CN101735994A - 一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法 - Google Patents
一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101735994A CN101735994A CN200910217470A CN200910217470A CN101735994A CN 101735994 A CN101735994 A CN 101735994A CN 200910217470 A CN200910217470 A CN 200910217470A CN 200910217470 A CN200910217470 A CN 200910217470A CN 101735994 A CN101735994 A CN 101735994A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bovine trypsin
- lactococcus lactis
- try
- ser
- psec
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法，它涉及一种表达牛胰蛋白酶的方法。解决了现有牛胰蛋白酶目前还不能在乳酸乳球菌中表达的问题。方法：将野生型牛胰蛋白酶N端的8个密码子和所有编码Leu和Ary的稀有密码子替换为乳酸乳球菌的偏爱密码子，得人工合成牛胰蛋白酶基因，并引入识别序列，然后与pUC57连接转化DH5α，筛选阳性转化子pUC57-trym，再与表达载体pSEC-E7同时双酶切后，回收所需目的片段，连接并构建重组表达载体pSEC-trym，电转化转入乳酸乳球菌NZ9000，厌氧培养后经乳链菌肽Nisin诱导，即完成。本发明使人工合成牛胰蛋白酶成功地在乳酸乳球菌中进行表达，且具有生物学活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达牛胰蛋白酶的方法。
背景技术
牛胰蛋白酶(bovine trypsin，EC 3.4.21.4)是一种丝氨酸蛋白酶，选择性地切除赖氨酸和精氨酸残基的C末端。作为一种动物源性消化酶，它被广泛应用于酶解法制备乳源生物活性肽。
此酶主要来源于牛胰腺，但随着海绵样脑病等一系列疾病的出现，从动物体中制备的产品尤其是用于食品业的产品存在很大的安全性问题。另外，还可以采用大肠杆菌重组法制备该酶，但会形成包涵体。因此，探索一种安全有效的牛胰蛋白酶制备方法意义重大。
乳酸乳球菌Lactococcus lactis(L.lactis)是公认的安全性菌株，常用于生产发酵乳制品。近年来，随着对其分子遗传学的不断深入了解，乳酸乳球菌被广泛地应用于现代生物技术领域。但是乳酸乳球菌是一种高度富含AT碱基的原核生物，因此导致牛胰蛋白酶目前还不能在该菌中表达。
发明内容
本发明的目的是解决现有牛胰蛋白酶目前还不能在乳酸乳球菌中表达的问题，而提供一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法。
在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法按以下步骤实现：一、将编码野生型牛胰蛋白酶氨基酸序列N端的8个氨基酸的密码子和牛胰蛋白酶中所有编码Leu和Ary的稀有密码子替换为乳酸乳球菌的偏爱密码子，得人工合成牛胰蛋白酶基因(trym)，并在其5′、3′端分别引入带有NsiI和SpeI的识别序列，然后与克隆载体pUC57一起连接转化大肠杆菌DH5α，再筛选阳性转化子pUC57-trym；二、将pUC57-trym和表达载体pSEC-E7分别经NsiI和SpeI双酶切后，回收所需目的片段，连接并构建重组表达载体pSEC-trym；三、将pSEC-trym经电转化转入乳酸乳球菌感受态细胞NZ9000，得含有重组质粒的乳酸乳球菌NZ9000-pSEC-trym，然后PCR鉴定；四、将NZ9000-pSEC-trym接种于GM17液体培养基中，在30℃下厌氧培养过夜后，取培养物，然后以1∶25的体积比接种于GM17液体培养基中进行扩增培养，在30℃下厌氧培养至OD600为0.4～0.6，再用质量浓度1ng/ml的乳链菌肽Nisin诱导3h，即完成在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶。
本发明不仅能够安全地制备牛胰蛋白酶，而且能够提高乳酸乳球菌的水解能力，这对乳源生物活性肽的发酵法和水解法制备都具有重大的意义。本发明采用乳酸乳球菌重组法制备牛胰蛋白酶，使人工合成牛胰蛋白酶成功地在乳酸乳球菌中进行表达，且具有生物学活性。
附图说明
图1是具体实施一中对所构建的重组质粒pSEC-trym的PCR鉴定电泳图，
其中M表示DNA Marker，从上到下为2000，1000，750，500，250，100bp，泳道1是PCR结果，目的带大小为892bp；图2是具体实施一中在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的Western blot分析图，其中泳道1是NZ9000-pSEC-trym诱导；图3是具体实施方式一中在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的活性测定图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法按以下步骤实现：一、将编码野生型牛胰蛋白酶氨基酸序列N端的8个氨基酸的密码子和牛胰蛋白酶中所有编码Leu和Ary的稀有密码子替换为乳酸乳球菌的偏爱密码子，得人工合成牛胰蛋白酶基因(trym)，并在其5′、3′端分别引入带有NsiI和SpeI的识别序列，然后与克隆载体pUC57一起连接转化大肠杆菌DH5α，再筛选阳性转化子pUC57-trym；二、将pUC57-trym和表达载体pSEC-E7分别经NsiI和SpeI双酶切后，回收所需目的片段，连接并构建重组表达载体pSEC-trym；三、将pSEC-trym经电转化转入乳酸乳球菌感受态细胞NZ9000，得含有重组质粒的乳酸乳球菌NZ9000-pSEC-trym，然后PCR鉴定；四、将NZ9000-pSEC-trym接种于GM17液体培养基中，在30℃下厌氧培养过夜后，取培养物，然后以1∶25的体积比接种于GM17液体培养基中进行扩增培养，在30℃下厌氧培养至OD600为0.4～0.6，再用质量浓度1ng/ml的乳链菌肽Nisin诱导3h，即完成在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶。
本实施方式步骤一中人工合成牛胰蛋白酶基因由上海旭冠公司合成。
本实施方式步骤一中筛选阳性转化子pUC57-trym，是送到上海生物工程技术服务有限公司进行双向测序；使用DNAMAN进行比对，结果表明合成的基因与预期突变结果一致。
本实施方式步骤三中PCR鉴定：针对重组质粒pSEC-trym设计引物，如重组质粒被成功构建，则如图1所示，经PCR会出现预期892bp大小的条带。
本实施方式步骤四中诱导终止后经溶菌酶处理提取菌体总蛋白进行SDS-PAGE(蛋白质电泳)、Western blot(免疫印迹杂交)分析：
Western blot结果如图2所示，重组菌NZ9000-pSEC-trym经乳链菌肽Nisin诱导后有目的条带出现，说明经突变的人工合成牛胰蛋白酶在乳酸乳球菌中成功表达。如图3所示，活性测定结果显示在牛胰蛋白酶的预期大小处紫色凝胶变为黄色，说明表达的人工合成牛胰蛋白酶具有生物学活性。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中野生型牛胰蛋白酶基因序列如SEQ ID NO：1所示。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
本实施方式中野生型牛胰蛋白酶基因序列来自基因文库(美国国立生物技术信息中心，www.ncbi.nlm.nih.gov)。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中人工合成牛胰蛋白酶基因的序列SEQ ID NO：3。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中双酶切的体系如下：
| 10×Buffer | 2.0μL |
| NsiI | 1.0μL |
| SpeI | 1.0μL |
| 重组质粒pUC57-trym | 7.0μL |
| ddH2O | 加至20.0μL |
双酶切反应条件为37℃下反应2h。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中双酶切的体系如下：
| 10×Buffer | 2.0μL |
| NsiI | 1.0μL |
| SpeI | 1.0μL |
| 重组质粒pSEC-E7 | 7.0μL |
| ddH2O | 加至20.0μL |
双酶切反应条件为37℃下反应2h。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中PCR的体系如下：
| PCR反应缓冲液buffer | 10.0μL |
| dNTP Mixture | 4.0μL |
| 上游引物 5′-TGAACGAACTTAATGGGAGG-3′ | 0.5μL |
| 下游引物 5′-GACGGTATCGATAAGCTTGA-3′ | 0.5μL |
| 提取质粒 | 0.5μL |
| Primer STARTM HS DNA Polymerase(PCR反应所用的酶) | 0.5μL |
| ddH2O | 加至50.0μL |
PCR反应条件为98℃下预变性20s，98℃下变性10s，56℃下退火15s，72℃下延伸1.5min，共循环35次，72℃下终延伸2min，4℃下保存。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤四中GM17液体培养基由4.225％肉汤和0.5％葡萄糖组成。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
序列表
<110>东北农业大学
<120>在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法
<160>5
<210>1
<211>672
<212>DNA
<213>牛(Bos)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(672)
<400>1
atc gtg ggc ggctac acc tgt ggg gca aat act gtc ccc tac caa gtg 48
Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Gly Ala Asn Thr Val Pro Tyr Gln Val
1 5 10 15
tcc ctg aac tct ggc tac cac ttc tgc ggg ggc tcc ctc atc aac agc 96
Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser
20 25 30
cag tgg gtg gtg tct gcg gct cac tgc tac aag tcc gga atc caa gtg 144
Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Gly Ile Gln Val
35 40 45
cgt ctg gga gaa gac aac att aat gtc gtt gag ggc aat gag caa ttc 192
Arg Leu Gly Glu Asp Asn Ile Asn Val Val Glu Gly Asn Glu Gln Phe
50 55 60
atc agc gca tcc aag agt atc gtc cat ccc agc tac aac tca aac acc 240
Ile Ser Ala Ser Lys Ser Ile Val Hi s Pro Ser Tyr Asn Ser Asn Thr
65 70 75 80
tta aac aac gac atc atg ctg att aaa ctg aaa tca gct gcc agt ctc 288
Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Lys Ser Ala Ala Ser Leu
85 90 95
aac agc cga gta gcc tct atc tct ctg cca aca tcc tgt gcc tct gct 336
Asn Ser Arg Val Ala Ser Ile Ser Leu Pro Thr Ser Cys Ala Ser Ala
100 105 110
ggc acc cag tgt ctc atc tct ggc tgg ggc aac acc aaa agc agt ggc 384
Gly Thr Gln Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly
115 120 125
acc agc tac cct gat gtc ctg aag tgt ctg aag gct ccc atc cta tca 432
Thr Ser Tyr Pro Asp Val Leu Lys Cys Leu Lys Ala Pro Ile Leu Ser
130 135 140
gac agc tct tgc aaa agt gcc tac cca ggc cag atc acc agc aac atg 480
Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ala Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Ser Asn Met
145 150 155 160
ttc tgt gcg ggc tac ctg gag ggc gga aag gac tcc tgc cag ggt gac 528
Phe Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp
165 170 175
tcc ggt ggc cct gtg gtc tgc agt gga aag ctc cag ggc att gtc tcc 576
Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Ser Gly Lys Leu Gln Gly Ile Val Ser
180 185 190
tgg ggc tct ggc tgc gct cag aaa aac aag cct ggt gtc tac acc aag 624
Trp Gly Ser Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys
195 200 205
gtc tgc aac tac gtg agc tgg att aag cag acc atc gcc tcc aac taa 672
Val Cys Asn Tyr Val Ser Trp Ile Lys Gln Thr Ile Ala Ser Asn
210 215 220
<210>2
<211>223
<212>PRT
<213>牛(Bos)
<400>2
Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Gly Ala Asn Thr Val Pro Tyr Gln Val
1 5 10 15
Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser
20 25 30
Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Gly Ile Gln Val
35 40 45
Arg Leu Gly Glu Asp Asn Ile Asn Val Val Glu Gly Asn Glu Gln Phe
50 55 60
Ile Ser Ala Ser Lys Ser Ile Val His Pro Ser Tyr Asn Ser Asn Thr
65 70 75 80
Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Lys Ser Ala Ala Ser Leu
85 90 95
Asn Ser Arg Val Ala Ser Ile Ser Leu Pro Thr Ser Cys Ala Ser Ala
100 105 110
Gly Thr Gln Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly
115 120 125
Thr Ser Tyr Pro Asp Val Leu Lys Cys Leu Lys Ala Pro Ile Leu Ser
130 135 140
Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ala Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Ser Asn Met
145 150 155 160
Phe Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp
165 170 175
Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Ser Gly Lys Leu Gln Gly Ile Val Ser
180 185 190
Trp Gly Ser Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys
195 200 205
Val Cys Asn Tyr Val Ser Trp Ile Lys Gln Thr Ile Ala Ser Asn
210 215 220
<210>3
<211>688
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成牛胰蛋白酶基因的序列。
<400>3
atgcatcaat cgttggtggt tacacttgtg gtgcaaatac tgtcccctac caagtgtccc 60
ttaactctgg ctaccacttc tgcgggggct cccttatcaa cagccagtgg gtggtgtctg 120
cggctcactg ctacaagtcc ggaatccaag tgcgtcttgg agaagacaac attaatgtcg 180
ttgagggcaa tgagcaattc atcagcgcat ccaagagtat cgtccatccc agctacaact 240
caaacacctt aaacaacgac atcatgctta ttaaacttaa atcagctgcc agtcttaaca 300
gccgtgtagc ctctatctct cttccaacat cctgtgcctc tgctggcacc cagtgtctta 360
tctctggctg gggcaacacc aaaagcagtg gcaccagcta ccctgatgtc cttaagtgtc 420
ttaaggctcc catcctttca gacagctctt gcaaaagtgc ctacccaggc cagatcacca 480
gcaacatgtt ctgtgcgggc taccttgagg gcggaaagga ctcctgccag ggtgactccg 540
gtggccctgt ggtctgcagt ggaaagcttc agggcattgt ctcctggggc tctggctgcg 600
ctcagaaaaa caagcctggt gtctacacca aggtctgcaa ctacgtgagc tggattaagc 660
agaccatcgc ctccaactaa ggactagt 688
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR上游引物的序列。
<400>4
tgaacgaact taatgggagg 20
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR下游引物的序列。
<400>5
gacggtatcg ataagcttga 20
Claims (7)
1.一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法，其特征在于在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法按以下步骤实现：一、将编码野生型牛胰蛋白酶氨基酸序列N端的8个氨基酸的密码子和牛胰蛋白酶中所有编码Leu和Ary的稀有密码子替换为乳酸乳球菌的偏爱密码子，得人工合成牛胰蛋白酶基因，并在其5′、3′端分别引入带有Nsi I和Spe I的识别序列，然后与克隆载体pUC57一起连接转化大肠杆菌DH5α，再筛选阳性转化子pUC57-trym；二、将pUC57-trym和表达载体pSEC-E7分别经Nsi I和Spe I双酶切后，回收所需目的片段，连接并构建重组表达载体pSEC-trym；三、将pSEC-trym经电转化转入乳酸乳球菌感受态细胞NZ9000，得含有重组质粒的乳酸乳球菌NZ9000-pSEC-trym，然后PCR鉴定；四、将NZ9000-pSEC-trym接种于GM17液体培养基中，在30℃下厌氧培养过夜后，取培养物，然后以1∶25的体积比接种于GM17液体培养基中进行扩增培养，在30℃下厌氧培养至OD600为0.4～0.6，再用质量浓度1ng/ml的乳链菌肽Nisin诱导3h，即完成在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法，其特征在于步骤一中野生型牛胰蛋白酶基因序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法，其特征在于步骤一中人工合成牛胰蛋白酶基因的序列SEQ ID NO：3。
4.根据权利要求1所述的一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法，其特征在于是步骤二中双酶切的体系如下：
双酶切反应条件为37℃下反应2h。
5.根据权利要求1所述的一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法，其特征在于是步骤二中双酶切的体系如下：
双酶切反应条件为37℃下反应2h。
6.根据权利要求1所述的一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法，其特征在于步骤三中PCR的体系如下：
PCR反应条件为98℃下预变性20s，98℃下变性10s，56℃下退火15s，72℃下延伸1.5min，共循环35次，72℃下终延伸2min，4℃下保存。
7.根据权利要求1所述的一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法，其特征在于步骤四中GM17液体培养基由4.225％肉汤和0.5％葡萄糖组成。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910217470A CN101735994A (zh) | 2009-12-31 | 2009-12-31 | 一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910217470A CN101735994A (zh) | 2009-12-31 | 2009-12-31 | 一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101735994A true CN101735994A (zh) | 2010-06-16 |
Family
ID=42460024
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910217470A Pending CN101735994A (zh) | 2009-12-31 | 2009-12-31 | 一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101735994A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106615622A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-05-10 | 东北农业大学 | 一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂及其应用 |
| CN112574935A (zh) * | 2020-12-16 | 2021-03-30 | 扬州市扬大康源乳业有限公司 | 一种具有降血压功能的乳酸菌基因工程菌及其构建方法与应用 |
-
2009
- 2009-12-31 CN CN200910217470A patent/CN101735994A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106615622A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-05-10 | 东北农业大学 | 一种促进雏鸡生长及增强雏鸡抵抗鸡白痢沙门氏菌感染能力的饲料添加剂及其应用 |
| CN112574935A (zh) * | 2020-12-16 | 2021-03-30 | 扬州市扬大康源乳业有限公司 | 一种具有降血压功能的乳酸菌基因工程菌及其构建方法与应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110845603A (zh) | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 | |
| CN110724187B (zh) | 一种高效表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其应用 | |
| CN108794635B (zh) | 一种牛乳铁蛋白肽-人溶菌酶融合蛋白、基因及其应用 | |
| CN108085308B (zh) | 一种能提高耐热脂肪酶产量的重组工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN114437238B (zh) | 胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其表达方法 | |
| GB2583189A (en) | Gene expression system for probiotic microorganisms | |
| CN114853881B (zh) | 一种重组人源融合胶原蛋白及其高效羟基化方法与应用 | |
| CN111763675B (zh) | 一种提升角蛋白酶异源表达的启动子 | |
| CN111411054B (zh) | 一种表达抗菌肽基因的乳酸乳球菌 | |
| CN109295067A (zh) | 一种密码子优化的德谷胰岛素前体基因及其表达方法 | |
| CN105713883A (zh) | 一种l-脯氨酸-4-羟基化酶及其应用 | |
| CN101735994A (zh) | 一种在乳酸乳球菌中表达牛胰蛋白酶的方法 | |
| CN110791508B (zh) | 密码子优化的片球菌素基因、表达载体及重组工程菌株 | |
| CN116554309A (zh) | 一种重组人源ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN108368512A (zh) | 一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法 | |
| CN101497863B (zh) | 一种制备N-末端乙酰化的胸腺素α1的方法及其专用工程菌 | |
| CN113699092B (zh) | 一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 | |
| CN113201074B (zh) | 一种pkek融合蛋白及制备方法与应用 | |
| AU2019218315A1 (en) | Codon optimized precursor gene and signal peptide gene of human insulin analogue | |
| CN110305887A (zh) | 抗真菌肽Drosomycin、制备方法及其应用 | |
| CN1900289A (zh) | 一种纳豆激酶的表达方法及其专用表达载体和工程菌 | |
| CN108771028B (zh) | 一种动物饲料添加剂及其制备方法与应用 | |
| CN106632654B (zh) | 一种优化的pIFN-γ肽链及在提高毕赤酵母分泌表达猪IFN-γ产量和活性中的应用 | |
| CN114621959B (zh) | 一种编码牙鲆igf2可溶性蛋白的基因及蛋白重组表达方法与应用 | |
| CN109929849B (zh) | 一种优化的pGH基因、蛋白及在提高毕赤酵母分泌表达pGH产量和活性中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20100616 |