DE69512929T2

DE69512929T2 - Salze von aminoalkoholen und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69512929T2
Application number: DE69512929T
Authority: DE
Inventors: Tiberio Bruzzese
Original assignee: Prospa NV
Current assignee: Prospa NV
Priority date: 1994-10-20
Filing date: 1995-03-22
Publication date: 2000-01-27
Anticipated expiration: 2015-03-23
Also published as: US5869714A; WO1996012696A1; EP0787119A1; NL9401743A; AU2111095A; EP0787119B1; JPH08134026A; JP3801225B2; DE69512929D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Salze von polyungesättigten omega-3-Fettsäuren und sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Salz von DHA und EPA mit Aminoalkoholen der folgenden allgemeinen Formel (I)
R-COO R'R"R''' N+-(CH&sub2;)n-OH (I)
worin:
R für die Alkenylgruppe der 4,7,10,13,16,19-cis-Docosahexaensäure (DHA) oder der 5,8,11,14,17-cis-Eicosapentaensäure (EPA) oder ein Gemisch davon steht,
R' für ein Wasserstoffatom oder einen C&sub1;-C&sub2;-Alkylrest steht,
R" und R''', wenn sie gleich sind, die oben angegebene Definition von R' haben oder für einen (CH&sub2;)nOH-Hydroxyalkylrest, in dem n 2 oder 3 ist, stehen, mit der Maßgabe, daß, wenn R' Wasserstoff ist, R" und R''' nicht -(CH&sub2;)&sub2;-OH sind, und
wenn R" und R''' verschieden sind, R" für Wasserstoff steht und R''' für Ethanol steht, wenn n = 2, oder für Propanol steht, wenn n = 3 ist.
Es wurde gefunden, daß langkettige polyungesättigte Fettsäuren, insbesondere polyungesättigte omega-3-Säuren, extrem wichtig sind für die Prophylaxe und Behandlung verschiedener Krankheitsformen, insbesondere solcher, die mit dem Herz-Kreislauf-System (der Anti-Thrombozyten-, bzw. Anti-Plättchenaggregationswirkung, der thrombolytischen Wirkung, der antiatheromatösen Wirkung usw., vergleiche A. Leafund P.C. Weber, New England J. Medicine, 318, 549, 1988), entzündlichen Erkrankungen (S.M. Prescott, J. Biol. Chem., 259, 7615, 1984) und einigen Krebsformen (H.O. Bang et al., Acta Med. Scand., 220, 69, 1976) in Verbindung stehen. Eine ausgeprägte Wirksamkeit wurde ebenfalls bei der Behandlung von Hypertriglyceridämie und Hypercholesterinämie, von Psoriasis, bei der Immunologie, bei Lern- und Gedächtnisstörungen, bei Erkrankungen des peripheren und zentralen Nervensystems usw. gezeigt. Diese Aktivitäten werden oft auf biochemischer Ebene durch Konkurrenz der fraglichen Säuren mit Arachidonsäure und den daraus durch die Wirkung von Cyclooxygenase- und Lipoxygenase-Enzymen entstehenden Metaboliten (Prostaglandine, Prostacyclin, Thromboxane und Leukotriene) stimuliert.
Beispielsweise wird in der US-A-3 952 035 die allgemeine Aktivität auf Prostaglandinsynthease, erzeugt durch unterschiedliche Arten von ungesättigten Fettsäuren und deren Salzen beschrieben.
In der EP-A-0 640 581 wird endemisches Nährmaterial beschrieben, das als aktiven Bestandteil ein Verseifungsprodukt von Docosahexaensäure und davon abgeleitete Derivate enthält.
In anderen Fällen wird die Wirkung einfach der Akkumulation polyungesättigter Säuren zugeordnet, die gesättigte Säuren oder solche, die in geringem Ausmaß ungesättigt sind, in verschiedenen Organ- und Zellbereichen (Plasma, Plättchen und Membran roter Blutzellen, Nervensystem usw.) ersetzen.
Von den oben erwähnten polyungesättigten Fettsäuren sind 4,7,10,13,16,19-cis-Docosahexaensäure (im folgenden als DHA bezeichnet) und 5,8,11,14,17-cis-Eicosapentaensäure (im folgenden als EPA) bezeichnet, die weitaus wichtigsten. Diese Säuren werden ebenfalls in Meeresalgen, wie auch in verschiedenen Mikroorganismen gefunden, aber sie treten vor allem in Fischölen auf, die derzeit die technische Quelle für diese polyungesättigten Substanzen sind. Es ist bekannt, daß Fischöle DHA und EPA in einem Gemisch mit gesättigten und weniger stark gesättigten Säuren in Form der Triglyceride enthalten, und es ist diese Form des Materials, die derzeit im Handel für diätetische oder therapeutische Verwendungen verfügbar ist (vergleiche beispielsweise Maxepa® Seven Seas Health Care Ltd., Hull, England, R.I. Sterling et al., J. Immunol., 139, 4186, 1987). Die Gehalte an EPA und DHA in diesen Glyceriden betragen etwa 30%, ausgedrückt als die Gesamtsumme der beiden Bestandteile.
Andere diätetische oder therapeutische Präparate von DHA und EPA (W.S. Harris, J. Lipid Res., 30, 785, 1989) werden durch Umesterung der Triglyceride mit Ethanol und nachfolgende Konzentrierung mit verschiedenen Verfahren erhalten und werden daher als konzentrierte Gemische aus EPA- Ethylester und DHA-Ethylester verwendet.
Vom pharmazeutischen Standpunkt aus sind diese langkettigen polyungesättigten Fettsäuren, wie auch allgemein gesagt alle Derivate davon, einschließlich ihrer Ethylester, extrem wasserunlösliche Öle, die oft in die Darreichungsform von Weichgelatinekapseln gebracht werden, wodurch es unmöglich wird, verschiedene pharmazeutische geeignete Zubereitungen zu erhalten.
Die Verwendung organischer Lösungsmittel zur Einarbeitung von Triglyceriden und Estern in die wäßrige Phase wäre als solches vom toxikologischen Standpunkt aus nicht ratsam und würde die Verdünnung des Präparats in Wasser in beliebigen Verhältnissen nicht erlauben, bedingt durch die nachfolgende Abscheidung der öligen Phase. Insbesondere führen die Alkali- und Erdalkalimetallsalze zu stark basischen Lösungen, die als Folge eine schlechte Verträglichkeit besitzen und den zusätzlichen Nachteil aufweisen, daß sie einen von der Konzentration abhängigen pH zeigen, was ein Hindernis für die Zufuhr von Metallionen ist.
Es wurde jetzt überraschenderweise gefunden, daß große und unerwartete Vorteile auf dem Gebiet der pharmazeutischen Technologie wie auch auf biologischem und pharmakologischem Gebiet erreicht werden können, wenn die Salze von polyungesättigten omega-3-C&sub2;&sub0;-C&sub2;&sub2;-Säuren DHA und EPA und ihre Gemische mit Aminoalkoholen der folgenden allgemeinen Formel (I):
R-COO- R'R"R''' N+-(CH&sub2;)n-OH (I)
worin
R für die Alkenylgruppe der 4,7,10,13,16,19-cis-Docosahexaensäure (DHA) oder der 5,8,11,14,17-cis-Eicosapentaensäure (EPA) oder ein Gemisch davon steht,
R' für ein Wasserstoffatom oder einen C&sub1;-C&sub2;-Alkylrest steht,
R" und R''', wenn sie gleich sind, die oben angegebene Definition von R' haben oder für einen (CH&sub2;)nOH-Hydroxyalkylrest, in dem n 2 oder 3 ist, stehen, mit der Maßgabe, daß, wenn R' Wasserstoff ist, R" und R''' nicht -(CH&sub2;)&sub2;-OH sind, und
wenn R" und R''' verschieden sind, R" für Wasserstoff steht und R''' für Ethanol steht, wenn n = 2, oder für Propanol steht, wenn n = 3,
verwendet werden.
Die so definierten Verbindungen stellen oft dicke Öle oder niedrigschmelzende und kaum kristallisierbare Feststoffe dar, die sehr stark wasserlöslich sind.
Typische Vertreter von erfindungsgemäßen Salzen sind DHA- und EPA-Salze mit Cholinhydroxid (CH&sub3;)&sub3;N&spplus;-CH&sub2;-CH&sub2;OH OH&supmin;
und mit Ethanolamin NH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-OH, Basen des physiologischen Typs, die bereits mit der Nahrung aufgenommen werden und somit absolute pharmakologische Verträglichkeit besitzen.
Die erfindungsgemäßen Salze werden beispielsweise durch Behandlung der genannten polyungesättigten Säure in wäßrigem Medium mit mindestens einem der genannten Aminoalkohole und schließlich Gewinnung des gewünschten Salzes durch übliche Verfahren wie Verdampfen zur Trockene bei niedriger Temperatur und Druck oder durch Lyophilisierung hergestellt.
Die erfindungsgemäßen Salze können ebenfalls durch Behandlung konzentrierter alkoholischer Lösungen der genannten Säuren mit äquimolarer Menge der genannten Aminoalkohole und nachfolgender Verdampfung der Lösung zur Trockene oder durch Präzipitation des Salzes durch Verdünnen mit geeigneten Lösungsmitteln, wie Petrolether, hergestellt werden.
Nicht so leicht ist die doppelte Austauschreaktion zwischen dem sauren Natriumsalz und beispielsweise dem Basenhydrochlorid. Oft kann die Salzbildung durch direkten Kontakt unter Kühlen erreicht werden, so daß die beiden fluiden ölhaltigen Bestandteile sich allmählich verdicken, wenn die Reaktion fortschreitet, was schnell zu dem gewünschten Salz führt.
Vom Standpunkt des pharmazeutischen Verfahrens aus ermöglicht die erreichte Wasserlöslichkeit die Herstellung verschiedener pharmazeutischer Zubereitungen, die mit den bekannten Triglyceriden, Ethylestern und den freien Säuren selbst, die alle extrem wasserunlöslich sind, unmöglich herzustellen waren. Insbesondere können monophasische Zubereitungen in wäßrigem Medium, wie flüssige Formen für die orale Verwendung, Trinkampullen, Sirupe usw., die sonst unmöglich herzustellen wären, leicht hergestellt werden.
Die Verwendung der fraglichen wasserlöslichen Salze ist aus dem gleichen Grund geeignet für die Herstellung von Granulaten, eventuell in Beutelchen mit individueller Dosis, die auf oralem Weg nach extemporärer Auflösung verabreicht werden sollen. Die Verbindungen können in der Tat in verschiedene Feststoffe, wasserlösliche Exzipientien, beispielsweise Saccharose, eingearbeitet werden, oder von Cyclodextrinen umhüllt werden, dann granuliert werden, wobei schäumende Formen oder sonstige Formen hergestellt werden können, und sie können nach der Auflösung in Wasser ohne Trennung der überstehenden öligen Phasen verwendet werden.
Die wasserlöslichen Salze können ebenfalls in Zubereitungen für die topische Verwendung, wie als Lotionen, wie auch als injizierbare Präparate, die für die parenterale Verabreichung mit entsprechender Sorgfalt bestimmt sind, formuliert werden. Im letzteren Fall führt jedoch die Salzbildung von DHA und EPA mit Aminoalkoholen zu Wasserlösungen mit neutralem pH, die besonders geeignet sind hinsichtlich der lokalen und systemischen Verträglichkeit des Arzneimittels.
Offensichtlich können die fraglichen DHA- und EPA-Salze wie die im Handel erhältlichen Triglyceride und Ethylester, die fluide wasserunlösliche Öle sind und die oft in die Darreichungsformen von Weichgelatinekapseln gebracht werden, formuliert werden.
Die hier beanspruchten Aminoalkoholsalze können in der Tat leicht mit geringen Mengen üblicher Lösungsmittel, die in der präparativen Technologie von Weichgelatinekapseln verwendet werden, wie zum Beispiel Triacetin, Gemische verschiedener Polyethylenglykole (PEG 200-600 + PEG 4000), Tween oder Tween/Ethanolgemische, Propylenglykol und verschiedene andere, verdünnt und solubilisiert werden. In all diesen Fällen kann das erhaltene Gemisch als übliche ölige Substanz gehandhabt werden und in Weichgelatinekapseln zubereitet werden.
Unabhängig von der obigen Information, verbunden mit der verbesserten Möglichkeit der Formulierung nach pharmazeutischen Verfahren, ergeben die Salze der polyungesättigten Säuren, wie die oben erwähnten DHA und EPA, mit Aminoalkoholen andere fundamentale Vorteile des biologischen, biochemischen, pharmakologischen Typs, verglichen mit den gleichen Verbindungen, wenn sie in Form der Triglyceride, der Ethylester und ebenfalls als Natriumsalze verwendet werden.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß sie besser auf oralem Weg absorbiert werden, verglichen mit den Vergleichsprodukten, und dementsprechend höhere Plasmagehalte ergeben als beispielsweise eine äquimolare Dosis des entsprechenden Ethylesters. Die bessere Absorption der Salze der polyungesättigten Säuren, verglichen mit beispielsweise den Estern, beruht auf der Tatsache, daß die Ester gastrische und enterische Gehalte, als ölige Tröpfchen, dispergierbar in wäßriger Phase nur nach der Bildung lokaler Mikroemulsionen zeigen, während sich die wasserlöslichen Salze in molekularer Form dispergieren und dann schnell in undiissoziierter Gleichgewichtsform absorbiert werden. Der daraus folgende Vorteil höherer Plasmagehalte und die darauf folgende Diffusion in andere Bereiche des Organismus führt zu höheren Konzentrationen der polyungesättigten Säure im Gehirn, im Nervensystem im allgemeinen, in der Retina und in den anderen bekannten Abscheidungs- und Akkumulationsstellen.
Besonders wichtig ist die Anreicherung von DHA und EPA in der Membran der roten Zellen und Plättchen, denen die polyungesättigten Säuren wichtige hämorheologische (Verringerung der Blutviskosität, erhöhte Verformbarkeit der roten Blutzellen) und Antiaggregations-Eigenschaften verleihen.
Die Salzbildung mit speziellen Aminoalkoholen wie zum Beispiel Ethanolamin und Cholin, ergibt andere günstige Eigenschaften für die neuen Salze: diese Substanzen sind in der Tat essentielle Bestandteile von Membranphospholipiden, beispielsweise von Erythrozyten und Plättchen, in Form von Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylcholin, und es wurde gefunden, daß sowohl die Säure als auch die Base absorbiert werden können und dadurch in synergistischer Weise die beiden entsprechenden Phospholipid- Subklassen, die oben erwähnt wurden, erhöhen. Ethanolamin kann weiterhin durch endogene Methylierungssysteme methyliert werden, wobei Cholin gebildet wird, und daher in beiden oben erwähnten Phospholipid-Klassen enthalten sein.
Insbesondere haben variierende Verhältnisse von EPA : DHA und Cholin : Ethanolamin von 8 : 2 bis 2 : 8 (vergleiche die Beispiele) sich für diesen Zweck als relevant erwiesen.
Phosphatidylserin und Phosphatidylinosit werden nicht signifikant durch die Verabreichung der erfindungsgemäßen Salze beeinflußt.
Wegen der Überlegung, daß die Phospholipid-Klasse der Erythrozytenmembran zusammen mit dem Grad der Unsättigung der Acylketten die Deformierbarkeit der roten Blutzellen und die Blutviskosität bestimmt, wurde eine Untersuchung, um die Wirkung der fraglichen Salze auf die Erythrozyten- Phospholipid-Zusammensetzung festzustellen, durchgeführt, die im folgenden zur Erläuterung beschrieben wird. 8 ge sunde Volontäre wurden ausgewählt und in 4 Gruppen geteilt, die auf oralem Weg 3 Wochen mit einer täglichen Menge von DHA in Mengen von 1,0 g in Form des Ethylesters (1,1 g), Natriumsalz (1,1 g), Cholinsalz (1,3 g) und Ethanolaminsalz (1,2 g) behandelt wurden. Vor und nach der Behandlung wurden Proben des venösen Bluts entnommen, und Natriumcitrat wurde zugegeben. Dann wurden die Erythrozyten isoliert, 3mal mit physiologischer Kochsalzlösung (0,15M NaCl, pH 7,4) bei 0ºC gewaschen und erneut in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. 1-ml-Proben der Suspension der roten Zellen wurden mit 5 ml Methanol während 10 Minuten, dann mit 5 ml Chloroform, enthaltend 2 mg/100 ml des Antioxidans 2,6-Di-tert.-butyl-4-methylphenol (BHT), behandelt. Die organischen Lösungsmittel, die aus den 3 Extraktionen stammen, wurden zur Trockene eingedampft und der Rückstand, gebildet von den Erythrozyt-Phospholipiden, wurde der zweidimensionalen Chromatographie, wie von Turner J.D. und Rouser G., Anal. Biochem. (Teil 1 Erythrocyte lipids) 38, 423, 1970, beschrieben, zur Trennung der unterschiedlichen Phospholipid-Klassen unterworfen. Es wurden Silicagel 60H (90 g, Merck) plus Fluorisil (7,2 g, BDH Chemicals)-Platten verwendet. Die Lösungsmittelsysteme bestanden aus Chloroform : Methanol : 25%igem Ammoniak : Wasser (90 : 54 : 5, 5 : 5, 5) und Chloroform : Methanol : Aceton : Essigsäure : Wasser (60 : 20 : 80 : 20 : 10). Die verschiedenen Klassen wurden gegenüber Standard- Phospholipiden (Sigma Chemical) identifiziert. Eine Probe der Gesamtphospholipide und der verschiedenen isolierten Flecken wurde mit 1,5 ml Bortrifluorid-Methanol während 1 h bei 65ºC unter Stickstoff zur Herstellung der Methylester der Säuren, die in den Phospholipiden enthalten waren, behandelt, um eine Gaschromatographie durchführen zu können. Hierfür wurde ein Hewlett-Packard-5890-Gaschromatograph verwendet, der mit einem Flammenionisationsdetektor und mit einer HP1-Säule von 25 m Länge und 0,31 mm im Innendurchmesser ausgerüstet war. Helium wurde als Trägergas verwendet, die Injektions-Einlaßtemperatur betrug 320ºC, und die Detektortemperatur betrug 340ºC. Die Kammertemperatur wurde bei 170ºC während 1 Min programmiert, dann mit 4ºC/Min erhöht und bei dieser Temperatur 15 Min gehalten. Es wurde so gefunden, daß Phosphatidylserin und Phosphatidylinosit sich in ihren DHA-Gehalten nur in geringen Mengen unterschieden, verglichen mit dem Grundlinienzustand (vor der Behandlung), während die Ergebnisse betreffend Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin und Gesamt-Phospholipid in Tabelle 1 aufgeführt sind. Tabelle 1 Prozentuale Erhöhung des DHA-Gehalts von Erythrozyten-Phospholipiden, verglichen mit den Grundlinienwerten
(*) jede Behandlung entspricht der Verabreichung von 1 g DHA während 3 Wochen
Die zuvor erwähnten Werte zeigen, daß die DHA-Salzbildung mit Cholin und Ethanolamin die DHA-Bioverfügbarkeit wie auch den Einschluß in die Phospholipide der Membranen roter Zellen (und dann in andere Bereiche des Organismus, wie Plasma, Plättchen, Nervensystem) erhöhen kann. Insbesondere kann durch die Salzbildung mit den oben erwähnten Basen hauptsächlich eine Erhöhung in den entsprechenden Phospholipid-Klassen, wie zum Beispiel Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin, erreicht werden.
Diese günstigen Eigenschaften der fraglichen Salze hinsichtlich der Absorption und Fähigkeit des Einschlusses in die verschiedenen Phospholipidsysteme führt ebenfalls zu überraschenden Ergebnissen, hinsichtlich ihrer pharmakologischen Wirksamkeit, wie beispielsweise zu einer unerwartet starken Wirkung für die Inhibition der Plättchenaggregation in vitro und ex vivo, demonstriert gemäß bekannten Versuchsmodellen. Wegen der Überlegung, daß diese Wirkung den möglichen therapeutischen Effekt des Arzneimittels nicht vollständig angibt, wurde die in-vivo-Wirkung der neuen Salze in extrem signifikanten Tests bestimmt, indem beispielsweise ihre Wirkung auf die Wachstumsgeschwindigkeit eines Thrombus, induziert durch ein bekanntes Aggregationsmittel (Adenosindiphosphat; ADP) in dem mikrovaskulären System des Hamsters bestimmt wurde (in vivo antithrombotische Wirkung).
Mittels eines unterschiedlichen in-vivo-Versuchsmodells wurde ebenfalls die Wirkung auf die Thrombusbildung und die Disaggregation im Hamster bestimmt, gefolgt von der vaskulären Schädigung, induziert durch elektrische Stimulierung (thrombolytische Wirkung).
Im Verlauf eines typischen Experiments wurden männliche Hamster vom Mesocricetus-auratus-Genus, die 95-115 g wogen, 1 Woche in einem Labor akklimatisiert, bevor die Untersuchung begann. Sie wurden dann semi-chronisch auf ora lem Weg während 10 aufeinanderfolgenden Tagen mit den zu prüfenden Produkten behandelt. Genauer gesagt wurden die Tiere in 4 Gruppen unterteilt: Gruppe I erhielt den Träger alleine, Gruppe II erhielt den DHA-Ethylester 100 mg/kg (äquivalent zu DHA 92 mg/kg), Gruppe III und IV erhielten DHA 50 mg/kg in Form des Ethanolaminsalzes (59,3 mg/kg) bzw. des Cholinsalzes (65,7 mg/kg). Eine Stunde nach der letzten Dosis wurden die Tiere mit Natriumpentobarbiton (90 mg/kg, i.p.) anästhesiert, die Wangentasche mit einem Baumwolltampon herausgestülpt und die obere Schicht und das darunterliegende vaskuläre Bindegewebe mit Augenscheren zum Freilegen der unteren vaskulären Schicht entfernt, die mit physiologischer Kochsalzlösung gebadet und unter einem Leitz-Dialux-Mikroskop (Vergrößerung · 250) geprüft wurde.
Die Bewertung der antithrombotischen Aktivität erfordert die Messung der Wachstumsrate eines Thrombus (weißer Körper) in der Mikrozirkulation, induziert durch Iontophorese von ADP aus einer Mikropipette durch die Gefäßwand. Eine Mikropipette mit einem Durchmesser von 12 u wurde mit 10&supmin;² M Lösung von ADP gefüllt und mit einer Silber/Silberchlorid- Referenzelektrode, die in den Mund des Tieres gegeben wurde, verbunden, und dann wurde eine Kapillarvene mit einem Durchmesser von 16-40 u angelegt. Durch Anlegen eines negativen Potentials an die Mikropipette wurde ADP (2 · 10&supmin;¹&sup4; mol pro Sekunde) injiziert, wodurch die Bildung eines weißen Körpers (Plättchenthrombus) verursacht wurde, der allmählich von der Wand der Kapillarvene wuchs. Die Wachstumsrate des Thrombus wurde durch die Zeit bestimmt, die erforderlich war, daß sich 30%, 50% und 90% des weißen Körpers bildeten, wobei 100% den Gesamtverschluß des Gefäßes bezeichneten (inklusive Stase). Wenn der Strom abgestellt wurde, enbolisierte der weiße Körper schnell, und es bildeten sich keine neuen weißen Körper, bis wieder Strom angelegt wurde. Die Inhibition der Thrombus-Wachstumsrate wurde berechnet durch den Vergleich der Messungen der behandelten Tiere mit den Messungen, die bei der Vergleichsgruppe erhalten wurden (Tabelle 2).
Zur Bewertung der thrombolytischen Aktivität wurde eine Mikropipette mit 1,0M Kaliumchlorid gefüllt, an eine Arteriole mit einem Durchmesser von 40-60 u angelegt und mit einer Referenzelektrode, die in das Maul des Tieres gesteckt wurde, verbunden. Es wurde ein negatives Potential während 5 Sekunden unter Verwendung eines Grass-548- Stimulators unter Bildung eines Stroms von 20-30 uA angelegt. Eine zweite Mikropipette, die 10&supmin;² M ADP enthielt, wurde an die Stelle der elektrischen Schädigung angelegt, und ein negatives Potential wurde während 3 Sekunden angewendet. Nach Abstellen des Stroms wurde unter Verwendung einer Stoppuhr die Zeit gemessen, die für die Bildung des entstehenden Thrombus und für seine Disaggregation erforderlich war (etwa 40 Sekunden). Das Verfahren der ADP- Stimulierung der geschädigten Arteriolen-Stelle wurde mehrere Male wiederholt, und der Mittelwert von den Werten, die während einer Stunde erhalten wurden, wurden aufgezeichnet und mit dem der Vergleichstiere verglichen.
Die Änderung in Prozent der Persistenz des Thrombus, der an der beschädigten Stelle in den behandelten und nichtbehandelten Tieren haftete, ist daher ein Index für die thrombolytische Aktivität des Arzneimittels (Tabelle 3). Tabelle 2 Prozentuale Verringerung, verglichen mit den Vergleichsproben, der Thrombus-Wachstumsrate, induziert durch ADP nach oraler Verabreichung von DHA-Ethylester, -Cholinsalz und -Ethanolaminsalz im Verlauf von 10 Tagen. Tabelle 3 Prozentuale Verringerung, verglichen mit den Vergleichsproben, der arteriolären Thrombus-Disaggregationszeit nach oraler Verabreichung von DHA-Ethylester, -Cholinsalz und -Ethanolaminsalz im Verlauf von 10 Tagen.
Die obigen Werte zeigen, daß der DHA-Ethylester als antithrombotisches Mittel in dem eingeführten Versuchsmodell mäßig aktiv ist, während DHA-Cholin- und Ethanolaminsalze sehr aktiv sind (Tabelle 1) mit einer prozentualen Verringerung in der ADP-induzierten Thrombus-Wachstumsrate in der Größenordnung von max. 33-34%.
Im Gegensatz dazu ist der DHA-Ethylester als thrombolytisches Mittel sehr aktiv und zeigt eine prozentuale Verringerung in der arteriolären Thrombus-Disaggregations-Zeit, äquivalent zu 36,2% (Tabelle 2). Jedoch verursachen DHA- Cholin und Ethanolaminsalze eine Verringerung in der Disaggregationszeit in der gleichen Größenordnung (37-38%), folgend auf die Verabreichung deutlich niedrigerer Dosen, und sie können daher definitiv als aktiver selbst bei diesem Test angesehen werden, wenn sie in den gleichen Dosen verabreicht werden.
Die gesamten oben aufgeführten Ergebnisse machen klar, daß die erfindungsgemäßen Aminoalkoholsalze von polyungesättigten omega-3-Säuren zweifelsfrei als Arzneimittel mit allen therapeutischen Indikationen, die bereits in der Literatur für ihren polyungesättigten Bestandteil beschrieben werden, verwendet werden können (Erniedrigung von Fett, Erniedrigung von Cholesterin, blutdrucksenkende, antientzündliche und antitumorale Wirkungen, Behandlung von Psoriasis, von Erkrankungen der Retina, Störungen des Gedächtnisses, des Lernens und des Immunsystems und für verschiedene Beeinträchtigungen des zentralen und peripheren Nervensystems. Insbesondere können sie als Plättchenaggregationsinhibitoren (antithrombotische und thrombolytische Wirkungen) und bei der Behandlung verwandter Krankheiten verwendet werden.
Bei den verschiedenen in Betracht gezogenen pharmazeutischen beschriebenen Zubereitungen, und wie teilweise bereits erläutert, können die erfindungsgemäßen Verbindungen als individuelle aktive Bestandteile oder als Gemische davon oder in Kombination mit anderen Arzneimitteln in Dosiseinheiten von 50 mg bis 1 g, bevorzugt von 100 mg bis 500 mg, bezogen auf den polyungesättigten Bestandteil, verwendet werden, und sie können einmal oder mehrere Male täglich verabreicht werden.
Die Verabreichung ist auf irgendeinem Wege möglich, einschließlich topischer und parenteraler Wege, aber sie erfolgt am häufigsten oral. Die erfindungsgemäßen Salze werden daher entweder individuell oder verdünnt mit geeigneten Trägerstoffen oder Exzipientien in Weichgelatinekapseln oder - nach der Absorption an verschiedene Materialien - in Kapseln, Granulaten, Tabletten, Sirupen, Tropfen und anderen flüssigen Formen oder selbst in Lotionen und Cremes für die topische Verwendung, entsprechend den Vorschlägen üblicher pharmazeutischer Technologie, verarbeitet.
Beispiele für die chemische Herstellung und für verschiedene Zubereitungen werden im folgenden gegeben, um die Erfindung näher zu erläutern.

Beispiel 1

32,8 g 4,7,10,13,16,19-cis-Docosahexaensäure (DHA, Reinheit > 90%) wurden in 140 ml destilliertem Wasser suspendiert und bei Raumtemperatur gerührt. 24,2 g der 50%igen Gew./Gew.-Cholinhydroxid-Wasserlösung werden dann unter Kühlen zugegeben, und es wird weitere 10 Minuten bis zur vollständigen Lösung gerührt. Die Lösung wird mit 50 ml Petrolether gewaschen und zur Trockene bei verringertem Druck und Temperatur eingedampft. Das DHA-Cholinsalz wird so in fast theoretischer Ausbeute erhalten.
Die Elementaranalyse des Produkts (C, H, N, O) und die Säure- und Basenreinheit entsprechen den erwarteten Werten.
IR-Spektrum: Carboxylat-Ionenpeak bei 1560 cm&supmin;¹ und 1395 cm&supmin;¹.
¹H-NMR-Spektrum (DMSO-d&sub6;): δ 5,32 (m, 12H, olefinisches H), 3,40 (m, 2H, CH&sub2;N&spplus;), 3,10 (s, 9H, (CH&sub3;)3N+), 2,80 (m, 12H, 6-, 9-, 12-, 15-, 18-CH&sub2;-; CH&sub2;-O), 2,14 (m, 2H, 3-CH&sub2;), 2,02 (m, 2H, 21-CH&sub2;), 1,91 (t, 2H, 2-CH&sub2;), 0,90 (t, 3H, 22- CH&sub3;).

Beispiel 2

16,4 g DHA in ethanolischer Lösung wurden mit 12,1 g einer 50%igen Gew./Gew.-Cholinhydroxidethanollösung unter Rühren bei Raumtemperatur behandelt, dann wurde die Lösung mit Aktivkohle entfernt und zur Trockene bei verringertem Druck und verringerter Temperatur eingedampft.
Der Rückstand wurde mit 50 ml Petrolether gewaschen (Sdp. 40-70ºC) und im Vakuum getrocknet, wobei das DHA-Cholinsalz mit fast theoretischer Ausbeute erhalten wurde.
Die physikochemischen und analytischen Eigenschaften des Produkts entsprechen denen von Beispiel 1.

Beispiel 3

16,4 g DHA wurden unter Rühren mit 6,0 g Cholinhydroxid unter Kühlen auf 0ºC behandelt. Das Reaktionsgemisch verdickt sich allmählich, wenn die Salzbildung fortschreitet und nach 10 Minuten scheidet sich das DHA-Cholinsalz ab, was identische Eigenschaften besitzt mit den Produkten, die in den vorhergehenden Beispielen erhalten wurden.

Beispiel 4

32,8 g DHA (Reinheit > 90%) wurden in 160 ml destilliertem Wasser suspendiert und unter Rühren mit 6,1 g Ethanolamin behandelt. Die Lösung wurde unter Rühren 10 Minuten gehalten, dann mit 50 ml Petrolether gewaschen und zur Trockene bei verringertem Druck und verringerter Temperatur eingedampft: es wurden 38,5 g DHA-Ethanolaminsalz erhalten.
Die Elementaranalyse des Produkts und die Säuren- und Basenreinheit entsprechen den erwarteten Werten.
IR-Spektrum: Carboxylat-Ionenpeak bei 1550 cm&supmin;¹ und 1400 cm&supmin;¹.
¹H-NMR-Spektrum (DMSO-d&sub6;) δ 5,32 (m, 12H, olefinisches H), 3,48 (t, 2H, CH&sub2;N+), 2,80/2,71 (m, 12H, 6-, 9-, 12-, 15-, 18-CH&sub2;, CH&sub2;O), 2,18 (m, 2H, 3-CH&sub2;), 2,00 (m, 4H, 2-CH&sub2; und 21-CH&sub2;), 0,90 (t, 3H, 22-CH&sub3;).

Beispiel 5

38,2 g DHA wurden unter langsamem Rühren gehalten, und dazu wurden tropfenweise 6,1 g Ethanolamin unter Kühlen auf 0ºC gegeben. Das ölartige Gemisch verdickt sich allmählich durch die Bildung des entsprechenden Salzes. Nach 10 Minuten unter Rühren ist die homogene Reaktionsmasse vollständig wasserlöslich und identisch, was die Analyse betrifft, mit dem DHA-Ethanolaminsalz, welches in Beispiel 4 beschrieben wurde.

Beispiel 6

30,2 g 5,8,11,14,17-cis-Eicosapentaensäure (EPA, Reinheit > 90%) wurden mit 12,1 g Cholinhydroxid gemäß einem der Verfahren der Beispiele 1 bis 3 behandelt. Nach der Behandlung mit Aktivkohle wurde das EPA-Cholinsalz in fast theoretischer Ausbeute erhalten. Das Produkt ist wasserlöslich, und seine physikochemischen und analytischen Eigenschaften entsprechen den erwarteten Werten.

Beispiel 7

30,2 g EPA wurden mit 6,1 g Ethanolamin gemäß dem Verfahren, wie in den Beispielen 4 und 5 beschrieben, behandelt. 36,2 g EPA-Ethanolaminsalz wurden erhalten, welches stark wasserlöslich ist und nach der Analyse recht rein ist.

Beispiel 8

0,1 mol DHA wurden mit Cholinhydroxid (0,05 mol) und mit Ethanolamin (0,05 mol) gemäß einem der vorherigen Beispiele behandelt. Ein DHA-Cholin- und -Ethanolamin-Mischsalz wurde so in hoher Ausbeute erhalten.

Beispiel 9

0,05 mol DHA und 0,05 mol EPA wurden mit 0,1 mol Cholin gemäß einem der vorhergehenden Beispiele umgesetzt.
Es wurde eine hohe Ausbeute an DHA- und EPA-Cholin- Mischsalz erhalten.

Beispiel 10

Es wurde gemäß einem der Verfahren, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, gearbeitet, aber unter Verwendung der geeigneten Säure und der geeigneten Base wurden die folgenden Salze hergestellt:
DHA-Propanolaminsalz
DHA-N,N-dimethylethanolaminsalz
DHA-Diethanolaminsalz
EPA-N,N-dimethylethanolaminsalz
EPA-Diethanolaminsalz

Beispiel 11

Zubereitung in Gelatinekapseln

DHA-Cholinsalz (394,2 mg), äquivalent zu DHA 300 mg
Triacetin 100 mg
Gelatine 127 mg
Glycerin 62 mg
Ethyl-p-hydroxybenzoatnatrium 0,58 mg
Propyl-p-hydroxybenzoatnatrium 0,29 mg
Vitamin E 1 mg

Beispiel 12

Zubereitung in Gelatinekapseln

DHA-Cholinsalz (131,4 mg), äquivalent zu DHA 100 mg
Triacetin 40 mg
Gelatine 65 mg
Glycerin 32 mg
Ethyl-p-hydroxybenzoatnatrium 0,3 mg
Propyl-p-hydroxybenzoatnatrium 0,15 mg
Vitamin E 0,5 mg

Beispiel 13

Zubereitung in Gelatinekapseln

EPA-Cholinsalz (402,3 mg), äquivalent zu EPA 300 mg
Triacetin 90 mg
Gelatine 127 mg
Glycerin 62 mg
Ethyl-p-hydroxybenzoatnatrium 0,58 mg
Propyl-p-hydroxybenzoatnatrium 0,29 mg
Vitamin E 3,00 mg

Beispiel 14

Zubereitung in Gelatinekapseln

DHA-Ethanolaminsalz (592,9 mg), äquivalent zu DHA 500 mg
Polyethylenglykol 300 200 mg
Gelatine 170 mg
Glycerin 83 mg
Ethyl-p-hydroxybenzoatnatrium 1 mg
Propyl-p-hydroxybenzoatnatrium 0,5 mg
Vitamin E 1 mg
Ascorbylpalmitat 2,5 mg

Beispiel 15

Zubereitung in Gelatinekanseln

EPA-Ethanolaminsalz (360,6), äquivalent zu EPA 300 mg
Polyethylenglykol 300 130 mg
Gelatine 127 mg
Glycerin 62 mg
Ethyl-p-hydroxybenzoatnatrium 0,58 mg
Propyl-p-hydroxybenzoatnatrium 0,29 mg
Vitamin E 1 mg

Beispiel 16

Zubereitung in Gelatinekanseln

DHA-Cholinsalz (197,1 mg), äquivalent zu DHA 150 mg
DHA-Ethanolaminsalz (177,9 mg) äquivalent zu DHA 150 mg
Polyethylenglykol 120 mg
Gelatine 130 mg
Glycerin 64 mg
Ethyl-p-hydroxybenzoatnatrium 0,6 mg
Propyl-p-hydroxybenzoatnatrium 0,3 mg
Vitamin E 1 mg

Beispiel 17

Zubereitung in Gelatinekapseln

DHA-Ethanolaminsalz (177,9 mg), äquivalent zu DHA 150 mg
EPA-Ethanolaminsalz (180,3 mg) äquivalent zu EPA 150 mg
Propylenglykol 130 mg
Gelatine 130 mg
Glycerin 64 mg
Ethyl-p-hydroxybenzoatnatrium 0,6 mg
Propyl-p-hydroxybenzoatnatrium 0,3 mg
Vitamin E 0,3 mg
BHT 0,15 mg

Beispiel 18

Zubereitung in Sirupform

DHA-Cholinsalz (3,94 g), äquivalent zu DHA 3 mg
Saccharose 50 mg
Methyl-p-hydroxybenzoat 0,075 mg
Ethyl-p-hydroxybenzoat 0,029 g
Propyl-p-hydroxybenzoat 0,021 mg
Natriumascorbat 0,100 g
Orangen-Geschmacksstoff 0,250 g
Gereinigtes Wasser q.s. bis zu 100 ml

Beispiel 19

Zubereitung in Tropfen

DHA-Ethanolaminsalz (35,58 g), äquivalent zu DHA 30 g
Methyl-p-hydroxybenzoat 0,090 g
Ethyl-p-hydroxybenzoat 0,035 g
Propyl-p-hydroxybenzoat 0,025 g
Natriummetabisulfit 0,300 g
Orangen-Geschmacksstoff 2 g
Gereinigtes Wasser q.s. bis zu 100 ml

Beispiel 20

Zubereitung in Lotion

DHA-Cholinsalz (13,14 g) 10 g
Ethanol 30 g
Natriummetabisulfit 0,3 g
Parfum 0,6 g
Gereinigtes Wasser q.s. bis zu 100 ml

Beispiel 21

Zubereitung für die orale Verabreichung als Einzeldosis- Granulat (extemporäre Auflösung)

DHA-Ethanolaminsalz (1185,8 mg) äquivalent zu DHA 1000 mg
Präzipitiertes Siliciumdioxid 50 mg
Citronenaroma 100 mg
Sorbit q.s. bis zu 5 g

Beispiel 22

Zubereitung in Tabletten für die orale Verwendung

DHA-Ethanolaminsalz (296,5 mg) äquivalent zu DHA 250 mg
Präzipitiertes Siliciumdioxid 50 mg
Mikrokristalline Cellulose 100 mg
Talk 10 mg
Magnesiumstearat 5 mg
Lactose 133,5 mg

Claims

1. Salz von DHA und EPA mit Aminoalkoholen mit er folgenden allgemeinen Formel (I)

R-COO- R'R"R''' N+-(CH&sub2;)n-OH (I)

in der:

R für den Alkenylrest der 4,7,10,13,16,19-cis- Docosahexaensäure (DHA) oder der 5,8,11,14,17-cis- Eicosapentaensäure (EPA) oder einem Gemisch davon steht,

R' für ein Wasserstoffatom oder einen C&sub1;-C&sub2;- Alkylrest steht,

R" und R''', wenn sie gleich sind, die oben angegebene Definition von R' haben oder für einen (CH&sub2;)nOH- Hydroxyalkylrest, in dem n 2 oder 3 ist, stehen, mit der Maßgabe, daß, wenn R' Wasserstoff ist, R" und R''' nicht -(CH&sub2;)&sub2;-OH sind, und

wenn R" und R''' verschieden sind, R" für Wasserstoff steht und R''' für Ethanol steht, wenn n = 2, oder für Propanol steht, wenn n = 3.

2. Salz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminoalkohol Ethanolamin, N- Methylethanolamin, N,N-Dimethylethanolamin, N,N,N- Trimethylethanolamin (im folgenden als Cholin bezeichnet), Diethanolamin, Propanolamin, Dipropanolamin oder ein Gemisch davon ist.

3. Salz nach den Ansprüchen 1 oder 2, nämlich DHA- Cholinsalz.

4. Salz nach den Ansprüchen 1 und 2, nämlich DHA- Ethanolaminsalz.

5. Salz nach den Ansprüchen 1 und 2, nämlich EPA- Cholinsalz.

6. Salz nach den Ansprüchen 1 und 2, nämlich EPA- Ethanolaminsalz.

7. Salz nach den Ansprüchen 1 und 2, nämlich DHA-Cholin und gemischtes DHA-Ethanolaminsalz.

8. Salz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Cholin zu Ethanolamin im Bereich von 2 : 8 und 8 : 2 auf molekularer Basis liegt.

9. Salz nach den Ansprüchen 1 und 2, nämlich gemischtes DHA-EPA-Cholinsalz.

10. Salz nach den Ansprüchen 1 und 2, nämlich gemischtes DHA-EPA-Ethanolaminsalz.

11. Salz nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von DHA zu EPA im Bereich von 2 : 8 bis 8 : 2 auf molekularer Basis liegt.

12. Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine der genannten mehrfachungesättigten Säuren mit wenigstens einem der genannten Aminoalkohole umgesetzt wird und das gewünschte Salz mittels üblicher Techniken gewonnen wird.

13. Pharmazeutische Formulierung, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge wenigstens eines der Salze nach Anspruch 1 als Wirkstoff.