CN105713883A

CN105713883A - 一种l-脯氨酸-4-羟基化酶及其应用

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Publication number: CN105713883A
Application number: CN201410740022.1A
Authority: CN
Inventors: 孙际宾; 郑平; 刘娇; 王兴初; 彭久合; 马延和
Original assignee: Tianjin Jingye Fine Chemicals Co ltd; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Jingye Fine Chemicals Co ltd; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2014-12-05
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2034-12-05
Also published as: CN105713883B

Abstract

本发明公开了一种L-脯氨酸-4-羟基化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶能够在宿主细胞中高效表达且具有高催化活性，从而提高从葡萄糖生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的水平。本发明还提供了包含所述L-脯氨酸-4-羟基化酶的编码序列的表达载体、包含所述表达载体的宿主细胞以及它们在产生反式-4-羟基-L-脯氨酸中的用途和生产方法。

Description

一种L-脯氨酸-4-羟基化酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及具有L-脯氨酸-4-羟基化酶活性的蛋白、编码该蛋白的基因和包含该酶或其编码基因的基因工程菌以及它们在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸(Trans-4-Hydroxy-L-proline，4HP)是一种具有独特生理活性的氨基酸,易溶于水。医药方面，4HP作为原料可用于合成碳青霉烯类抗生素、消炎药、抗肿瘤、降压药及新型胃药等。化妆品方面，由于4HP具有抗氧化和抗辐射等作用，许多高级化妆品中都添加4HP以期延缓衰老。动物饲料方面，添加4HP可防止营养不良现象。4HP还可以应用于香味料及抗氧化、防腐和保鲜剂等。

反式-4-羟基-L-脯氨酸可以通过L-脯氨酸-4-羟基化酶催化L-脯氨酸羟基化来生产，目前用于生产L-脯氨酸等氨基酸的工程菌主要是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、大肠杆菌(E.coli)等，但是这些菌都没有编码L-脯氨酸-4-羟基化酶的基因。因此，挖掘能够在L-脯氨酸生产菌中表达并具有高效催化活性的L-脯氨酸-4-羟基化酶是实现反式-4-羟基-L-脯氨酸工业生产的关键。

L-脯氨酸-4-羟基化酶的催化反应

日本协和发酵公司通过筛选得到一株脯氨酸4-羟基化酶酶活最高的指孢囊菌，并命名为指孢囊菌RH1，测序获得脯氨酸4-羟基化酶基因序列(CN96190335)；将指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟基化酶基因进行密码子优化后置于一个强启动子的调控下，导入到大肠杆菌中，添加外源L-脯氨酸，在发酵罐中转化100h后，反式-4-羟基-L-脯氨酸的积累量达到41g/L，转化效率只有87％(Shibasaki,Takeshi,HideoMori,andAkioOzaki."Enzymaticproductionoftrans-4-hydroxy-L-prolinebyregio-andstereospecifichydroxylationofL-proline."Bioscience,biotechnology,andbiochemistry64.4(2000):746-750)。为了进一步降低反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产成本，日本协和发酵公司又将密码子改造的指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟基化酶基因导入到L-脯氨酸生产菌中，在以葡萄糖为底物的发酵培养基中培养99h后反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到25g/L，发酵过程L-脯氨酸最高积累量达到7.8g/L，初步实现了羟脯氨酸的从头合成(CN97117929.8和Shibasaki,Takeshi等,"Constructionofanovelhydroxyproline-producingrecombinant<i>Escherichiacoli</i>byintroducingaproline4-hydroxylasegene."Journalofbioscienceandbioengineering90.5(2000):522-525)。

然而，目前报道的具有工业应用前景的L-脯氨酸-4-羟基化酶只有来源于指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟基化酶。指孢囊菌属于放线菌，是一种高GC含量的革兰氏阳性细菌，指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟基化酶基因的GC含量为74％，并且含有大肠杆菌稀有密码子。因此，指孢囊菌的野生型L-脯氨酸-4-羟基化酶在原核生物，例如大肠杆菌中重组表达时主要以没有活性或活性很低的包涵体形式存在，经过密码子优化后的突变型L-脯氨酸-4-羟基化酶在表达量和催化性能上依然较差。

因此，本领域急需能够在反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株中高效表达且具有高催化性能的新型L-脯氨酸-4-羟基化酶，从而有助于提升从葡萄糖生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的水平。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型L-脯氨酸-4-羟基化酶，该新型L-脯氨酸-4-羟基化酶能够在反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株中高效表达且具有高催化性能。

在第一方面，本发明提供一种用于催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸的L-脯氨酸-4-羟基化酶，所述L-脯氨酸-4-羟基化酶为以下蛋白：

(a)氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白；或

(b)由SEQIDNO:1所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在具体的实施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由SEQIDNO:1所示氨基酸序列经过1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在具体的实施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由SEQIDNO:1所示氨基酸序列经过1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在具体的实施方式中，(b)所述的衍生蛋白是在SEQIDNO:1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在优选的实施方式中，本发明提供一种用于催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸的L-脯氨酸-4-羟基化酶，所述L-脯氨酸-4-羟基化酶为氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白。

在具体的实施方式中，所述蛋白在谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、大肠杆菌(E.coli)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中表达。

在具体的实施方式中，所述蛋白在大肠杆菌(E.coli)中表达。

在第二方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含编码本发明第一方面所述蛋白的核苷酸序列。

在具体的实施方式中，所述表达载体包含SEQIDNO:2所示核苷酸序列。

在第三方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第二方面所述的表达载体，或基因组上整合有编码本发明第一方面所述蛋白的核苷酸序列，或基因组上整合有SEQIDNO:2所示核苷酸序列。

在具体的实施方式中，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、大肠杆菌(E.coli)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞中不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱的谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase)和谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehydedehydrogenase)的活性增强。

在第四方面，本发明提供本发明第一方面所述的蛋白或本发明第二方面所述的表达载体或本发明第三方面所述宿主细胞的用途，用于催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物。

在第五方面，本发明提供一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：

1)利用本发明第三方面所述的宿主细胞或本发明第一方面所述的蛋白进行发酵或转化，从而产生反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物；和

2)从1)的体系中获得反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物。

在具体的实施方式中，所述生产反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物的方法是以L-脯氨酸为前体生产反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物。

在具体的实施方式中，所述生产反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物的方法是以葡萄糖或淀粉等糖类水解的葡萄糖为前体生产反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明克隆的基因在大肠杆菌中表达后的蛋白电泳图；其中，1为大肠杆菌BL21(pET21a)无目的蛋白表达的对照，2为大肠杆菌BL21(pSW1)表达目的蛋白。

图2显示了本发明的pSW2和pSW3质粒的构建图谱。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现了一种新型L-脯氨酸-4-羟基化酶及其编码基因，该基因的GC％含量适中，可以在基因工程菌中可溶性表达并维持高催化活性。在此基础上完成了本发明。

L-脯氨酸-4-羟基化酶

本文所用的术语“L-脯氨酸-4-羟基化酶”或“本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶”或“本发明的酶”具有相同的意义，在本文可以互换使用，均是指具有催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸活性的蛋白。在具体的实施方式中，本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶表示氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白质，其编码序列如SEQIDNO:2所示。

本文所用的术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。因此，本文所用的术语“分离的L-脯氨酸-4-羟基化酶”是指所述蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的条带。

然而，鉴于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员还应明白“L-脯氨酸-4-羟基化酶”还应包括所述蛋白的变异形式，所述变异形式具有与“本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶”相同或相似的功能，但其氨基酸序列与SEQIDNO:1所示氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-6个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为6个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的标签通常不会改变所得蛋白质的功能。例如，本申请实施例中1-4中的蛋白都是在C端带有6his标签的蛋白。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与“本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶”的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还包括其他多肽，如包含“本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶”或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还应包括“本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶”的活性片段。通常，该片段具有“本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶”的氨基酸序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供“L-脯氨酸-4-羟基化酶”的类似物。这些类似物与天然“本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶”的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

在本发明中，“L-脯氨酸-4-羟基化酶”的保守性变异多肽指与SEQIDNO:1所示氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽，但所述保守性变异多肽依然具有与氨基酸序列如SEQIDNO:1所示蛋白相同或相似的活性，即，催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸活性。

因此，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生保守性变异的突变体。

初始残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val

Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本领域技术人员明白，本发明的“L-脯氨酸-4-羟基化酶”还包括“L-脯氨酸-4-羟基化酶”的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的“L-脯氨酸-4-羟基化酶”相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

鉴于本领域现有技术和本发明的教导，本领域技术人员不难获得本发明L-脯氨酸-4-羟基化酶的活性片段。例如，CN201310235337.6描述了L-脯氨酸-4-羟基化酶在C端缺失15个氨基酸仍然保持催化活性，而且能够提高催化效率。因此，任何一种“L-脯氨酸-4-羟基化酶”的生物活性片段都可以应用于本发明。在本文中，“L-脯氨酸-4-羟基化酶”的生物活性片段是指“L-脯氨酸-4-羟基化酶”的片段，但其仍然能保持全长“L-脯氨酸-4-羟基化酶”的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持全长“L-脯氨酸-4-羟基化酶”的50％的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长“L-脯氨酸-4-羟基化酶”的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

基于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员还可以明白，可以将本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶制成固定化酶等其它利用形式。

本发明还提供了编码本发明“L-脯氨酸-4-羟基化酶”或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的蛋白质，但与SEQIDNO:2所示编码序列有差别的核酸序列。

编码SEQIDNO:1所示成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码“L-脯氨酸-4-羟基化酶”的多聚核苷酸。

本发明的“L-脯氨酸-4-羟基化酶”核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明编码序列的表达载体，以及用本发明的表达载体或“L-脯氨酸-4-羟基化酶”编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的“L-脯氨酸-4-羟基化酶”。一般来说有以下步骤：

1.用本发明的编码“L-脯氨酸-4-羟基化酶”的多核苷酸(或其变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

2.在合适的培养基中培养的宿主细胞；

3.从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，“L-脯氨酸-4-羟基化酶”的编码多核苷酸序列可插入重组表达载体或基因组。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员可采用熟知的方法能用于构建含“L-脯氨酸-4-羟基化酶”编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

本文所述的宿主细胞包括包含表达载体或基因组上整合了本发明“L-脯氨酸-4-羟基化酶”编码序列，优选SEQIDNO:2所示核苷酸序列的宿主细胞。本发明的宿主细胞或菌株能够高效表达具有高催化性能的新型L-脯氨酸-4-羟基化酶，从而提高从葡萄糖等前体生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的水平。

本发明的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞。在具体的实施方式中，所述菌株包括但不限于：谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)或大肠杆菌(E.Coli)。在优选的实施方式中，所述菌株为大肠杆菌(E.Coli)。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在优选的实施方式中，所述“L-脯氨酸-4-羟基化酶”是：(a)具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的蛋白；或(b)由SEQIDNO:1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有“L-脯氨酸-4-羟基化酶”功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)由SEQIDNO:1所示氨基酸序列经过一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白；或(d)在SEQIDNO:1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白。

相应地，所述“L-脯氨酸-4-羟基化酶”的编码基因是：

(a)氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白的编码核苷酸序列；或

(b)由SEQIDNO:1所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQIDNO:1所示蛋白功能的衍生蛋白的编码核苷酸序列；或

(c)由SEQIDNO:1所示氨基酸序列经过一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白的编码序列；或

(d)在SEQIDNO:1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个，优选1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白的编码序列。

在进一步优选的实施方式中，所述“L-脯氨酸-4-羟基化酶”的编码基因是：(i)具有SEQIDNO:2所示序列的多核苷酸；或(ii)具有与SEQIDNO:2所示序列互补的多核苷酸。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员会理解，本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶及其编码序列、表达载体、宿主细胞可用于催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物。

本发明还提供了利用本发明的表达载体或宿主细胞催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物的方法。例如，在具体的实施方式中，可通过发酵包含本发明表达载体或其基因组上整合由本发明蛋白的编码序列的宿主细胞，使之产生反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物；然后从发酵体系中获得反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物。在优选的实施方式中，所述生产反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物的方法是以L-脯氨酸为前体生产反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物。在另一优选的实施方式中，所述生产反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物的方法是以葡萄糖为前体生产反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物。

本发明的应用与优点：

1.本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶的编码基因的GC％含量适中，不需要经过密码子修饰等改变就能够在原核细胞中可溶性表达并具备高催化活性；

2.本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶也能够如现有技术中已有的L-脯氨酸-4-羟基化酶那样，以L-脯氨酸为前体或以葡萄糖为前体生产反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物，从而为反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物的生产提供了另一种技术手段和思路。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。

实施例1.L-脯氨酸-4-羟基化酶的全基因合成及克隆表达

首先，发明人通过全基因合成了序列如SEQIDNO:2所示的基因。随后，通过NdeI和HindIII酶切位点将全基因合成的该基因(序列如SEQIDNO:2所示)克隆至pET21a质粒(购自Novagen公司)，获得的重组质粒命名为pSW1，其表达的蛋白在C端带有6个his标签，再将重组质粒导入大肠杆菌BL21菌株(购自北京全式金生物技术有限公司)，获得大肠杆菌BL21(pSW1)菌株。大肠杆菌BL21(pSW1)用于诱导表达序列2所示蛋白，以带有空质粒的大肠杆菌BL21(pET21a)菌株为对照，采用LB补加5g/L脯氨酸做为培养基，1％接种，加50ug/mL的氨苄青霉素，37℃220rpm培养2-3h，OD长至0.6-0.8，加入0.5mMIPTG，28℃220rpm诱导表达14h。收集45mL菌体，4℃离心后0.1MTris-Hcl(pH6.5)洗两次，重悬至5mL0.1MTris-Hcl(pH6.5)，超声破壁，4℃离心30min取少量上清进行SDS-PAGE电泳，其余部分上清作为粗酶液用作粗酶活测定。SDS-PAGE电泳结果如图1所示，其显示大肠杆菌BL21(pSW1)可以表达出约30KD的目标蛋白，而对照大肠杆菌BL21(pET21a)没有，说明克隆的基因可以在大肠杆菌中实现很好的可溶性表达。

实施例2.L-脯氨酸-4-羟基化酶的粗酶活测定

实施例1中制备的粗酶液，利用BCA蛋白定量分析试剂盒(购自伯乐公司，货号：23227)进行粗酶液的总蛋白定量。酶活测定体系：240mMMES(pH6.5)，6mMFeSO₄，24mMα-酮戊二酸，8mML-抗坏血酸，12mML-脯氨酸及适量的粗酶，35℃反应10min后终止酶活，测定反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量。反式-4-羟基-L-脯氨酸的检测方法参考国标GB/T9695.23-2008。1个酶活力单位U定义为每分钟催化生成1nmol反式-4-羟基-L-脯氨酸所需酶量。大肠杆菌BL21(pSW1)及对照菌株的粗酶液比酶活如下表所示，说明大肠杆菌BL21(pSW1)菌株表达目标蛋白具有较高的L-脯氨酸-4-羟基化酶活性，而对照没有检测到活性。

菌株	比酶活(U/mg)
		大肠杆菌BL21(pET21a)	未检出活性
大肠杆菌BL21(pSW1)	443.46

实施例3.以L-脯氨酸为前体全细胞催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸

参照实施例1的方法诱导表达L-脯氨酸-4-羟基化酶，采用诱导表达的菌体直接以L-脯氨酸为前体全细胞催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。催化体系：将诱导表达的菌收集OD＝2的菌10ml，重悬在10ml的催化体系中(80mMMES，6mMFeSO₄，200mMα-酮戊二酸，6mML-抗坏血酸，200mM脯氨酸及1％NoidetP-40)，35℃200rpm催化20h，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量如下表，结果显示能够表达L-脯氨酸-4-羟基化酶的大肠杆菌BL21(pSW1)菌株能够以L-脯氨酸为前体全细胞催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。

菌种	反式-4-羟基-L-脯氨酸含量(mg/L)
		大肠杆菌BL21(pET21a)	未检出

大肠杆菌BL21(pSW1)

68.47

本实施例通过离线催化证明，包含本发明基因的宿主细胞具有产生催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的活性。

实施例4.以L-脯氨酸为前体发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸

发酵培养基为：葡萄糖10g/L；胰蛋白胨8g/L；硫酸铵5g/L；磷酸氢二钾1g/L；氯化钠2g/L；硫酸镁0.5g/L；硫酸亚铁0.278g/L；氯化钙0.015g/L；脯氨酸10g/L，α-酮戊二酸5g/L，mops40/L，pH6.5。E.coliBL21(pET21a)和E.coliBL21(pSW1)采用LB培养基过夜培养种子，1％接种发酵培养基，加50ug/ml的氨苄青霉素，37℃220rpm培养2-3h，OD长至0.6-0.8，加入0.5mMIPTG，28℃220rpm发酵26h，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量如下表，结果显示能够表达L-脯氨酸-4-羟基化酶的大肠杆菌BL21(pSW1)菌株能够以L-脯氨酸为前体直接发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。

菌株	26h羟脯氨酸含量(mg/L)
		大肠杆菌BL21(pET21a)	未检出
大肠杆菌BL21(pSW1)	84.5

本实施例证明，包含本发明基因的宿主细胞具有催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产意义。

实施例5.以葡萄糖为原料从头发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸

根据文献(Gene.1988Apr29；64(2):199-205.NucleotidesequenceofamutationintheproBgeneofEscherichiacolithatconfersprolineoverproductionandenhancedtolerancetoosmoticstress)报道，大肠杆菌的proB(NCBI-GI:16128228)基因107位Asp突变为Asn，即proB74突变体可以解除L-脯氨酸对proB基因的反馈抑制。根据文献(ShibasakiT,HashimotoS,MoriH等,Constructionofanovelhydroxyproline-producingrecombinantEscherichiacolibyintroducingaproline4-hydroxylasegene.[J].JBiosciBioeng.2000,905:522-525)报道，在大肠杆菌中过表达proB74谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase)和proA谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehydedehydrogenase)(NCBI-GI:16128229)基因可以生产L-脯氨酸。因此发明人首先在puc19质粒(购自宝生物工程(大连)有限公司)基础上构建了proB74(谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase))和proA(谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehydedehydrogenase))过表达质粒pSW2；在pSW2的基础上进一步构建过表达本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶的pSW3质粒，pSW3质粒质粒表达的蛋白不带有任何标签，质粒构建过程如图2所示。pSW2和pSW3质粒分别导入E.coliDH5α获得E.coliDH5α(pSW2)和E.coliDH5α(pSW3)。

发酵培养基：葡萄糖10g/L；鱼粉蛋白胨8g/L；硫酸铵5g/L；磷酸氢二钾1g/L；氯化钠2g/L；硫酸镁0.5g/L；硫酸亚铁0.278g/L；氯化钙0.015g/L；MOPS40g/L。发酵条件：5％接种量，33℃，220rpm，33h。

其中L-脯氨酸的检测方法为：收集菌液，10000rpm离心5min收集上清液，用3％(W/V)磺基水杨酸稀释到合适浓度；取1mL稀释液，加入1mL酸合茚三酮(1.25g茚三酮溶于30mL冰醋酸和20mL6MH3PO4中，搅拌加热(70℃)溶解，贮于冰箱中)和1mL冰醋酸，100℃沸水浴反应45min；冷却后，加入2mL甲苯，剧烈振荡1min，静置，吸取上层脯氨酸甲苯溶液在520nm测量OD值。采用0-100mg/L浓度的L-脯氨酸绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的浓度。

E.coliDH5α(pSW2)和E.coliDH5α(pSW3)菌株发酵结果如下表所示：

从上表所示的结果可以看出，E.coliDH5α(pSW2)只能产生L-脯氨酸，而进一步过表达本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶的E.coliDH5α(pSW3)能够产生反式-4-羟基-L-脯氨酸，从而说明本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶可以应用于以葡萄糖等糖类原料直接发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种用于催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸的L-脯氨酸-4-羟基化酶，所述L-脯氨酸-4-羟基化酶为以下蛋白：

(a)氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白；或

2.如权利要求1所述的L-脯氨酸-4-羟基化酶，其特征在于，

(b)所述的衍生蛋白是由SEQIDNO:1所示氨基酸序列经过1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

3.如权利要求2所述的L-脯氨酸-4-羟基化酶，其特征在于，

(b)所述的衍生蛋白是由SEQIDNO:1所示氨基酸序列经过1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

4.如权利要求2所述的L-脯氨酸-4-羟基化酶，其特征在于，(b)所述的衍生蛋白是在SEQIDNO:1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-50个，更优选1-30个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

5.一种用于催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸的L-脯氨酸-4-羟基化酶，所述L-脯氨酸-4-羟基化酶为氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的蛋白。

6.一种表达载体，所述表达载体包含编码权利要求1-5中任一项所述蛋白的核苷酸序列。

7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含SEQIDNO:2所示核苷酸序列。

8.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求6或7所述的表达载体，或基因组上整合有编码权利要求1-5中任一项所述蛋白的核苷酸序列，或基因组上整合有SEQIDNO:2所示核苷酸序列。

9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、大肠杆菌(E.coli)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

10.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。

11.如权利要求8-10中任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中的谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase)不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱。

12.如权利要求11中所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中谷氨酸激酶(Glutamate-5-kinase)和/或谷氨酸半醛脱氢酶(Glutamate-semialdehydedehydrogenase)的活性增强。

13.权利要求1-5中任一项所述的蛋白或权利要求6或7所述的表达载体或权利要求8-12中任一项所述宿主细胞的用途，其特征在于，用于催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物。

14.一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)利用权利要求8-12中任一项所述的宿主细胞或权利要求1-5中任一项所述的蛋白进行发酵或转化，从而产生反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物；和

2)从1)的体系中获得反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物。