CN103805587A

CN103805587A - 一种超氧化物歧化酶脂肪酸包合物及其制备方法

Info

Publication number: CN103805587A
Application number: CN201410013618.1A
Authority: CN
Inventors: 李健
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-01-13
Filing date: 2014-01-13
Publication date: 2014-05-21

Abstract

本发明提供了一种超氧化物歧化酶脂肪酸包合物及其制备方法。该包合物，采用低分子量的脂肪酸对超氧化物歧化酶分子中的氨基酸残基进行修饰，使超氧化物歧化酶氨基酸残基修饰率达到10.1-90%，修饰后的超氧化物歧化酶的分子量比未修饰前相应增加了2-25%。经超氧化物歧化酶的修饰反应与产品的纯化即得粉末状超氧化物歧化酶脂肪酸包合物。本发明是以小分子脂肪酸为修饰剂，对超氧化物歧化酶进行共价修饰，所得的超氧化物歧化酶脂肪酸包合物具有体内半衰期长、无免疫原性等优点，还增强超氧化物歧化酶的稳定性和抗蛋白水解的能力，消除对人体的免疫原性，延长了在人体内的半衰期，可以广泛应用于医药、食品和化妆品等领域中。

Description

一种超氧化物歧化酶脂肪酸包合物及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种超氧化物歧化酶脂肪酸包合物及其制备方法。

背景技术

超氧化物歧化酶（SOD：Superoxide Dismutase）是生物体内催化氧自由基（O₂ ^—·）发生歧化反应的重要酶，它对超氧的催化速度是化学能的1万倍，能够清除氧自由基对人体的毒害，是国际上公认氧自由基的清除剂。自1969年McCord和Fridovich首次从牛血液中发现超氧化物岐化以来，引起了各国生化界和医学界的重视。自90年代，科学界已经认识到氧自由基是在人体疲劳、生病时产生的多余的自由基，它们会破坏人体的细胞核内DNA物质，促使人衰老，或细胞癌变。20世纪，科学家们提出了人体疾病衰老的几种学说，自由基学说是当中唯一被证实且最为可靠的一种学说，它比较清楚地阐述了机体疾病衰老的过程。由于呼吸，机体组织器官时刻都在进行氧代谢，在正常生理情况下，自由基的产生与清除处于动态平衡，当某种因素使氧自由基生成过多、或超出清除能力、或清除能力减弱时，过多的氧自由基通过损伤生命大分子，破坏细胞结构与功能，导致疾病的发生与发展，从而加速机体老化。现代医学已经证实：氧自由基引起的疾病，已超过一百多种，严重的威胁着我们的健康与长寿。导致氧自由基产生的因素很多，包括：（1）人体利用氧气的过程中每日约可产生大量的活性氧（自由基）；（2）衰老：25岁以后，人体内的超氧化物歧化酶随着人体组织的老化而逐渐降低；（3）体力透支；（4）精神压力：急躁、焦虑，郁闷；（5）过度饮酒；（6）疾病、手术；（7）辐射线：核能、日光照射、X光、复印机、计算机；（8）电磁波：微波炉、吹风机、手机；（9）污染：汽车排放的废气、工业废气废水，香烟、二手烟；（10）药物滥用、食品添加剂；（11）农药残留、杀虫剂。超氧化物歧化酶作为清除人体负氧自由基的清除剂，已成为二十世纪医药学最热门研究课题。天然超氧化物歧化酶存在着一定抗原性，在人体内的半衰期短，只有6-10分钟，稳定性差容易失活，因此限制了它的应用。克服这些缺点常用的方法之一是利用水溶性大分子对超氧化物歧化酶进行共价修饰，常用的修饰剂有聚乙二醇、聚蔗糖、右旋糖酐、变性淀粉、聚烯属羟基化合物等。经过这些大分子修饰过的超氧化物歧化酶虽然免疫原性降低、体内半衰期延长、稳定性增加，但是上述修饰超氧化物歧化酶分子量过大（＞10万道尔顿）无法透过细胞膜，静脉注射易引发生毛细血管拴塞，因此只有实验室意义，应用价值不大。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种超氧化物歧化酶脂肪酸包合物及其制备方法。

本发明所述超氧化物歧化酶脂肪酸包合物，采用低分子量的脂肪酸对超氧化物歧化酶分子中的氨基酸残基进行修饰，使超氧化物歧化酶氨基酸残基修饰率达到10.1-90%，修饰后的超氧化物歧化酶的分子量比未修饰前相应增加了2-25%。

根据本发明，所述脂肪酸为碳原子数为6-30的脂肪酸。

优选的，所述脂肪酸为12-20的脂肪酸。

进一步优选的，所述脂肪酸为碳原子数为12或14或16或18的脂肪酸。

根据本发明实施方式之一，所述脂肪酸为一元饱和脂肪酸或不饱合脂肪酸。

优选的，所述一元饱和脂肪酸为8碳的正辛酸或10碳的正癸酸或12碳的月桂酸或14碳的肉豆蔻酸或16碳的棕榈酸或18碳的硬脂酸。

优选的，所述不饱和脂肪酸为一烯酸的油酸或二烯酸的亚油酸或三烯酸的亚麻酸。

本发明所述超氧化物歧化酶脂肪酸包合物的制备方法，主要包括如下步骤：

1）超氧化物歧化酶的修饰反应：将2-5% 重量份的超氧化物歧化酶溶于pH值为8-10的缓冲液中，保持溶液温度20-25℃，一边搅拌一边加入1-2.5%重量份的脂肪酸卤化物，同时用碱液保持溶液的pH值不变，加入脂肪酸卤化物之后升温至40-44℃，然后搅拌反应1-1.2小时，再迅速降温至20-24℃，得到混合溶液；

2）产品的纯化：在步骤1）所得混合溶液中加入2.5-3.5重量份的预冷丙酮，收集沉淀物，将沉淀物溶于水中，取其上清液进行提纯，经冷冻干燥，得到粉末状超氧化物歧化酶脂肪酸包合物。

根据本发明，所述脂肪酸为碳原子数为6-30的脂肪酸。

优选的，所述脂肪酸为12-20的脂肪酸。

根据本发明实施方式之一，步骤1）中加入脂肪酸卤化物之后升温至42℃。

根据本发明实施方式之一，步骤2）所述纯化使用层析柱。

根据本发明实施方式之一，步骤2）所述预冷丙酮的温度范围为-10 - -30℃。

本发明超氧化物歧化酶脂肪酸包合物的制备方法，采用低分子量的脂肪酸对超氧化物歧化酶分子中的氨基酸残基进行修饰，使超氧化物歧化酶氨基酸残基修饰率达到10.1-90%，修饰后的超氧化物歧化酶的分子量比未修饰前相应增加了2-25%。修饰超氧化物歧化酶产品的活性回收率用连苯三酚自氧化法对反应前后的活性进行测定，超氧化物歧化酶氨基酸残基的修饰率用聚丙烯酰胺凝胶电泳或氨基酸自动分析仪对反应前后氨基酸残基进行测定，超氧化物歧化酶的分子量用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定。

本发明是以小分子脂肪酸为修饰剂，对超氧化物歧化酶进行共价修饰，得到的超氧化物歧化酶脂肪酸包合物，所得的超氧化物歧化酶脂肪酸包合物具有体内半衰期长、无免疫原性、比活性高、稳定性强等优点，还增强超氧化物歧化酶的稳定性和抗蛋白水解的能力，消除对人体的免疫原性，延长了在人体内的半衰期，可以广泛应用于医药、食品和化妆品等领域中。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但这些实施例仅用于说明本发明而对本发明没有限制。

实施例1：月桂酸修饰

（1）修饰反应：将含量为6035U/mg的天然超氧化物歧化酶1000mg溶于50ml pH 9.0的0.1mol/L的碳酸盐缓冲液中，保持溶液温度20℃。搅拌中加入800mg的月桂酰氯，同时用1mol/L的NaOH溶液保持溶液的pH值不变，立即升温至42℃，搅拌反应1小时，再迅速降至室温约24℃。

（2）产品纯化：将所得反应物加入3倍体积量的预冷丙酮（-10℃），离心收集沉淀，将沉淀物溶于蒸馏水中，离心后取上清液，上葡聚糖凝胶Sephadex G-100层析柱纯化，冻干，得到月桂酸修饰超氧化物歧化酶LA-SOD。

（3）产品的活性回收率、修饰率与分子量：经连苯三酚自氧化法测定SOD活性，1000mg超氧化物歧化酶经月桂酰氯修饰后，得到LA-SOD 942mg，比活为5779 U/mg，活性回收率为90.2%。用聚丙烯酰胺凝胶电泳或氨基酸自动分析仪对反应前后氨基酸残基进行测定，得修饰率约为81%，表明超氧化物歧化酶得到了较好的保护。未修饰前的分子量为34000，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定修饰后的分子量为41140，仅比未修饰前增加了21.0%。

实施例2：肉豆蔻酸修饰

（1）修饰反应：将含量为6035U/mg的天然超氧化物歧化酶1000mg溶于50ml pH 8.5的0.1mol/L的碳酸盐缓冲液中，保持溶液温度25℃。搅拌中加入1000mg的肉豆蔻酰氯，同时用1mol/L的NaOH溶液保持溶液的pH值不变，立即升温至42℃，搅拌反应1小时，再迅速降至室温约20℃。

（2）产品纯化：将所得的反应物加入3倍体积量的预冷丙酮（-20℃），离心收集沉淀，将沉淀物溶于蒸馏水中，离心后取上清液，上葡聚糖凝胶Sephadex G-100层析柱纯化，冻干，得到肉豆蔻酸修饰超氧化物歧化酶MA-SOD。

（3）产品的活性回收率、修饰率与分子量：经连苯三酚自氧化法测定SOD活性，1000mg超氧化物歧化酶经肉豆蔻酰氯修饰后，得到MA-SOD 930mg，比活为5525 U/mg，活性回收率为85.1%。用氨基酸分析仪对反应前后氨基酸残基进行测定，得修饰率约为74%，表明超氧化物歧化酶得到了较好的保护。未修饰前的分子量为34000，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定修饰后的分子量为40460，仅比未修饰前增加了19.0%。

实施例3：棕榈酸修饰

（1）修饰反应：将含量为6035U/mg的天然超氧化物歧化酶1000mg溶于50ml pH 8.5的0.1mol/L的碳酸盐缓冲液中，保持溶液温度22℃。搅拌中加入900mg的棕榈酰氯，同时用1mol/L的NaOH溶液保持溶液的pH值不变，立即升温至42℃，搅拌反应1小时，再迅速降至室温约24℃。

（2）产品纯化：将所得的反应物加入3倍体积量的预冷丙酮（-25℃），离心收集沉淀，将沉淀物溶于蒸馏水中，离心后取上清液，上葡聚糖凝胶Sephadex G-100层析柱纯化，冻干，得到棕榈酸修饰超氧化物歧化酶PA-SOD。

（3）产品的活性回收率、修饰率与分子量：经连苯三酚自氧化法测定SOD活性，1000mg超氧化物歧化酶经脂肪酸卤化物修饰后，得到PA-SOD 819mg，比活为5025 U/mg，活性回收率为68.2%。用氨基酸自动分析仪对氨基酸残基进行测定，得修饰率约为58%。未修饰前的分子量为34000，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定修饰后的分子量为38760，仅比未修饰前增加了14.0%。

实施例4：亚油酸修饰

修饰剂为亚油酸（Linoleic Acid），是18碳二烯不饱和脂肪酸，分子式C₁₈H₃₂O₂，相对分子量280.45。将含量为6035U/mg的天然超氧化物歧化酶1000mg溶于pH 9.0的磷酸盐缓冲液中，保持溶液温度24℃。搅拌中加入1200mg亚油酰氯，同时用1mol/L的KOH溶液保持溶液的pH值不变，立即升温至42℃，搅拌反应1小时，再迅速降至室温约20℃。将所得的反应物加入3倍体积量的预冷丙酮（-30℃），离心收集沉淀，将沉淀物溶于蒸馏水中，离心后取上清液，上葡聚糖凝胶Sephadex G-100层析柱纯化，冻干，得到亚油酸修饰超氧化物歧化酶LiA-SOD。

经连苯三酚自氧化法测定SOD活性，活性回收率为48.0%。用氨基酸自动分析仪对氨基酸残基进行测定，修饰率约为40%。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定修饰后的分子量，仅比未修饰前增加了9.0%。

Claims

1.一种超氧化物歧化酶脂肪酸包合物，其特征在于，采用低分子量的脂肪酸对超氧化物歧化酶分子中的氨基酸残基进行修饰，使超氧化物歧化酶氨基酸残基修饰率达到10.1-90%，修饰后的超氧化物歧化酶的分子量比未修饰前相应增加了2-25%。

2.如权利要求1所述超氧化物歧化酶脂肪酸包合物，其特征在于，所述脂肪酸为碳原子数为6-30的脂肪酸。

3.如权利要求2所述超氧化物歧化酶脂肪酸包合物，其特征在于，所述脂肪酸为12-20的脂肪酸；优选的，所述脂肪酸为碳原子数为12或14或16或18的脂肪酸。

4.如权利要求1或2所述超氧化物歧化酶脂肪酸包合物，其特征在于，所述脂肪酸为一元饱和脂肪酸或不饱合脂肪酸；优选的，所述一元饱和脂肪酸为8碳的正辛酸或10碳的正癸酸或12碳的月桂酸或14碳的肉豆蔻酸或16碳的棕榈酸或18碳的硬脂酸；优选的，所述不饱和脂肪酸为一烯酸的油酸或二烯酸的亚油酸或三烯酸的亚麻酸。

5.如权利要求1-4任一项所述超氧化物歧化酶脂肪酸包合物的制备方法，主要包括如下步骤：

6.如权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述脂肪酸为碳原子数为6-30的脂肪酸；优选的，所述脂肪酸为12-20的脂肪酸；进一步优选的，所述脂肪酸为碳原子数为12或14或16或18的脂肪酸。

7.如权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述脂肪酸为一元饱和脂肪酸或不饱合脂肪酸；优选的，所述一元饱和脂肪酸为8碳的正辛酸或10碳的正癸酸或12碳的月桂酸或14碳的肉豆蔻酸或16碳的棕榈酸或18碳的硬脂酸；优选的，所述不饱和脂肪酸为一烯酸的油酸或二烯酸的亚油酸或三烯酸的亚麻酸。

8.如权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤1）中加入脂肪酸卤化物之后升温至42℃。

9.如权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤2）所述纯化使用层析柱。

10.如权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤2）所述预冷丙酮的温度范围为-10 - -30℃。