CN114437238B

CN114437238B - 胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其表达方法

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Publication number: CN114437238B
Application number: CN202210095274.8A
Authority: CN
Inventors: 魏春; 刘春�; 刘心雨; 刘辰龙; 阮柯钦
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2022-01-26
Filing date: 2022-01-26
Publication date: 2024-03-26
Anticipated expiration: 2042-01-26
Also published as: CN114437238A

Abstract

本发明公开了一株分泌表达胶原蛋白肽‑牛乳铁蛋白肽融合蛋白的重组巴斯德毕赤酵母菌株，编码该所述的胶原蛋白肽‑牛乳铁蛋白肽融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEC ID NO.6所示。通过构建融合基因表达其融合蛋白，其氨基酸序列包括胶原蛋白肽序列，牛乳铁蛋白肽序列。由于牛乳铁蛋白肽表达量低，通过此融合表达证明产量较高的胶原蛋白肽能作为携带标签更好的引导牛乳铁蛋白肽的表达，从而增加表达量，为之后研究及生产提供更好的方向。

Description

胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其表达方法

(一)技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体的是一种胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其表达方法。

(二)背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是1960年Groves首先从牛乳分离出来的，由于乳铁蛋白与铁结合形成红色的复合物，故始称为“红蛋白”。乳铁蛋白是一种糖蛋白，存在于哺乳动物多个腺体中，如乳汁、泪液、唾液和其他外分泌液或中性粒细胞、血浆中，研究表明在初乳中含量最高。

牛乳铁蛋白由于抗菌活性和抑制非正常细胞的生长的能力而具有调节机体免疫力能力的作用，并被广泛应用于饲料和食品添加剂、化妆品以及医药等行业。牛乳铁蛋白具有较高等电点，蛋白表面带正电，是一种碱性蛋白，其具有抗菌，抗病毒，参与铁代谢，参与免疫调节，抗氧化和抑制肿瘤细胞等多种生物学功能，已经作为一种抗菌肽和营养物质并具有重要的研究价值。牛乳铁蛋白的稳定性与pH、温度、盐类及缓冲液环境等多种因素相关。已对牛乳铁蛋白在不同温度下的热稳定性进行了研究，结果表明，超高温瞬时法在一定程度上会破坏牛乳铁蛋白的活性，而巴氏消毒法则不会破坏其活性。

牛乳铁蛋白经消化道分解变成25个氨基酸残基按顺序构成的较小的多肽，这些多肽是牛乳铁蛋白中第17～41位氨基酸残基，这些活性小肽和细胞功能关系密切，可以增强正常细胞的水平，破坏非正常细胞，这些特性使牛乳铁蛋白具有抑菌、杀灭细菌以及防止微生物感染细胞的作用。

就目前研究报道中，Montoya等利用大肠杆菌表达系统表达重组牛乳铁蛋白，其产量为15.3mg/L，并且验证了牛乳铁蛋白的抗菌活性。Rosano等研究表明，原核表达系统表达的蛋白对细胞本身产生毒性而影响细胞的正常生长。2002年，Wang等利用毕赤酵母表达猪乳铁蛋白，表达量为12mg/L；Paramasivam等利用毕赤酵母表达马乳铁蛋白，表达量达到了40mg/L。2006年，Dong等利用毕赤酵母表达耗牛乳铁蛋白，表达量为40mg/L。2007年，Chen等利用毕赤酵母表达羊乳铁蛋白，表达量为2mg/L。2019年，Sun等采用融合表达的方法将牛乳铁蛋白N端与其他抗菌肽融合，表达量为35.6mg/L。Isui和Jose等人成功克隆了牛乳铁蛋白肽(LfcinB)的cDNA基因，与硫氧还蛋白组成融合蛋白，构建pET32-bLf重组表达载体，转入大肠杆菌进行表达，经过镍柱分离纯化后，产量为15.3mg/L；Zigang Tian等人设计合成LfcinB衍生肽多聚体序列，插入表达载体pET32a，IPTG诱导表达，表达量最高达到10mg/L；易俊波等人将LfcinB基因片段克隆到分泌型表达载体pPIC9K中，得到重组质粒，线性化电转毕赤酵母，经甲醇诱导后，LfcinB在酵母中获得了表达，但需要浓缩10倍才能在SDS-PAGE胶上看见明显条带，说明其表达量很低。综合文献结果分析表明，牛乳铁蛋白及牛乳铁蛋白肽在分泌表达中产量都相对较低，无法达到生产需求，目前并无表达量高的规模化生产牛乳铁蛋白肽的报道。

胶原蛋白(COL)是一种生物高分子，它广泛存在于动物结缔组织中，约占体内蛋白总量的25％-30％，是哺乳动物体内分布最广、质量分数最多的功能性蛋白。由于其良好的生物活性、生物相容性以及生物降解性，它在生物医学、食品和化妆品等领域都有着广泛的应用。胶原蛋白在毕赤酵母表达系统中已有较高的产量，Werten等在毕赤酵母中表达重组明胶(胶原蛋白部分水解后的产物)，其单拷贝表达量达到3-6g/L；Olsen等研发了小分子质量的重组人源性明胶，其长度仅为101个氨基酸，并利用毕赤酵母进行表达，经过高拷贝的筛选后发酵制备了具有生物活性的人源性明胶，产量达到1.47g/L。综上，胶原蛋白在毕赤酵母中的表达量普遍较高，能利用其良好的生物学性质，通过与牛乳铁蛋白肽融合表达来增加牛乳铁蛋白肽的产量及保持牛乳铁蛋白肽原有的抗菌效果。因此本研究使用毕赤酵母作为宿主，构建一株分泌表达量高的胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白重组巴斯德毕赤酵母菌株。

(三)发明内容

为了解决现有技术存在的牛乳铁蛋白产量低的问题，本发明提供一种胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白、编码所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的基因、含所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白基因的重组质粒、表达所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的菌株以及所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的表达方法。

为此，本发明构建了一株分泌表达胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的重组毕赤酵母菌株，编码该重组融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列缩写如SEQ ID NO:6所示。以胶原蛋白肽作为标签更好的引导牛乳铁蛋白肽的表达，从而解决牛乳铁蛋白肽产量很低的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白，所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白包括牛乳铁蛋白肽和连接于所述牛乳铁蛋白肽N端的胶原蛋白肽，所述牛乳铁蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述胶原蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

第二方面，本发明提供一种上述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因。

优选地，所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO:5所示。

优选地，所述的胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白，所选择的宿主为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，且编码融合蛋白的核苷酸序列中的罕见密码子都优化为毕赤酵母偏好的密码子序列。

进一步地，所述的胶原蛋白肽选取人源Ⅲ型胶原蛋白αⅠ链(NCBI序列号：NM_000090.4，来源于Homo sapiens)，并根据其序列的亲疏水性分析优选一段亲水性好的胶原蛋白氨基酸序列并与牛乳铁蛋白肽连接，其序列位于去端肽Ⅲ型胶原蛋白αⅠ链序列的1824-3204位核苷酸。

其中，所述的胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白，编码胶原蛋白肽(COL)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白，其中牛乳铁蛋白肽(LfcinB)序列为全长牛乳铁蛋白(NCBI序列号：NM_180998.2，来源于Bos taurus)经消化道分解变成的25个氨基酸残基构成的具有抑菌功能的活性小肽。

其中，所述的胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白，编码牛乳铁蛋白肽(LfcinB)的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

进一步地，所述融合蛋白的胶原蛋白肽连接在牛乳铁蛋白肽的N-端，相对于牛乳铁蛋白肽C端而言，在其N端融合胶原蛋白肽的分泌表达产量更高。

第三方面，本发明提供一种含上述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒。

进一步，所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒的载体为pPIC9K质粒。

优选地，所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒按如下方法构建：

(1)将如SEQ ID NO:1所示的胶原蛋白肽基因和如SEQ ID NO:3所示的牛乳铁蛋白肽基因分别用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切法连接到pPIC9K质粒的多克隆位点上，分别得到pPIC9K-COL质粒和pPIC9K-LfcinB质粒；

(2)以步骤(1)制备的pPIC9K-COL质粒为模板，用下列引物扩增出pPIC9K-COL载体片段：

COLZT-F：TAATACGTAGAATTCCCTAGGGCG

COLZT-R：TCCGTAGTAAGGGGCGAATCC

以步骤(1)制备的pPIC9K-LfcinB质粒为模板，用下列引物扩增出LfcinB片段：

LfcinBPD-F：

GATTCGCCCCTTACTACGGATTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGA LfcinBPD-R：

CTAGGGAATTCTACGTATTAGAAAGCTCTTCTAACACAAGTAATAGATG

(3)将步骤(2)所述的pPIC9K-COL载体片段与LfcinB片段利用一步克隆试剂盒进行无缝连接，所得产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞后，在含氨苄青霉素和卡那霉素的平板上培养后，挑取阳性克隆子测序验证，得到含所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒的菌株，提取质粒，得到所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒。

第四方面，本发明还提供一种含所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒的菌株。

优选地，所述含所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒的菌株为毕赤酵母菌株GS115。

优选地，所述含所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒的菌株按如下方法获得：

COLZT-F：TAATACGTAGAATTCCCTAGGGCG

COLZT-R：TCCGTAGTAAGGGGCGAATCC

LfcinBPD-F：

GATTCGCCCCTTACTACGGATTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGA LfcinBPD-R：

CTAGGGAATTCTACGTATTAGAAAGCTCTTCTAACACAAGTAATAGATG

(3)将步骤(2)所述的pPIC9K-COL载体片段与LfcinB片段利用一步克隆试剂盒进行无缝连接，所得产物转入感受态细胞后，在含氨苄青霉素和卡那霉素的平板上培养后，挑取阳性克隆子测序验证，得到含所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒的菌株，提取质粒，得到所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒；

(4)将步骤(3)所述的胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒用限制性核酸内切酶SacⅠ线性化后通过电激法转入毕赤酵母工程菌GS115的感受态细胞中，于含氨苄青霉素和卡那霉素的MD平板上取阳性转化子测序验证，得到所述含所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒的菌株。

第五方面，本发明提供一种上述含所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒的菌株在表达所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白中的应用。

优选地，一株分泌表达胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的重组毕赤酵母菌株，其特征在于，所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合片段(COL-LfcinB)通过无缝克隆技术连接至pPIC9K质粒上，并通过电转化法将重组质粒pPIC9K-COL-LfcinB整合进入巴斯德毕赤酵母GS115中，得到分泌表达该融合蛋白的重组毕赤酵母菌株(GS115-pPIC9K-COL-LficnB)。

所述的重组毕赤酵母菌株，将产量较高的胶原蛋白肽片段与产量较低的牛乳铁蛋白肽片段连接，从而更好的引导牛乳铁蛋白肽的表达。

进一步地，所述应用为：将所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒的菌株以含甲醇的BMM培养基为诱导培养基，pH调节至3-3.5，于30℃，220rpm条件下进行诱导表达48-72h，所得培养物离心，即得到含所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的上清。优选所述含甲醇的BMM培养基中甲醇的终浓度为1％。

本发明中抗生素浓度都采用0.1wt％。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：由于现有技术中牛乳铁蛋白肽表达量低，通过此融合表达证明产量较高的胶原蛋白肽能作为携带标签更好的引导牛乳铁蛋白肽的表达，从而增加其表达量。由于胶原蛋白本身可作为食品及医用原料，因而该融合蛋白整体可用于食品、饲料等产品中。

(四)附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为根据本发明实施例1的重组胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白重组质粒pPIC9K-COL-LfcinB图谱；

图2为根据本发明实施例1的重组质粒转化大肠杆菌DH5α的阳性转化子琼脂糖凝胶验证胶图；

图3为根据本发明实施例的重组质粒转化表达载体巴斯德毕赤酵母GS115的阳性转化子琼脂糖凝胶验证胶图；

图4为根据本发明实施例的胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白表达的SDS-PAGE分析图，其中COL是胶原蛋白的对照条带，通道6.1、6.2、6.3是指三个摇瓶中的平行组。

(五)具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所属实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面具体描述表达上述基因的重组工程菌的构建及蛋白表达方法。

步骤一、构建重组表达载体

首先，提供了一种优化了的牛乳铁蛋白肽的基因序列以及优化了的胶原蛋白肽的基因序列。其中，在不改变各个融合片段的氨基酸序列的前提下优化其对应的基因序列，其优化处理是根据毕赤酵母的偏好密码子进行，将融合蛋白基因序列中的agg、ggg、gca、ggc等序列优化为其偏好密码子agg、gct、ggt等，以便在毕赤酵母表达系统中更好的进行表达。

接着，通过基因合成的方法获得胶原蛋白肽COL及牛乳铁蛋白肽LfcinB的基因序列，基因由南京金斯瑞生物技术有限公司合成，得到pPIC9K-COL，pPIC9K-LfcinB两个质粒。

使用引物COLZT-F，COLZT-R；LfcinBPD-F，LfcinBPD-R两对引物分别对pPIC9K-COL和pPIC9K-LfcinB进行PCR扩增，将扩增到的PCR产物进行纯化，并通过一步克隆试剂盒重组连接成环，重组产物保存于-20℃备用。

将上述保存的重组产物转化入大肠杆菌DH5α感受态中，挑选阳性转化子并验证，将正确转化子菌株pPIC9K-COL-LfcinB保存于-80℃冰箱。

步骤二、构建基因重组毕赤酵母工程菌

将重组质粒用限制性内切酶SacⅠ进行酶切线性化，并通过电转化法转入毕赤酵母GS115感受态细胞中，以组氨酸缺陷型标记筛选出阳性重组子，得到毕赤酵母重组工程菌。

步骤三、重组胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽的融合表达

用BMG培养基于30℃、220rpm条件下培养工程菌16-18h，至OD600达到2-6，室温下4000rpm-5000rpm离心5min，收集菌体，用BMM培养基重悬菌体，使OD600为1～2，于30℃、220rpm培养3天；每24h向培养基中添加甲醇至终浓度为1％；发酵结束后，离心收集发酵液上清并进行SDS-PAGE检测。

下面结合具体实施例描述本发明的所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白载体的构建及其蛋白表达。

一、本发明所选用的毕赤酵母Pichia pastoris GS115菌株、表达载体pPIC9K均购自美国Invitrogen公司。

二、培养基配方如下：

1、YPD完全培养基：

酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基含2％琼脂)；

2、MD培养基(选择培养基)：

配100mL，向80mL水中加入琼脂糖2g(20g/L)，121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 10mL(13.4g/L)，10×葡萄糖10mL(20g/L)，500×生物素0.2mL(4×10^-4g/L)；

3、BMG培养基(酵母生长培养基)：

完全溶解3g K₂HPO₄，11.8g KH₂PO₄，3.4g YNB(无氨基酵母氮源)，10g硫酸铵，10mL甘油，定容到1L。115℃蒸汽高压灭菌30min。待冷却后在超净台加入2mL的0.02％生物素。

4、BMM培养基(酵母诱导培养基)：

完全溶解3g K₂HPO₄，11.8g KH₂PO₄，3.4g YNB(无氨基酵母氮源)，10g硫酸铵，定容到1L。115℃蒸汽高压灭菌30min。待冷却后在超净台加入2mL的0.02％生物素，1％甲醇。

实施例1

重组胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合表达基因全长为1458bp，共486个氨基酸，该重组胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合表达基因碱基序列如SEQ ID NO:5所示。

重组胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合表达基因克隆载体制备方法如下：

1、胶原蛋白肽(COL)，牛乳铁蛋白肽(LfcinB)基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，所用方法为经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切法连接到pPIC9K质粒的多克隆位点上，且COL、LfcinB基因已根据毕赤酵母密码子偏好进行优化。

2、将合成的pPIC9K-COL，pPIC9K-LfcinB两个克隆载体菌种保存至-80℃冰箱。提取相应菌种质粒得到两个克隆载体。

3、通过无缝克隆技术构建pPIC9K-COL-LfcinB融合表达克隆载体：

3.1、使用COLZT-F，COLZT-R克隆出pPIC9K-COL载体片段，

COLZT-F：TAATACGTAGAATTCCCTAGGGCG

COLZT-R：TCCGTAGTAAGGGGCGAATCC

使用LfcinBPD-F，LfcinBPD-R克隆出LfcinB片段，

LfcinBPD-F：

GATTCGCCCCTTACTACGGATTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGA

LfcinBPD-R：

CTAGGGAATTCTACGTATTAGAAAGCTCTTCTAACACAAGTAATAGATG

PCR体系如下：

F 1μL

R 1μL

DNA 1μL

高保真酶 25μL

水 up to 50μL

3.2、将PCR产物使用DPNⅠ酶进行消化，去除原有模板干扰，体系如下：

PCR原液 50μL

DPNⅠ 1μL

10×BUFFER 5μL

4、将消化后的PCR产物使用纯化试剂盒进行纯化(试剂盒购自上海生工有限公司)，具体操作按试剂盒说明书进行。

5、使用一步克隆试剂盒进行重组连接(一步克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，重组连接具体操作按试剂盒说明书操作进行，反应体系如下：

重组酶 1μL

Buffer 2μL

pPIC9K-COL片段 2μL

LfcinB片段 3μL

无菌水 2μL

6、将重组产物转化至大肠杆菌DH5α(DH5α商用感受态购自北京金沙生物科技有限公司)，具体操作如下：

6.1、取100μL冰上融化的感受态细胞，加入目的DNA(连接产物)，轻轻混匀，冰上静置5min；

6.2、42℃水浴热激45s，迅速放回冰上静置2min；

6.3、向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏至少20min；

6.4、吸取100μL感受态细胞加到含有终浓度为0.1％的氨苄青霉素及0.1％卡那霉素的LB固体培养基上，均匀涂开后吹干平板；

6.5、将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

6.6、挑选转化平板上的单菌落进行阳性转化子的验证，如图2所示，1-9个转化子均为阳性转化子；

6.7、将阳性转化子提取质粒进行测序并将正确菌种保藏于-80℃冰箱。

实施例2

构建重组毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-COL-LfcinB：

1、表达载体pPIC9K-COL-LfcinB的线性化

用限制性核酸内切酶SacⅠ于37℃进行酶切过夜，反应体系如下：

质粒pPIC9K-COL-LfcinB 1μg

10×L缓冲液 2μL

SacⅠ 1μL

灭菌水加至 20μL

然后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测是否完全切开，待完全切开之后，用PCR产物纯化试剂盒对酶切液进行纯化处理，回收线性化质粒。

2、制备毕赤酵母GS115感受态细胞

2.1、在YPD平板上挑取毕赤酵母GS115单菌落，接种于含有3mL的YPD液体培养基的试管中，30℃，220rpm振荡培养过夜；

2.2、取500μL的过夜培养物接种于含有50mL新鲜YPD液体培养基的500mL三角瓶中，30℃，220rpm振荡培养过夜，至OD600达到1.3-1.5；

2.3、将上述培养物导入无菌离心管中，4℃，5000rpm离心5min，去除上清，置于冰上；

2.4、将上述菌体用20mL的LiAc-DTT溶液(100mM LiAc，10mM DTT，0.6M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH 7.5)进行重悬，30℃摇床培养30min，4℃，5000rpm离心5min，去除上清。

2.5、将上述步骤4重复三次或者加入1mL冰上预冷的1M山梨醇重悬菌体，之后转入1.5mL的EP管中，3000rpm离心5min，去除上清，重复此步骤三次。

2.6、将收集到的菌体用冰上预冷的1M山梨醇重悬，其终体积约为0.5mL；

2.7、分装成80μL一管，于-80℃保存备用。

3、毕赤酵母的电转化

3.1、将感受态细胞从-80℃冰箱取出置于冰上；

3.2、将1μg线性化的质粒与感受态80μL混匀，转移到0.2cm的预冷电转杯中，轻轻敲打使之位于电转杯的底部，置于冰上5-10min；

3.3、按照Bio-Rad电转仪的操作说明，将模式设定在Pic模式，将电转杯外壁擦干水分并放入电击位置，电击电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间5msec；

3.4、电击结束立即将1mL预冷的1M山梨醇加入电转杯中，轻轻吹打混匀，并迅速转移至1.5mL EP管中，30℃，220rpm静置培养1-2h；

3.5、取100-200μL菌体涂布于含0.1％氨苄青霉素和0.1％卡那霉素的MD平板上，置于30℃恒温培养箱倒置培养2-4天，直至有单菌落出现；

4、重组转化子的PCR鉴定

4.1、酵母转化子的破壁

1)挑选转化平板上的单菌落于含有0.1M NaOH溶液的PCR管中，吹打混匀至可见的浑浊；

2)将PCR管置于微波炉加热5min，之后迅速将其放至液氮中冷冻5min，如此重复两次，最后于微波炉加热5min；

3)离心将沉淀置于PCR管底部；

4.2、菌落PCR的鉴定

验证引物序列如下：

α-F：TACTATTGCCAGCATTGCTGCT

3AOX：GCAAATGGCATTCTGACATCC

以α-F，3AOX引物为扩增引物进行PCR验证，所用的酶为T5 Super PCR Mix(Colony)(购自北京擎科生物有限公司)，其PCR条件为：98℃预变性，5min，一个热循环；98℃热变性10s，55℃退火15s，72℃延伸15s，30个热循环；72℃终延伸5min。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物为1654bp左右条带为目的基因，所对应的菌种为阳性转化子，凝胶电泳如图3所示，除8号外，1-9号均为阳性转化子。将转化MD平板上对应阳性转化子的单菌落接种至含50mL YPD培养基的250mL三角瓶中，于30℃，220rpm过夜培养。

4.3、利用甘油法保存菌种于-80℃冰箱中。

5、重组酵母的诱导表达

5.1、将-80℃保存的菌株按1％接种量接种至BMG培养基中，30℃，200rpm培养12-16h至OD600为2-6。

5.2、室温下4500rpm离心5min，收集菌体，用BMM培养基重悬菌体，至OD600为1左右，转移至BMM培养基中，用纱布封口，30℃，200rpm摇床培养3天。

5.3、每24h向BMM培养基中加入100％甲醇至终浓度为1％。

5.4、每24h取1mL菌液样品，室温12000rpm离心2min，收集上清，用于SDS-PAGE电泳检测。取样时间为48h，72h。

5.5、待检测样品置于-80℃冰箱中保存备用。

实施例3

重组酵母融合蛋白的检测

1、将收集到的上清进行SDS-PAGE检测，结果如图4所示。43.71kDa左右条带为胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白，可以明显看出融合蛋白条带大小稍大于理论值40kDa大小的COL对照条带，符合预期，且48h、72h融合蛋白条带都较为明显。

2、通过BCA试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)定量测定融合蛋白表达量，具体操作步骤参照BCA试剂盒说明书。测得重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-COL-LfcinB融合蛋白表达量达到2.1g/L，相较于在本发明背景中提及的文献报道----产量大多在mg/L级别或者只有通过浓缩10倍才能看到明显条带而言，其表达量显著提高，从而反映胶原蛋白肽和牛乳铁蛋白肽融合表达能增加其表达量，与其它融合端相比较，能更好的引导牛乳铁蛋白肽的分泌表达。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其表达方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1380

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtccaactg gtcctatcgg tccacctgga ccagccggtc aaccaggaga taaaggtgaa 60

ggtggtgctc caggtttgcc tggtattgct ggtcctagag gttctccagg tgaaagaggt 120

gagactggtc cacctggacc tgctggtttt ccaggtgctc ctggtcaaaa cggtgaacca 180

ggtggtaaag gagaaagagg tgctccagga gaaaaaggag agggtggtcc acctggtgtt 240

gccggtccac ctggtggttc tggtccagcc ggtccacctg gacctcaagg tgttaagggt 300

gaaagaggtt ctccaggtgg tcctggtgct gctggtttcc ctggtgctag aggtttgcct 360

ggtccacctg gatctaacgg taaccctggt ccacctggac cttctggttc tccaggtaaa 420

gacggtccac ctggtccagc tggtaacact ggtgctccag gttctcctgg tgtttctggt 480

ccaaagggag atgccggtca acctggagag aaaggttctc caggtgctca aggtccacct 540

ggtgctccag gtccattggg tattgctggt attactggtg ctagaggttt ggctggtcca 600

cctggtatgc caggacctag aggttctcca ggaccacagg gtgttaaggg tgaatctggt 660

aaaccaggtg ctaatggttt gtccggagag agaggtccac ctggaccaca aggtttgcca 720

ggtttggctg gtactgctgg tgaacctgga agagatggta acccaggttc tgatggtttg 780

cctggtagag atggttctcc aggtggtaaa ggagatagag gtgaaaatgg ttctccaggt 840

gctcctggtg ctccagggca cccaggtcca cctggacctg tcggtcctgc tggtaaatcc 900

ggagatagag gtgaatctgg tccagctggt cctgctggtg ctccaggacc agctggttcc 960

agaggtgctc caggaccaca aggtccaaga ggagataagg gtgaaactgg agagagaggt 1020

gctgctggta ttaaaggtca cagaggtttc ccaggtaacc caggtgctcc aggttctcca 1080

ggaccagctg gtcaacaagg tgctattggt tctccaggac ctgccggtcc tagaggtcca 1140

gttggtcctt ctggtccacc tggtaaagat ggtacttctg gtcatccagg accaattggt 1200

ccacctggtc caagaggtaa tagaggtgaa agaggttctg agggttctcc aggtcaccca 1260

ggacagcctg gtccacctgg tccacctggt gctccagggc cttgttgtgg tggtgttggt 1320

gctgcagcca tcgcaggtat tggaggagag aaagcaggtg gattcgcccc ttactacgga 1380

<210> 2

<211> 460

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Pro Gly

1 5 10 15

Asp Lys Gly Glu Gly Gly Ala Pro Gly Leu Pro Gly Ile Ala Gly Pro

20 25 30

Arg Gly Ser Pro Gly Glu Arg Gly Glu Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala

35 40 45

Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Gln Asn Gly Glu Pro Gly Gly Lys Gly

50 55 60

Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu Lys Gly Glu Gly Gly Pro Pro Gly Val

65 70 75 80

Ala Gly Pro Pro Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Gln

85 90 95

Gly Val Lys Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ala Ala Gly

100 105 110

Phe Pro Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ser Asn Gly Asn

115 120 125

Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Pro Pro

130 135 140

Gly Pro Ala Gly Asn Thr Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Val Ser Gly

145 150 155 160

Pro Lys Gly Asp Ala Gly Gln Pro Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala

165 170 175

Gln Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ile Thr

180 185 190

Gly Ala Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Met Pro Gly Pro Arg Gly

195 200 205

Ser Pro Gly Pro Gln Gly Val Lys Gly Glu Ser Gly Lys Pro Gly Ala

210 215 220

Asn Gly Leu Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro

225 230 235 240

Gly Leu Ala Gly Thr Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly

245 250 255

Ser Asp Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Asp

260 265 270

Arg Gly Glu Asn Gly Ser Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly His Pro

275 280 285

Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly

290 295 300

Glu Ser Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser

305 310 315 320

Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr

325 330 335

Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Pro Gly

340 345 350

Asn Pro Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Gln Gln Gly Ala

355 360 365

Ile Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Val Gly Pro Ser

370 375 380

Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Thr Ser Gly His Pro Gly Pro Ile Gly

385 390 395 400

Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asn Arg Gly Glu Arg Gly Ser Glu Gly Ser

405 410 415

Pro Gly His Pro Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro

420 425 430

Gly Pro Cys Cys Gly Gly Val Gly Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ile Gly

435 440 445

Gly Glu Lys Ala Gly Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr Gly

450 455 460

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttaagtgta gaagatggca atggagaatg aagaagttgg gtgctccatc tattacttgt 60

gttagaagag ctttc 75

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 牛(Bos taurus)

<400> 4

Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro

1 5 10 15

Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe

20 25

<210> 5

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtccaactg gtcctatcgg tccacctgga ccagccggtc aaccaggaga taaaggtgaa 60

ggtggtgctc caggtttgcc tggtattgct ggtcctagag gttctccagg tgaaagaggt 120

gagactggtc cacctggacc tgctggtttt ccaggtgctc ctggtcaaaa cggtgaacca 180

ggtggtaaag gagaaagagg tgctccagga gaaaaaggag agggtggtcc acctggtgtt 240

gccggtccac ctggtggttc tggtccagcc ggtccacctg gacctcaagg tgttaagggt 300

gaaagaggtt ctccaggtgg tcctggtgct gctggtttcc ctggtgctag aggtttgcct 360

ggtccacctg gatctaacgg taaccctggt ccacctggac cttctggttc tccaggtaaa 420

gacggtccac ctggtccagc tggtaacact ggtgctccag gttctcctgg tgtttctggt 480

ccaaagggag atgccggtca acctggagag aaaggttctc caggtgctca aggtccacct 540

ggtgctccag gtccattggg tattgctggt attactggtg ctagaggttt ggctggtcca 600

cctggtatgc caggacctag aggttctcca ggaccacagg gtgttaaggg tgaatctggt 660

aaaccaggtg ctaatggttt gtccggagag agaggtccac ctggaccaca aggtttgcca 720

ggtttggctg gtactgctgg tgaacctgga agagatggta acccaggttc tgatggtttg 780

cctggtagag atggttctcc aggtggtaaa ggagatagag gtgaaaatgg ttctccaggt 840

gctcctggtg ctccagggca cccaggtcca cctggacctg tcggtcctgc tggtaaatcc 900

ggagatagag gtgaatctgg tccagctggt cctgctggtg ctccaggacc agctggttcc 960

agaggtgctc caggaccaca aggtccaaga ggagataagg gtgaaactgg agagagaggt 1020

gctgctggta ttaaaggtca cagaggtttc ccaggtaacc caggtgctcc aggttctcca 1080

ggaccagctg gtcaacaagg tgctattggt tctccaggac ctgccggtcc tagaggtcca 1140

gttggtcctt ctggtccacc tggtaaagat ggtacttctg gtcatccagg accaattggt 1200

ccacctggtc caagaggtaa tagaggtgaa agaggttctg agggttctcc aggtcaccca 1260

ggacagcctg gtccacctgg tccacctggt gctccagggc cttgttgtgg tggtgttggt 1320

gctgcagcca tcgcaggtat tggaggagag aaagcaggtg gattcgcccc ttactacgga 1380

tttaagtgta gaagatggca atggagaatg aagaagttgg gtgctccatc tattacttgt 1440

gttagaagag ctttctaa 1458

<210> 6

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Pro Gly

1 5 10 15

Asp Lys Gly Glu Gly Gly Ala Pro Gly Leu Pro Gly Ile Ala Gly Pro

20 25 30

Arg Gly Ser Pro Gly Glu Arg Gly Glu Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala

35 40 45

Gly Phe Pro Gly Ala Pro Gly Gln Asn Gly Glu Pro Gly Gly Lys Gly

50 55 60

Glu Arg Gly Ala Pro Gly Glu Lys Gly Glu Gly Gly Pro Pro Gly Val

65 70 75 80

Ala Gly Pro Pro Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Pro Gln

85 90 95

Gly Val Lys Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Gly Pro Gly Ala Ala Gly

100 105 110

Phe Pro Gly Ala Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ser Asn Gly Asn

115 120 125

Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Pro Pro

130 135 140

Gly Pro Ala Gly Asn Thr Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Val Ser Gly

145 150 155 160

Pro Lys Gly Asp Ala Gly Gln Pro Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala

165 170 175

Gln Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Ile Thr

180 185 190

Gly Ala Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Met Pro Gly Pro Arg Gly

195 200 205

Ser Pro Gly Pro Gln Gly Val Lys Gly Glu Ser Gly Lys Pro Gly Ala

210 215 220

Asn Gly Leu Ser Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro

225 230 235 240

Gly Leu Ala Gly Thr Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly Asn Pro Gly

245 250 255

Ser Asp Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Asp

260 265 270

Arg Gly Glu Asn Gly Ser Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly His Pro

275 280 285

Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly

290 295 300

Glu Ser Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser

305 310 315 320

Arg Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr

325 330 335

Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Pro Gly

340 345 350

Asn Pro Gly Ala Pro Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Gln Gln Gly Ala

355 360 365

Ile Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Val Gly Pro Ser

370 375 380

Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Thr Ser Gly His Pro Gly Pro Ile Gly

385 390 395 400

Pro Pro Gly Pro Arg Gly Asn Arg Gly Glu Arg Gly Ser Glu Gly Ser

405 410 415

Pro Gly His Pro Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro

420 425 430

Gly Pro Cys Cys Gly Gly Val Gly Ala Ala Ala Ile Ala Gly Ile Gly

435 440 445

Gly Glu Lys Ala Gly Gly Phe Ala Pro Tyr Tyr Gly Phe Lys Cys Arg

450 455 460

Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile Thr Cys

465 470 475 480

Val Arg Arg Ala Phe

485

Claims

1.一种胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白，其特征在于：所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白为牛乳铁蛋白肽和连接于所述牛乳铁蛋白肽N端的胶原蛋白肽，所述牛乳铁蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述胶原蛋白肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2.如权利要求1所述的胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因。

3.如权利要求2所述的胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因，其特征在于：所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

4.一种含如权利要求2所述的胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒。

5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒的载体为pPIC9K质粒。

6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒按如下方法构建：

COLZT-F：TAATACGTAGAATTCCCTAGGGCG

COLZT-R：TCCGTAGTAAGGGGCGAATCC

LfcinBPD-F：

GATTCGCCCCTTACTACGGATTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGA

LfcinBPD-R：

CTAGGGAATTCTACGTATTAGAAAGCTCTTCTAACACAAGTAATAGATG

7.一种含如权利要求4所述的重组质粒的菌株。

8.如权利要求7所述的菌株，其特征在于：所述菌株按如下方法获得：(1)将如SEQ IDNO:1所示的胶原蛋白肽基因和如SEQ ID NO:3所示的牛乳铁蛋白肽基因分别用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切法连接到pPIC9K质粒的多克隆位点上，分别得到pPIC9K-COL质粒和pPIC9K-LfcinB质粒；

COLZT-F：TAATACGTAGAATTCCCTAGGGCG

COLZT-R：TCCGTAGTAAGGGGCGAATCC

LfcinBPD-F：GATTCGCCCCTTACTACGGATTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGA

LfcinBPD-R：CTAGGGAATTCTACGTATTAGAAAGCTCTTCTAACACAAGTAATAGATG

(4)将步骤(3)所述的胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒用限制性核酸内切酶SacⅠ线性化后通过电激法转入毕赤酵母菌株GS115的感受态细胞中，于含氨苄青霉素和卡那霉素的MD平板上取阳性转化子测序验证，得到所述含所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白的编码基因的重组质粒的菌株。

9.如权利要求7所述的菌株在表达权利要求1所述胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白中的应用。