CN107177641A

CN107177641A - 新的赖氨酸脱羧酶及其应用

Info

Publication number: CN107177641A
Application number: CN201610970315.8A
Authority: CN
Inventors: 孙际宾; 刘娇; 赵晶; 寇风雨; 郑平; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2016-11-03
Filing date: 2016-11-03
Publication date: 2017-09-19

Abstract

本发明公开了新的赖氨酸脱羧酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。本发明的赖氨酸脱羧酶能够在宿主细胞中高效表达且具备优异的热稳定性、在中偏碱性条件下具有高活力等特性，从而优于现有的赖氨酸脱羧酶。本发明还提供了包含所述赖氨酸脱羧酶的编码序列的表达载体、包含能够表达所述蛋白的宿主细胞以及它们在产生1,5‑戊二胺中的用途和生产方法。

Description

新的赖氨酸脱羧酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及具有赖氨酸脱羧酶活性的蛋白以及包含该蛋白编码基因的表达载体和能够表达该蛋白的基因工程菌在生产1,5-戊二胺中的应用。

背景技术

1,5-戊二胺，又名尸胺、1,5-二氨基戊烷、五亚甲基二胺和尸毒素，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，是赖氨酸在赖氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.18)的作用下脱羧产生的，反应为L-lysine+H⁺→CO₂+cadaverine。

1,5-戊二胺具有多种用途。例如，在农业上，1,5-戊二胺可用于调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育、改善植物果实发育、提高果实产量。在医学上，它可作为一种有效治疗痢疾的药物，也是一种重要的药物中间体。在工业上，1,5-戊二胺是一种重要的化工原料；将1,5-戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料——新型尼龙。

尼龙66是由己二胺和己二酸1:1聚合生成，与尼龙6同为尼龙两大品种之一。目前，己二胺的合成仍然依赖于石油化工路线，己二胺及其前体己二腈主要依赖进口。随着石油资源逐渐枯竭，石油资源消耗带来的温室效应、环境污染等问题日益突出，绿色可持续发展的呼声不断升高，人们试图寻找一种用生物路线生产己二胺或其替代物、最终用可再生资源替代石油原料来生产尼龙的新方法。

1,5-戊二胺与己二胺互为同系物，在结构上与己二胺非常相似，可以和二元酸共聚合成具有实用性的尼龙5X(尼龙54、尼龙56、尼龙510等)。例如，尼龙56是一种新型尼龙，与尼龙66一样具有良好的机械强度、较高的熔点和耐各种溶剂的特性，可以替代尼龙66使用，而且尼龙56触感宜人，如棉一样吸湿透气，显示出开发高舒适性服装的前景。尼龙54和尼龙510等其它以1,5-戊二胺为单体制成的尼龙产品则具有特殊的材料性能，具有潜在的应用价值。非常可喜的是，1,5-戊二胺可以用可再生生物质为原料，通过生物合成路线进行合成。

赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧形成1,5-戊二胺，是1,5-戊二胺生物合成途径中的关键酶。赖氨酸脱羧酶存在于各种微生物中。目前，已经分别从大肠杆菌(E.coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)等细菌中克隆出赖氨酸脱羧酶基因。

目前，主要是来源于大肠杆菌的两种赖氨酸脱羧酶CadA和LdcC用于1,5-戊二胺的生产或研究。日本味之素公司的US7189543专利以二羧酸调节pH并通过细胞过表达大肠杆菌的CadA酶转化赖氨酸产生1,5-戊二胺，最高产量达69g/L；上海凯赛在其专利CN102851307A和CN201410004636.3中改造了蜂房哈夫尼菌，过量表达大肠杆菌CadA酶来催化赖氨酸生产1,5-戊二胺，催化温度为50℃，赖氨酸盐酸盐浓度为450g/kg，并调节赖氨酸底物初始pH为6.0，菌体用量为42.75g/L(细胞干重)，催化48h产生251g/kg的1,5-戊二胺。Young Hoon等人采用E.coli XL1-Blue工程菌过表达ldcC，控制初始菌体OD₆₀₀＝50，赖氨酸初始浓度为200g/L，并调节赖氨酸底物初始pH为6.8，催化温度为37℃，经过120小时催化后最终获得133.75g/L的戊二胺(Oh YH et al 2015)。现有的大肠杆菌的两个酶均有不足之处。CadA的最适pH约为5.5，当pH高于6.5活性快速下降，当pH提高到8.0时，它的活力几乎完全丧失(Lemonnier and Lane 1998)。由于1,5-戊二胺是较强的碱性物质，在赖氨酸脱羧转变为1,5-戊二胺时pH会升高，要维持赖氨酸脱羧酶的催化活力，需要加入大量的酸进行中和，这会导致成本的增加并最终产生无机盐废弃物。同时受反应器混合特性制约或受细胞内外环境的非均一特性影响，反应效率会由于局部pH过高而下降。如果使用具有高pH耐受特性的赖氨酸脱羧酶，1,5-戊二胺的生物合成路线将会效率更高，更加环保，更加有成本竞争力。另一方面，虽然LdcC的最适pH相对较高，约为7.6，并在pH6-8之间都具有较高活性，但它的热稳定性很差，当温度超过37℃时，随着温度升高酶活性快速下降(Lemonnier andLane 1998)。由于酶的稳定性与酶的用量、工艺成本直接相关，因而LdcC也不是一个理想的1,5-戊二胺生产用酶。

综上所述，本领域急需pH稳定、温度稳定的赖氨酸脱羧酶用于1,5-戊二胺生物合成。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够从赖氨酸产生1,5-戊二胺的方法以及用于该方法中的赖氨酸脱羧酶，并且所述赖氨酸脱羧酶能够具备优异的pH稳定性和温度稳定性。

在第一方面，本发明提供一种生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括以下步骤：

1)利用以下蛋白或能够表达以下蛋白的宿主细胞产生1,5-戊二胺；和

2)从1)的体系中获得1,5-戊二胺；

所述蛋白是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2中任意所示的蛋白；或

(b)由SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在优选的实施方式中，所述蛋白或所述宿主细胞催化赖氨酸脱羧反应，从而产生1,5-戊二胺。

在具体的实施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列经过1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在具体的实施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列经过1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在具体的实施方式中，(b)所述的衍生蛋白是在SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-50个、优选1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在具体的实施方式中，所述蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的蛋白。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；更优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。

在具体的实施方式中，所述方法在pH 5.0-8.5；优选地，在pH 6-8；更优选地，在pH6.5-7.5下进行。

在优选的实施方式中，所述蛋白的最适pH在5.0-8.5；优选地，所述蛋白的最适pH在6-8；更优选地，所述蛋白的最适pH在6.5-7.5。

在优选的实施方式中，所述蛋白在pH从5.0-8.5的范围内能够保持40％以上的相对酶活；优选地，所述蛋白在pH从6.0-8.0的范围内能够保持70％以上的相对酶活；最优选地，所述蛋白在pH从6.5-7.5的范围内能够保持90％以上的相对酶活。

在优选的实施方式中，本发明的蛋白在37℃孵育12h后，剩余的相对比酶活高于80％；在50℃孵育12h后，本发明的蛋白剩余的相对比酶活高于45％。在优选的实施方式中，所述生产1,5-戊二胺的方法是以赖氨酸为前体生产1,5-戊二胺。

在具体的实施方式中，所述方法在30-60℃的温度范围内；优选在37-50℃的温度范围内；更优选在37℃进行。

在第二方面，本发明提供以下蛋白、或包含编码以下蛋白的核苷酸序列的表达载体、或能够表达以下蛋白的宿主细胞的用途，用于生产1,5-戊二胺，所述蛋白为：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2中任意所示的蛋白；或

在优选的实施方式中，所述蛋白或所述表达载体或所述宿主细胞用于催化赖氨酸产生1,5-戊二胺。

在优选的实施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列经过1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在优选的实施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列经过1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在优选的实施方式中，(b)所述的衍生蛋白是在SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在优选的实施方式中，所述蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白。

在第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含编码以下蛋白的核苷酸序列：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2中任意所示的蛋白；或

在第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞能够表达以下蛋白，所述蛋白是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2中任一所示的蛋白；或

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了3个赖氨酸脱羧酶LDC6、LDC14和CadA在不同pH的比酶活。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现两种赖氨酸脱羧酶，这些赖氨酸脱羧酶具备更适合实际生产的最适pH、较高的热稳定性、较高的比酶活，从而为开发得到优异的赖氨酸脱羧酶，进而用于1,5-戊二胺的生产提供了物质基础。在此基础上完成了本发明。

赖氨酸脱羧酶

赖氨酸脱羧酶是催化赖氨酸脱羧形成1,5-戊二胺的合成途径中的关键酶。赖氨酸脱羧酶存在于各种各样的微生物中，包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、耐碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、尸杆菌(Bacterium cadaveris)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiavietnamensia)、青紫色素杆菌(Chromobacterium violaceum)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、毛链霉菌(Streptomyces polosus)等。目前，已经分别从大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、反刍动物月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)等细菌中克隆出赖氨酸脱羧酶基因。

虽然可以从各种不同的微生物来源获得赖氨酸脱羧酶，但各种赖氨酸脱羧酶的特性显著不同。例如，大肠杆菌中有两种赖氨酸脱羧酶：CadA和LdcC，它们都需要磷酸吡哆醛作为辅助因子。CadA的最适pH是5.5，在pH 8.0时完全失活；LdcC的最适pH是7.6，在广泛的pH范围内均有活性。CadA的热稳定性明显优越，在70℃时仍能保持很高的活性，而LdcC从37℃开始，随着温度升高热稳定性显著下降(Lemonnier and Lane 1998)。本领域技术人员无法从序列分析上知晓何种赖氨酸脱羧酶能够具备所需的特性，例如高比活、热稳定性、pH稳定性，特别是能够适用于实际生产的最适温度以及最适pH，进而无法用于1,5-戊二胺的实际生产。此外，赖氨酸脱羧酶的温度稳定性和pH稳定性偏离实际生产条件还会大幅度增加生产成本。

在本文中，所用的术语“赖氨酸脱羧酶”或“本发明的赖氨酸脱羧酶”或“本发明的酶”具有相同的意义，在本文可以互换使用，均是指具有催化赖氨酸产生1,5-戊二胺活性的蛋白。

在具体的实施方式中，本发明的赖氨酸脱羧酶表示氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2中任一所述的蛋白质。在优选的实施方式中，本发明的赖氨酸脱羧酶表示氨基酸序列如SEQID NO:1所述的蛋白质。

如上所述，赖氨酸脱羧酶的温度稳定性和pH稳定性对于实际生产至关重要。而本发明的赖氨酸脱羧酶能够具备优异的pH稳定性和温度稳定性。

在具体的实施方式中，本发明的赖氨酸脱羧酶在pH从5.0-8.5的范围内能够保持40％以上的相对酶活；优选地，在pH从6.0-8.0的范围内能够保持70％以上的相对酶活；最优选地，在pH从6.5-7.5的范围内能够保持90％以上的相对酶活。

本发明的赖氨酸脱羧酶在一定温度下孵育一定时间后能够保留较高的比酶活。在具体的实施方式中，本发明的蛋白在37℃孵育12h后，剩余的相对比酶活高于80％或更高；在50℃孵育12h后，本发明的蛋白剩余的相对比酶活高于45％。相比之下文献报道的LdcC当温度超过37℃时，活力随着温度升高快速下降(Lemonnier and Lane 1998)。

本文所用的术语“比酶活”具有本领域技术人员通常理解的含义，是指在特定条件下，单位重量(mg)的蛋白所具有的酶活力单位数。一般来说，对同一种酶而言，比活力越高，表示酶的催化性能越好。

本文所用的术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。因此，本文所用的术语“分离纯化的赖氨酸脱羧酶”是指所述蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化本发明的赖氨酸脱羧酶。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的条带。

鉴于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员还应明白“赖氨酸脱羧酶”还应包括所述蛋白的变异形式，所述变异形式具有与“本发明的赖氨酸脱羧酶”相同或相似的功能，但其氨基酸序列与SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-10个，更佳地1-6个，最佳地1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为6个或3个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的标签通常不会改变所得蛋白质的功能。例如，本申请实施例中1-4中的蛋白都是在C端带有6his标签的蛋白。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与“本发明的赖氨酸脱羧酶”的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还包括其他多肽，如包含“本发明的赖氨酸脱羧酶”或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还应包括“本发明的赖氨酸脱羧酶”的活性片段。通常，该片段具有“本发明的赖氨酸脱羧酶”的氨基酸序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供“赖氨酸脱羧酶”的类似物。这些类似物与天然“本发明的赖氨酸脱羧酶”的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

在本发明中，“赖氨酸脱羧酶”的保守性变异多肽指与SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽，但所述保守性变异多肽依然具有与氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2中任一所示蛋白相同或相似的活性，即催化赖氨酸产生1,5-戊二胺活性。

因此，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生保守性变异的突变体。

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本领域技术人员明白，本发明的“赖氨酸脱羧酶”还包括“赖氨酸脱羧酶”的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的“赖氨酸脱羧酶”相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

鉴于本领域现有技术和本发明的教导，本领域技术人员不难获得本发明赖氨酸脱羧酶的活性片段。例如，在本文中，“赖氨酸脱羧酶”的生物活性片段是指“赖氨酸脱羧酶”的片段，但其仍然能保持全长“赖氨酸脱羧酶”的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持全长“赖氨酸脱羧酶”的50％的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长“赖氨酸脱羧酶”的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

基于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员还可以明白，可以将本发明的赖氨酸脱羧酶制成固定化酶等其它利用形式。

在本发明的赖氨酸脱羧酶的基础上，本发明还提供了编码本发明“赖氨酸脱羧酶”或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列的核苷酸序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列的蛋白质，但与SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列的编码核苷酸序列有差别的核酸序列。

本发明中，“赖氨酸脱羧酶”的编码多核苷酸序列可插入重组表达载体或基因组。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员可采用熟知的方法能用于构建含“赖氨酸脱羧酶”编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

本文所述的宿主细胞包括包含上述表达载体或基因组上整合了本发明“赖氨酸脱羧酶”编码序列，优选SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列的编码核苷酸序列的宿主细胞。本发明的宿主细胞或菌株能够高效表达具有高催化性能的新型赖氨酸脱羧酶，从而提高生产1,5-戊二胺的水平。

本发明的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞。在具体的实施方式中，所述菌株包括但不限于：大肠杆菌(E.Coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在优选的实施方式中，所述菌株为大肠杆菌(E.Coli)。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。在上面的方法中的重组多肽可以组成型表达或条件表达，例如当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、高压匀浆、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在优选的实施方式中，所述“赖氨酸脱羧酶”是：(a)具有SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列的蛋白；或(b)由SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有“赖氨酸脱羧酶”功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)由SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列经过一个或数个，优选1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白；或(d)在SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个，优选1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成的且具有(a)所述蛋白功能的衍生蛋白。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员会理解，本发明的赖氨酸脱羧酶及其编码序列、表达载体、宿主细胞可用于催化赖氨酸脱羧产生1,5-戊二胺。

在此基础上，本发明还提供了利用本发明的表达载体或宿主细胞催化赖氨酸脱羧产生1,5-戊二胺的方法。例如，在具体的实施方式中，可通过培养包含本发明表达载体或其基因组上整合由本发明蛋白的编码序列的宿主细胞或者利用本发明的赖氨酸脱羧酶，催化赖氨酸产生1,5-戊二胺；然后从催化体系中获得产生的1,5-戊二胺。在优选的实施方式中，所述方法在pH 6-8之间，更优选在pH 6.5-7.5进行。

本发明所述的用于催化的赖氨酸，可以是宿主细胞自身产生的赖氨酸，也可以是外源添加的赖氨酸。

本发明的优点：

1.相比于现有技术中效果最好的赖氨酸脱羧酶，本发明的赖氨酸脱羧酶具备优异pH稳定性以及温度稳定性；

2.由于本发明的赖氨酸脱羧酶的pH稳定性以及温度稳定性更适合实际生产，从而能够显著降低生产成本和减少对环境的污染；和

3.本发明的赖氨酸脱羧酶为进一步优化1,5-戊二胺的生产提供了物质基础。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。

实施例1.赖氨酸脱羧酶的表达质粒和菌株构建

本发明的赖氨酸脱羧酶序列如以下SEQ ID NO:1-2所示：

SEQ ID NO:1(命名为Ldc6)–MNIFAILNHSGVFFKEEPVRELHASLEKAGYKVVYPVDAQDLYKMVEMNPRICGVLFDWDKYSLDLCTEINVLNEKLPLYAFANQHSTLDISLTDLRLNLHFFEYALGMADDIALKINQATEEYIDQIMPPFTKALFKYVEEGKYTFCTPGHMGGTAFQKSPAGSIFYDFYGPNAFKADVSISMPELGSLLDHSGPHKEAEEYIARTFNADSSYIVTNGTSTSNKIVGMFSAPAGSTVLVDRNCHKSLTHMMMMSDVTPIYFRPTRNAYGILGGIPQSEFTREVIEAKVAATPNATMPGYAVITNSTYDGLLYNTQYIKETLDTKFIHFDSAWVPYTNFNSIYEGKCGMSGEAMPGKVFYETQSTHKLLAAFSQASMIHVKGEFDKESFNEAFMMHTSTSPQYGIVASTEIAAAMMRGNTGKKLIQDSIDRAIRFRKEIKRLESESDSWFFDVWQPENIDTTECWKLDPKDTWHGFKDIDDDHMYLDPIKVTLLTPGMNENSEMSETGIPASIVAKYLDEHGIVVEKTGPYNLLFLFSIGIDKSKAMQLLRALTDFKRGYDLNLTVKNFLPSLYNEDPSFYEGMRIQELAQGIHDLTRQYRLPELMFKAFDVLPELKVTPHAAWQEELRGNVEEVKLEEMVGRVSANMILPYPPGVPLVLPGEMVTTESRPVLDFLEMLCAIGAHYPGFETDIHGVYAQKDGSYTVKVLKED；

SEQ ID NO:2(命名为Ldc14)–MKDILFLCNPSPTFKRIPLEELYAQLRDRGFNIIESTSVDDLLDLVRNNAQLAGVVFDWDSYSLDLCKHITALNEMLPLYAFANTHSTLDVSLGDLRMNIQFFEYTLGGAADIADKIRQGTDDYIDTIMPPLTKALFHYVKEGKYTFCTPGHMGGTAFQKSPVGSLFYDFFGANTMKSDISISVSELGSLLDHSGPHKEAEEYIARTFNADRSYMVTNGTSTANKIVGMYAAPAGSTILIDRNCHKSLTHLMMMSDVIPIYLRPTRNAYGILGGIPQREFTHDTIEARVKNTPNATWPVHAVVTNSTYDGLFYNAEYIKKTLDVKSIHFDSAWVPYTNFSPIYQGLCGMSGERVEGKVIYETQSTHKLLAAFSQASMIHVKGDFNQETFNEAYMMHTSTSPHYGIVASIETAAAMMKGHAGKRLINDSIARAIRFRKEIKRLRSESDGWFFDVWQPDNIDQVACWKLDPKESWHGFKGIDDNHMYLDPIKVTLLTPGMNPDGTMADDGIPAAIVAKYLDEHGIIVEKTGPYNLLFLFSIGIDKTKALSLLRALTDFKRAYDLNLRVKNMLPSLYREDPEFYEHMRIQALAQGIHALILHHNLPDLMYRAFEVLPTMVLNPHDAFQQELRGQAEEVYLDEMIGKVNANMILPYPPGVPLVMPGEMLTEESRPVLEFLQMLCEIGAHYPGFETDIHGAYRQADGRYTVKVLKQ。

将赖氨酸脱羧酶Ldc6(SEQ ID NO:3)和Ldc14(SEQ ID NO:4)基因的DNA序列分别进行全基因合成，并通过5‘NdeI和3’XhoI克隆至载体pET-21a(+)(购自苏州金唯智有限公司)，获得2个表达质粒，分别命名为pSKP1和pSKP2；同时以目前生产性能更优的大肠杆菌CadA作为对照，基因序列在NCBI的Gene ID为948643，表达质粒命名为pSKP3。然后将对照空质粒pET-21a(+)、pSKP1、pSKP2和pSKP3质粒分别转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞(购自北京全市金有限公司)，获得表达菌株SKEcC1、SKEcC2、SKEcC3和SKEcC4。

实施例2.酶的分离纯化

将重组菌SKEcC2、SKEcC3和SKEcC4分别接入含有100μg/mL氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，37℃，200r/min培养10h左右。取0.5mL种子液接入含有100μg/mL氨苄青霉素的50mL LB液体培养基的500mL摇瓶中，37℃，200r/min培养。当生长至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入ITPG至终浓度为0.1mM，20℃，200r/min诱导表达20h。诱导表达的菌液4℃离心收集菌体，采用4℃预冷的重悬Buffer(20mM磷酸钾，20mM咪唑，0.1mM磷酸吡哆醛，1mM DTT，100mM NaCl，调节pH＝7.4)对诱导后的细胞进行重悬并洗3次后，采用超声进行破碎。对破碎液以12,000rpm离心20min，获得的可溶性上清液，在AKTA仪器上利用His标签进行镍柱纯化，最终通过洗脱Buffer(20mM磷酸钾，500mM咪唑，0.1mM磷酸吡哆醛，1mM DTT，100mM NaCl，调节pH＝7.4)洗脱目的蛋白，再通过10KD超滤管超滤除盐，最终获得溶于保存Buffer(20mM磷酸钾，0.1mM磷酸吡哆醛，100mM NaCl，5％甘油，调节pH＝7.4)的纯酶，所得的酶为分离纯化的赖氨酸脱羧酶，保存于-80℃，用于各种酶学性质表征。

实施例3.不同pH条件酶活测定

在100ul的酶反应体系中(100mM磷酸钾,0.1mM磷酸吡哆醛，1mM DTT，100mM NaCl)LDC纯酶用量为0.5ug，底物L-赖氨酸浓度为15mM，调节缓冲液pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，在37℃反应3min。吸取30ul反应液加入到70ul 1M碳酸钠终止液中终止反应，取50ul 10mM的TNBS加入到反应终止液中，42℃显色5min，最后用500ul甲苯萃取，吸取200μL上清液在酶标仪上读取340nm下吸光值。酶活力单位U定义为：在以上酶反应条件下，每分钟催化产生1μmol1,5-戊二胺所需的酶量定义为一个酶活单位。

Ldc6和Ldc14在不同pH条件下的比酶活如图1所示，Ldc6和Ldc14的pH耐受范围较广，在pH5.0-8.5的范围内仍能够保持40％以上的相对酶活，在pH6.0-8.0的范围内能够保持70％以上的相对酶活；在pH6.5-7.5的范围内能够保持90％以上的相对酶活，最适pH值分别为7.5和7.0，在最适pH下的比酶活分别为205.1和141.9U.mg^-1。大肠杆菌的CadA的最适pH为5.5，在最适pH下的比酶活为171.6U.mg^-1，当pH升高到6.5以上时CadA比酶活就开始显著下降，与文献报道一致(Lemonnier and Lane 1998)。催化反应在中偏碱性条件进行时，与大肠杆菌等菌株的生长pH相接近，并且可以减少中和酸的用量，减少废弃物无机盐对环境的污染，因此Ldc6和Ldc14更适合于1,5-戊二胺的实际生产。

实施例4.热稳定性的测定

Ldc6、Ldc14和CadA分别用各自最适pH值的缓冲液配制成10μg/mL的浓度，并分别于37℃和50℃进行孵育，孵育12小时后测定剩余酶活力，并与孵育前的酶活力进行比对，计算剩余的相对比酶活。。

结果如表1所示，在37℃孵育12h后Ldc6、Ldc14和CadA剩余的相对比酶活都超过80％，在50℃孵育12h后Ldc6、Ldc14和CadA剩余的相对酶活都超过45％，其中Ldc6的剩余酶活最高，CadA和Ldc14基本相当。而文献报道的LdcC当温度超过37℃时，活力随着温度升高快速下降(Lemonnier and Lane 1998)。说明Ldc6和Ldc14与CadA一样具有良好的热稳定性。

表1 LDC温度稳定性测定

从实施例3和4的结果可以看出，本发明的赖氨酸脱羧酶不仅在中性偏碱pH下具有较高酶活力，而且也具有良好的热稳定性，具有良好的1,5-戊二胺生产应用前景。

实施例5.赖氨酸脱羧酶的全细胞催化

本发明人进一步利用实施例2所示的诱导表达条件，获得SKEcC1、SKEcC2和SKEcC3菌株的表达菌液，SKEcC1作为对照，离心收集菌体。在以下体系中进行赖氨酸全细胞转化反应：100mM的磷酸钾缓冲液，0.1mM PLP，初始赖氨酸盐酸盐浓度35g/L，初始菌体OD600为3.0，反应温度37℃，搅拌转速200r/min，SKEcC1、SKEcC2、SKEcC3三个催化体系加硫酸控制恒定反应pH分别为7.0、7.5和7.0，催化反应时间5小时，结果如表2所示，从表2可以看出，能够表达本发明的赖氨酸脱羧酶的SKEcC2和SKEcC3菌株均能够在比较高的pH条件下实现全细胞催化赖氨酸转化为1,5-戊二胺。

表2 不同赖氨酸脱羧酶全细胞催化产生1,5-戊二胺

菌株	催化5h生成的1,5-戊二胺(g/L)
		SKEcC1	0.5
SKEcC2	17.6
		SKEcC3	5.9

讨论：

本发明人通过细致的研究，出乎意料地发现几种具备催化赖氨酸脱羧产生1,5-戊二胺活性的赖氨酸脱羧酶。这些赖氨酸脱羧酶(尤其是Ldc6)在整体上明显优于现有技术中效果最好的赖氨酸脱羧酶，特别是在反应pH、热稳定性等多个方面；从而为进一步优化1,5-戊二胺的生产提供了新的物质基础。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 新的赖氨酸脱羧酶及其应用

<130> P2015-1664

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 712

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 赖氨酸脱羧酶Ldc6

<400> 1

Met Asn Ile Phe Ala Ile Leu Asn His Ser Gly Val Phe Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Val Arg Glu Leu His Ala Ser Leu Glu Lys Ala Gly Tyr Lys

20 25 30

Val Val Tyr Pro Val Asp Ala Gln Asp Leu Tyr Lys Met Val Glu Met

35 40 45

Asn Pro Arg Ile Cys Gly Val Leu Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Ser Leu

50 55 60

Asp Leu Cys Thr Glu Ile Asn Val Leu Asn Glu Lys Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Gln His Ser Thr Leu Asp Ile Ser Leu Thr Asp Leu

85 90 95

Arg Leu Asn Leu His Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Met Ala Asp Asp

100 105 110

Ile Ala Leu Lys Ile Asn Gln Ala Thr Glu Glu Tyr Ile Asp Gln Ile

115 120 125

Met Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Glu Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Ala Gly Ser Ile Phe Tyr Asp Phe Tyr Gly Pro Asn Ala Phe

165 170 175

Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Met Pro Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

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His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe

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210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Phe Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Val Leu Val

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Met Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Thr Arg Glu Val Ile Glu Ala Lys

275 280 285

Val Ala Ala Thr Pro Asn Ala Thr Met Pro Gly Tyr Ala Val Ile Thr

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Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Gln Tyr Ile Lys Glu

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325 330 335

Thr Asn Phe Asn Ser Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Glu

340 345 350

Ala Met Pro Gly Lys Val Phe Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Glu Phe

370 375 380

Asp Lys Glu Ser Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Ser Thr Ser

385 390 395 400

Pro Gln Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Ile Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Arg Gly Asn Thr Gly Lys Lys Leu Ile Gln Asp Ser Ile Asp Arg Ala

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Ile Arg Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Glu Ser Glu Ser Asp Ser

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Glu Asn Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

Trp Lys Leu Asp Pro Lys Asp Thr Trp His Gly Phe Lys Asp Ile Asp

465 470 475 480

Asp Asp His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Asn Glu Asn Ser Glu Met Ser Glu Thr Gly Ile Pro Ala Ser

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Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Ser

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Lys Ala Met Gln Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Gly Tyr

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Thr Val Lys Asn Phe Leu Pro Ser Leu Tyr Asn Glu

565 570 575

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Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

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Pro Leu Val Leu Pro Gly Glu Met Val Thr Thr Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Asp Phe Leu Glu Met Leu Cys Ala Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

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690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Asp

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<210> 2

<211> 711

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 赖氨酸脱羧酶 Ldc14

<400> 2

Met Lys Asp Ile Leu Phe Leu Cys Asn Pro Ser Pro Thr Phe Lys Arg

1 5 10 15

Ile Pro Leu Glu Glu Leu Tyr Ala Gln Leu Arg Asp Arg Gly Phe Asn

20 25 30

Ile Ile Glu Ser Thr Ser Val Asp Asp Leu Leu Asp Leu Val Arg Asn

35 40 45

Asn Ala Gln Leu Ala Gly Val Val Phe Asp Trp Asp Ser Tyr Ser Leu

50 55 60

Asp Leu Cys Lys His Ile Thr Ala Leu Asn Glu Met Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Thr His Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Gly Asp Leu

85 90 95

Arg Met Asn Ile Gln Phe Phe Glu Tyr Thr Leu Gly Gly Ala Ala Asp

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Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

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Val Ile Pro Ile Tyr Leu Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

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Trp Lys Leu Asp Pro Lys Glu Ser Trp His Gly Phe Lys Gly Ile Asp

465 470 475 480

Asp Asn His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Asn Pro Asp Gly Thr Met Ala Asp Asp Gly Ile Pro Ala Ala

500 505 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Ile Val Glu Lys Thr

515 520 525

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Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Tyr

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Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

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580 585 590

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<210> 3

<211> 2136

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 赖氨酸脱羧酶Ldc6编码序列

<400> 3

atgaatattt ttgctatcct aaaccactca ggtgttttct ttaaagaaga gccagttcgc 60

gaacttcatg cttctttaga aaaagcaggc tacaaagttg tttacccagt agacgcacaa 120

gatttgtata aaatggttga aatgaaccca cgtatttgtg gtgtgttatt tgactgggat 180

aaatactcat tagacttatg tactgaaatt aatgtcttga atgaaaaatt gcctttgtat 240

gcctttgcaa accaacattc aacgttagat atttcattaa cggatttacg tctaaatctt 300

catttcttcg aatatgcatt aggcatggcc gatgatatcg ctctgaaaat taatcaagcg 360

actgaagaat acatagatca aatcatgcct ccttttacta aggcactatt caaatatgta 420

gaagaaggta aatatacgtt ctgtactccg ggtcacatgg gcggtactgc tttccaaaaa 480

agtccagcag gcagcatctt ctatgatttc tacggtccaa acgcatttaa agcggatgtc 540

tcaatttcaa tgcctgaact aggttcattg cttgatcact ctggtcctca taaagaagca 600

gaagagtata ttgctcgcac gtttaatgca gacagctctt acatcgtaac gaacggtacg 660

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gaccgtaact gtcacaaatc tttgactcac atgatgatga tgagtgatgt aacccctatc 780

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actcgtgaag tgattgaagc aaaagtagca gcaacaccaa acgcaactat gcctggttat 900

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gaaacacaat caactcataa attattggct gcgttctctc aagcatcaat gatccacgtg 1140

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tacgaaggca tgcgcattca agaactggca caaggcattc acgatcttac tcgtcaatac 1800

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cctggtgaaa tggtaacaac agaatctcgt ccagtacttg atttcttaga gatgctatgt 2040

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<210> 4

<211> 2133

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 赖氨酸脱羧酶Ldc14编码序列

<400> 4

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ccgcactatg gcatcgtggc ctccatcgaa accgcggcgg cgatgatgaa gggtcacgcc 1260

ggtaaacgcc tgatcaatga ctctatcgcg cgagccatcc gcttccgtaa ggagatcaag 1320

cgcctgcgca gcgagtccga cggctggttc ttcgacgtct ggcagccgga caatattgac 1380

caggtcgcct gctggaagct ggatccgaaa gagtcctggc acggctttaa gggcatcgat 1440

gacaaccaca tgtaccttga cccgatcaag gtcaccctgc tgaccccggg gatgaacccg 1500

gacggcacga tggcggatga cggtatcccg gccgccatcg tggccaagta cctggacgag 1560

cacggcatca tcgtcgagaa gaccggcccg tacaacctgc tgttcctgtt cagcatcggc 1620

atcgacaaga ccaaggccct gagcctgctg cgcgcgctga ccgacttcaa gcgggcctat 1680

gacctgaacc tgcgcgtgaa gaacatgctg ccgtcgctgt accgcgaaga tccggagttc 1740

tatgagcaca tgcggatcca ggcgctggcc cagggcatcc acgcgctgat cctacaccat 1800

aacctgccgg atctgatgta ccgcgccttc gaggtgctac cgaccatggt gctgaacccg 1860

cacgacgcct tccaacagga gctgcgcggc caggccgaag aggtctacct cgacgagatg 1920

atcggcaagg tcaacgccaa catgatcctg ccgtacccgc cgggcgtgcc gctggtgatg 1980

ccgggcgaaa tgctgacgga ggagagccgg ccggtgctgg agtttctgca gatgctgtgc 2040

gaaatcggcg cccactatcc gggcttcgaa accgacatcc acggcgccta tcgtcaggcc 2100

gacgggcgct atacggtgaa agtgctcaag cag 2133

Claims

1.一种生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括以下步骤：

2)从1)的体系中获得1,5-戊二胺；

所述蛋白是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2中一所示的蛋白；或

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列经过1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列经过1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(b)所述的衍生蛋白是在SEQ ID NO:1-2中任一所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白是氨基酸序列如SEQ IDNO:1或SEQID NO:2所示的蛋白。

6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在pH5.0-8.5；优选地，在pH 6-8；更优选地，在pH 6.5-7.5下进行。

7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在30-60℃的温度范围内；优选在37-50℃的温度范围内；更优选在37℃进行。

8.以下蛋白、或包含编码以下蛋白的核苷酸序列的表达载体、或能够表达以下蛋白的宿主细胞的用途，用于生产1,5-戊二胺，所述蛋白为：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2中任一所示的蛋白；或

9.一种表达载体，所述表达载体包含编码以下蛋白的核苷酸序列：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2中任一所示的蛋白；或

10.一种宿主细胞，所述宿主细胞能够表达以下蛋白，所述蛋白是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2中任一所示的蛋白；或