CN101633919A - 不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物及其制备 - Google Patents
不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物及其制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一类不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物及其制备,所述Cu/Zn-超氧化物歧化酶上的自由氨基与不饱和脂肪酸上的羧基以酰胺键的形式结合,一个Cu/Zn-超氧化物歧化酶分子结合不多于20个不饱和脂肪酸分子;所述的不饱和脂肪酸的碳链长度为16~26。所述的制备方法是:采用二氯亚砜活化法或者N-羟基琥珀酰亚胺活化法活化不饱和脂肪酸上的羧基,得到不饱和脂肪酸的活化产物;将Cu/Zn-超氧化物歧化酶与不饱和脂肪酸的活化产物加入pH6.0~9.0缓冲溶液中,在0~30℃下搅拌反应,制得目标产物。本发明所述的不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物,充分发挥不饱和脂肪酸和Cu/Zn-SOD的协同作用,提高了Cu/Zn-超氧化物歧化酶的稳定性,降低其免疫原性,具有更好的使用效果和使用范围。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,特别是涉及不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物及其制备方法。
背景技术
超氧化物歧化酶(SOD)是一类重要的超氧阴离子自由基清除剂,可用于防治过量超氧阴离子自由基引起的疾病和机体损伤,如糖尿病、关节炎、自身免疫性疾病、放射性损伤、缺血再关注损伤等。迄今为止,科学家已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内都分离得到了SOD。基于金属辅基不同,这些SOD至少可以分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三种类型。一般来说,Fe-SOD是被认为存在于较原始的生物类群中的一种SOD类型;Mn-SOD是在Fe-SOD基础上进化而来的一种蛋白类型,由于任何来源的Mn-SOD和Fe-SOD的一级结构同源性都很高,均不同于Cu/Zn-SOD的序列,可见它们来自同一个祖先;Cu/Zn-SOD分布最广,是一种真核生物酶,广泛存在于动物的血、肝和菠菜叶、刺梨等生物体中。
但是,以上那些天然来源超氧化物歧化酶存在一定的抗原性、体内半衰期短、稳定性差和不易吸收等缺陷,限制了其实际应用。克服超氧化物歧化酶缺陷的方法主要是对其分子进行化学修饰,天然的Cu/Zn-SOD结构拥有20个可用于结构修饰的胺基,这些基团的存在为结构修饰提供了结构修饰的位点。目前的修饰主要针对天然来源丰富的Cu/Zn-SOD,采用的修饰剂有聚乙二醇(USP 5066590)、右旋糖酐、低分子肝素、硫酸软骨素、聚甘露糖等。这些物质修饰后其免疫原性降低、体内半衰期延长、稳定性增加。但这些结合物活性保持率不高、分子量大不易吸收,且一般修饰操作复杂,反应难于控制,反应原料毒性较大,对于治疗与超氧阴离子自由基有关的疾病疗效并不十分理想。采用小分子物质修饰超氧化物歧化酶的报道较少,如阎家麒等人采用月桂酸修饰超氧化物歧化酶(阎家麒,谢文正月桂酸修饰超氧化物歧化酶的制备及其性质研究[J].生物化学与生物物理进展,1994,21(2):154-157),显著性降低了Cu/Zn-超氧化物歧化酶的抗原性,增强了其稳定性。但还存在如下不足:修饰后Cu/Zn-SOD活性保持率不是很高,只有85%,此外月桂酸属于饱和脂肪酸本身没有生理活性,无法发挥脂肪酸和SOD的协同效应。
发明内容
本发明要解决的首要技术问题是提供一种不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物,以提高Cu/Zn-超氧化物歧化酶的稳定性、降低其免疫原性,使其具有更好的使用效果和使用范围。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
一类不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物,Cu/Zn-超氧化物歧化酶上的自由氨基与不饱和脂肪酸上的羧基以酰胺键的形式结合,一个Cu/Zn-超氧化物歧化酶分子结合不多于20个不饱和脂肪酸分子。
本发明所述的不饱和脂肪酸,其碳链结构中至少含有一个碳-碳双键的烯基键,其碳链长度推荐为16-26。优选所述的不饱和脂肪酸为亚油酸、亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。
不饱和脂肪酸具有重要的生理活性,如亚油酸和亚麻酸是人体必须脂肪酸,分别是ω-6和ω-3不饱和脂肪酸的前体;不饱和脂肪酸中花生四烯酸参与多种生理代谢功能,二十二碳六烯酸是脑和视网膜的重要脂质成分。不饱和脂肪酸是细胞膜磷脂的重要成分,其成分的改变可影响膜的流动性和某些酶的活性以及激素与受体的结合和信号的传递。本发明采用具有重要生理活性的小分子不饱和脂肪酸修饰Cu/Zn-超氧化物歧化酶,可以发挥小分子不饱和脂肪酸与Cu/Zn-超氧化物歧化酶的协同抗氧化作用。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种上述不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法,该工艺合成方法简便,工艺稳定性好,产品性能良好。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
一种不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法,先是采用二氯亚砜活化法或者N-羟基琥珀酰亚胺活化法活化不饱和脂肪酸上的羧基,得到不饱和脂肪酸的活化产物;然后将Cu/Zn-超氧化物歧化酶与不饱和脂肪酸的活化产物加入pH 6.0~9.0缓冲溶液中,在0~30℃下搅拌反应,反应完全后采用预冷丙酮沉淀和葡聚糖凝胶柱层析法分离不饱和脂肪酸超氧化物歧化酶修饰物,再经过冷冻干燥制得粉末状不饱和脂肪酸超氧化物歧化酶修饰物。
本发明推荐所述Cu/Zn-超氧化物歧化酶与不饱和脂肪酸的活化产物的投料摩尔比为1∶5~100,优选1∶20~40,其中Cu/Zn-超氧化物歧化酶分子量以30000计算,不饱和脂肪酸的活化产物的摩尔数以不饱和脂肪酸的当量计。
所述二氯亚砜活化法通常可按照如下进行:在无溶剂条件下或是在有机溶剂A中,将不饱和脂肪酸和过量的二氯亚砜在氮气保护下加热回流反应2~4小时,充分反应后回收溶剂(除去过量的二氯亚砜或者除去有机溶剂A和过量的二氯亚砜)即得不饱和脂肪酰氯,即为所述的不饱和脂肪酸的活化产物。所述的有机溶剂A可选自下列之一:石油醚、环己烷、正己烷等低级烷烃。所述的不饱和脂肪酸与二氯亚砜的投料摩尔比推荐为1∶2~5,所述的有机溶剂A的体积用量以不饱和脂肪酸的质量计为3~5ml/g。二氯亚砜活化法具有原料易得、价格低廉,操作简单的优点。本发明推荐所述的Cu/Zn-超氧化物歧化酶与不饱和脂肪酰氯在0~30℃下搅拌反应0.5~2小时,优选在15~25℃下搅拌反应1小时。
所述的N-羟基琥珀酰亚胺活化法通常可按照如下进行:将不饱和脂肪酸溶于有机溶剂B中,加入N-羟基琥珀酰亚胺和N,N’-二环己基碳酰亚胺,溶液在20~40℃反应10~20小时后,过滤取滤液,经纯化得N-羟基琥珀酰亚胺不饱和脂肪酸酯,即为所述的不饱和脂肪酸的活化产物。所说的有机溶剂B可选自下列之一:N,N’-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环、二甲基亚砜、四氢呋喃。所述的不饱和脂肪酸、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N’-二环己基碳酰亚胺的投料摩尔比推荐为1∶2.5~4∶2.5~4。所述的有机溶剂B的体积用量以不饱和脂肪酸的质量计为5~10ml/g。所述的纯化可采用硅胶柱层析,推荐洗脱剂:石油醚∶乙醚=1∶1。N-羟基琥珀酰亚胺活化合成法具有反应条件温和、对环境友好,而且合成得到的不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物具有极高的活性保持率的优点。本发明推荐所述的超氧化物歧化酶与N-羟基琥珀酰亚胺不饱和脂肪酸酯在0~30℃下搅拌反应15~30小时,优选在20~30℃下搅拌反应20~25小时。
本发明制得的不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物可用于制备防治氧自由基引起的各类疾病的药物,并可作为保健食品、化妆品添加剂应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:本发明制得的不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物具有极高的活性保持率,明显高于大分子修饰的Cu/Zn-超氧化物歧化酶,同时也高于饱和脂肪酸修饰Cu/Zn-超氧化物歧化酶。与天然Cu/Zn-超氧化物歧化酶相比不仅具有抗原性低、半衰期长、稳定性高、亲脂性强等优点,而且能充分发挥亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸特有的调节心血管、抗炎、抗肿瘤等特性,将其制成药物对于防治氧自由基引起的各类疾病有重要作用,将会比天然Cu/Zn-超氧化物歧化酶及其他结合物有更好使用效果和使用范围。此外,用作保健食品、化妆品添加剂,也比天然Cu/Zn-超氧化物歧化酶更具优越性,如稳定性明显增加,从而能在保健食品和化妆品中较长时间地保持较高活性,且亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸是人体必须脂肪酸,在西方国家大量食用。
附图说明
图1为实施例4得到的天然Cu/Zn-SOD(■),亚油酸-Cu/Zn-SOD(○)和亚麻酸-Cu/Zn-SOD(▲)的热稳定性曲线图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的内容,下面将描述本发明的几个实施例,但这些实施例绝不是对本发明的任何限制。
实施例1:二氯亚砜活化法合成不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物
于四口烧瓶中装上机械搅拌,回流冷凝器,滴液漏斗和温度计,加入6ml石油醚,氯化亚砜2ml,通入氮气,冰浴降温至0℃以下,缓慢滴加不饱和脂肪酸酸(亚油酸、亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸)1.8克,滴加时维持温度在5℃左右,滴加完毕后,室温下反应3小时。蒸除石油醚和过量氯化亚砜,得不饱和脂肪酰氯。取1.2gCu/Zn-SOD溶于弱碱性磷酸缓冲溶液中,20℃下搅拌溶解。氮气保护下缓慢加入活化的不饱和脂肪酸,并加入少量氢氧化钠溶液维持pH为9.0,随即升温至25℃,搅拌60min迅速降至室温,加入3倍体积预冷(-20℃)丙酮,离心取沉淀经葡聚糖G-100凝胶柱分离,以水为洗脱溶剂,收集活性洗脱液,冷冻干燥制得粉末状不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物。
对比例1:饱和脂肪酸月桂酸修饰的Cu/Zn-SOD的制备
于四口烧瓶中装上机械搅拌,回流冷凝器,滴液漏斗和温度计,加入6ml石油醚,氯化亚砜2ml,通入氮气,冰浴降温至0℃以下,缓慢滴加月桂酸1.8克,滴加时维持温度在5℃左右,滴加完毕后,室温下反应3小时。蒸除石油醚和过量氯化亚砜,得不饱和脂肪酰氯。取1.2g Cu/Zn-SOD溶于弱碱性磷酸缓冲溶液中,20℃下搅拌溶解。氮气保护下缓慢加入活化的月桂酸,并加入少量氢氧化钠溶液维持pH为9.0,随即升温至25℃,搅拌60min迅速降至室温,加入3倍体积预冷(-20℃)丙酮,离心取沉淀经葡聚糖G-100凝胶柱分离,以水为洗脱溶剂,收集活性洗脱液,冷冻干燥制得粉末状月桂酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物。
实施例2:N-羟基琥珀酰亚胺法合成不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物
取1g不饱和脂肪酸(亚油酸、亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸)溶于8ml 1,4-二氧六环中,然后加入200mg N-羟基琥珀酰亚胺和400mg N′,N′-二环己基碳酰亚胺,25℃条件下反应24小时。过滤取滤液旋蒸得白色固体,乙酸乙酯∶乙醚=10∶1硅胶柱分离得活化的不饱和脂肪酸酯。称取500mg Cu/Zn-超氧化物歧化酶溶于10ml 0.1mol/L的磷酸缓冲溶液中(pH8.0),搅拌下加入N-羟基琥珀酰亚胺不饱和脂肪酸酯,25℃搅拌反应24小时。反应液倒入20ml预冷丙酮(-20℃),离心取沉淀经葡聚糖凝胶G-100柱分离,以水为洗脱溶剂,收集活性洗脱液,冷冻干燥制得粉末状不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶结合物。
实施例3:饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸修饰的Cu/Zn-SOD性能比较
本发明采用了对比例1合成的饱和脂肪酸-Cu/Zn氧化物歧化酶结修饰物(月桂酸-Cu/Zn-SOD)和实施例1合成的不饱和脂肪酸-Cu/Zn氧化物歧化酶修饰物(亚油酸-Cu/Zn-SOD、亚麻酸-Cu/Zn-SOD)。其性能如表1所示:
表1月桂酸-Cu/Zn-SOD修饰物、不饱和脂肪酸-Cu/Zn-SOD修饰物的性能比较
样品 | 酶比活(U/mg) | 活性回收率 | 氨基修饰率(%) |
天然Cu/Zn-SOD | 5170 | ||
月桂酸-Cu/Zn-SOD | 4467 | 84% | 72 |
亚油酸-Cu/Zn-SOD | 5399 | 104% | 72 |
亚麻酸-Cu/Zn-SOD | 5074 | 98% | 70 |
由表1可以看出,在氨基修饰率基本相同的情况下,亚油酸-Cu/Zn-SOD和亚麻酸-Cu/Zn-SOD活性回收率高达104%和98%,均明显高于饱和脂肪酸(月桂酸)修饰的Cu/Zn-SOD。也明显高于文献报道的大分子物质修饰Cu/Zn-SOD,如羧甲基半胱氨酸(CMCH)修饰Cu/Zn-SOD活性回收率为57%,低分子肝素(LMW)修饰Cu/Zn-SOD活性回收率为63.9%,聚甘露糖修(Man)饰Cu/Zn-SOD活性回收率为52%。这可能是因为两方面的原因:一方面小分子不饱和脂肪酸修饰Cu/Zn-SOD较好地保留了酶的催化活化结构;另一方面不饱和脂肪酸本身具有抗氧化作用,修饰Cu/Zn-SOD后发挥了协同抗氧化作用。
实施例4:天然Cu/Zn-SOD与不饱和脂肪酸修饰的Cu/Zn-SOD的热稳定性比较
由图1可以看出,未修饰的天然Cu/Zn-SOD与实施例2制得的不饱和脂肪酸(亚油酸、亚麻酸)修饰的Cu/Zn-SOD在耐热稳定性方面比较,差异显著。在75℃水浴保温下天然Cu/Zn-SOD迅速失活,保温2小时后活性保持率仅为49%。亚油酸、亚麻酸修饰的Cu/Zn-SOD均可以显著增强其热稳定性,保温两小时后活性保持率分别为77%和76%。
实施例5:天然Cu/Zn-SOD与不饱和脂肪酸修饰的Cu/Zn-SOD的耐酸碱稳定性
天然Cu/Zn-SOD、实施例2制得的亚油酸-Cu/Zn-SOD和亚麻酸-Cu/Zn-SOD在25℃分别置于pH5.2的酸性溶液和pH10.8的碱性溶液中进行处理,结果如表2所示:
表2天然Cu/Zn-SOD、亚油酸和亚麻酸-Cu/Zn-SOD 25℃的耐酸碱稳定性
由表2可以看出,经过6h的酸碱处理,两种修饰Cu/Zn-SOD在酸性环境和碱性环境中的稳定性均比天然Cu/Zn-SOD稳定性高。在pH 5.2时,亚油酸-Cu/Zn-SOD和亚麻酸-Cu/Zn-SOD剩余活力分别为78%和79%,远高于天然的Cu/Zn-SOD的53%;在pH 10.8亚油酸-Cu/Zn-SOD和亚麻酸-Cu/Zn-SOD剩余活力分别为73%和78%,亦高于天然Cu/Zn-S OD的58%。
实施例6:天然Cu/Zn-SOD与不饱和脂肪酸修饰的Cu/Zn-SOD的抗蛋白酶稳定性
取天然Cu/Zn-SOD、实施例2的亚油酸修饰的Cu/Zn-SOD和亚麻酸修饰的Cu/Zn-SOD,进行了抗蛋白酶稳定性研究(胃蛋白酶、胰蛋白酶),结果如表3所示:
表3天然Cu/Zn-SOD、不饱和脂肪酸修饰的Cu/Zn-SOD抗蛋白酶稳定性
由表3可知,天然Cu/Zn-SOD在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下迅速失活,当作用60分钟时活性保持率分别为22%和55%,相同条件下亚油酸修饰Cu/Zn-SOD和亚麻酸修饰Cu/Zn-SOD活性保持率分别高于50%和70%。表明Cu/Zn-SOD经过不饱和脂肪酸修饰后,其对胃蛋白酶和胰蛋白酶耐受性明显提高,可以明显提高其体内实际使用效果。
Claims (10)
1、一类不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物,其特征是Cu/Zn-超氧化物歧化酶上的自由氨基与不饱和脂肪酸上的羧基以酰胺键的形式结合,一个Cu/Zn-超氧化物歧化酶分子结合不多于20个不饱和脂肪酸分子;所述的不饱和脂肪酸的碳链长度为16~26。
2、根据权利要求1所述的不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物,其特征在于所述的不饱和脂肪酸为亚油酸、亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸。
3.一种如权利要求1所述的不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法,其特征在于采用二氯亚砜活化法或者N-羟基琥珀酰亚胺活化法活化不饱和脂肪酸上的羧基,得到不饱和脂肪酸的活化产物;将Cu/Zn-超氧化物歧化酶与不饱和脂肪酸的活化产物加入pH 6.0~9.0缓冲溶液中,在0~30℃下搅拌反应,反应完全后采用预冷丙酮沉淀和凝胶柱层析法分离不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物,再经过冷冻干燥制得粉末状不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物。
4、如权利要求3所述的不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法,其特征在于所述Cu/Zn-超氧化物歧化酶与不饱和脂肪酸的活化产物的投料摩尔比为1∶5~100,其中Cu/Zn-超氧化物歧化酶分子量以30000计算,不饱和脂肪酸的活化产物的摩尔数以不饱和脂肪酸的当量计。
5、如权利要求3或4所述的不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法,其特征在于所述二氯亚砜活化法具体如下:在无溶剂条件下或在有机溶剂A中,不饱和脂肪酸和过量的二氯亚砜在氮气保护下在20~40℃反应2~4小时,回收溶剂即得不饱和脂肪酰氯,即为所述的不饱和脂肪酸的活化产物。
6、如权利要求5所述的不饱和脂肪酸Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法,其特征在于所述的有机溶剂A选自下列之一:石油醚、环己烷、正己烷。
7、如权利要求5所述的不饱和脂肪酸Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法,其特征在于所述的Cu/Zn-超氧化物歧化酶与不饱和脂肪酰氯在0~30℃下搅拌反应0.5~2小时。
8、如权利要求3或4所述的不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法,其特征在于所述的N-羟基琥珀酰亚胺活化法具体如下:将不饱和脂肪酸溶于有机溶剂B中,加入N-羟基琥珀酰亚胺和N,N’-二环己基碳酰亚胺,在20~40℃反应10~20小时后,过滤取滤液,经纯化得N-羟基琥珀酰亚胺不饱和脂肪酸酯,即为所述的不饱和脂肪酸的活化产物。
9、如权利要求8所述的不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法,其特征在于所述的有机溶剂B选自下列之一:N,N’-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环、二甲基亚砜、四氢呋喃。
10、如权利要求8所述的不饱和脂肪酸-Cu/Zn-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法,其特征在于所述的Cu/Zn-超氧化物歧化酶与N-羟基琥珀酰亚胺不饱和脂肪酸酯在0~30℃下搅拌反应10~30小时。
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