlich, daß das SOD-Derivat und die Zusammensetzung der Erfindung den Albuminverlust am Ort der Brandwunde im Vergleich zu den Kontrollgruppen bedeutend hemmten.

(II) Versuch zur Übertragung der SOD-Derivatzusammensetzung ins Blut nach oraler Verabreichung

Die Blutkonzentration des SOD-Derivats wurde durch eine Radioaktivitätsuntersuchung bestimmt. Die Versuchsdurchführungen und Ergebnisse sind nachstehend angegeben.

(1) Herstellung des mit ¹&sup4;C-Glycin markierten SOD-Derivats

In 1,5 ml destilliertem Wasser wurden 17,7 mg SOD-Derivat gemäß Synthesebeispiel 1 gelöst, worauf eine Zugabe von 18,2 mg wasserlöslichen Carbodiimids folgte. Nach 5 Minuten wurden 0,13 mg (0,5 ml wäßrige Lösung) 1&sup4;C-Glycin (New England Nuclear, USA; 113,0 mCi/mmol) zugesetzt. Der pH-Wert des Gemischs wurde mit 1 M wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung auf etwa 6 eingestellt und die Umsetzung wurde unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur im Dunkeln 1 Stunde fortschreiten gelassen. Dann wurde 1,0 ml 1 M Acetatpuffer (pH 6,0) zugesetzt, sodaß die Umsetzung beendet wurde, und das Umsetzungsgemisch wurde mit einer Säule (2,3 x 10 cm) aus Sephadex G-25 (Pharmacia F.C.) entsalzt und gefriergetrocknet. Das Verfahren ergab 15,5 mg mit ¹&sup4;C-Glycin markiertes SOD-Derivat mit einer spezifischen Radioaktivität von 10,7 uCi/mg. Dieses Produkt war ein im wesentlichen einheitliches Produkt, das hauptsächlich eine Glycineinheit pro Molekül SOD-Derivat enthielt. Dieses Produkt war eine stabile Verbindung, in der Glycin durch eine Amidbindung an die Carboxylgruppe des SOD- Derivats gebunden worden war.

(2) Versuch über orale Verabreichung bei Tieren

Unter Verwendung des mit ¹&sup4;C-Glycin markierten SOD-Derivats wurde eine Zusammensetzung gemäß dem nachstehend in Formulierungsbeispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt und unter Verwendung eines Magenschlauchs wurden 0,2 ml (4,26 uCi) der Zusammensetzung männlichen ddY-Mäusen, die 8 Wochen alt waren, oral verabreicht. Die Mäuse wurden fortlaufend 3, 7 und 24 Stunden nach Verabreichung getötet und die Radioaktivitätsanteile im Plasma und in den bedeutenden Organen wurden bestimmt. Die Radioaktivität wurde in dpm pro 1,0 g Gewebe ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Tabelle gezeigt 3. Tabelle 3 Zeitverlauf der Gewebekonzentration des mit ¹&sup4;C-Glycin markierten SOD-Derivats nach oraler Verabreichung Gewebe Nach Stdn. Plasma Leber Niere Milz Muskel
Die Daten in Tabelle 3 zeigen, daß die Zusammensetzung, die das in Synthesebeispiel 1 hergestellte SOD-Derivat enthält, effizient in das Blut und verschiedene Organe und Gewebe übertragen wird. Das gleiche Ergebnis wurde auch mit einer ähnlichen Zusammensetzung erhalten, die das in Synthesebeispiel 2 erhaltene SOD-Derivat enthält.
Somit ruft das SOD-Derivat der Erfindung, wenn es in die Zusammensetzung der Erfindung formuliert und oral verabreicht wird, besonders bemerkenswerte entzündungshemmende Wirkungen hervor.
Zur klinischen Anwendung der vorstehenden Zusammensetzung bei Menschen, kann die Zusammensetzung weiter zu geeigneten Dosierungsformen, wie Weichkapseln, Kapseln, Tabletten, Granulaten, Flüssigkeiten, Zäpfchen, usw., verarbeitet und an Patienten verabreicht werden.
Solche Zubereitungen werden im allgemeinen in einer Dosis von 0,1 bis 100 mg (als SOD-Derivat) 1- bis 5mal am Tag entweder jeden Tag oder jeden zweiten Tag verabreicht. Die Dosierung wird dem Zustand des Patienten und anderen Faktoren entsprechend eingestellt.

(e) Beispiele

Die folgenden Synthese- und Formulierungsbeispiele sind weiter beispielhaft für die Erfindung, wobei es jedoch selbstverständlich ist, daß die Erfindung keineswegs auf diese speziellen Beispiele beschränkt ist.

Synthesebeispiel 1

In 10 ml 0,1 M wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung (pH 8,0) wurden 95 mg Rindererythrozyten-SOD (Sigma) unter Rühren bei 4ºC gelöst. Dieser Lösung wurden schrittweise 17 mg eines festen Pulvers von partiellem Hydrolysat (Hydrolysegrad = etwa 50%) eines Divinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymers (Molverhältnis von Divinylether zu Maleinsäureanhydrid = 1:2, w = 5600, Molekulargewichtsverteilung: w/ n = etwa 1,5) ( w = gewichtsgemitteltes Molekulargewicht, n = zahlengemitteltes Molekulargewicht) zugesetzt und die Umsetzung wurde etwa 1,0 Stunden durchgeführt. Das Umsetzungsgemisch wurde in eine Säule (4,2 x 80 cm) aus Sephadex G-50 (Pharmacia F.C.) zur Gelfiltration gegossen und die Elution wurde mit destilliertem Wasser durchgeführt. Das Eluat wurde durch das Absorptionsverfahren bei 280 nm und 220 nm überwacht und die Fraktion, die das nichtumgesetzte partielle Hydrolysat des Divinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymers enthielt, wurde verworfen. Die verbleibende Fraktion wurde gefriergetrocknet, wobei das SOD-Derivat als weißes Pulver erhalten wurde.
Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des so erhaltenen SOD-Derivats wurde in Phosphatpuffer bei der Konzentration von 1 mg/ml und dem pH-Wert 7,4 gemessen. Das UV-Absorptionsspektrum dieses Produkts ist in Abb. 2 gezeigt.
Die vorstehend verwendete Rindererythrozyten-SOD enthielt 20 Aminogruppen pro Molekül. Um zu bestätigen, daß sich diese Aminogruppen mit dem partiellen Hydrolysat des Divinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymers umgesetzt hatten, wurde die Gehaltsbestimmung der restlichen Aminogruppen unter Verwendung von Natriumtrinitrobenzolsulfonat (TNBS) durchgeführt. Es wurde gefunden, daß sich unter den vorstehenden Umsetzungsbedingungen etwa 22 Mol-% der Aminogruppen der Rindererythrozyten-SOD umgesetzt hatten, sodaß durchschnittlich 4 bis 5 Moleküle des partiellen Hydrolysats des Divinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymers an jedes SOD-Molekül gebunden waren.
Wenn die enzymatische Aktivität des SOD-Derivats durch das im European Journal of Biochemistry, 47, 469-474, 1974, beschriebene Pyrogallol-Autoxidationsverfahren bestimmt wurde, wurde gefunden, daß das SOD-Derivat 45% der enzymatischen Aktivität der ursprünglichen SOD behält.

Synthesebeispiel 2

(a) Synthese des partiell halbveresterten Divinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymers

Eine 100 ml (etwa) Ampulle mit einem Magnetrührer wurde mit 2,0 g Divinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymer (Molverhältnis von Divinylether zu Maleinsäureanhydrid = 1:2, w = 5600, Molekulargewichtsverteilung: w/ n = 1,5), 0,88 g n-Butanol, 40 mg wasserfreiem Lithiumacetat und 60 ml Tetrahydrofuran beschickt, worauf sie verschlossen wurde. Der Ampulleninhalt wurde unter Rühren 20 Stunden auf 55ºC erwärmt. Eine Teilmenge des Umsetzungsgemischs wurde entnommen und das nichtumgesetzte n-Butanol im Umsetzungsgemisch wurde gaschromatographisch unter Verwendung von Ethylcellosolve als internem Standard abgeschätzt. Aus der Umsetzungsgeschwindigkeit des eingetragenen n-Butanols wurde der Umwandlungsgrad des Maleinsäureanhydridrings des Copolymers zum n-Butylhalbester zu 43,3 Mol-% berechnet. Das Umsetzungsgemisch wurde dann unter vermindertem Druck eingeengt und das Konzentrat wurde tropfenweise zu 500 ml n-Hexan zur Wiederausfällung zugesetzt. Der erhaltene Niederschlag wurde abgetrennt und bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet, wobei 1,13 g des gewünschten mit n-Butanol halbveresterten Divinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymers erhalten wurden.

(b) Synthese des SOD-Derivats durch Umsetzung des mit n-Butanol halbveresterten Divinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymers mit SOD

In 1,8 ml isotonischem Phosphatpuffer (pH 7,04) wurden 200 ul wäßrige Human-Erythrozyten-SOD-Lösung (62,8 mg/ml) und 170 mg Natriumhydrogencarbonat gelöst. Dieser Lösung wurden allmählich 64 mg des mit n-Butanol halbveresterten Divinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymers, das wie vorstehend unter (a) hergestellt wurde, unter Rühren bei Raumtemperatur zugesetzt. Die Umsetzung wurde weitere 2 Stunden durchgeführt und dann wurde das Gemisch bei 4ºC über Nacht stehengelassen. Das Umsetzungsgemisch wurde filtriert und das Filtrat wurde einer Gelfiltration an Sephadex G-75 (Pharmacia F.C.) unter Verwendung von 10 mM wäßrigem Ammoniumbicarbonat als Elutionsmittel unterworfen. Die das SOD-Derivat enthaltende Fraktion wurde gefriergetrocknet, wobei 8,52 mg SOD-Derivat als weißes Pulver erhalten wurden. Das Infrarotabsorptionsspektrum (KBr-Platte) dieses Produkts ist in Abb. 3 gezeigt. Das Densitogramm des SOD-Ausgangsmaterials, das durch Polyacrylamid-Elektrophorese (native PAGE) bestimmt wurde, ist in Abb. 4 (i) gezeigt und das des SOD-Derivats in Abb. 4 (ii). In den Zeichnungen stellt a SOD und b das SOD-Derivat dar.
Das in den folgenden Formulierungsbeispielen verwendete SOD-Derivat wurde gemäß Synthesebeispiel 1 erhalten. Vergleichbare Zusammensetzungen sind auch durch Verwendung von anderen SOD-Derivaten gemäß dieser Erfindung erhältlich.

Formulierungsverfahren 1

Das in Synthesebeispiel 1 hergestellte SOD-Derivat wird in destilliertem Wasser (10 mg/ml) unter Eiskühlung gelöst. Die Lösung wird durch tropfenweise Zugabe von 0,5 M Essigsäure auf einen pH-Wert von etwa 3,0 eingestellt und gefriergetrocknet. Dem gefriergetrockneten Pulver des SOD-Derivats wurde ein mittleres/höheres Fettsäureglycerid, das mit einem amphiphilen Mittel und/oder einem niederen Alkanol ergänzt war, zugesetzt und das Gemisch wird geschüttelt, bis eine makroskopisch einheitliche Dispersion erhalten wird. Die Schüttelbehandlung wird unter Verwendung des TOMY UR-150P chipartigen Ultraschallwellengenerators (Tomy Seiki) ausgeführt.
Die Dauer dieser Behandlung ist nicht länger als 30 Sekunden.

Formulierungsverfahren 2

Eine vorher festgelegte Menge eines amphiphilen Mittels wird einer gegebenen Menge destillierten Wassers zugesetzt und nach Zugabe eines niederen Alkanols nach Bedarf wird eine Ultraschallbehandlung ausgeführt, wobei eine Lösung hergestellt wird. Dann wird eine Lösung (4 mg/ml) von Pulver des SOD-Derivats (Synthesebeispiel 1) in 0,02 %iger wäßriger Ammoniumcarbonatlösung, die unter Eiskühlung hergestellt wird, der vorstehenden Lösung in gleichen Volumina zugesetzt und das Gemisch wird gefriergetrocknet. Dem erhaltenen gefriergetrockneten Pulver wird das mittlere/höhere Fettsäureglycerid Zugesetzt, worauf nach Bedarf eine Zugabe des niederen Alkanols folgt. Das Gemisch wird in einem Eis-Wasser-Bad 30 Sekunden mit Ultraschall behandelt.
Das vorstehende Verfahren ergab Zusammensetzungen der Erfindung, die in Tabelle 4 gezeigt sind. Tabelle 4 Formulierung Nr. In Synthesebeispiel 1 hergestelltes SOD-Derivat Mittleres/höheres Fettsäureglycerid Amphiphiles Mittel und/oder niederes Alkanol Herstellungsverfahren Panasate Olivenöl ODO Linolsäure Homoteks Ethanol-ODO Phosphatidylcholin Unigli Dotterlecithin Sojabohnenlecithin Phosphatidylethanolamin Unigli PEG Tween Span Tabelle 4 (fortgesetzt) Formulierung Nr. In Synthesebeispiel 1 hergestelltes SOD-Derivat Mittleres/höheres Fettsäureglycerid Amphiphiles Mittel und/oder niederes Alkanol Herstellungsverfahren Panasate Linolsäure Olivenöl Speiseöl [Nisshin Seiyu K.K.] ODO Phosphatidylcholin Eison Tabelle 4 (fortgesetzt) Formulierung Nr. In Synthesebeispiel 1 hergestelltes SOD-Derivat Mittleres/höheres Fettsäureglycerid Amphiphiles Mittel und/oder niederes Alkanol Herstellungsverfahren Panasate Unigli Ethanol

Claims

1. Superoxid-Dismutase-Derivat der allgemeinen Formel Cu,Zn-tSOD][Z]n, in der [SOD] eine Superoxid-Dismutase darstellt, die an Stelle von Aminogruppen 1 bis 22 oder 24 Reste aufweist, die jeweils durch Entfernen eines Wasserstoffatoms von einer Aminogruppe abgeleitet sind, [Z] einen monovalenten Copolymerrest darstellt, der als Struktureinheiten einen Rest der Formel

aufweist, in der R¹, R², R³ und R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Rest darstellen, der durch Entfernen einer Hydroxylgruppe aus einem Alkanol mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einem Ethylenglykolmonoalkylether, der eine Alkyleinheit aus 1 bis 4 Kohlenstoffatomen enthält, oder einem Glycerindialkylether, der Alkyleinheiten aus 1 bis 4 Kohlenstoffatomen enthält, abgeleitet wird, mit der Maßgabe, daß entweder R¹ oder R² und entweder R³ oder R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom darstellen, und einen Rest aufweist, der aus dem Rest der vorstehend erwähnten Formel durch Entfernen eines Rests OR¹, OR², OR³ oder OR&sup4; aus einem seiner Reste COOR¹, COOR², COOR³ und COOR&sup4; abgeleitet wird (wobei die Bindung am Kohlenstoffatom der Carbonylgruppe an [SOD] gebunden ist), wobei dieser monovalente Copolymerrest ein mittleres Molekulargewicht von 500 bis 200000 aufweist, und n eine ganze Zahl von 1 bis 22 oder 24 darstellt, die der Zahl der Reste entspricht, die in der [SOD] jeweils durch Entfernen eines Wasserstoffatoms von einer Aminogruppe abgeleitet sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.

2. Superoxid-Dismutase-Derivat oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon nach Anspruch 1, wobei R¹, R², R³ und R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom darstellen.

3. Verfahren zur Herstellung eines Superoxid-Dismutase-Derivats der Formel Cu,Zn-[SOD][Z]n, wobei [SOD] eine Superoxid-Dismutase darstellt, die an Stelle von Aminogruppen 1 bis 22 oder 24 Reste aufweist, die jeweils durch Entfernen eines Wasserstoffatoms von einer Aminogruppe abgeleitet sind, [Z] einen monovalenten Copolymerrest darstellt, der als Struktureinheiten einen Rest der Formel

aufweist, in der R¹, R², R³ und R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Rest darstellen, der durch Entfernen einer Hydroxylgruppe aus einem Alkanol mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einem Ethylenglykolmonoalkylether, der eine Alkyleinheit aus 1 bis 4 Kohlenstoffatomen enthält, oder einem Glycerindialkylether, der Alkyleinheiten aus 1 bis 4 Kohlenstoffatomen enthält, abgeleitet wird, mit der Maßgabe, daß entweder R¹ oder R² und entweder R³ oder R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom darstellen, und einen Rest aufweist, der aus dem Rest der vorstehend erwähnten Formel durch Entfernen eines Rests OR¹, OR², OR³ oder OR&sup4; aus einem seiner Reste COOR¹, COOR², COOR³ und COOR&sup4; abgeleitet wird (wobei die Bindung am Kohlenstoffatom der Carbonylgruppe an [SOD] gebunden ist), wobei dieser monovalente Copolymerrest ein mittleres Molekulargewicht von 500 bis 200000 aufweist, und n eine ganze Zahl von 1 bis 22 oder 24 darstellt, die der Zahl der Reste entspricht, die in der [SOD] jeweils durch Entfernen eines Wasserstoffatoms von einer Aminogruppe abgeleitet sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, das die Umsetzung von Superoxid-Dismutase mit einem Copolymer, das Struktureinheiten aufweist, die:

(a) ein Rest der allgemeinen Formel

in der R¹, R², R³ und R&sup4; wie vorstehend definiert sind, und

(b) ein Rest sind, der aus der Klasse ausgewählt ist, die aus einem Rest der Formel

in der R¹ bzw. R² wie vorstehend definiert sind, einem Rest der Formel

in der R³ bzw. R&sup4; wie vorstehend definiert sind, und einem Rest der Formel

besteht, wobei das Copolymer ein mittleres Molekulargewicht von 500 bis 200000 aufweist, in Gegenwart einer basischen wäßrigen Lösung vom pH-Wert 7 - 11 umfaßt.

4. Verfahren zur Herstellung eines Superoxid-Dismutase- Derivats oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon nach Anspruch 3, wobei R¹, R², R³ und R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom darstellen.

5. Superoxid-Dismutase-Derivat oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung als pharmakologischer Wirkstoff.

6. Medikament, das das Superoxid-Dismutase-Derivat oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon nach Anspruch 1 oder 2 umfaßt.

7. Entzündungshemmendes Mittel, das das Superoxid-Dismutase-Derivat oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon nach Anspruch 1 oder 2 umfaßt.

8. Verwendung des Superoxid-Dismutase-Derivats oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines entzündungshemmenden Mittels.

9. Arzneimittel zur oralen Verabreichung, umfassend ein Superoxid-Dismutase-Derivat der allgemeinen Formel Cu,Zn-[SODJ[Z)n, in der [SOD] eine Superoxid-Dismutase darstellt, die an Stelle von Aminogruppen 1 bis 22 oder 24 Reste aufweist, die jeweils durch Entfernen eines Wasserstoffatoms von einer Aminogruppe abgeleitet sind, [Z] einen monovalenten Copolymerrest darstellt, der als Struktureinheiten einen Rest der Formel

aufweist, in der R¹, R², R³ und R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Rest darstellen, der durch Entfernen einer Hydroxylgruppe aus einem Alkanol mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einem Ethylenglykolmonoalkylether, der eine Alkyleinheit aus 1 bis 4 Kohlenstoffatomen enthält, oder einem Glycerindialkylether, der Alkyleinheiten aus 1 bis 4 Kohlenstoffatomen enthält, abgeleitet wird, mit der Maßgabe, daß entweder R¹ oder R² und entweder R³ oder R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom darstellen, und einen Rest aufweist, der aus dem Rest der vorstehend erwähnten Formel durch Entfernen eines Rests OR¹, OR², OR³ oder OR&sup4; aus einem seiner Reste COOR¹, COOR², COOR³ und COOR&sup4; abgeleitet wird (wobei die Bindung am Kohlenstoffatom der Carbonylgruppe an [SOD] gebunden ist), wobei dieser monovaiente Copolymerrest ein mittleres Molekulargewicht von 500 bis 200000 aufweist, und n eine ganze Zahl von 1 bis 22 oder 24 darstellt, die der Zahl der Reste entspricht, die in der [SOD] jeweils durch Entfernen eines Wasserstoffatoms von einer Aminogruppe abgeleitet sind, und/oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon und ein mittleres/höheres Fettsäureglycerid.

10. Arzneimittel nach Anspruch 9, wobei das mittlere/höhere Fettsäureglycerid ein einzelnes oder ein Gemisch aus Triglyceriden von Fettsäuren ist, die 6 bis 20 Kohlenstoffatome enthalten.

11. Arzneimittel nach Anspruch 10, wobei das mittlere/höhere Fettsäureglycerid Caprylsäuretriglycerid, Caprinsäuretriglycerid oder ein Gemisch davon ist.

12. Arzneimittel zur oralen Verabreichung, umfassend ein Superoxid-Dismutase-Derivat der allgemeinen Formel Cu,Zn-[SOD][Z]n, wobei [SOD] eine Superoxid-Dismutase darstellt, die an Stelle von Aminogruppen 1 bis 22 oder 24 Reste aufweist, die jeweils durch Entfernen eines Wasserstoffatoms von einer Aminogruppe abgeleitet sind, [Z] einen monovalenten Copolymerrest darstellt, der als Struktureinheiten einen Rest der Formel

aufweist, in der R¹, R², R³ und R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom oder einen Rest, der durch Entfernen einer Hydroxylgruppe aus einem Alkanol mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, einem Ethylenglykolmonoalkylether, der eine Alkyleinheit aus 1 bis 4 Kohlenstoffatomen enthält, oder einem Glycerindialkylether, der Alkyleinheiten aus 1 bis 4 Kohlenstoffatomen enthält, abgeleitet wird, darstellen, mit der Maßgabe, daß entweder R¹ oder R² und entweder R³ oder R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom darstellen, und einen Rest aufweist, der aus dem Rest der vorstehend erwähnten Formel durch Entfernen eines Rests OR¹, OR², OR³ oder OR&sup4; aus einem seiner Reste COOR¹, COOR², COOR³ und COOR&sup4; abgeleitet wird (wobei die Bindung am Kohlenstoffatom der Carbonylgruppe an [SOD] gebunden ist), wobei dieser monovalente Copolymerrest ein mittleres Molekulargewicht von 500 bis 200000 aufweist, und n eine ganze Zahl von 1 bis 22 oder 24 darstellt, die der Zahl der Reste entspricht, die in der [SOD] jeweils durch Entfernen eines Wasserstoffatoms von einer Aminogruppe abgeleitet sind, und/oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, ein mittleres/höheres Fettsäureglycerid und ein amphiphiles Mittel und/oder ein niederes Alkanol.