CN115637279B - 一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白及其制备方法。通过种子培养、摇瓶发酵、离心干燥等得到重组人源胶原蛋白，并将其应用到敷贴中，敷贴包括重组人源胶原蛋白原液和载体，将重组人源胶原蛋白原液和载体无菌封装于铝箔袋中，封口后低温辐射灭菌得到敷贴，其中重组人源胶原蛋白原液由重组人源胶原蛋白、促透剂、增稠剂、薰衣草提取物、防腐剂和水组成，制备得到的敷贴能够有效的提高皮肤的含水量，适用于不同情况后的修复。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白及其制备方法。
背景技术
皮肤因手术、感染、烧烫伤等各种原因形成的瘢痕影响人体美观，可对患者的日常生活和社会活动造成严重影响。随着时代的发展和生活水平的提高，人们对瘢痕美化的要求越来越高，故各种成分的祛疤制剂如硅酮类凝胶、动物胶原蛋白凝胶和类人胶原蛋白凝胶等相继出现。其中重组人源胶原蛋白是利用基因工程技术将人源胶原蛋白的原始基因序列经过优化重组表达得到的，与人体天然胶原蛋白的氨基酸序列高度一致。重组人源胶原蛋白含有丰富的亲水性氨基酸残基，有利于纤维细胞的粘附和增殖，加快胶原蛋白合成和沉积的速度，缩短创伤愈合时间。但是其具有容易被酶水解、热不稳定和难以穿透角质层细胞间的脂质结构的问题。
申请号为201110327865.5的中国专利公开了一种重组人源胶原蛋白及其制备方法，通过对表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建、基因工程菌的发酵培养、重组人源胶原蛋白诱导表达及重组人源胶原蛋白的提取纯化得到成品重组人源胶原蛋白，实现了分子水平的操作简单化、胶原蛋白的基因工程菌发酵生产；可诱导表达的毕赤酵母工程菌能实现重组人源胶原蛋白在胞内和胞外的高水平表达，但并未对得到的重组人源胶原蛋白的应用进行研究，尤其是针对不同术后肌肤修复情况的研究。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白及其制备方法。通过种子培养、摇瓶发酵、离心干燥等得到重组人源胶原蛋白，并将其应用到敷贴中，制备得到的敷贴能够有效的提高皮肤的含水量，适用于不同情况后的修复。
本发明解决上述问题的技术方案如下：
一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：
S1、将在新鲜MD培养基中培养的工程菌按10%-12%的接种量，优选为10%，接种到BMG培养基中，25-28℃，200-400r/min振荡培养过夜，优选为28℃，200r/min，然后接入BMG培养基中继续培养至OD600达6.0-8.0；
S2、室温下10000-12000r/min离心10-15min，优选为10000r/min离心15min，收集BMG培养基中菌体，以BMM液体培养基重新悬浮菌体，使菌浓OD600为3.0，在25-28℃，优选为28℃，自然pH值下，200-400r/min培养24-28h，优选为200r/min培养28h，每6-8h补加甲醇至3%，优选为每6h补加一次；
S3、对发酵液进行离心分离，收集上清液，上清液经滤膜过滤后，用Sephadex G100凝胶柱层析分离纯化，再经冷冻干燥得到成品重组人源胶原蛋白。
进一步地，所述MD培养基：1.34% YNB，4×10-5% Biotin，2%葡萄糖；固体培养基再加入终浓度为1.5%的琼脂；所述BMG培养基：100mM磷酸缓冲液，pH为6.0，1.34% YNB，4×10-5% Biotin，1%甘油（V/V）；所述BMM培养基：100mM磷酸缓冲液，pH为6.0，1.34% YNB，4×10-5% Biotin，0.5%甲醇（V/V）。
本发明还提供一种由上述制备方法得到的重组人源胶原蛋白在敷贴中的应用，所述敷贴包括重组人源胶原蛋白原液和载体；所述重组人源胶原蛋白原液由以下重量份组分组成：重组人源胶原蛋白8-12份，促透剂6-8份，增稠剂3-6份，薰衣草提取物2-6份，防腐剂2-5份，水40-50份；优选为：重组人源胶原蛋白10份，促透剂6份，增稠剂5份，薰衣草提取物4份，防腐剂3份，水45份；所述载体为非织无纺布。
进一步地，所述增稠剂为波姆、黄原胶、羟乙基纤维素、丙烯酸酯中的一种或几种混合；防腐剂为甲基氯异噻唑啉酮、2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇、甲基异噻唑啉酮、苯氧乙醇、4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸乙酯、4-羟基苯甲酸丙酯、4-羟基苯甲酸异丁酯中的一种或几种混合。
进一步地，薰衣草提取物的加入能够促进细胞再生，平衡皮脂分泌，对组织的生长和修复有良好的功效。
进一步地，所述重组人源胶原蛋白原液和所述载体被无菌封装于铝箔袋中，随后封口，并低温辐射灭菌，其中低温辐照灭菌的温度是-20～-10℃、辐照剂量是5-15kGy。
进一步地，所述促透剂的制备方法为：以四氢呋喃为溶剂，加入己内酰胺和氯甲基环氧乙烷，搅拌均匀后加热回流反应2-4h，优选为4h，生成1-（环氧乙烷-2-基甲基）氮杂环-2-酮，即为所述促透剂，反应过程为：
进一步地所述重组人源胶原蛋白原液的制备步骤为：
S1、以乙醇为溶剂，加入重组人源胶原蛋白和N，N-二异丙基乙胺，混合均匀后向其中添加所述促透剂，升高温度至45-55℃，反应4-6h，优选为升高温度至50℃，反应6h，将得到的反应液置于透析袋中用去离子水透析30-36h，优选为36h，每隔6h换水一次，透析完成后，经离心、冻干得到白色固体；其中离心的条件为：10000-12000r/min条件下离心4-6min，优选为10000r/min条件下离心5min；冻干条件为：-20℃预冻20-24h，-80℃冷冻干燥68-72h，优选为-20℃预冻24h，-80℃冷冻干燥72h；在该步操作中，在碱性溶液下，加入的促透剂，其结构中具有的环氧基发生开环与重组人源胶原蛋白上含有的-NH2发生反应，对重组人源胶原蛋白进行了进一步修饰；其中反应过程为：
S2、将步骤S1得到的白色固体溶解于部分水中，混合均匀后依次加入促透剂和增稠剂，搅拌均匀后得到第一溶液；
S3、在剩余水中加入薰衣草提取物和防腐剂，搅拌均匀后得到第二溶液；
S4、在搅拌状态下，向第二溶液中加入第一溶液，添加完成后，持续搅拌至混合均匀，得到所述重组人源胶原蛋白原液。
本发明具有如下有益效果为：
本发明通过种子培养、摇瓶发酵、离心干燥等得到重组人源胶原蛋白，并将其应用到敷贴中，敷贴包括重组人源胶原蛋白原液和载体，将重组人源胶原蛋白原液和载体无菌封装于铝箔袋中，封口后低温辐射灭菌得到敷贴。其中重组人源胶原蛋白原液由重组人源胶原蛋白、促透剂、增稠剂、薰衣草提取物、防腐剂和水组成。在本发明中制备的促透剂1-（环氧乙烷-2-基甲基）氮杂环-2-酮具有带环氧基的烃链和极性很强的七元环内酰胺基结构，在与重组人源胶原蛋白混合过程中，环氧基开环与重组人源胶原蛋白上含有的氨基发生反应，将1-（环氧乙烷-2-基甲基）氮杂环-2-酮接枝到重组人源胶原蛋白上，并引入了大量的亲水基团；在使用过程中能够渗入皮肤角质层经毛囊途径渗入毛囊内根鞘，与细胞间脂质或生物膜类脂质作用，增加膜酯的流动性，导致细胞结构疏松，促进吸收；同时亲水基团的存在能够增加细胞含水量；有效的填补局部塌陷，改善松弛，收紧皮肤，减少皱纹。
附图说明
图1为术后3个月后红斑修复效果对比图；
图2为术后直接使用效果对比图；
图3为痘痘术后直接使用效果对比图；
图4为微针术后直接使用效果对比图；
图5为日常直接使用效果对比图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
四氢呋喃CAS号：109-99-9，己内酰胺CAS号：105-60-2，氯甲基环氧乙烷CAS号：106-89-8，N,N-二异丙基乙胺CAS号：7087-68-5，市售促透剂购买自湖北东曹化学科技有限公司，市售胶原蛋白购买自山东天骄生物技术有限公司，薰衣草提取物购买自陕西斯诺特生物技术有限公司，所有试剂均为市售；本申请所用工程菌采用申请号为201811590564.X，发明名称为“重组人源Ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法”的发明专利申请中公开的方法得到，表达菌株为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0301，保藏编号为CGMCCNo.16462。
实施例1
一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：
S1、将在新鲜MD培养基中培养的工程菌按10%的接种量，接种到50mL BMG培养基中，28℃，200r/min振荡培养过夜，然后接入200mL BMG培养基中继续培养至OD600达6.0；
S2、室温下10000r/min离心15min，收集BMG培养基中菌体，以100mL BMM液体培养基重新悬浮菌体，使菌浓OD600为3.0，在28℃，自然pH值下，200r/min培养28h，每6h补加甲醇至3%；
S3、对发酵液进行离心分离，收集上清液，经检测最终重组人源胶原蛋白浓度为18.8g/L，上清液经滤膜过滤后，用Sephadex G100凝胶柱层析分离纯化，再经冷冻干燥得到成品重组人源胶原蛋白。
其中，MD培养基：1.34% YNB，4×10-5% Biotin，2%葡萄糖；固体培养基再加入终浓度为1.5%的琼脂；BMG培养基：100mM磷酸缓冲液，pH为6.0，1.34% YNB，4×10-5% Biotin，1%甘油（V/V）；BMM培养基：100mM磷酸缓冲液，pH为6.0，1.34% YNB，4×10-5% Biotin，0.5%甲醇（V/V）。
一种由上述制备方法得到的重组人源胶原蛋白在敷贴中的应用，敷贴包括重组人源胶原蛋白原液和载体；重组人源胶原蛋白原液由以下重量份组分组成：重组人源胶原蛋白10份，促透剂6份，增稠剂5份，薰衣草提取物4份，防腐剂3份，水45份；载体为非织无纺布；其中增稠剂为黄原胶，防腐剂为4-羟基苯甲酸甲酯；其中，薰衣草提取物的加入能够促进细胞再生，平衡皮脂分泌，对组织的生长和修复有良好的功效。
促透剂的制备方法为：以15重量份四氢呋喃为溶剂，加入12重量份己内酰胺和10重量份氯甲基环氧乙烷，搅拌均匀后加热回流反应4h，生成1-（环氧乙烷-2-基甲基）氮杂环-2-酮，即为促透剂，反应过程为：
其中，重组人源胶原蛋白原液的制备步骤为：
S1、以15重量份乙醇为溶剂，加入6重量份重组人源胶原蛋白和3重量份N,N-二异丙基乙胺，混合均匀后向其中添加10重量份促透剂，升高温度至50℃，反应6h，将得到的反应液置于透析袋中用去离子水透析36h，每隔6h换水一次，透析完成后，经离心、冻干得到白色固体；其中离心的条件为：10000r/min条件下离心5min；冻干条件为：-20℃预冻24h，-80℃冷冻干燥72h；其中反应过程如下：
S2、将步骤S1得到的白色固体溶解于20重量份水中，混合均匀后依次加入促透剂和增稠剂，搅拌均匀后得到第一溶液；
S3、在剩余25重量份水中加入薰衣草提取物和防腐剂，搅拌均匀后得到第二溶液；
S4、在搅拌状态下，向第二溶液中加入第一溶液，添加完成后，持续搅拌至混合均匀，得到重组人源胶原蛋白原液。
将重组人源胶原蛋白原液和载体被无菌封装于铝箔袋中，随后封口，并低温辐射灭菌，其中低温辐照灭菌的温度是-20℃、电子束灭菌辐照的剂量为10kGy，进行电子束灭菌辐照3s，即得重组人源胶原蛋白敷贴。
实施例2
本实施例与实施例1相比，部分培养条件及反应条件不同，其余参照实施例1。
一种修复肌肤用重组人源胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：
S1、将在新鲜MD培养基中培养的工程菌按12%的接种量，接种到50mL BMG培养基中，25℃，400r/min振荡培养过夜，然后接入200mL BMG培养基中继续培养至OD600达8.0；
S2、室温下12000r/min离心10min，收集BMG培养基中菌体，以100mL BMM液体培养基重新悬浮菌体，使菌浓OD600为3.0，在25℃，自然pH值下，400r/min培养24h，每8h补加甲醇至3%；
S3、对发酵液进行离心分离，收集上清液，经检测最终重组人源胶原蛋白浓度为17.5g/L，上清液经滤膜过滤后，用Sephadex G100凝胶柱层析分离纯化，再经冷冻干燥得到成品重组人源胶原蛋白。
其中，MD培养基：1.34% YNB，4×10-5% Biotin，2%葡萄糖；固体培养基再加入终浓度为1.5%的琼脂；BMG培养基：100mM磷酸缓冲液，pH为6.0，1.34% YNB，4×10-5% Biotin，1%甘油（V/V）；BMM培养基：100mM磷酸缓冲液，pH为6.0，1.34% YNB，4×10-5% Biotin，0.5%甲醇（V/V）。
一种由上述制备方法得到的重组人源胶原蛋白在敷贴中的应用，敷贴包括重组人源胶原蛋白原液和载体；重组人源胶原蛋白原液由以下重量份组分组成：重组人源胶原蛋白8份，促透剂6份，增稠剂3份，薰衣草提取物2份，防腐剂2份，水40份；载体为非织无纺布；其中增稠剂为羟乙基纤维素，防腐剂为4-羟基苯甲酸乙酯。
促透剂的制备方法为：以12重量份四氢呋喃为溶剂，加入8重量份己内酰胺和6重量份氯甲基环氧乙烷，搅拌均匀后加热回流反应2h，生成1-（环氧乙烷-2-基甲基）氮杂环-2-酮，即为促透剂。
其中，重组人源胶原蛋白原液的制备步骤为：
S1、以12重量份乙醇为溶剂，加入5重量份重组人源胶原蛋白和2重量份N，N-二异丙基乙胺，混合均匀后向其中添加8重量份促透剂，升高温度至45℃，反应4h，将得到的反应液置于透析袋中用去离子水透析30h，每隔5h换水一次，透析完成后，经离心、冻干得到白色固体；其中离心的条件为：12000r/min条件下离心4min；冻干条件为：-20℃预冻20h，-80℃冷冻干燥68h；
S2、将步骤S1得到的白色固体溶解于20重量份水中，混合均匀后依次加入促透剂和增稠剂，搅拌均匀后得到第一溶液；
S3、在20重量份水中加入薰衣草提取物和防腐剂，搅拌均匀后得到第二溶液；
S4、在搅拌状态下，向第二溶液中加入第一溶液，添加完成后，持续搅拌至混合均匀，得到重组人源胶原蛋白原液。
将重组人源胶原蛋白原液和载体被无菌封装于铝箔袋中，随后封口，并低温辐射灭菌，其中低温辐照灭菌的温度是-20℃、电子束灭菌辐照的剂量为8kGy，进行电子束灭菌辐照3s，即得重组人源胶原蛋白敷贴。
实施例3
本实施例与实施例1相比，在重组人源胶原蛋白敷贴的制备过程中反应条件不同，其余参照实施例1。
一种由上述制备方法得到的重组人源胶原蛋白在敷贴中的应用，敷贴包括重组人源胶原蛋白原液和载体；重组人源胶原蛋白原液由以下重量份组分组成：重组人源胶原蛋白12份，促透剂8份，增稠剂6份，薰衣草提取物6份，防腐剂5份，水50份。
促透剂的制备方法为：以18重量份四氢呋喃为溶剂，加入15重量份己内酰胺和12重量份氯甲基环氧乙烷，搅拌均匀后加热回流反应4h，生成1-（环氧乙烷-2-基甲基）氮杂环-2-酮，即为促透剂。
其中，重组人源胶原蛋白原液的制备步骤为：
S1、以18重量份乙醇为溶剂，加入8重量份重组人源胶原蛋白和5重量份N，N-二异丙基乙胺，混合均匀后向其中添加12重量份促透剂，升高温度至55℃，反应6h，将得到的反应液置于透析袋中用去离子水透析36h，每隔6h换水一次，透析完成后，经离心、冻干得到白色固体；其中离心的条件为：12000r/min条件下离心6min；冻干条件为：-20℃预冻24h，-80℃冷冻干燥72h；
S2、将步骤S1得到的白色固体溶解于25重量份水中，混合均匀后依次加入促透剂和增稠剂，搅拌均匀后得到第一溶液；
S3、在剩余25重量份水中加入薰衣草提取物和防腐剂，搅拌均匀后得到第二溶液；
S4、在搅拌状态下，向第二溶液中加入第一溶液，添加完成后，持续搅拌至混合均匀，得到重组人源胶原蛋白原液。
将重组人源胶原蛋白原液和载体被无菌封装于铝箔袋中，随后封口，并低温辐射灭菌，其中低温辐照灭菌的温度是-20℃、电子束灭菌辐照的剂量为15kGy，进行电子束灭菌辐照5s，即得重组人源胶原蛋白敷贴。
对比例1
本对比例与实施例1相比，在重组人源胶原蛋白原液的制备过程中，直接将重组人源胶原蛋白与制备的促透剂进行混合，其余过程参照实施例1。
其中，重组人源胶原蛋白原液的制备步骤为：
S1、将6重量份重组人源胶原蛋白和10重量份促透剂溶解于20重量份水中，混合均匀后依次加入促透剂和增稠剂，搅拌均匀后得到第一溶液；
S2、在剩余25重量份水中加入薰衣草提取物和防腐剂，搅拌均匀后得到第二溶液；
S3、在搅拌状态下，向第二溶液中加入第一溶液，添加完成后，持续搅拌至混合均匀，得到重组人源胶原蛋白原液。
其余部分参照实施例1。
对比例2
本对比例与实施例1相比，在重组人源胶原蛋白原液制备过程中，采用市售的促透剂进行制备，其中重组人源胶原蛋白原液的制备过程参照对比例1，其余过程参照实施例1。
对比例3
本对比例与实施例1相比，在重组人源胶原蛋白原液制备过程中，将重组人源胶原蛋白更换为市售的胶原蛋白，其余制备过程参照实施例1。
相关测试
一、选取30名志愿者，年龄在25-30之间，混合性肤质，痘史10年，T区毛孔大、皮肤粗糙，发红严重，有少量痘痘。使用方法：清洁面部后使用提供的敷贴，每天1次，连续使用7天。固定每天早上11点进行测试，收集使用后面部水分含量及血红素含量数据，其中水分含量数据如表1所示，血红素含量数据如表2所示。
由表1数据可以看出，各组分水份含量持续稳定升高，但实施例1-3水份含量高于同时期对比例水份含水量，差异较为明显，其中实施例1含水量最高；由表2数据可以看出，各组分血红素含量均有所下降，而实施例1-3下降幅度要高于对比例1-3，尤其实施例1最为明显，这可能是因为，本发明制备的促透剂和重组人源胶原蛋白经一定工艺混合后，二者间能够形成相互促进的作用，从而使得作用更加显著，功效更加明显。
二、不同案例使用后修复情况
1.术后3个月后红斑修复
症状：有持续潮红现象，皮肤干燥，有小粒具有炎症的红痘。
使用方法：清洁面部后，使用实施例1制备的敷贴，每天1次，连用15天。
诊评：第15次使用后红斑完全消退，完全脱痂，无反黑，皮肤细腻光滑，患者无灼热、瘙痒、疼痛感，产品安全有效，加快了术后修复；结果如图1所示，其中每组中左侧为使用前、右侧为使用后的效果图。
2.术后直接使用
症状：使用点痣淡化皮肤痘坑。
使用方法：清洁面部后，使用实施例1制备的敷贴，每天1次，连用5天。
诊评：第五次使用后患者脱痂完全，无反黑，皮肤细腻光滑，患者无灼热、瘙痒、疼痛感，产品效果明显，加快了术后修复；结果如图2所示，其中每组中左侧为使用前、右侧为使用后的效果图。
3.痘痘术后直接使用
症状：皮肤有中度痤疮，脸颊和嘴角都有炎症痘痘，皮肤旁边还有少量的粉刺，脸颊右下巴有严重的脓包。
使用方法：清洁面部后，使用实施例1制备的敷贴，每天1次，连用15天。
诊评：连用使用15天后无红肿热痛，部分脱痂，丘疹、脓包减少，无反黑，皮肤细腻光滑，产品安全有效，加快了术后修复；结果如图3所示，其中每组中左侧为使用前、右侧为使用后的效果图。
4.微针术后直接使用
症状：皮肤干燥缺水并伴有术后潮红、红印。
使用方法：洁面后，使用实施例1制备的敷贴，每天1次，连用7天。
诊评：使用后无红肿热痛，皮肤光滑细腻，无反黑，产品安全有效，明显加快了术后修复。结果如图4所示，其中每组中左侧为使用前、右侧为使用后的效果图。
5.日常直接使用
症状：皮肤衰老松弛，胶原流失严重，眼角纹，脸颊纹爬满全脸。
使用方法：洁面后，使用实施例1制备的敷贴，每天1次，连用28天。
诊评：使用后皮肤皱纹的数量和深度均得到明显改善，皱纹的数量平均减少了25%，深度平均变浅了8%。皮肤弹性增加，轮廓紧致。结果如图5所示，其中每组中左侧为使用前、右侧为使用后的效果图。
在本发明提供的敷贴的制备过程中，与现有技术相比加入了重组人源胶原蛋白和制备的促透剂，重组人源胶原蛋白与源于动物体的天然胶原蛋白相比，能够有效的避免从动物组织中提取的胶原蛋白固有的交叉结构弱点及病毒隐患的缺陷，因而更加安全有效。重组人源胶原蛋白作为核心成分的加入，能够迅速作用并在肌表形成保护膜，深度修护，构筑肌肤稳固屏障，帮助平衡肌肤的酸碱值，维护肌肤的天然平衡，水润强韧，修护屏障,有效促进成纤维细胞增殖，为创面愈合提供有利环境，显著修护受损肌肤。另外在本发明中还加了促透剂，该促透剂由以内酰胺和氯甲基环氧乙烷在四氢呋喃为溶剂的作用下加热回流反应得到。在该结构中，含有带环氧基的烃链和极性很强的七元环内酰胺基，使得得到的促透剂具有亲水和亲脂两性，对于亲水性和亲脂性化合物均具有良好的促透效果。
在进行重组人源胶原蛋白原液的制备过程中在碱性溶液条件下重组人源胶原蛋白和促透剂混合，一定温度下环氧基发生开环与重组人源胶原蛋白上含有的-NH2发生反应，使得1-（环氧乙烷-2-基甲基）氮杂环-2-酮接枝在重组人源胶原蛋白上。在该结构中重组人源胶原蛋白与含有-NH-和-OH的烃链相连，且在另一端保留了强极性的七元环内酰胺基。在使用过程中，能够渗入皮肤角质层经毛囊途径渗入毛囊内根鞘，与细胞间脂质或生物膜类脂质作用，增加膜酯的流动性，导致细胞结构疏松，促进吸收；同时其上含有的大量亲水基团能够为肌肤锁住大量水份，增加细胞含水量；能够有效的填补局部塌陷，改善松弛，收紧皮肤，减少皱纹。同时在制备重组人源胶原蛋白原液时还加入了薰衣草提取物，能够提供较为舒适的香味，还能够促进细胞再生，平衡皮脂分泌，对组织的生长和修复有良好的功效。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本申请的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本申请的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本申请的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种重组人源胶原蛋白在敷贴中的应用，其特征在于，所述敷贴包括重组人源胶原蛋白原液和载体；所述重组人源胶原蛋白原液由以下重量份组分组成：重组人源胶原蛋白10份，促透剂6份，增稠剂5份，薰衣草提取物4份，防腐剂3份，水45份；所述载体为非织无纺布；
所述重组人源胶原蛋白的制备方法为：
S1、将在新鲜MD培养基中培养的工程菌按10%-12%的接种量接种到BMG培养基中，25-28℃，200-400r/min振荡培养过夜，然后接入BMG培养基中继续培养至OD600达6.0-8.0；所述工程菌保藏编号为CGMCC No.16462；
S2、室温下10000-12000r/min离心10-15min，收集BMG培养基中菌体，以BMM液体培养基重新悬浮菌体，使菌浓OD600为3.0，在25-28℃，自然pH值下，200-400r/min培养24-28h，每6-8h补加甲醇至3%；
S3、对发酵液进行离心分离，收集上清液，上清液经滤膜过滤后，用Sephadex G100凝胶柱层析分离纯化，再经冷冻干燥得到成品重组人源胶原蛋白；
所述促透剂的制备方法为：以四氢呋喃为溶剂，加入己内酰胺和氯甲基环氧乙烷，搅拌均匀后加热回流反应2-4h，生成1-（环氧乙烷-2-基甲基）氮杂环-2-酮，即为所述促透剂；
所述重组人源胶原蛋白原液的制备步骤为：
A1、以乙醇为溶剂，加入重组人源胶原蛋白和N，N-二异丙基乙胺，混合均匀后向其中添加所述促透剂，升高温度至45-55℃，反应4-6h，将得到的反应液置于透析袋中用去离子水透析30-36h，透析完成后，经离心、冻干得到白色固体；
A2、将步骤A1得到的白色固体溶解于部分水中，混合均匀后依次加入促透剂和增稠剂，搅拌均匀后得到第一溶液；
A3、在剩余水中加入薰衣草提取物和防腐剂，搅拌均匀后得到第二溶液；
A4、在搅拌状态下，向第二溶液中加入第一溶液，添加完成后，持续搅拌至混合均匀，得到所述重组人源胶原蛋白原液。
2.根据权利要求1所述的一种重组人源胶原蛋白在敷贴中的应用，其特征在于，所述MD培养基：1.34% YNB，4×10-5% Biotin，2%葡萄糖；固体培养基再加入终浓度为1.5%的琼脂。
3.根据权利要求1所述的一种重组人源胶原蛋白在敷贴中的应用，其特征在于，所述BMG培养基：100mM磷酸缓冲液，pH为6.0，1.34% YNB，4×10-5% Biotin，1%甘油。
4.根据权利要求1所述的一种重组人源胶原蛋白在敷贴中的应用，其特征在于，所述BMM液体培养基：100mM磷酸缓冲液，pH为6.0，1.34% YNB，4×10-5% Biotin，0.5%甲醇。
5.根据权利要求1所述的一种重组人源胶原蛋白在敷贴中的应用，其特征在于，所述重组人源胶原蛋白原液和所述载体被无菌封装于铝箔袋中，随后封口，并低温辐射灭菌。
6.根据权利要求1所述的一种重组人源胶原蛋白在敷贴中的应用，其特征在于，透析过程中，每隔6h换水一次；离心的条件为：10000-12000r/min条件下离心4-6min；冻干条件为：-20℃预冻20-24h，-80℃冷冻干燥68-72h。
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