CN115029353A - 一种高效分泌表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的毕赤酵母及其发酵工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效分泌表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的毕赤酵母及其发酵工艺，属于微生物发酵技术领域。本发明首先将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列转化毕赤酵母GS115，为进一步提高表达量再将Hac1基因SEQ ID NO.3导入3拷贝胶原蛋白基因的重组毕赤酵母，并通过PTVA筛选出了COL‑C基因拷贝数为3、Hac1基因拷贝数为3的重组毕赤酵母菌株GS‑COL3‑H3。这一优化的基因拷贝数组合明显提高了胶原蛋白的分泌表达效率，本发明优化得到的高密度发酵工艺可减少重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的降解，菌株GS‑COL3‑H3在5L发酵罐中应用该工艺，胶原蛋白降解率减少至10％以下。

Description

一种高效分泌表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的毕赤酵母及 其发酵工艺

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种高效分泌表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的毕赤酵母及其发酵工艺。

背景技术

人源胶原蛋白由于具备抗原性弱，利于细胞黏附，可诱导细胞增殖、分化，可为细胞长入胶原沉积和新血管形成提供支架，其降解产物也可为创面修复提供必须的氨基酸等优势，因而成为制备创面敷料、化妆品、组织工程、医疗器械等应用领域的重要材料。人体皮肤内胶原蛋白为I型胶原和III型胶原。成人皮肤组织中I型胶原蛋白比例较高，胎儿皮肤组织中Ⅲ型胶原蛋白比例明显较成人高。婴幼儿皮肤受损恢复后无瘢痕，其中Ⅲ型胶原蛋白起了主要作用，因而提高Ⅲ型胶原蛋白比例有望增加皮肤弹性，减轻瘢痕增生，所以Ⅲ型胶原蛋白在化妆品中更有应用价值。

人源Ⅲ型胶原蛋白由三条相同的α1链缠绕组成。随着生物工程技术的不断进步，利用基因工程生产人源胶原蛋白的技术近几年逐渐成熟，其中又分为第二代利用大肠杆菌表达重组人胶原蛋白的技术和利用毕赤酵母表达重组人胶原蛋白的第三代技术。从重组表达产量来看，人源Ⅲ型胶原蛋白α1单链很适合毕赤酵母分泌表达，产量较高，但存在发酵过程中降解较严重的问题。

国内外研究机构及企业对人或动物胶原蛋白单链的重组表达或者人工改造的研究及生产已有较多报道(Yang S et al.2021.Fermentation process with Pichia yeastexpressing recombinant protein.US专利号011136373B2)；Dai L.et al.2019.Yeaststrains and methods for producing collagen.US专利号20190002893A1；van HeerdeGV et al.2012.Method for recombinant microorganism expression and isolationof collagen-like polypeptides.US专利号008188230B2；He J et al.2015.Newstrategy for expression of recombinant hydroxylated human collagen α1(III)chains in Pichia pastoris GS115.Biotechnol Appl Biochem.62(3):293-9.doi:10.1002/bab.1264)。芬兰奥卢大学胶原蛋白研究中心对胶原蛋白的分泌表达和胞内表达进行了比较研究；美国的David R.Olsen等的研究表明I型胶原的基因中不含两端前肽基因时，表达量分别为原胶原的18倍、缺乏N前肽基因的4.6倍和缺乏C前肽基因的3倍，这些研究报道为利用毕赤酵母生产重组胶原蛋白提供了技术基础。胶原蛋白单链的生产技术目前是以毕赤酵母表达体系为最佳。完全按照天然氨基酸序列的毕赤酵母表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1单链的研究，其产量在4.5g/L以上，但由于分子量在90KD以上，对毕赤酵母表达造成一定影响，且由于存在多个蛋白酶降解位点，因而发酵过程中需要解决蛋白降解问题，代表性研究机构为西北大学范代娣课题组、江苏悦智生物医药有限公司(中国专利201911093124.8)。为此，不少研究机构的重组胶原蛋白产品是改变了氨基酸组成的类人胶原蛋白或明胶类似物，蛋白降解程度减小了，但由于氨基酸序列的改变，其应用存在局限性，该类产品的代表性研究机构为南京理工大学和江苏江山聚源生物技术有限公司(中国专利201110327865.5、201810049618.5)。另外，基因辅表达策略，比如导入Hac1、PDI等辅表达基因(HanM.etal.2021.Increased Expression of Recombinant Chitosanase by Co-expression of Hac1p in the Yeast Pichia pastoris.Protein Pept Lett.28(12):1434-1441.doi:10.2174/0929866528666211105111155；Bao C.et al.2020.Expressionand function of an Hac1-regulated multi-copy xylanase gene in Saccharomycescerevisiae.Sci Rep 10(1):11686.doi:10.1038/s41598-020-68570-6.)在毕赤酵母表达重组蛋白中已有一些实例的应用，但在有关胶原蛋白的重组表达中，尚未见应用报道。

在毕赤酵母高密度发酵工艺的研究中，对于减少胶原蛋白的降解已有一些文献报道。和Invitrogen公司“Pichia Fermentation Process Guidelines”推荐的工艺类似，中国专利202111190388.2提到在诱导期间一次性添加酪蛋白氨基酸15g/L可竞争性地减少重组胶原蛋白的降解；中国专利201810049618.5中提到，在甲醇诱导84h后，向发酵罐中一次性添加0.2～0.5M L-赖氨酸或L-精氨酸能有效防止目的产物被蛋白酶降解，且该工艺较添加酪蛋白氨基酸成本低。但中国专利201810049618.5是针对非天然序列的重组胶原蛋白，对于诱导初期就有降解现象发生的基于天然序列的重组胶原蛋白并不适用。因此，添加酪蛋白氨基酸的工艺有效，但工艺仍需提升、成本上仍需要降低。

上述背景表明，基于天然序列的人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的重组表达在菌株构建及减少蛋白降解的发酵工艺上均迫切需要开发新的技术。

发明内容

本发明目的是提供一种高效分泌表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的毕赤酵母及其发酵工艺，所述重组毕赤酵母能够高效分泌表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链，相配套的高密度发酵工艺可以使得胶原蛋白降解率控制在10％以下，可降低纯化成本，满足化妆品原料等产品的应用要求。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组毕赤酵母菌种，所述重组毕赤酵母菌种是将SEQ ID NO.1所示基因COL-C、SEQ ID NO.3所示基因Hac1分别导入宿主菌，并以PTVA技术筛选优化的拷贝数组合获得的。

本发明所述宿主菌优选为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115(购自Invitrogen)。

进一步地，胶原蛋白基因COL-C优选自人源Ⅲ型胶原蛋白αⅠ链(NCBI序列号：NM_000090.4，来源于Homo sapiens)C端的部分连续基因，其序列位于去端肽人源Ⅲ型胶原蛋白α1链基因序列的1824-3204位核苷酸。优选的序列经毕赤酵母偏好密码子优化后由南京金斯瑞公司合成，对应基因序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明对选取自NM_000090.4的不同长度、不同位置的连续基因片段，分别进行了克隆表达，所述SEQ ID NO.1为分泌表达量最高的优选基因片段。

本发明所述基因Hac1编码的Hac1p蛋白是酵母内质网中未折叠蛋白响应机制(UPR)的激活因子。以酿酒酵母by4741(购自Invitrogen)为模板，扩增Hac1基因片段，得到如SEQ ID NO.3所示的UPR激活因子基因Hac1，利用一步克隆试剂盒将该基因与组成型表达载体pGAPZ B(购自Invitrogen)进行无缝连接，构建表达载体pGAPZ-Hac1。

本发明所述重组毕赤酵母菌种按如下方法构建：

将表达载体pPIC9K-COL-C电转入宿主菌GS115中，筛选得到单拷贝COL-C基因的工程菌，利用转化后载体扩增方法(试管液体PTVA法)获得具有1-6个COL-C基因拷贝数的工程菌，发酵比较后确定分泌表达最优的COL-C基因3拷贝菌株GS-COL3。将表达载体pGAPZ-Hac1电转入上述工程菌GS-COL3中，筛选得到COL-C基因3拷贝、Hac1基因单拷贝的工程菌，进一步利用转化后载体扩增方法(试管液体PTVA法)获得具有1-6个Hac1基因拷贝数的工程菌，发酵比较后确定分泌表达最优的COL-C基因3拷贝、Hac1基因3拷贝的工程菌株GS-COL3-H3。

本发明所述重组毕赤酵母菌种的构建具体为：

(1)选用毕赤酵母GS115作为出发菌株；

(2)构建表达载体

将选取的人源Ⅲ型胶原蛋白α1链基因序列按照毕赤酵母偏好密码子优化后人工合成，得到基因COL-C(SEQ ID NO.1)，将基因COL-C连接在毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建得到表达载体pPIC9K-COL-C；

以酿酒酵母by4741(购自Invitrogen)为模板扩增Hac1基因片段，得到如SEQ IDNO.3所示的UPR激活因子基因Hac1，该基因与pGAPZ B载体利用一步克隆试剂盒进行无缝连接，构建表达载体pGAPZ-Hac1；

(3)将表达载体pPIC9K-COL-C电转化至毕赤酵母菌株GS115中，同源重组整合至其基因组，构建出重组毕赤酵母菌株GS-COL；

(4)对重组毕赤酵母菌株GS-COL进行转化后载体扩增(基于G418浓度递增的试管液体PTVA法)，以荧光定量PCR方法检测筛得菌株的基因拷贝数，得到COL-C基因拷贝数为1～6的不同毕赤酵母菌株；经过摇瓶发酵筛选，获得一株胶原蛋白表达量最高、COL-C基因拷贝数为3的重组毕赤酵母菌株GS-COL3；

(5)将表达载体pGAPZ-Hac1电转入重组毕赤酵母菌株GS-COL3中，筛选得到整合有Hac1基因的重组毕赤酵母GS-COL3-H；

(6)对重组菌株GS-COL3-H进行转化后载体扩增(基于zeocin浓度递增的试管液体PTVA法试管液体)，以荧光定量PCR方法检测筛得菌株的Hac1基因拷贝数，得到Hac1基因拷贝数为1～6的不同毕赤酵母菌株；经过摇瓶发酵筛选，获得一株胶原蛋白表达量最高、COL-C基因拷贝数为3、Hac1基因拷贝数为3的重组毕赤酵母菌株GS-COL3-H3。

本发明还提供了一种可减少重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链降解的高密度发酵工艺，该工艺的关键步骤为：甘油补料阶段添加终浓度0.1M的硫酸铵，甲醇诱导阶段pH控制在3.0，同时在诱导阶段添加酪蛋白水解物，通过指数流加方式流加甲醇以控制比生长速率在0.03h^-1。

具体地，本发明所述重组毕赤酵母工程菌GS-COL3-H3的高密度发酵按如下优化后的工艺组合进行：将重组毕赤酵母接种至含BSM培养基的发酵罐中，用氨水控制pH在5.0，温度为30℃，初始转速设置为400r/min并逐步提升，调节通气量，控制溶氧在20％以上；当培养基中甘油消耗完后，溶氧快速上升，随即开始以10-50ml/h/L发酵液的速度流加含PTM112mL/L的体积浓度50％的甘油水溶液，同时关停与pH关联的氨水自动补料泵，让发酵液pH自然下降到3.0再打开氨水泵，并一次性添加终浓度为0.1M的硫酸铵。甘油补料培养至菌体湿重为150-180g/L；甘油流加结束后，一次性补加甲醇至终浓度3g/L，同时在诱导开始及诱导32h时分别添加终浓度为5g/L的酪蛋白水解液。甲醇补料以3.6ml/h/L流速起始并按指数流加模式递增，使工程菌比生长速率维持在0.03h^-1。发酵培养至菌体湿重达到400g/L时结束。

所述BSM培养基：H₃PO₄ 31.4mL/L，KOH 4.13g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，CaSO₄ 0.93g/L，MgSO₄7 H₂O 14.9g/L，甘油40.0g/L，接种前用氨水调pH到5.0-5.5，并加4.35mL/L的PTM1；

PTM1配方：H₃BO₃ 0.02g/L，CuSO₄·5H₂O 6.0g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g/L，CoCl₂ 0.5g/L，NaI 0.08g/L，ZnCl₂ 20.0g/L，FeSO₄·7H₂O 65.0g/L，生物素0.2g/L，5.0mL/L的H₂SO₄，ddH₂O定容至1L。

本发明所述的高密度发酵工艺，其特征在于所述重组毕赤酵母在发酵前，先进行两级种子扩大培养，二级种子OD为5-6时，以体积浓度10％接种量接种至BSM培养基。所述两级扩大培养是将重组毕赤酵母接种至BMGY液体培养基，30℃培养10-24h。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明SEQ ID NO.1所示胶原蛋白基因COL-C是通过选取不同长度、不同位置基因序列分别克隆表达后优选得到的源自人源Ⅲ型胶原蛋白αⅠ链(NCBI序列号：NM_000090.4，来源于Homo sapiens)C端的部分连续基因，其序列位于去端肽人源Ⅲ型胶原蛋白α1链基因序列的1824-3204位核苷酸，优选的该序列没有改变天然人源氨基酸序列，同时对应的肽链长度只有约全长人源胶原蛋白肽链的一半，因而更适合毕赤酵母表达。进一步地，本发明将Hac1基因导入了表达COL-C的重组毕赤酵母中，并且在不同拷贝数的组合中筛选出了COL-C基因拷贝数为3、Hac1基因拷贝数为3的重组毕赤酵母菌株GS-COL3-H3，这一优化的基因拷贝数组合大大提高了胶原蛋白的分泌表达效率。

本发明优化得到的高密度发酵工艺提供了一种配套的可减少重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链降解的策略。和使用Invitrogen公司“Pichia Fermentation ProcessGuidelines”里推荐的常规工艺相比较，菌株GS-COL3-H3在5L发酵罐中应用该工艺后重组胶原蛋白的降解率由50％减少至10％以下。另外，由于在高密度发酵阶段组合应用了降pH、控制比生长速率、添加硫酸氨等工艺，酪蛋白氨基酸添加量减少，生产成本更低。

附图说明

图1为实施例1中重组质粒pPIC9K-COL-C图谱。

图2为实施例1中重组质粒pGAPZ-Hac1图谱。

图3为实施例3中高密度发酵上清的SDS-PAGE胶图。

图4为实施例3中高密度发酵的菌体湿重及比生长速率变化图。

图5-1为实施例3中重组胶原蛋白浓度0mg/mL时的细胞迁移率结果图。

图5-2为实施例3中重组胶原蛋白浓度0.01mg/mL时的细胞迁移率结果图。

图5-3为实施例3中重组胶原蛋白浓度0.1mg/mL时的细胞迁移率结果图。

图5-4为实施例3中重组胶原蛋白浓度0.5mg/mL时的细胞迁移率结果图。

图5-5为实施例3中重组胶原蛋白浓度1mg/mL时的细胞迁移率结果图。

图5-6为为实施例3中重组胶原蛋白浓度2mg/mL时的细胞迁移率结果图。

图6为实施例3中的重组胶原蛋白对细胞迁移率的影响结果图。

图7-1为实施例3中重组胶原蛋白浓度0mg/mL时细胞离心前后对比结果图。

图7-2为实施例3中重组胶原蛋白浓度0.5mg/mL时细胞离心前后对比结果图。

图7-3为实施例3中重组胶原蛋白浓度1mg/mL时细胞离心前后对比结果图。

图8为实施例3中不同浓度重组胶原蛋白对细胞的相对粘附性结果图。

图9为对比例1中高密度发酵上清的SDS-PAGE胶图。

具体实施方式

以下实施例所选用的毕赤酵母Pichia pastoris GS115菌株、表达载体pPIC9K、pGAPZ B均购自美国Invitrogen公司。

以下实施例所用培养基配方如下：

(1)YPD完全培养基：

酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基含2％琼脂)。

(2)MD培养基(选择培养基)：

配100mL，向80mL水中加入琼脂糖2g(20g/L)，121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4g/L)，10×葡萄糖10mL(20g/L)，500×生物素0.2mL(4×10^-4g/L)。

(3)BMG培养基(摇瓶生长培养基)：

完全溶解3g K₂HPO₄，11.8g KH₂PO₄，3.4g YNB(无氨基酵母氮源)，10g硫酸铵，10mL甘油，定容到1L，115℃蒸汽高压灭菌30min，待冷却后在超净台加入2mL的0.02％生物素。

(4)BMM培养基(摇瓶诱导培养基)：

完全溶解3g K₂HPO₄，11.8g KH₂PO₄，3.4g YNB(无氨基酵母氮源)，10g硫酸铵，定容到1L。115℃蒸汽高压灭菌30min，待冷却后在超净台加入2mL的0.02％生物素，1％甲醇。

(5)发酵罐BSM培养基：

H₃PO₄ 31.4mL/L，KOH 4.13g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，CaSO₄ 0.93g/L，MgSO₄·7H₂O14.9g/L，甘油40.0g/L，接种前用氨水调pH到5.0-5.5，并加4.35mL/L的PTM1；

PTM1配方：H₃BO₃ 0.02g/L，CuSO₄·5H₂O 6.0g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g/L，CoCl₂ 0.5g/L，NaI 0.08g/L，ZnCl₂ 20.0g/L，FeSO₄·7H₂O 65.0g/L，生物素0.2g/L，5.0mL/L的H₂SO₄，ddH₂O定容至1L。

实施例1

表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的重组毕赤酵母GS-COL3的构建方法步骤如下：

(1)优选的基因序列位于去端肽的人源Ⅲ型胶原蛋白α1链基因序列的1824-3204位核苷酸，该序列经毕赤酵母偏好密码子优化后由南京金斯瑞公司合成，对应基因序列为SEQ ID NO.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所用方法为经EcoRV酶切法连接到pUC57-Mini质粒的多克隆位点上，并转化TOP10菌株保存。

(2)将含有COL-C(对应SEQ ID NO.1序列)克隆载体的TOP10菌种保存至-80℃冰箱，提取菌种质粒得到实验所需克隆载体量。

(3)通过无缝克隆技术构建pPIC9K-COL-C表达载体：

使用南京诺维赞公司的“

II One Step Cloning Kit”试剂盒进行无缝克隆。

①以携带COL-C基因的pUC57-Mini质粒为模板，使用同源臂引物COLZT-F，COLZT-R扩增出带同源臂的COL-C基因片段，

COLZT-F SEQ ID NO.4：TAATACGTAGAATTCCCTAGGGCG；

COLZT-R SEQ ID NO.5：TCCGTAGTAAGGGGCGAATCC；

以pPIC9K质粒为模板，利用反向PCR方法扩增出线性化的pPIC9K载体，

PCR体系如下：

F 1μL

R 1μL

DNA 1μL

高保真酶 25μL

水 加至50μL

②将PCR产物使用DPNⅠ酶进行消化，去除原有模板干扰，体系如下：

PCR原液 50μL

DPNⅠ 1μL

10×BUFFER 5μL

③将消化后的PCR产物使用纯化试剂盒进行纯化(试剂盒购自上海生工有限公司)，具体操作按试剂盒说明书进行。

④使用一步克隆试剂盒进行重组连接(一步克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，重组连接具体操作按试剂盒说明书操作进行，反应体系如下：

重组酶 1μL

Buffe r2μL

pPIC9K片段 2μL

带同源臂的COL-C基因片段 3μL

无菌水 2μL

⑤将重组产物转化至大肠杆菌DH5α(DH5α商用感受态购自北京擎科生物科技有限公司)，具体操作如下：

a.取100μL冰上融化的感受态细胞，加入目的DNA(连接产物)，轻轻混匀，冰上静置5min；

b.42℃水浴热激45s，迅速放回冰上静置2min；

c.向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏至少20min；

d.吸取100μL感受态细胞加到含有终浓度为0.1％的氨苄青霉素及0.1％卡那霉素的LB固体培养基上，均匀涂开后吹干平板；

e.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

f.挑选转化平板上的单菌落进行阳性转化子的验证；

g.将阳性转化子提取质粒进行测序并将正确菌种保藏于-80℃冰箱。

构建的pPIC9K-COL-C质粒图谱如图1所示。

(4)pPIC9K-COL-C质粒转化毕赤酵母GS115

①表达载体pPIC9K-COL-C的线性化

用限制性核酸内切酶SacⅠ处理质粒pPIC9K-COL-C，于37℃进行酶切过夜。SacⅠ切割在质粒的AOX1启动子区域，使整个质粒根据同源重组原理整合到毕赤酵母染色体的AOX1启动子区域。反应体系如下：

质粒pPIC9K-COL-C 1μg

10×L缓冲液 2μL

SacⅠ 1μL

灭菌水 加至20μL

然后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测是否完全切开，待完全切开之后，用PCR产物纯化试剂盒对酶切液进行纯化处理，回收线性化质粒。

②制备毕赤酵母GS115感受态细胞

a.在YPD平板上挑取毕赤酵母GS115单菌落，接种于含有3mL的YPD液体培养基的试管中，30℃，220rpm振荡培养过夜；

b.取500μL的过夜培养物接种于含有50mL新鲜YPD液体培养基的500mL三角瓶中，30℃，220rpm振荡培养过夜，至OD₆₀₀达到1.3-1.5；

c.将上述培养物导入无菌离心管中，4℃，5000rpm离心5min，去除上清，置于冰上；

d.将上述菌体用20mL的LiAc-DTT溶液(100mM LiAc，10mM DTT，0.6M 山梨醇，10mMTris-HCl，pH 7.5)进行重悬，30℃摇床培养30min，4℃，5000rpm离心5min，去除上清。

e.将上述步骤4重复三次或者加入1mL冰上预冷的1M山梨醇重悬菌体，之后转入1.5mL的EP管中，3000rpm离心5min，去除上清，重复此步骤三次。

f.将收集到的菌体用冰上预冷的1M山梨醇重悬，其终体积约为0.5mL；

g.分装成80μL一管，于-80℃保存备用。

③毕赤酵母GS115的电转化

a.将感受态细胞从-80℃冰箱取出置于冰上；

b.将1μg线性化的质粒与感受态80μL混匀，转移到0.2cm的预冷电转杯中，轻轻敲打使之位于电转杯的底部，置于冰上5-10min；

c.按照Bio-Rad电转仪的操作说明，将模式设定在Pic模式，将电转杯外壁擦干水分并放入电击位置，电击电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间5msec；

d.电击结束立即将1mL预冷的1M山梨醇加入电转杯中，轻轻吹打混匀，并迅速转移至1.5mL EP管中，30℃，220rpm静置培养1-2h；

e.取100-200μL菌体涂布于含0.1％氨苄青霉素和0.1％卡那霉素的MD平板上，置于30℃恒温培养箱倒置培养2-4天，直至有单菌落出现；

④重组转化子的鉴定

a.酵母转化子的破壁

1)挑选转化平板上的单菌落于含有0.1M NaOH溶液的PCR管中，吹打混匀至可见的浑浊；

2)将PCR管置于微波炉加热5min，之后迅速将其放至液氮中冷冻5min，如此重复两次，最后于微波炉加热5min；

3)离心将沉淀置于PCR管底部；

b.菌落PCR的鉴定

验证引物序列如下：

α-F SEQ ID NO.6：TACTATTGCCAGCATTGCTGCT；

3AOX SEQ ID NO.7：GCAAATGGCATTCTGACATCC；

c.将转化MD平板上对应阳性转化子GS-COL-C的单菌落接种至含50mL YPD培养基的250mL三角瓶中，于30℃，220rpm过夜培养。

⑤利用甘油法保存菌种于-80℃冰箱中。

(5)重组酵母GS-COL-C的诱导表达

①将-80℃保存的菌株GS-COL-C按1％接种量接种至BMG培养基中，30℃，200rpm培养12-16h至OD₆₀₀为2-6。

②室温下4500rpm离心5min，收集菌体，用BMM培养基重悬菌体，至OD₆₀₀为1左右，转移至BMM培养基中，用纱布封口，30℃，200rpm摇床培养3天。

③每24h向BMM培养基中加入100％甲醇至终浓度为1％。

④每24h取1mL菌液样品，室温12000rpm离心2min，收集上清，用于SDS-PAGE电泳检测，取样时间为48h，72h。

⑤待检测样品置于-80℃冰箱中保存备用。

(6)PTVA筛选多拷贝重组菌株(以G418抗生素浓度梯度递增筛选)

①配置100mg/mL G418母液。取5mL YPD培养基置于无菌50mL离心管中，加入17.5μL 100mg/mL G418，接种重组毕赤酵母GS-COL-C菌株至OD600＝0.1，用无菌纱布封口，30℃，200rpm避光培养24h；

②无菌条件下，4500rpm离心，弃上清，加入5mL新鲜YPD重悬菌体，再加入25μL100mg/mL的G418，30℃，200rpm摇床避光培养24h；

③每24h将G418添加量提高一次，具体添加量为：17.5μL、25μL、50μL、75μL、100μL、125μL、150μL，直至PTVA过程结束；

④PTVA过程结束的菌液测定OD值，先将菌液在无菌条件下用无菌ddH₂O稀释至OD₆₀₀＝1，然后再将菌液稀释10⁶倍，取100μL涂含G418抗性(浓度与PTVA过程末次浓度相同，即3mg/mL)的YPD平板，30℃培养箱培养3-5天；

⑤挑取较大的单菌落进行拷贝数测定及摇瓶发酵筛选。

通过以上实施过程，最终筛选到分泌表达量高的具有COL-C基因3拷贝的重组毕赤酵母GS-COL3。

实施例2

表达人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的重组毕赤酵母GS-COL3-H3的构建方法如下：

(1)pGAPZ-Hac1表达载体的构建

以酿酒酵母by4741(购自Invitrogen)为模板，扩增Hac1基因片段，得到如SEQ IDNO.3所示的UPR激活因子基因Hac1，该基因与pGAPZ B载体使用南京诺维赞公司的“

II One Step Cloning Kit”试剂盒进行无缝克隆，构建表达载体pGAPZ-Hac1，具体无缝连接实验方法参照实施例1；构建的pGAPZ-Hac1质粒图谱如图2所示。

(2)pGAPZ-Hac1表达载体转化至重组毕赤酵母GS-COL3

将表达载体pGAPZ-Hac1用Avr II酶线性化后电转入重组毕赤酵母菌株GS-COL3中，筛选得到基因组整合有Hac1基因的重组毕赤酵母GS-COL3-H。由于质粒线性化切割在GAP启动子区域，根据同源重组原理，线性化的pGAPZ-Hac1整合在毕赤酵母染色体的GAP启动子区域。

(3)PTVA筛选Hac1多拷贝重组菌株(以zeocin抗生素浓度梯度递增筛选)

对重组菌株GS-COL3-H进行转化后载体扩增(基于zeocin浓度递增的试管液体PTVA法试管液体)，以荧光定量PCR方法检测筛得菌株的Hac1基因拷贝数，得到Hac1基因拷贝数为1～6的不同毕赤酵母菌株；经过对不同拷贝数组合菌株GS-COL3-H1、GS-COL3-H2、GS-COL3-H3、GS-COL3-H4、GS-COL3-H5、GS-COL3-H6进行摇瓶发酵筛选，获得其中一株胶原蛋白表达量最高、COL-C基因拷贝数为3、Hac1基因拷贝数为3的重组毕赤酵母菌株GS-COL3-H3。具体PTVA实验步骤如下：

①取1mL YPD置于无菌试管中，加入1μL 100mg/mL的zeocin，接种重组毕赤酵母GS-COL3-H至OD600＝0.1，30℃，200rpm摇床避光培养24h；

②菌液转移至无菌的1.5mLEP管中，4500rpm离心，弃上清，加入1mL新鲜YPD重悬菌体，再加入5μL 100mg/mL的zeocin，30℃，200rpm摇床避光培养24h；

③每24h将zeocin添加量提高一次，具体添加量为：1μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL，直至PTVA过程结束；

④PTVA过程结束的菌液测定OD值，先将菌液在无菌条件下用无菌ddH₂O稀释至OD600＝1，然后再将菌液稀释10⁶倍，取100μL涂含zeocin抗性(浓度与PTVA过程末次浓度相同)的YPD平板，30℃培养箱避光培养3-4天；

⑤挑取较大的单菌落进行拷贝数测定及摇瓶发酵试验

通过以上实施过程，最终筛选到分泌表达量最高的具有COL-C基因3拷贝、Hac1基因3拷贝的重组毕赤酵母GS-COL3-H3。

实施例3

重组毕赤酵母GS-COL3-H3的5L罐高密度发酵步骤如下：

(1)5L罐高密度发酵

重组毕赤酵母GS-COL3-H3先进行两级种子扩大培养，二级种子OD为5-6时，以体积浓度10％接种量接种至BSM培养基。所述两级扩大培养是将重组毕赤酵母接种至BMG液体培养基，30℃培养10-24h。

将重组毕赤酵母GS-COL3-H3接种至发酵罐中后，用氨水控制pH在5.0，温度为30℃，初始转速设置为400r/min并逐步提升，调节通气量，控制溶氧在20％以上；当培养基中甘油消耗完后，溶氧快速上升，随即开始以10-50ml/h/L发酵液的速度流加含PTM1 12mL/L的体积浓度50％的甘油水溶液，同时关停与pH关联的氨水自动补料泵，让发酵液pH自然下降到3.0再打开氨水泵，并一次性添加终浓度为0.1M的硫酸铵。甘油补料培养至菌体湿重为150-180g/L；甘油流加结束后，一次性补加甲醇至终浓度3g/L，同时在诱导开始及诱导32h时分别添加终浓度为5g/L的酪蛋白水解液。甲醇补料以3.6ml/h/L流速起始并按指数流加模式递增，使工程菌比生长速率维持在0.03h^-1。发酵培养至菌体湿重达到400g/L时结束。

每隔一定时间取样测定菌体湿重，冻存发酵上清及相应时间的菌体，直到发酵结束后放罐。

(2)发酵检测

①SDS-PAGE分析

将发酵过程中定期收集到的离心发酵上清进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示。由于胶原蛋白氨基酸序列的特殊性，其分子量在SDS-PAGE显示偏大，为46kDa左右，理论值为40.7kDa。重组胶原蛋白表达量为5g/L，降解率经检测为6～8％，两方面指标明显优于对比例1。

②菌体湿重测定及比生长速率计算

取2mL发酵液置于预称重的2mL离心管内，5000rpm离心5min弃上清，用超纯水洗两遍，进行同样的离心操作后，再用超纯水重悬菌体并转入已经称重的离心管内离心，弃上清，称重重量减去离心管重量为细胞湿重。每次测定测3个平行组取平均值作为此次取样所得菌体湿重。通过不同时间点测定的菌体湿重，可计算发酵过程中的比生长速率变化情况，结果如图4所示。

(3)生物活性检测

①细胞划痕法检测细胞迁移能力

将发酵离心纯化得到的重组胶原蛋白进行细胞划痕检测，选用BALB/3T3细胞，设定供试品组和对照组，通过不同组之间的细胞向划痕区移行的比较，判断供试品组细胞的迁移能力。

a、细胞培养：先用marker笔在6孔板背后每孔纵向划三条线做记号。按每孔约5×10⁵个种细胞。目标为培养24h后能达到95-100％汇合状态。

b、划痕试验：细胞培养24h后，用10μL枪头比着直尺垂直对准孔板向下轻推纵向划线形成划痕，用D-PBS漂洗细胞3次，去除划掉的细胞，分别在6个孔中加入2mL维持培养基配制的重组胶原蛋白，终浓度为0mg/mL、0.01mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL。空白对照组只加入维持培养基。

c、在37℃，5％CO₂培养箱培养，于0h、24h、48h后，以横向和纵向划线的交点为核心，在40倍显微镜下拍照，每孔获得9个部位的照片。

d、测量划痕区面积，通过固定划痕区移行细胞的总面积除以固定划痕区初始面积，计算每组细胞迁移率。

结果如图5-1至5-6和图6所示，其中图5-1中重组胶原蛋白浓度0mg/mL，24h细胞迁移率30.3％，48h细胞迁移率40.3％；图5-2中重组胶原蛋白浓度0.01mg/mL，24h细胞迁移率32.4％，48h细胞迁移率44.6％；图5-3中重组胶原蛋白浓度0.1mg/mL，24h细胞迁移率32.3％，48h细胞迁移率41.3％；图5-4中重组胶原蛋白浓度0.5mg/mL，24h细胞迁移率39.8％，48h细胞迁移率54.7％；图5-5中重组胶原蛋白浓度1mg/mL，24h细胞迁移率40.0％，48h细胞迁移率54.5％；图5-6中重组胶原蛋白浓度2mg/mL，24h细胞迁移率48.2％，48h细胞迁移率64.6％；图6为重组胶原蛋白对细胞迁移率的影响。对照组(重组胶原蛋白0mg/mL)培养24h后，细胞迁移率为32.09％，培养48h后细胞迁移率为41.72％；当重组胶原蛋白浓度增加到0.5mg/mL时，细胞24h和48h迁移率明显增加，当浓度继续增加到2mg/mL的过程中，细胞24h和48h迁移率持续增加。证明重组胶原具有生物学活性。

②细胞粘附性测定和相对粘附性计算

将发酵离心纯化得到的重组胶原蛋白包被于细胞培养板上，可通过离心法定量测定胶原蛋白与细胞形成黏附后分离所需的力，根据离心前后细胞数量变化来评价重组胶原对细胞的促粘附能力。选用BALB/3T3细胞，设定供试品组和对照组，在最佳相对离心力(RCF)洗脱未黏附的细胞，测定离心前后细胞分离百分比，以此来判定重组胶原蛋白样品的相对促细胞黏附性。

a、涂层制备：向96孔板内分别加入100μL重组胶原蛋白(0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml)样品。每个样品包被制备3个孔，在37℃，5％CO₂培养箱中孵育4h。从孔中除去多余的D-PBS包被溶液，加入100μL 0.5％BSA-PBS溶液，37℃，5％CO₂培养箱中孵育1h。移除孔内液体后，用D-PBS洗涤三次，弃除清洗液，用封口膜密封后置于4℃备用。使用前将细胞板放置培养箱中回温。

b、细胞制备：将BALB/3T3细胞于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养，每天在倒置显微镜下观察细胞密度及状态。当细胞生长至培养瓶的80-90％时进行细胞传代或细胞接种。使用已经与Hoechst 33342荧光染色剂(10％)预混合的完全培养基，将细胞以1.5×10⁴个/孔种于96孔板，每孔100μL，设置三个复孔，用锡纸覆盖在37℃，5％CO₂孵育。孵育时间为1h。

c、检测：离心前每个样品孔分别进行荧光拍照。拍摄完后每个孔用250μL D-PBS填充以形成“反向弯月面”并用封口膜覆盖，倒置放置以316离心力离心5min，弃去封口膜并从孔中取出上清液。用D-PBS清洗1次后，再加入100μL D-PBS，对每个孔进行拍摄。(每孔拍摄4个相连视野)

d、结果计算：使用自动细胞计数程序来计数荧光标记的细胞核数目，测定离心前后的细胞数。按下式计算黏附百分比：

V—黏附百分比；

N_t—离心后细胞数；

N_c—离心前细胞数。

相对细胞黏附性比值按式计算：

P—相对细胞黏附性比值；

V1—胶原蛋白样品各复孔的黏附百分比平均值；

v2—阴性对照各复孔的黏附百分比平均值。

e、结论：通过图7-1至7-3和图8可以看出，重组胶原蛋白具有一定的促细胞粘附性，其中图7-1为重组胶原蛋白浓度0mg/mL，细胞离心前后对比结果，a为离心前，b为离心后；图7-2为重组胶原蛋白浓度0.5mg/mL，细胞离心前后对比结果，c为离心前，d为离心后；图7-3为重组胶原蛋白浓度1mg/mL，细胞离心前后对比结果，e为离心前，f离心后；图8为不同浓度重组胶原蛋白对细胞的相对粘附性结果。

对比例1

重组毕赤酵母GS-COL-C的5L罐高密度发酵步骤如下：

(1)5L罐高密度发酵

重组毕赤酵母GS-COL-C先进行两级种子扩大培养，二级种子OD为5-6时，以体积浓度10％接种量接种至BSM培养基。所述两级扩大培养是将重组毕赤酵母接种至BMG液体培养基，30℃培养10-24h。

将重组毕赤酵母GS-COL-C接种至发酵罐中后，用氨水控制pH在5.0，温度为30℃，初始转速设置为400r/min并逐步提升，调节通气量，控制溶氧在20％以上；当培养基中甘油消耗完后，溶氧快速上升，随即开始以10-50ml/h/L发酵液的速度流加含PTM112mL/L的体积浓度50％的甘油水溶液。甘油补料培养至菌体湿重为150-180g/L；甘油流加结束后，饥饿半小时，然后一次性补加甲醇至终浓度3g/L，以使酵母更快地适应甲醇代谢。2～4h后，甲醇补料按照Invitrogen公司“Pichia Fermentation Process Guidelines”推荐的工艺进行。即以3.6ml/h/L流速流加5h，然后以7.3ml/h/L的流速流加2h、10.9ml/h/L的流速流加4h，此后甲醇流加速度根据溶氧情况决定继续递增、保持不变或减少。发酵培养至菌体湿重达到400g/L时结束。

每隔一定时间取样测定菌体湿重，冻存发酵上清及相应时间的菌体，直到发酵结束后放罐。

(2)发酵检测

①SDS-PAGE分析

将发酵过程中定期收集到的离心发酵上清进行SDS-PAGE检测，结果如图9所示，重组原胶原蛋白降解率在40～50％左右。

②菌体湿重测定

取2mL发酵液置于预称重的2mL离心管内，5000rpm离心5min弃上清，用超纯水洗两遍，进行同样的离心操作后，再用超纯水重悬菌体并转入已经称重的离心管内离心，弃上清，称重重量减去离心管重量为细胞湿重。每次测定测3个平行组取平均值作为此次取样所得菌体湿重。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种编码重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链，其特征在于，所述重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链是由权利要求1所述的核苷酸序列编码表达获得的。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的核苷酸序列。

4.一种重组毕赤酵母菌种，其特征在于，所述重组毕赤酵母菌种的基因组中整合有SEQID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的重组毕赤酵母菌种，其特征在于，所述重组毕赤酵母菌种基因组中整合有3个拷贝的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列以及3个拷贝的SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

6.如权利要求5所述的重组毕赤酵母菌种，其特征在于，所述重组毕赤酵母菌种通过下述步骤获得：

(1)合成如SEQ ID NO.1所示的编码重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的核苷酸序列；

(2)构建含有SEQ ID NO.1的重组表达载体；

(3)将制备得到的重组表达载体线性化后导入毕赤酵母中，筛选阳性克隆；

(4)构建含有SEQ ID NO.3的重组表达载体；

(5)线性化步骤(4)制备的重组表达载体，并导入步骤(3)获得的阳性克隆中，并再次进行阳性克隆的筛选，获得重组毕赤酵母菌种。

7.如权利要求4-6中任一项所述的重组毕赤酵母菌种，其特征在于，所述毕赤酵母菌种为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115。

8.一种生产如权利要求2所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：甘油补料阶段添加终浓度0.1M的硫酸铵，甲醇诱导阶段pH控制在3.0，同时在诱导阶段添加酪蛋白水解物，通过指数流加方式流加甲醇以控制比生长速率在0.03h^-1。

9.如权利要求3所述的表达载体在制备基因工程酵母中的应用。

10.如权利要求4或5所述的重组毕赤酵母菌种在制备重组人源Ⅲ型胶原蛋白α1链中的应用。

Images