CN106795485A

CN106795485A - 生产o‑磷酸丝氨酸的微生物和利用其生产o‑磷酸丝氨酸或l‑半胱氨酸的方法

Info

Publication number: CN106795485A
Application number: CN201580043665.3A
Authority: CN
Inventors: 金率; 柳寅和; 张真淑; 金蕙园
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2014-08-12
Filing date: 2015-08-10
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2035-08-10
Also published as: JP6570617B2; UA119985C2; KR101677328B1; KR20160020050A; CN106795485B; EP3181685B1; RU2663726C1; TWI654305B; TW201612319A; JP2017528126A; US20170260556A1; ES2753413T3; WO2016024771A1; US10323262B2; EP3181685A1; AR102049A1; JP6807976B2; EP3181685A4; JP2019150038A

Abstract

本发明涉及微生物，其中能够输出O‑磷酸丝氨酸(OPS)的多肽的活性被增强；以及利用该微生物生产O‑磷酸丝氨酸、半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的方法。

Description

生产O-磷酸丝氨酸的微生物和利用其生产O-磷酸丝氨酸或L- 半胱氨酸的方法

技术领域

本发明涉及能够生产O-磷酸丝氨酸的微生物，和利用该微生物生产O-磷酸丝氨酸、半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的方法。

背景技术

L-半胱氨酸，一种在所有活生物体中的硫代谢中起重要作用的氨基酸，不仅用于诸如毛发角蛋白、谷胱甘肽、生物素、甲硫氨酸及其它含硫代谢物的生物蛋白的合成，而且用作辅酶A的生物合成前体。

利用微生物生产L-半胱氨酸的已知方法包括：1)利用微生物将D,L-ATC生物转化为L-半胱氨酸的方法、2)利用大肠杆菌(E.coli)通过直接发酵来生产L-半胱氨酸的方法(EP0885962B；Wada M和Takagi H,Appl.Microbiol.Biochem.,73:48-54,2006)、和3)利用微生物通过发酵生产O-磷酸丝氨酸(下称“OPS”)并在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(下称“OPSS”)的催化作用下通过使OPS与硫化物反应而将OPS转化为L-半胱氨酸的方法(韩国专利号1381048)。

具体而言，为了通过方法3)以高产率生产半胱氨酸，应过量生产前体OPS。就此而言，发明人已做出大量努力以发现能够将OPS生产微生物中生成的O-磷酸丝氨酸从细胞中顺利地输出的适当输出因子。

公开内容

技术问题

在这些情况下，发明人发现了两种新型的生产OPS的多肽YhhS和MdtD，并证实可以通过激活这两种多肽而从OPS生产微生物中有效地输出OPS，从而完成本发明。

技术方案

因此，本发明的一个目的是提供生产OPS的微生物，其中能够输出OPS的多肽的活性相比于其内源活性被增强。

本发明的另一目的是提供用于生产OPS的方法，包括：在培养基中培养OPS生产微生物，并从OPS生产微生物或其培养物中分离OPS。

本发明的又一目的是提供通过该多肽的OPS生产或输出的用途。

本发明的又一目的是提供生产半胱氨酸或其衍生物的方法，包括：a)通过在培养基中培养OPS生产微生物(其中能够输出OPS的多肽的活性相比于其内源活性被增强)而生产OPS；和b)在OPS硫化氢解酶或能够表达其的微生物的存在下，使a)中生产的OPS或含有其的培养物与硫化物反应。

发明的有利效果

本发明的具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的新型多肽具有优越的OPS输出能力。因此，当将本发明的新型多肽应用于能够生产OPS的微生物时，其可以导致高产率的OPS生产，并且还可以有效地用于L-半胱氨酸的合成等。

附图描述

图1显示了示例在从YhhS和MdtD蛋白的功能被增强的本发明的重组微生物的培养物中去除所有输出的OPS后，通过高效液相色谱法(HPLC)得到的OPS胞内水平测量结果的图。

最佳方式

一方面，本发明提供了OPS生产微生物，其中具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列并且能够输出O-磷酸丝氨酸的多肽的活性相比于其内源活性被增强。

如本文所用，术语“O-磷酸丝氨酸”(下称“OPS”)是指丝氨酸和磷酸的酯，其是很多蛋白质的成分。具体而言，OPS是L-半胱氨酸的前体，并且可以在OPS硫化氢解酶(以下称为“OPSS”)的催化作用下通过与硫化物反应而转化成半胱氨酸(韩国专利号1381048)。因此，增加OPS生产是半胱氨酸生产中的重要因素，因此需要研发能够使胞内OPS从OPS生产菌株有效地分泌出来的转运体。

如本文所用，术语“具有输出O-磷酸丝氨酸的活性的多肽”是指具有将细胞中的OPS输出到细胞外的活性的膜蛋白，并且具体地可以是源自大肠杆菌的膜蛋白。在存在过量OPS的条件下，从消除了生长抑制的大肠杆菌中鉴定出两种膜蛋白。具体地，由此鉴定的具有OPS输出能力的膜蛋白是具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的YhhS MFS(主要促进子超家族(major facilitator superfamily))转运体和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的YegB MFS转运体。在本发明中，YegB MFS转运体可以与MdtD互换使用。该蛋白的OPS输出能力本发明首次验证之前是未知的。

此外，该多肽可以是由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列，并且可非限制地包括与上述序列具有至少70％、具体地至少80％、更具体地至少90％、还更具体地至少95％的序列同源性的膜蛋白，只要其具有与该多肽基本上相同或相当的OPS输出能力。此外，显而易见的是，其中部分序列被删除、修饰、取代或插入的多肽变体应被包括在本发明的范围内，只要其是具有这些同源性和OPS输出能力的氨基酸序列。

此外，呈现OPS输出能力的多肽的多核苷酸序列可包括编码由SEQ ID NO:1或SEQID NO:2表示的氨基酸的多核苷酸序列。此外，基于遗传密码简并、考虑到有机体表达多肽所优选的密码子，可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内对编码区进行各种修饰。多核苷酸序列可以是由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列，并且可包括与这些序列具有至少70％的序列同源性的核苷酸序列，但并不限于此。

如本文所用，术语“同源性”是指与给定多肽序列或多核苷酸序列的同一性的程度，并且可以以百分比表示。如本文所用，与给定多肽序列或多核苷酸序列具有相同或相似活性的同源序列可以以“％同源性”表示。％同源性可以利用用于计算参数如评分、同一性和相似性的标准软件(即BLAST2.0)或者通过经由southern杂交实验比较序列来确定，并且适当的限定杂交条件可以通过本领域技术人员已知的方法来确定(例如，Sambrook等人，1989，见下文)。

在本发明的示例性实施方式中，证实了在能够生产OPS的微生物中的YhhS蛋白(SEQ ID NO:1)或MdtD蛋白(SEQ ID NO:2)的活性增强时，该微生物显示具有比RhtB蛋白增强的菌株(韩国专利申请公开号10-2012-0041115)(阳性对照)、或MFS转运体EmrD或YcaD的活性增强的菌株(实验组)更优的OPS输出能力。“RhtB”是膜蛋白，由rhtB基因编码，其可以输出高丝氨酸/高丝氨酸内酯。由于已经证实OPS生产菌株中RhtB活性的增强使该菌株中的OPS输出能力增加(韩国专利号138104)，因此将其用作阳性对照。当在OPS生产菌株中分别增强RhtB蛋白以及本发明的YhhS和MdtD蛋白的活性时，RhtB蛋白以及本发明的YhhS和MdtD蛋白呈现相对于RhtB蛋白优越的OPS输出能力。此外，术语“EmrD”和“YcaD”是指大肠杆菌的MFS转运蛋白，并且分别由emrD基因和ycaD基因编码。EmrD和YcaD——如YhhS和MdtD蛋白是属于MFS转运体的蛋白——用作实验组，以检验其它属于MFS转运体的蛋白是否也可以呈现OPS输出能力。结果证实，与YhhS和MdtD蛋白不同，EmrD和YcaD蛋白不呈现OPS输出能力。

同时，本发明的多肽具有OPS输出能力，因而当具有OPS生产能力的微生物中该多肽的活性与其内源活性相比被增强时，可以有效地生产OPS。

如本文所用，术语“OPS生产”不仅指在菌株内的OPS生产，而且还指将细胞中的OPS至细胞外(例如，至培养基)的输出，和具体地，OPS从细胞内部向外部的输出。

如本文所用，术语“内源活性”是指天然状态下(即，在未经修饰的状态下)的微生物中的多肽的活性状态。

如本文所用，术语“相比于其内源活性增强”是指微生物中多肽与其天然状态下所具有的活性相比时活性增加，并且其是包括在不具有具体多肽活性的微生物中赋予具体多肽活性的概念。

如本文所用，术语“活性增强”不仅指由于多肽本身的活性增加而获取比原有功能更高的效果，而且指由于内源基因活性增加、内源基因通过内部或外部因素扩增、启动子的置换、修饰或突变等而导致的蛋白质活性增加(但不具体限制于此)。具体地，活性增强可以通过诸如下列的方法进行：增加细胞中编码多肽的基因的拷贝数的方法、对编码多肽的基因的调控序列进行修饰的方法、用突变基因取代染色体上编码多肽的基因以增加该多肽的活性的方法、在染色体上的编码多肽的基因中引入修饰以增强该多肽的活性的方法等，但并不限于此。可以以相同的方式参照这些活性增强方法来增强本发明的其它多肽的活性。

在上述中，基因拷贝数的增加，尽管不具体限制于此，可以在可操作地连接至载体的状态下或通过插入宿主细胞内的染色体中而进行。具体地，可以通过以下实施该方法：在宿主细胞中引入载体，通过该载体编码本发明的蛋白质的多核苷酸被可操作地连接至宿主细胞，并且可以复制并独立于宿主发挥作用；或者在宿主细胞中引入与多核苷酸可操作地连接、能够将该多核苷酸插入宿主细胞的染色体中的载体。多核苷酸在染色体中的插入可以利用本领域已知的方法进行，例如通过同源重组。由于本发明的载体可以通过同源重组插入染色体中，因此可以进一步包括用于确认在染色体中的插入的选择标记物(selectionmarker)。选择标记物用于选择转化的细胞，即，为了确认靶多核苷酸是否已被插入，并且可以使用能够提供可选表型(如耐药性、营养需求、细胞毒性试剂耐受性以及表面蛋白表达)的标记物，但并不限于此。在处理选择剂的情况下，只有能够表达选择标记物的细胞可以存活或表达其它表型性状，因而转化的细胞可以容易被选出。

载体可以是DNA构建体，其包含编码目标蛋白的多核苷酸的多核苷酸序列，可操作地连接至合适的调控序列，使得目标蛋白可以在合适的宿主中表达。调控序列包括能够启动转录的启动子、用于调控转录的无规操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合域的序列、和用于调控转录和翻译的序列。载体在被转化到合适的宿主细胞中后可以独立于宿主基因组复制或发挥作用，或者可被整合到宿主基因组本身中。

本发明中所使用的载体可不受具体限制——只要该载体在宿主细胞中是可复制的，且可以使用本领域已知的任何载体。载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等；并且作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。

如本文所用，术语“转化”是指将包含编码目标蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞，从而使该蛋白所编码的多核苷酸能够在宿主细胞中表达的过程。关于转化的多核苷酸，无论是被插入宿主细胞的染色体并且定位于其中还是定位于染色体外都没有关系，只要其可以在宿主细胞中表达。此外，多核苷酸包括编码目标蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式插入，只要其可以被引入宿主细胞并在其中表达。例如，可以以表达盒的形式将多核苷酸引入宿主细胞中，所述表达盒是包括自我表达所需的所有必需元素的基因构建体，但并不限于此。表达盒可常规地包括可操作地连接至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合域和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以被原样引入宿主细胞中，并可操作地连接至其在宿主细胞中表达所必需的序列。

此外，如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子序列(其启动和介导编码本发明目标蛋白的多核苷酸的转录)和上述基因序列之间的功能性连接。

然后，用于增加多核苷酸表达的表达调控序列的修饰，尽管不具体受限于此，可以通过下列进行：通过删除、插入、保守取代、非保守取代或其组合，在多核苷酸序列中诱导变异，以进一步增强表达调控序列的活性；或将多核苷酸序列用活性更强的多核苷酸序列替代。表达调控序列，尽管不具体受限于此，可包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合域的序列、和用于调控转录和翻译的终止的序列等。

强启动子，代替原有启动子，可以被连接至多核苷酸的表达单元的上端，但并不限于此。已知的强启动子的实例可包括cj1启动子(韩国专利号0620092)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子和tet启动子。

此外，染色体上多核苷酸序列的修饰，尽管不具体受限于此，可以通过下列进行：通过删除、插入、保守取代、非保守取代或其组合，在多核苷酸序列的表达调控序列上诱导变异，以进一步增强多核苷酸序列的活性；或将多核苷酸序列用活性更强的增强型多核苷酸序列替代。

总体上，蛋白质活性的引入和增强可以使相应蛋白质的活性或浓度相对于野生型蛋白质的活性或浓度或在微生物菌株中增加至少1％、10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％至最高1000％或2000％，但并不限于此。

如本文所用，术语“OPS生产微生物”是指其中能够生产OPS的原核或真核微生物菌株，并且具体地是指通过基因工程其中能够聚积OPS的微生物。

在本发明的示例性实施方式中，微生物并不受具体限制，但可以是SEQ ID NO:1或2的多肽的活性增强时可以生产OPS的任何原核或真核微生物，并且具体地是原核微生物。微生物的实例可包括属于埃希氏菌属(genus Escherichia)、欧文氏菌属(genusErwinia)、沙雷氏菌属(genus Serratia)、普罗威登斯菌属(genus Providencia)、棒状杆菌属(genus Corynebacterium)和短杆菌属(genus Brevibacterium)的微生物菌株。具体地，微生物可以是埃希氏菌属微生物。更具体地，其可以是大肠杆菌。具体地，埃希氏菌属或棒状杆菌属微生物可生产OPS和L-丝氨酸，因为其含有SerA、SerC和SerB蛋白——这些是L-丝氨酸的生物合成途径中的酶(Ahmed Zahoor,Computational and StructuralBiotechnology Journal,vol.3,2012年10月；Wendisch VF等,Curr Opin Microbiol.2006年6月；9(3):268-74；Peters-Wendisch P等,Appl Environ Microbiol.2005年11月；71(11):7139-44)。

此外，在OPS生产微生物中，磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)的活性可以相比于其内源活性被进一步减弱。

SerB具有将OPS转化为L-丝氨酸的活性，因而经修饰以降低SerB活性的微生物具有在其中聚积OPS的性质，因此可用于生产OPS。SerB可以是具有由SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:18表示的氨基酸序列的蛋白质，但并不限于此。此外，SerB可包括具有80％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，甚至更具体地99％或更高的序列同一性的氨基酸序列——只要其显示出SerB活性，但并不限于此。此外，编码SerB的多核苷酸序列可具有编码由SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18表示的氨基酸的多核苷酸序列。

基于遗传密码简并、考虑到生物体表达多肽所优选的密码子，可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内对编码区域进行多核苷酸的各种修饰。多核苷酸序列可以是由SEQID NO:19或SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列，并且可包括与这些序列具有80％并且具体地至少90％的序列同源性的核苷酸序列，但并不限于此。

如本文所用，术语“相比于其内源活性减弱”是指蛋白质活性与其天然状态下所具有的活性相比时降低，并且还包括其活性被消除时。

减弱是指代以下情形的概念：蛋白质的活性由于蛋白质编码基因中的修饰等而相比于微生物原有蛋白质活性降低时的情形、整体蛋白质表达水平由于其编码基因的表达抑制或翻译抑制而低于微生物的天然菌株的水平时的情形、或基因完全不表达时的情形、和基因表达但不呈现活性时的情形。

蛋白质活性的减弱或失活可以通过本领域公知的各种方法实现。方法的实例可包括利用突变基因取代染色体上编码蛋白质的基因以使酶活性可以降低的方法(包括消除蛋白质活性时的情形)；对编码蛋白质的基因的表达调控序列进行修饰的方法；将染色体上编码蛋白质的基因的部分或全部删除的方法；引入反义寡核苷酸(如反义RNA)的方法，该反义寡核苷酸通过与染色体上的基因的转录子互补结合来抑制mRNA向蛋白质的翻译；使核糖体不能附接的方法——通过将Shine-Dalgarno(SD)序列及其互补序列人工添加在编码蛋白质的基因的SD序列的前端而形成二级结构；逆转录工程(RTE)方法——添加启动子从而在相应序列的开放阅读框(ORF)的3’端进行逆转录，等等，并且还包括其组合，但并不限于此。

具体地，将编码蛋白质的基因的部分或全部删除的方法可以通过如下进行：利用将染色体插入细菌的载体，用具有部分地删除的核酸序列的多核苷酸或标记基因替代染色体内编码内源目标蛋白的多核苷酸。在示例性实施方式中，可以通过同源重组来删除基因。此外，如本文所用，术语“部分”，虽然其可以根据多核苷酸种类而相异，可以具体指代1个核苷酸至300个核苷酸，更具体地1个核苷酸至100个核苷酸，甚至更具体地1个核苷酸至50个核苷酸，但并不限于此。

此外，对表达调控序列进行修饰的方法可以通过如下进行：经由删除、插入、保守取代、非保守取代或其组合，在表达调控序列中诱导变异，从而进一步减弱表达调控序列的活性；或将序列用活性较弱的核酸序列替代。表达调控序列包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合域的序列和用于调控转录和翻译的序列。

此外，对基因序列进行修饰的方法可以通过如下进行：经由删除、插入、保守取代、非保守取代或其组合，在基因序列中诱导变异，从而进一步减弱蛋白质的活性；或将序列用改良后具有较弱活性的基因序列或改良后完全不具有活性的基因序列替代。

此外，OPS生产微生物可以是其中磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)或磷酸丝氨酸转氨酶(SerC)的活性相比于其内源活性进一步增强的微生物。

SerA是能够将3-磷酸甘油酸转化为3-磷酸-羟基丙酮酸的蛋白质，并且关于SerA，可以使用野生型、或丝氨酸反馈被消除的变体。此外，SerC是能够将3-磷酸-羟基丙酮酸转化为OPS的蛋白质。因此，SerA和/或SerC活性增强的任何微生物都可以有效地用作OPS生产微生物。

SerA可具有选自SEQ ID NO:21至26的氨基酸序列，但并不限于此。SEQ ID NO:21是野生型SerA的序列，而SEQ ID NO:22至26是丝氨酸反馈被消除的变体的序列。此外，可以包括与上述氨基酸具有至少80％，具体地至少90％，更具体地至少95％，甚至更具体地至少99％的序列同一性的那些氨基酸序列，只要其呈现野生型SerA或丝氨酸反馈被消除的SerA变体的活性，但并不限于此。反馈被消除的变体是这样的蛋白质：其中通过插入、取代等，将修饰引入SerA编码基因上，从而能够维持通过丝氨酸或甘氨酸的反馈抑制而带来的活性，或增强其活性，并且反馈被消除的那些变体已经公知(Grant GA等,J.Biol.Chem.,39:5357-5361,1999；Grant GA等,Biochem.,39:7316-7319,2000；Grant GA等,J.Biol.Chem.,276:17844-17850,2001；Peters-Wendisch P等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,60:437-441,2002；欧洲专利号EP0943687B)。

此外，编码野生型SerA或丝氨酸反馈被消除的变体的多核苷酸序列可以是编码由SEQ ID NO:21至26表示的任一氨基酸序列的多核苷酸序列，但并不限于此。由于遗传密码简并或考虑到生物体表达多肽所优选的密码子，可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内对编码区进行多核苷酸的各种修饰。例如，多核苷酸序列可以是由SEQ ID NO:27至32表示的多核苷酸序列中的任一个，并且可具有与该多核苷酸序列具有至少80％，具体地至少90％的同源性的核苷酸序列，但并不限于此。

SerC可以是具有例如由SEQ ID NO:33表示的氨基酸序列的蛋白质，但并不限于此。此外，氨基酸序列，只要其呈现SerC活性，也可包括与上述氨基酸序列具有至少80％，具体地至少90％，更具体地至少95％，甚至更具体地至少99％的序列同一性的氨基酸序列，但并不限于此。

此外，编码SerC的多核苷酸序列可以是编码由SEQ ID NO:33表示的氨基酸的多核苷酸序列。由于遗传密码简并或考虑到生物体表达多肽所优选的密码子，可以在不改变多肽的氨基酸序列的范围内对编码区进行多核苷酸的各种修饰。例如，多核苷酸序列可以是由SEQ ID NO:34表示的多核苷酸序列，并且可具有与该多核苷酸序列具有至少80％，具体地至少90％的同源性的核苷酸序列，但并不限于此。

此外，微生物可以是其中将OPS引入或分解到细胞中的能力被进一步减弱的微生物。

关于OPS生产微生物的内容，除了上述那些之外，韩国专利号1381048或美国专利申请公开号2012-0190081中的公开内容也可以用作本发明的参考。

另一方面，本发明提供生产OPS的方法，包括在培养基中培养能够生产O-磷酸丝氨酸的微生物——其中具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列并且能够输出O-磷酸丝氨酸的多肽的活性被增强；和从能够生产O-磷酸丝氨酸的微生物或其培养基中分离O-磷酸丝氨酸。

如本文所用，术语“培养”是指使微生物在适当调节的环境中生长。培养过程可以根据适当的培养基和本领域已知的培养条件来进行。培养过程可以容易被本领域普通技术人员根据所要选择的菌株调整使用。具体地，培养可以是分批培养、连续培养和补料分批培养(fetch culture)，但并不限于此。

在培养SerB活性相比于其内源活性降低的重组微生物时，培养基可以进一步含有甘氨酸或丝氨酸，因为重组微生物的丝氨酸需求被诱导。甘氨酸可以以纯化的甘氨酸、含甘氨酸的酵母提取物或胰蛋白胨的形式提供。培养基中的甘氨酸浓度总体上为0.1g/L至10g/L，具体为0.5g/L至3g/L。此外，丝氨酸可以以纯化的丝氨酸、含丝氨酸的酵母提取物或胰蛋白胨的形式提供。培养基中的丝氨酸浓度总体上为0.1g/L至5g/L，具体为0.1g/L至1g/L。

培养基中包含的碳源的实例可包括碳水化合物和糖类，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，如大豆油、葵花油，蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，如甘油和乙醇；和有机酸，如乙酸。这些碳源可以单独使用或组合使用，但并不限于此。培养基中包含的氮源的实例可包括有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆(CSL)和豆粉；和无机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独使用或组合使用，但并不限于此。作为磷源，培养基可进一步包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐，但并不限于此。培养基可包括金属，如硫酸镁和硫酸铁。此外，可包括氨基酸、维生素和适当的前体。这些培养基或前体可以被添加至以分批培养或连续培养的形式的培养中，但并不限于此。

此外，培养物的pH可以通过以适当的方式在培养期间添加诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸的化合物来调节。此外，可以利用诸如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂来防止培养期间气泡形成。此外，可以向培养物中添加氧气或含有氧气的气体以维持培养液中的有氧条件；可不添加空气以维持厌氧条件或微氧条件；或者可以注入氮气、氢气或二氧化碳。培养温度可以为27℃至37℃，具体地30℃至35℃。可以持续进行培养直至可实现期望物质的生产，具体为10小时至100小时。

在本发明中，可以进一步分离和纯化培养期间生产的OPS。根据培养方法，如分批培养、连续培养和补料分批培养，可以利用本领域已知的适当方法从培养物中回收目标OPS，但并不限于此。

另一方面，本发明提供了通过具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽得到的OPS生产和OPS输出的用途。

又一方面，本发明提供了生产半胱氨酸或其衍生物的方法，包括a)通过在培养基中培养微生物来生产O-磷酸丝氨酸(OPS)，该微生物中具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列并且能够输出O-磷酸丝氨酸的多肽的活性相比于其内源活性被增强；和b)在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或能够表达其的微生物的存在下，使a)中生成的O-磷酸丝氨酸(OPS)或含有其的培养物与硫化物反应。

如本文所用，术语“O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶”(下称“OPSS”)是指催化其中向OPS提供巯基(SH)以使OPS转化为半胱氨酸的反应的多肽。此酶在Aeropyrum pernix、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatics)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)中被首先发现(Mino K和Ishikawa K,FEBS Letters,551:133-138,2003；Burns KE等,J.Am.Chem.Soc.,127:11602-11603,2005)。此外，OPSS的范围不仅包括野生型OPSS蛋白，而且包括在编码OPSS的多核苷酸序列部分中包括删除、取代或添加，显示等于或高于野生型OPSS蛋白生物活性的活性的变体，例如，包括韩国专利号1381048和1208267中公开的OPSS蛋白及其变体。

本发明中所使用的硫化物可以是任何硫化物——不仅有以本领域常用的固体形式提供的硫化物，而且有因pH、压力和溶解度差异而以液体或气体形式提供的硫化物，因而可以以例如硫化物(S^2-)或硫代硫酸盐(S₂O₃ ^2-)的形式转化为巯基(SH)。具体地，本发明中所使用的硫化物可以是Na₂S、NaSH、H₂S、(NH₄)₂S或Na₂S₂O₃，其可以为OPS提供巯基。在反应中，一个巯基被供应至一个反应性OPS基团以产生一个半胱氨酸或其衍生物。在反应中，具体地，硫化物的添加量为0.1mol至3mol，具体地1mol至2mol——每1mol OPS。

此外，本发明的方法进一步包括将步骤b)的反应中生成的半胱氨酸分离和纯化。在此，可以通过本领域已知的适当反应从反应溶液中分离和纯化半胱氨酸来回收期望的半胱氨酸。

此外，本发明涉及通过增强OPS生产微生物中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽的活性而实现的高产率OPS生产，然后使由此生产的OPS与OPSS反应，从而有效地生产半胱氨酸。由此制备的半胱氨酸可以通过本领域已知的化学合成反应来合成各种半胱氨酸衍生物——通过修饰氢原子或具体的原子基团。

如本文所用，术语“衍生物”是指通过化学修饰任何化合物的一部分而获得的类似化合物。通常，该术语是指其中氢原子或原子基团被另一氢原子或原子基团取代的化合物。

如本文所用，术语“半胱氨酸衍生物”是指其中半胱氨酸的氢原子或原子基团被另一个原子或原子基团取代的化合物。例如，半胱氨酸衍生物可具有如下形式：其中半胱氨酸中的胺基(-NH₂)的氮原子或巯基(-SH)的硫原子附接有另一原子或原子基团。半胱氨酸衍生物的实例包括N-乙酰基半胱氨酸(NAC)、S-羧甲基半胱氨酸(SCMC)、Boc-Cys(Me)-OH、(R)-S-(2-氨基-2-羧乙基)-L-高半胱氨酸、(R)-2-氨基-3-磺基丙酸、D-2-氨基-4-(乙基硫)丁酸、3-亚磺基-L-丙氨酸、Fmoc-Cys(Boc-甲基)-OH、硒-L-半胱氨酸、S-(2-噻唑基)-L-半胱氨酸、S-(2-噻吩基)-L-半胱氨酸、S-(4-甲苯基)-L-半胱氨酸，但并不限于此。半胱氨酸通过与乙酰化试剂反应可容易合成N-乙酰基半胱氨酸(NAC)，并且在碱性条件下，其可通过与卤代乙酸反应合成S-羧甲基半胱氨酸(SCMC)。这些半胱氨酸衍生物主要用作镇咳剂、止咳剂和支气管炎、支气管哮喘、喉咽炎治疗剂等的药用材料。

发明方式

下文将参考以下实施例对本发明进行更详细地描述。然而，这些实施例仅以示例为目的，并不意图本发明受限于这些实施例。

实施例1：YhhS MFS转运体和YegB MFS转运体的鉴定

为了鉴定OPS输出涉及的大肠杆菌膜蛋白，对大肠杆菌K12_W3110(ATCC27325)的基因组DNA文库进行筛选。

具体地，为建立OPS抑制大肠杆菌生长的条件，构建了生产OPS的平台菌株(platform strain)。用于筛选的平台菌株是经修饰降低野生型大肠杆菌菌株W3110的内源磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)的活性的重组微生物，并被命名为“KCCM11212P”(也称为“CA07-0012”；韩国专利号10-1381048；美国专利申请公开号2012-0190081)。利用该OPS生产菌株KCCM11212P，通过在含有OPS的培养基中培养作为OPS生产菌株的KCCM11212P，建立显示出生长抑制的最佳筛选条件。

然后，通过电穿孔(van der Rest等.1999)将W3110的基因组文库质粒转化到CA07-0012中，并选择在含有过量OPS的培养基条件下显示出生长抑制消除的菌落。从选择的菌落获得质粒，并通过测序技术分析其核苷酸序列。结果是，鉴定出在含有过量OPS的培养基条件下消除生长抑制所涉及的两种大肠杆菌膜蛋白。

这两种大肠杆菌膜蛋白被鉴定为yhhS和mdtD，其分别编码YhhS主要促进子超家族(MFS)转运体(SEQ ID NO:1的氨基酸序列和SEQ ID NO:3的核苷酸序列)和YegB MFS转运体(SEQ ID NO:2的氨基酸序列和SEQ ID NO:4的核苷酸序列)(Pao SS,Paulsen IT,Saier MH(1998).“Major facilitator superfamily.”Microbiol Mol Biol Rev 1998；62(1)；1-34.PMID:9529885)。

实施例2：yhhS-和mdtD-过表达载体的构建

为了检验当YhhS MFS转运体和YegB MFS转运体(其在消除OPS造成的生长抑制中被涉及)在OPS生产菌株中被增强时OPS输出能力是否增强，构建了过表达各基因的载体。此外，由于发明人已经证实当高丝氨酸/高丝氨酸内酯转运体RhtB在OPS生产菌株中被增强时OPS的浓度会增加(韩国专利号138104)，因此将RhtB增强型菌株作为阳性对照。此外，还评价了多药物排出物(multidrug efflux)转运体EmrD和YcaD MFS，其属于MacB所属的主要促进子超家族(MFS)。以与YhhS和MdtD中相同的方式，对多药物排出物转运体EmrD和YcaD MFS转运体(其是属于主要促进子超家族(MFS)的大肠杆菌膜蛋白)也进行了评价。在此实施例中，利用W3110的基因组DNA作为模板，通过PCR获得了编码YhhS MFS转运体的基因yhhS(SEQID NO:3，登录号：b3473)的片段和编码YegB MFS转运体的基因mdtD(SEQ ID NO:4，登录号：b2077)的片段。

用于构建各膜蛋白基因的过表达载体的引物序列显示在下表1中。

[表1]

具体地，使用SEQ ID NO:5和6的引物进行yhhS的PCR反应，并使用SEQ ID NO:7和8的引物进行mdtD的PCR反应。基于保藏于NIH GenBank的K12W3110基因(GenBank登录号AP00347)和周围核苷酸序列的信息构建PCR反应中所使用的引物。

此外，使用下表1所示的各引物对，通过PCT反应扩增rhtB、emrD和ycaD基因的片段。

将各扩增基因片段用限制酶EcoRV和HindIII进行处理，并克隆到pCL-PrhtB载体的EcoRV和HindIII限制酶位点——该pCL-PrhtB载体包括插入到pCL1920载体(GenBank编号AB236930)中的大肠杆菌rhtB基因的启动子(PrhtB)，从而分别构建出pCL-PrhtB-rhtB、pCL-PrhtB-yhhS、pCL-PrhtB-mdtD、pCL-PrhtB-emrD和pCL-PrhtB-ycaD。

实施例3：构建YhhS MFS转运体和YegB MFS转运体增强的菌株和评价OPS生产能力

<实施例3-1：利用CA07-0012构建YhhS MFS转运体和YegB MFS转运体增强的菌株和评价OPS生产能力>

将实施例2中构建的5种质粒中的每一种引入OPS生产菌株CA07-0012中，然后对所得菌株的OPS生产能力进行评价。

具体地，将每种菌株铺平在LB固体培养基上，并在培养箱中于33℃培养过夜。将在LB固体培养基上培养过夜的每种菌株接种到下表2所示的25mL效价培养基(titer medium)中，然后在培养箱中于34.5℃和200rpm培育40小时。结果显示在表3中。

[表2]

组成	浓度(每1L)
		葡萄糖	50g
KH₂PO₄	6g
		(NH₄)₂SO₄	17g
MgSO₄·7H₂O	1g
		FeSO₄·7H₂O	5mg
MnSO₄·4H₂O	10mg
		L-甘氨酸	2.5g
酵母提取物	3g
		碳酸钙	30g
pH	6.8

[表3]

如上表3所示，在大肠杆菌膜蛋白基因分别被进一步引入大肠杆菌CA07-0012菌株的情况之中，具有增强的rhtB、emrD或ycaD的菌株相比于CA07-0012菌株显示OPS生产显著增加，并且具体地，具有增强的YhhS和MdtD的菌株显示OPS浓度至少150％的增加。相反，用作实验组的具有增强的EmrD和YcaD的菌株未显示出任何OPS浓度增加。

称为“CA07-0012/pCL-PrhtB-yhhS”的菌株被命名为“大肠杆菌CA07-0266(CA07-0266)”，并于2013年12月9日被保藏于根据布达佩斯条约认定为国际保藏机构的韩国微生物培养中心(Korean Culture Center of Microorganisms)，登录号为KCCM11495P。

此外，称为“CA07-0012/pCL-PrhtB-mdtD”的菌株被命名为“大肠杆菌CA07-0267(CA07-0267)”，并于2013年12月9日被保藏于根据布达佩斯条约认定为国际保藏机构的韩国微生物培养中心，登录号为KCCM11496P。

<实施例3-2：利用SerA和SerC增强的菌株构建YhhS MFS转运体和YegB MFS转运体增强的菌株和评价OPS生产能力>

此外，利用OPS生产菌株，CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC(韩国专利申请公开号10-2012-004111)，检验大肠杆菌膜蛋白基因的效果，该菌株中作为OPS生物合成途径的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)和3-磷酸丝氨酸转氨酶(SerC)的活性被增强。结果显示在下表4中。

[表4]

如上述表4所示，再次确认了在大肠杆菌膜蛋白基因被进一步引CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC菌株的菌株中，本发明的具有增强的YhhS和MdtD的菌株和具有增强的RhtB的菌株(阳性对照)相比于源自大肠杆菌的CA07-0012菌株显示出OPS生产增加。具体地，本发明的具有增强的YhhS和MdtD的菌株显示出OPS浓度至少145％的增加，类似于上述表3所示的结果。相反，具有增强的ErmD和YcaD的菌株相对于对照组显示出OPS浓度降低。

<实施例3-3：根据启动子强度构建YhhS MFS转运体和YegB MFS转运体增强的菌株和评价OPS生产能力>

此外，为了检验启动子强度的增强是否可以增加输出能力，将具有OPS浓度增加的膜蛋白YhhS和MdtD与对照组进行比较——通过利用trc启动子(Ptrc)(一种比rhtB启动子(PrhtB)更强的启动子)进一步将yhhS和mdtD基因引入CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC中。

将yhhS和mdtD基因的片段中的每一个用限制酶EcoRV和HindIII处理，并克隆到pCL-Ptrc-GFP载体的EcoRV和HindIII限制酶位点——该pCL-Ptrc-GFP载体包括插入到pCL1920载体中的trc启动子，从而分别构建pCL-Ptrc-yhhS和pCL-Ptrc-mdtD。然后，利用各质粒作为模板连同SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的引物对进行PCR反应，并将所得物用HindIII处理，然后克隆到pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC的HindIII限制位点。

[表5]

结果是，如上表5所示，当通过增强启动子来增加大肠杆菌膜蛋白的表达时，产量相比于对照组有至少150％的增加，并且相比于使用rhtB启动子时有至少120％的增加。

<实施例3-4：根据染色体上的启动子强度构建YhhS MFS转运体和YegB MFS转运体增强的菌株和评价OPS生产能力>

此外，为了检验在染色体上利用更强的启动子替代yhhS和mdtD基因的启动子是否可以增强输出能力，通过构建其中cj1启动子(韩国专利号0620092)替代自身启动子的菌株来评价OPS生产能力。cj1启动子在大肠杆菌染色体中的引入通过下述常规方法进行。关于染色体上yhhS和mdtD自身启动子的替代，将构建的重组载体转化到OPS生产菌株CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC(韩国专利号138104)中，并通过同源重组置换载体上的上述启动子序列和自身启动子序列，从而将cj1启动子序列插入到染色体中。

将各菌株铺平在LB固体培养基上，并在培养箱中于33℃培养过夜。将在LB固体培养基上培养过夜的各菌株接种到上表2所示的25mL效价培养基中，然后在培养箱中于34.5℃和200rpm下培育40小时。结果显示在下表6中。

[表6]

如上表6所示，当染色体上各膜蛋白的表达增加时，产量相对于对照组增加上至130％。

实施例4：确认YhhS MFS转运体和YegB MFS转运体的OPS输出功能

在实施例3中确认OPS生产的烧瓶样品之中，在利用CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC(膜蛋白未增强的阴性对照)和样品CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC-Ptrc-yhhS和CA07-0022/pCL-Prmf-SerA*(G336V)-(RBS)SerC-Ptrc-mdtD(其中膜蛋白YhhS和MdtD被增强)去除培养基中输出的全部OPS后，仅收集细胞，并将细胞破碎。通过高效液相色谱法(HPLC)测量细胞内的OPS浓度，结果显示在图1中。

结果是，如图1所示，本发明的具有增强的YhhS和MdtD的菌株相比于对照组显示出胞内OPS浓度降低30％至40％，从而确认Yhhs和MdtD蛋白在输出OPS至细胞外中具有重要作用。因此，确认Yhhs和MdtD蛋白的增强可顺利地将细胞中的OPS输出到外部，从而提高OPS产生能力。

根据前述，本发明所属领域技术人员将能够理解，在不改变本发明的技术思路或本质特征的情况下，本发明可以以其它具体形式实施。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅以示例为目的，并且不应被解释为限制本发明的范围。相反，本发明旨在不仅包括示例性实施方式，而且包括可被包括在根据所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的各种替代形式、改动、等同形式和其它实施方式。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 生产O-磷酸丝氨酸的微生物和利用其生产O-磷酸丝氨酸或L-半胱氨酸的方法

<130> OPA15193

<150> KR 10-2014-0104670

<151> 2014-08-12

<160> 34

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 405

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(405)

<223> YhhS MFS转运体, YhhS

<400> 1

Met Pro Glu Pro Val Ala Glu Pro Ala Leu Asn Gly Leu Arg Leu Asn

1 5 10 15

Leu Arg Ile Val Ser Ile Val Met Phe Asn Phe Ala Ser Tyr Leu Thr

20 25 30

Ile Gly Leu Pro Leu Ala Val Leu Pro Gly Tyr Val His Asp Val Met

35 40 45

Gly Phe Ser Ala Phe Trp Ala Gly Leu Val Ile Ser Leu Gln Tyr Phe

50 55 60

Ala Thr Leu Leu Ser Arg Pro His Ala Gly Arg Tyr Ala Asp Ser Leu

65 70 75 80

Gly Pro Lys Lys Ile Val Val Phe Gly Leu Cys Gly Cys Phe Leu Ser

85 90 95

Gly Leu Gly Tyr Leu Thr Ala Gly Leu Thr Ala Ser Leu Pro Val Ile

100 105 110

Ser Leu Leu Leu Leu Cys Leu Gly Arg Val Ile Leu Gly Ile Gly Gln

115 120 125

Ser Phe Ala Gly Thr Gly Ser Thr Leu Trp Gly Val Gly Val Val Gly

130 135 140

Ser Leu His Ile Gly Arg Val Ile Ser Trp Asn Gly Ile Val Thr Tyr

145 150 155 160

Gly Ala Met Ala Met Gly Ala Pro Leu Gly Val Val Phe Tyr His Trp

165 170 175

Gly Gly Leu Gln Ala Leu Ala Leu Ile Ile Met Gly Val Ala Leu Val

180 185 190

Ala Ile Leu Leu Ala Ile Pro Arg Pro Thr Val Lys Ala Ser Lys Gly

195 200 205

Lys Pro Leu Pro Phe Arg Ala Val Leu Gly Arg Val Trp Leu Tyr Gly

210 215 220

Met Ala Leu Ala Leu Ala Ser Ala Gly Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe

225 230 235 240

Ile Thr Leu Phe Tyr Asp Ala Lys Gly Trp Asp Gly Ala Ala Phe Ala

245 250 255

Leu Thr Leu Phe Ser Cys Ala Phe Val Gly Thr Arg Leu Leu Phe Pro

260 265 270

Asn Gly Ile Asn Arg Ile Gly Gly Leu Asn Val Ala Met Ile Cys Phe

275 280 285

Ser Val Glu Ile Ile Gly Leu Leu Leu Val Gly Val Ala Thr Met Pro

290 295 300

Trp Met Ala Lys Ile Gly Val Leu Leu Ala Gly Ala Gly Phe Ser Leu

305 310 315 320

Val Phe Pro Ala Leu Gly Val Val Ala Val Lys Ala Val Pro Gln Gln

325 330 335

Asn Gln Gly Ala Ala Leu Ala Thr Tyr Thr Val Phe Met Asp Leu Ser

340 345 350

Leu Gly Val Thr Gly Pro Leu Ala Gly Leu Val Met Ser Trp Ala Gly

355 360 365

Val Pro Val Ile Tyr Leu Ala Ala Ala Gly Leu Val Ala Ile Ala Leu

370 375 380

Leu Leu Thr Trp Arg Leu Lys Lys Arg Pro Pro Glu His Val Pro Glu

385 390 395 400

Ala Ala Ser Ser Ser

405

<210> 2

<211> 471

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(471)

<223> YegB MFS转运体, MdtD

<400> 2

Met Thr Asp Leu Pro Asp Ser Thr Arg Trp Gln Leu Trp Ile Val Ala

1 5 10 15

Phe Gly Phe Phe Met Gln Ser Leu Asp Thr Thr Ile Val Asn Thr Ala

20 25 30

Leu Pro Ser Met Ala Gln Ser Leu Gly Glu Ser Pro Leu His Met His

35 40 45

Met Val Ile Val Ser Tyr Val Leu Thr Val Ala Val Met Leu Pro Ala

50 55 60

Ser Gly Trp Leu Ala Asp Lys Val Gly Val Arg Asn Ile Phe Phe Thr

65 70 75 80

Ala Ile Val Leu Phe Thr Leu Gly Ser Leu Phe Cys Ala Leu Ser Gly

85 90 95

Thr Leu Asn Glu Leu Leu Leu Ala Arg Ala Leu Gln Gly Val Gly Gly

100 105 110

Ala Met Met Val Pro Val Gly Arg Leu Thr Val Met Lys Ile Val Pro

115 120 125

Arg Glu Gln Tyr Met Ala Ala Met Thr Phe Val Thr Leu Pro Gly Gln

130 135 140

Val Gly Pro Leu Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Leu Leu Val Glu Tyr

145 150 155 160

Ala Ser Trp His Trp Ile Phe Leu Ile Asn Ile Pro Val Gly Ile Ile

165 170 175

Gly Ala Ile Ala Thr Leu Leu Leu Met Pro Asn Tyr Thr Met Gln Thr

180 185 190

Arg Arg Phe Asp Leu Ser Gly Phe Leu Leu Leu Ala Val Gly Met Ala

195 200 205

Val Leu Thr Leu Ala Leu Asp Gly Ser Lys Gly Thr Gly Leu Ser Pro

210 215 220

Leu Thr Ile Ala Gly Leu Val Ala Val Gly Val Val Ala Leu Val Leu

225 230 235 240

Tyr Leu Leu His Ala Arg Asn Asn Asn Arg Ala Leu Phe Ser Leu Lys

245 250 255

Leu Phe Arg Thr Arg Thr Phe Ser Leu Gly Leu Ala Gly Ser Phe Ala

260 265 270

Gly Arg Ile Gly Ser Gly Met Leu Pro Phe Met Thr Pro Val Phe Leu

275 280 285

Gln Ile Gly Leu Gly Phe Ser Pro Phe His Ala Gly Leu Met Met Ile

290 295 300

Pro Met Val Leu Gly Ser Met Gly Met Lys Arg Ile Val Val Gln Val

305 310 315 320

Val Asn Arg Phe Gly Tyr Arg Arg Val Leu Val Ala Thr Thr Leu Gly

325 330 335

Leu Ser Leu Val Thr Leu Leu Phe Met Thr Thr Ala Leu Leu Gly Trp

340 345 350

Tyr Tyr Val Leu Pro Phe Val Leu Phe Leu Gln Gly Met Val Asn Ser

355 360 365

Thr Arg Phe Ser Ser Met Asn Thr Leu Thr Leu Lys Asp Leu Pro Asp

370 375 380

Asn Leu Ala Ser Ser Gly Asn Ser Leu Leu Ser Met Ile Met Gln Leu

385 390 395 400

Ser Met Ser Ile Gly Val Thr Ile Ala Gly Leu Leu Leu Gly Leu Phe

405 410 415

Gly Ser Gln His Val Ser Val Asp Ser Gly Thr Thr Gln Thr Val Phe

420 425 430

Met Tyr Thr Trp Leu Ser Met Ala Leu Ile Ile Ala Leu Pro Ala Phe

435 440 445

Ile Phe Ala Arg Val Pro Asn Asp Thr His Gln Asn Val Ala Ile Ser

450 455 460

Arg Arg Lys Arg Ser Ala Gln

465 470

<210> 3

<211> 1218

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1218)

<223> yhhS

<400> 3

atgcccgaac ccgtagccga acccgcgcta aacggattgc gcctgaattt gcgcattgtc 60

tctatagtca tgtttaactt cgccagctac ctcaccatcg ggttgccgct cgctgtatta 120

ccgggctatg tccatgatgt gatgggcttt agcgccttct gggcaggatt ggttatcagc 180

ctgcaatatt tcgccacctt gctgagccgc cctcatgccg gacgttacgc cgattcgctg 240

ggacccaaaa agattgtcgt cttcggttta tgcggctgct ttttgagcgg tctggggtat 300

ctgacggcag gattaaccgc cagtctgcct gtcatcagcc tgttattact ttgcctgggg 360

cgcgtcatcc ttgggattgg gcaaagtttt gccggaacgg gatcgaccct atggggcgtt 420

ggcgtggttg gctcgctgca tatcgggcgg gtgatttcgt ggaacggcat tgtcacttac 480

ggggcgatgg cgatgggtgc gccgttaggc gtcgtgtttt atcactgggg cggcttgcag 540

gcgttagcgt taatcattat gggcgtggcg ctggtggcca ttttgttggc gatcccgcgt 600

ccgacggtaa aagccagtaa aggcaaaccg ctgccgtttc gcgcggtgct tgggcgcgtc 660

tggctgtacg gtatggcgct ggcactggct tccgccggat ttggcgtcat cgccaccttt 720

atcacgctgt tttatgacgc taaaggttgg gacggtgcgg ctttcgcgct gacgctgttt 780

agctgtgcgt ttgtcggtac gcgtttgtta ttccctaacg gcattaaccg tatcggtggc 840

ttaaacgtag cgatgatttg ctttagcgtt gagataatcg gcctgctact ggttggcgtg 900

gcgactatgc cgtggatggc gaaaatcggc gtcttactgg cgggggccgg gttttcgctg 960

gtgttcccgg cattgggtgt agtggcggta aaagcggttc cgcagcaaaa tcagggggcg 1020

gcgctggcaa cttacaccgt atttatggat ttatcgcttg gcgtgactgg accactggct 1080

gggctggtga tgagctgggc gggcgtaccg gtgatttatc tggcggcggc gggactggtc 1140

gcaatcgcgt tattactgac gtggcgatta aaaaaacggc ctccggaaca cgtccctgag 1200

gccgcctcat catcttaa 1218

<210> 4

<211> 1416

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1416)

<223> mdtD

<400> 4

atgacagatc ttcccgacag cacccgttgg caattgtgga ttgtggcttt cggcttcttt 60

atgcagtcgc tggacaccac catcgtaaac accgcccttc cctcaatggc gcaaagcctc 120

ggggaaagtc cgttgcatat gcacatggtc attgtctctt atgtgctgac cgtggcggtg 180

atgctgcccg ccagcggctg gctggcggac aaagtcggcg tgcgcaatat tttctttacc 240

gccatcgtgc tgtttactct cggttcactg ttttgcgcgc tttccggcac gctgaacgaa 300

ctgttgctgg cacgcgcgtt acagggcgtt ggcggcgcga tgatggtgcc ggtcggcaga 360

ttgacggtga tgaaaatcgt accgcgcgag caatatatgg cggcgatgac ctttgtcacg 420

ttacccggtc aggtcggtcc gctgctcggt ccggcgctcg gcggtctgct ggtggagtac 480

gcatcgtggc actggatctt tttgatcaac attccggtgg ggattatcgg tgcgatcgcc 540

acattgctgt taatgccgaa ctacaccatg cagacgcggc gctttgatct ctccggattt 600

ttattgctgg cggttggcat ggcggtatta accctggcgc tggacggcag taaaggtaca 660

ggtttatcgc cgctgacgat tgcaggcctg gtcgcagttg gcgtggtggc actggtgctt 720

tatctgctgc acgccagaaa taacaaccgt gccctgttca gtctgaaact gttccgtact 780

cgtacctttt cgctgggcct ggcggggagc tttgccggac gtattggcag tggcatgttg 840

ccctttatga caccggtttt cctgcaaatt ggcctcggtt tctcgccgtt tcatgccgga 900

ctgatgatga tcccgatggt gcttggcagc atgggaatga agcgaattgt ggtacaggtg 960

gtgaatcgct ttggttatcg tcgggtactg gtagcgacca cgctgggtct gtcgctggtc 1020

accctgttgt ttatgactac cgccctgctg ggctggtact acgttttgcc gttcgtcctg 1080

tttttacaag ggatggtcaa ctcgacgcgt ttctcctcca tgaacaccct gacgctgaaa 1140

gatctcccgg acaatctggc gagcagcggc aacagcctgc tgtcgatgat tatgcaattg 1200

tcgatgagta tcggcgtcac tatcgccggg ctgttgctgg gactttttgg ttcacagcat 1260

gtcagcgtcg acagcggcac cacacaaacc gtctttatgt acacctggct tagcatggcg 1320

ttgatcatcg cccttccggc gttcatcttt gccagagtgc cgaacgatac gcatcaaaat 1380

gtagctattt cgcggcgaaa aaggagcgcg caatga 1416

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增yhhS以构建pCL-PrhtB-yhhS的引物

<400> 5

gatatcatgc ccgaacccgt agc 23

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增yhhS以构建pCL-PrhtB-yhhS的引物

<400> 6

aagcttttaa gatgatgagg cggcct 26

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增mdtD以构建pCL-PrhtB-mdtD的引物

<400> 7

gatatcatga cagatcttcc cgacagc 27

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增mdtD以构建pCL-PrhtB-mdtD的引物

<400> 8

aagctttcat tgcgcgctcc ttt 23

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增rhtB以构建pCL-PrhtB-rhtB的引物

<400> 9

gatatcatga ccttagaatg gtgg 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增rhtB以构建pCL-PrhtB-rhtB的引物

<400> 10

aagctttcac gcatgcctcg ccga 24

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增emrD以构建pCL-PrhtB-emrD的引物

<400> 11

gatatcatga aaaggcaaag aaacgtcaa 29

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增emrD以构建pCL-PrhtB-emrD的引物

<400> 12

aagcttttaa acgggctgcc cct 23

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增ycaD以构建pCL-PrhtB-ycaD的引物

<400> 13

gatatcatgt ccacgtatac ccagcctg 28

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增ycaD以构建pCL-PrhtB-ycaD的引物

<400> 14

aagcttttac acgtgagcaa cgggttt 27

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增pCL-PrhtB-基因以构建pCL-Prmf-serA(G336V)-serC_PrhtB-基因的引物

<400> 15

aagcttcggg cctcttcgct attacgc 27

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 16

aagcttaggc ttacccgtct tactgtc 27

<210> 17

<211> 446

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(446)

<223> 磷酸丝氨酸磷酸酶, SerB

<400> 17

Met Ser Cys Ser Ala Leu Arg His Glu Thr Ile Val Ala Val Thr Glu

1 5 10 15

Leu Ile Gln Asn Glu Ser Gln Glu Ile Ala Glu Leu Glu Ala Gly Gln

20 25 30

Gln Val Ala Leu Arg Glu Gly Tyr Leu Pro Ala Val Ile Thr Val Ser

35 40 45

Gly Lys Asp Arg Pro Gly Val Thr Ala Ala Phe Phe Arg Val Leu Ser

50 55 60

Ala Asn Gln Val Gln Val Leu Asp Val Glu Gln Ser Met Phe Arg Gly

65 70 75 80

Phe Leu Asn Leu Ala Ala Phe Val Gly Ile Ala Pro Glu Arg Val Glu

85 90 95

Thr Val Thr Thr Gly Leu Thr Asp Thr Leu Lys Val His Gly Gln Ser

100 105 110

Val Val Val Glu Leu Gln Glu Thr Val Gln Ser Ser Arg Pro Arg Ser

115 120 125

Ser His Val Val Val Val Leu Gly Asp Pro Val Asp Ala Leu Asp Ile

130 135 140

Ser Arg Ile Gly Gln Thr Leu Ala Asp Tyr Asp Ala Asn Ile Asp Thr

145 150 155 160

Ile Arg Gly Ile Ser Asp Tyr Pro Val Thr Gly Leu Glu Leu Lys Val

165 170 175

Thr Val Pro Asp Val Ser Pro Gly Gly Gly Glu Ala Met Arg Lys Ala

180 185 190

Leu Ala Ala Leu Thr Ser Glu Leu Asn Val Asp Ile Ala Ile Glu Arg

195 200 205

Ser Gly Leu Leu Arg Arg Ser Lys Arg Leu Val Cys Phe Asp Cys Asp

210 215 220

Ser Thr Leu Ile Thr Gly Glu Val Ile Glu Met Leu Ala Ala His Ala

225 230 235 240

Gly Lys Glu Ala Glu Val Ala Ala Val Thr Glu Arg Ala Met Arg Gly

245 250 255

Glu Leu Asp Phe Glu Glu Ser Leu Arg Glu Arg Val Lys Ala Leu Ala

260 265 270

Gly Leu Asp Ala Ser Val Ile Asp Glu Val Ala Ala Ala Ile Glu Leu

275 280 285

Thr Pro Gly Ala Arg Thr Thr Ile Arg Thr Leu Asn Arg Met Gly Tyr

290 295 300

Gln Thr Ala Val Val Ser Gly Gly Phe Ile Gln Val Leu Glu Gly Leu

305 310 315 320

Ala Glu Glu Leu Glu Leu Asp Tyr Val Arg Ala Asn Thr Leu Glu Ile

325 330 335

Val Asp Gly Lys Leu Thr Gly Asn Val Thr Gly Lys Ile Val Asp Arg

340 345 350

Ala Ala Lys Ala Glu Phe Leu Arg Glu Phe Ala Ala Asp Ser Gly Leu

355 360 365

Lys Met Tyr Gln Thr Val Ala Val Gly Asp Gly Ala Asn Asp Ile Asp

370 375 380

Met Leu Ser Ala Ala Gly Leu Gly Val Ala Phe Asn Ala Lys Pro Ala

385 390 395 400

Leu Lys Glu Ile Ala Asp Thr Ser Val Asn His Pro Phe Leu Asp Glu

405 410 415

Val Leu His Ile Met Gly Ile Ser Arg Asp Glu Ile Asp Leu Ala Asp

420 425 430

Gln Glu Asp Gly Thr Phe His Arg Val Pro Leu Thr Asn Ala

435 440 445

<210> 18

<211> 322

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(322)

<223> 磷酸丝氨酸磷酸酶, SerB

<400> 18

Met Pro Asn Ile Thr Trp Cys Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Leu Trp

1 5 10 15

Pro Gly Leu Pro Leu Ser Leu Ser Gly Asp Glu Val Met Pro Leu Asp

20 25 30

Tyr His Ala Gly Arg Ser Gly Trp Leu Leu Tyr Gly Arg Gly Leu Asp

35 40 45

Lys Gln Arg Leu Thr Gln Tyr Gln Ser Lys Leu Gly Ala Ala Met Val

50 55 60

Ile Val Ala Ala Trp Cys Val Glu Asp Tyr Gln Val Ile Arg Leu Ala

65 70 75 80

Gly Ser Leu Thr Ala Arg Ala Thr Arg Leu Ala His Glu Ala Gln Leu

85 90 95

Asp Val Ala Pro Leu Gly Lys Ile Pro His Leu Arg Thr Pro Gly Leu

100 105 110

Leu Val Met Asp Met Asp Ser Thr Ala Ile Gln Ile Glu Cys Ile Asp

115 120 125

Glu Ile Ala Lys Leu Ala Gly Thr Gly Glu Met Val Ala Glu Val Thr

130 135 140

Glu Arg Ala Met Arg Gly Glu Leu Asp Phe Thr Ala Ser Leu Arg Ser

145 150 155 160

Arg Val Ala Thr Leu Lys Gly Ala Asp Ala Asn Ile Leu Gln Gln Val

165 170 175

Arg Glu Asn Leu Pro Leu Met Pro Gly Leu Thr Gln Leu Val Leu Lys

180 185 190

Leu Glu Thr Leu Gly Trp Lys Val Ala Ile Ala Ser Gly Gly Phe Thr

195 200 205

Phe Phe Ala Glu Tyr Leu Arg Asp Lys Leu Arg Leu Thr Ala Val Val

210 215 220

Ala Asn Glu Leu Glu Ile Met Asp Gly Lys Phe Thr Gly Asn Val Ile

225 230 235 240

Gly Asp Ile Val Asp Ala Gln Tyr Lys Ala Lys Thr Leu Thr Arg Leu

245 250 255

Ala Gln Glu Tyr Glu Ile Pro Leu Ala Gln Thr Val Ala Ile Gly Asp

260 265 270

Gly Ala Asn Asp Leu Pro Met Ile Lys Ala Ala Gly Leu Gly Ile Ala

275 280 285

Tyr His Ala Lys Pro Lys Val Asn Glu Lys Ala Glu Val Thr Ile Arg

290 295 300

His Ala Asp Leu Met Gly Val Phe Cys Ile Leu Ser Gly Ser Leu Asn

305 310 315 320

Gln Lys

<210> 19

<211> 1341

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1341)

<223> 磷酸丝氨酸磷酸酶, SerB

<400> 19

atgtcgtgtt ccgcgctcag acatgagaca attgttgccg tgactgaact catccagaat 60

gaatcccaag aaatcgctga gctggaagcc ggccagcagg ttgcattgcg tgaaggttat 120

cttcctgcgg tgatcacagt gagcggtaaa gaccgcccag gtgtgactgc cgcgttcttt 180

agggtcttgt ccgctaatca ggttcaggtc ttggacgttg agcagtcaat gttccgtggc 240

tttttgaact tggcggcgtt tgtgggtatc gcacctgagc gtgtcgagac cgtcaccaca 300

ggcctgactg acaccctcaa ggtgcatgga cagtccgtgg tggtggagct gcaggaaact 360

gtgcagtcgt cccgtcctcg ttcttcccat gttgttgtgg tgttgggtga tccggttgat 420

gcgttggata tttcccgcat tggtcagacc ctggcggatt acgatgccaa cattgacacc 480

attcgtggta tttcggatta ccctgtgacc ggcctggagc tgaaggtgac tgtgccggat 540

gtcagccctg gtggtggtga agcgatgcgt aaggcgcttg ctgctcttac ctctgagctg 600

aatgtggata ttgcgattga gcgttctggt ttgctgcgtc gttctaagcg tctggtgtgc 660

ttcgattgtg attccacgtt gatcactggt gaggtcattg agatgctggc ggctcacgcg 720

ggcaaggaag ctgaagttgc ggcagttact gagcgtgcga tgcgcggtga gctcgatttc 780

gaggagtctc tgcgtgagcg tgtgaaggcg ttggctggtt tggatgcgtc ggtgatcgat 840

gaggtcgctg ccgctattga gctgacccct ggtgcgcgca ccacgatccg tacgctgaac 900

cgcatgggtt accagaccgc tgttgtttcc ggtggtttca tccaggtgtt ggaaggtttg 960

gctgaggagt tggagttgga ttatgtccgc gccaacactt tggaaatcgt tgatggcaag 1020

ctgaccggca acgtcaccgg aaagatcgtt gaccgcgctg cgaaggctga gttcctccgt 1080

gagttcgctg cggattctgg cctgaagatg taccagactg tcgctgtcgg tgatggcgct 1140

aatgacatcg atatgctctc cgctgcgggt ctgggtgttg ctttcaacgc gaagcctgcg 1200

ctgaaggaga ttgcggatac ttccgtgaac cacccattcc tcgacgaggt tttgcacatc 1260

atgggcattt cccgcgacga gatcgatctg gcggatcagg aagacggcac tttccaccgc 1320

gttccattga ccaatgccta a 1341

<210> 20

<211> 969

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(969)

<223> 磷酸丝氨酸磷酸酶, SerB

<400> 20

atgcctaaca ttacctggtg cgacctgcct gaagatgtct ctttatggcc gggtctgcct 60

ctttcattaa gtggtgatga agtgatgcca ctggattacc acgcaggtcg tagcggctgg 120

ctgctgtatg gtcgtgggct ggataaacaa cgtctgaccc aataccagag caaactgggt 180

gcggcgatgg tgattgttgc cgcctggtgc gtggaagatt atcaggtgat tcgtctggca 240

ggttcactca ccgcacgggc tacacgcctg gcccacgaag cgcagctgga tgtcgccccg 300

ctggggaaaa tcccgcacct gcgcacgccg ggtttgctgg tgatggatat ggactccacc 360

gccatccaga ttgaatgtat tgatgaaatt gccaaactgg ccggaacggg cgagatggtg 420

gcggaagtaa ccgaacgggc gatgcgcggc gaactcgatt ttaccgccag cctgcgcagc 480

cgtgtggcga cgctgaaagg cgctgacgcc aatattctgc aacaggtgcg tgaaaatctg 540

ccgctgatgc caggcttaac gcaactggtg ctcaagctgg aaacgctggg ctggaaagtg 600

gcgattgcct ccggcggctt tactttcttt gctgaatacc tgcgcgacaa gctgcgcctg 660

accgccgtgg tagccaatga actggagatc atggacggta aatttaccgg caatgtgatc 720

ggcgacatcg tagacgcgca gtacaaagcg aaaactctga ctcgcctcgc gcaggagtat 780

gaaatcccgc tggcgcagac cgtggcgatt ggcgatggag ccaatgacct gccgatgatc 840

aaagcggcag ggctggggat tgcctaccat gccaagccaa aagtgaatga aaaggcggaa 900

gtcaccatcc gtcacgctga cctgatgggg gtattctgca tcctctcagg cagcctgaat 960

cagaagtaa 969

<210> 21

<211> 410

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(410)

<223> SerA

<400> 21

Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val

1 5 10 15

Glu Gly Val His Gln Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala Gly Tyr

20 25 30

Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asp Glu Gln Leu Lys

35 40 45

Glu Ser Ile Arg Asp Ala His Phe Ile Gly Leu Arg Ser Arg Thr His

50 55 60

Leu Thr Glu Asp Val Ile Asn Ala Ala Glu Lys Leu Val Ala Ile Gly

65 70 75 80

Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Lys

85 90 95

Arg Gly Ile Pro Val Phe Asn Ala Pro Phe Ser Asn Thr Arg Ser Val

100 105 110

Ala Glu Leu Val Ile Gly Glu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Val Pro

115 120 125

Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Val Trp Asn Lys Leu Ala Ala

130 135 140

Gly Ser Phe Glu Ala Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly

145 150 155 160

His Ile Gly Thr Gln Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Tyr

165 170 175

Val Tyr Phe Tyr Asp Ile Glu Asn Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Thr

180 185 190

Gln Val Gln His Leu Ser Asp Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser

195 200 205

Leu His Val Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lys Asn Met Met Gly Ala Lys

210 215 220

Glu Ile Ser Leu Met Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg

225 230 235 240

Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Asp Ala Leu Ala Ser Lys

245 250 255

His Leu Ala Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Thr Glu Pro Ala Thr

260 265 270

Asn Ser Asp Pro Phe Thr Ser Pro Leu Cys Glu Phe Asp Asn Val Leu

275 280 285

Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Gln Glu Ala Gln Glu Asn Ile

290 295 300

Gly Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu Ile Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser

305 310 315 320

Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Leu His Gly

325 330 335

Gly Arg Arg Leu Met His Ile His Glu Asn Arg Pro Gly Val Leu Thr

340 345 350

Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Glu Gln Gly Val Asn Ile Ala Ala Gln

355 360 365

Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Gln Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu

370 375 380

Ala Asp Glu Asp Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Ala Met Lys Ala Ile

385 390 395 400

Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr

405 410

<210> 22

<211> 530

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(E235K), SerA(E235K)

<400> 22

Met Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gln Ser Thr Val Asp Ala Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val

20 25 30

Asp Gly Pro Asn Arg Pro Glu Leu Leu Asp Ala Val Lys Glu Ala Asp

35 40 45

Ala Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala

50 55 60

Ala Ala Pro Asn Leu Lys Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp

65 70 75 80

Asn Val Asp Ile Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn

85 90 95

Ala Pro Thr Ser Asn Ile His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu

100 105 110

Leu Leu Ser Thr Ala Arg Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg

115 120 125

Glu Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly

130 135 140

Lys Thr Val Gly Ile Val Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala

145 150 155 160

Gln Arg Leu Ala Ala Phe Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr

165 170 175

Ala Asn Pro Ala Arg Ala Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu

180 185 190

Asp Glu Leu Met Ser Arg Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys

195 200 205

Thr Lys Glu Thr Ala Gly Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser

210 215 220

Lys Lys Gly Gln Ile Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp

225 230 235 240

Glu Gln Ala Leu Ala Asp Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala

245 250 255

Gly Phe Asp Val Tyr Ser Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe

260 265 270

Lys Leu Pro Gln Val Val Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu

275 280 285

Glu Ala Gln Asp Arg Ala Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys

290 295 300

Ala Leu Ala Gly Glu Phe Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly

305 310 315 320

Arg Val Gly Glu Lys Val Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu

325 330 335

Gly Leu Leu Ala Gly Lys Leu Val Asp Ala Ala Pro Val Ser Ile Glu

340 345 350

Val Glu Ala Arg Gly Glu Leu Ser Ser Glu Gln Val Asp Ala Leu Gly

355 360 365

Leu Ser Ala Val Arg Gly Leu Phe Ser Gly Ile Ile Glu Glu Ser Val

370 375 380

Thr Phe Val Asn Ala Pro Arg Ile Ala Glu Glu Arg Gly Leu Asp Ile

385 390 395 400

Ser Val Lys Thr Asn Ser Glu Ser Val Thr His Arg Ser Val Leu Gln

405 410 415

Val Lys Val Ile Thr Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Val Val Gly Ala

420 425 430

Leu Thr Gly Leu Glu Arg Val Glu Lys Ile Thr Arg Ile Asn Gly Arg

435 440 445

Gly Leu Asp Leu Arg Ala Glu Gly Leu Asn Leu Phe Leu Gln Tyr Thr

450 455 460

Asp Ala Pro Gly Ala Leu Gly Thr Val Gly Thr Lys Leu Gly Ala Ala

465 470 475 480

Gly Ile Asn Ile Glu Ala Ala Ala Leu Thr Gln Ala Glu Lys Gly Asp

485 490 495

Gly Ala Val Leu Ile Leu Arg Val Glu Ser Ala Val Ser Glu Glu Leu

500 505 510

Glu Ala Glu Ile Asn Ala Glu Leu Gly Ala Thr Ser Phe Gln Val Asp

515 520 525

Leu Asp

530

<210> 23

<211> 333

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(197Δ), SerA(197Δ)

<400> 23

Met Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gln Ser Thr Val Asp Ala Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val

20 25 30

Asp Gly Pro Asn Arg Pro Glu Leu Leu Asp Ala Val Lys Glu Ala Asp

35 40 45

Ala Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala

50 55 60

Ala Ala Pro Asn Leu Lys Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp

65 70 75 80

Asn Val Asp Ile Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn

85 90 95

Ala Pro Thr Ser Asn Ile His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu

100 105 110

Leu Leu Ser Thr Ala Arg Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg

115 120 125

Glu Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly

130 135 140

Lys Thr Val Gly Ile Val Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala

145 150 155 160

Gln Arg Leu Ala Ala Phe Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr

165 170 175

Ala Asn Pro Ala Arg Ala Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu

180 185 190

Asp Glu Leu Met Ser Arg Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys

195 200 205

Thr Lys Glu Thr Ala Gly Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser

210 215 220

Lys Lys Gly Gln Ile Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp

225 230 235 240

Glu Gln Ala Leu Ala Asp Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala

245 250 255

Gly Phe Asp Val Tyr Ser Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe

260 265 270

Lys Leu Pro Gln Val Val Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu

275 280 285

Glu Ala Gln Asp Arg Ala Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys

290 295 300

Ala Leu Ala Gly Glu Phe Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly

305 310 315 320

Arg Val Gly Glu Glu Val Ala Val Trp Met Asp Leu Ala

325 330

<210> 24

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(G336V), SerA(G336V)

<400> 24

Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val

1 5 10 15

Glu Gly Val His Gln Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala Gly Tyr

20 25 30

Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asp Glu Gln Leu Lys

35 40 45

Glu Ser Ile Arg Asp Ala His Phe Ile Gly Leu Arg Ser Arg Thr His

50 55 60

Leu Thr Glu Asp Val Ile Asn Ala Ala Glu Lys Leu Val Ala Ile Gly

65 70 75 80

Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Lys

85 90 95

Arg Gly Ile Pro Val Phe Asn Ala Pro Phe Ser Asn Thr Arg Ser Val

100 105 110

Ala Glu Leu Val Ile Gly Glu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Val Pro

115 120 125

Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Val Trp Asn Lys Leu Ala Ala

130 135 140

Gly Ser Phe Glu Ala Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly

145 150 155 160

His Ile Gly Thr Gln Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Tyr

165 170 175

Val Tyr Phe Tyr Asp Ile Glu Asn Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Thr

180 185 190

Gln Val Gln His Leu Ser Asp Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser

195 200 205

Leu His Val Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lys Asn Met Met Gly Ala Lys

210 215 220

Glu Ile Ser Leu Met Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg

225 230 235 240

Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Asp Ala Leu Ala Ser Lys

245 250 255

His Leu Ala Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Thr Glu Pro Ala Thr

260 265 270

Asn Ser Asp Pro Phe Thr Ser Pro Leu Cys Glu Phe Asp Asn Val Leu

275 280 285

Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Gln Glu Ala Gln Glu Asn Ile

290 295 300

Gly Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu Ile Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser

305 310 315 320

Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Leu His Val

325 330 335

Gly Arg Arg Leu Met His Ile His Glu Asn Arg Pro Gly Val Leu Thr

340 345 350

Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Glu Gln Gly Val Asn Ile Ala Ala Gln

355 360 365

Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Gln Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu

370 375 380

Ala Asp Glu Asp Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Ala Met Lys Ala Ile

385 390 395 400

Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr

405 410

<210> 25

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(G336V, G337V), SerA(G336V, G337V)

<400> 25

Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val

1 5 10 15

Glu Gly Val His Gln Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala Gly Tyr

20 25 30

Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asp Glu Gln Leu Lys

35 40 45

Glu Ser Ile Arg Asp Ala His Phe Ile Gly Leu Arg Ser Arg Thr His

50 55 60

Leu Thr Glu Asp Val Ile Asn Ala Ala Glu Lys Leu Val Ala Ile Gly

65 70 75 80

Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Lys

85 90 95

Arg Gly Ile Pro Val Phe Asn Ala Pro Phe Ser Asn Thr Arg Ser Val

100 105 110

Ala Glu Leu Val Ile Gly Glu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Val Pro

115 120 125

Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Val Trp Asn Lys Leu Ala Ala

130 135 140

Gly Ser Phe Glu Ala Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly

145 150 155 160

His Ile Gly Thr Gln Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Tyr

165 170 175

Val Tyr Phe Tyr Asp Ile Glu Asn Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Thr

180 185 190

Gln Val Gln His Leu Ser Asp Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser

195 200 205

Leu His Val Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lys Asn Met Met Gly Ala Lys

210 215 220

Glu Ile Ser Leu Met Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg

225 230 235 240

Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Asp Ala Leu Ala Ser Lys

245 250 255

His Leu Ala Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Thr Glu Pro Ala Thr

260 265 270

Asn Ser Asp Pro Phe Thr Ser Pro Leu Cys Glu Phe Asp Asn Val Leu

275 280 285

Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Gln Glu Ala Gln Glu Asn Ile

290 295 300

Gly Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu Ile Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser

305 310 315 320

Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Leu His Val

325 330 335

Val Arg Arg Leu Met His Ile His Glu Asn Arg Pro Gly Val Leu Thr

340 345 350

Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Glu Gln Gly Val Asn Ile Ala Ala Gln

355 360 365

Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Gln Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu

370 375 380

Ala Asp Glu Asp Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Ala Met Lys Ala Ile

385 390 395 400

Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr

405 410

<210> 26

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(G336V, R338G), SerA(G336V,

R338G)

<400> 26

Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val

1 5 10 15

Glu Gly Val His Gln Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala Gly Tyr

20 25 30

Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asp Glu Gln Leu Lys

35 40 45

Glu Ser Ile Arg Asp Ala His Phe Ile Gly Leu Arg Ser Arg Thr His

50 55 60

Leu Thr Glu Asp Val Ile Asn Ala Ala Glu Lys Leu Val Ala Ile Gly

65 70 75 80

Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Lys

85 90 95

Arg Gly Ile Pro Val Phe Asn Ala Pro Phe Ser Asn Thr Arg Ser Val

100 105 110

Ala Glu Leu Val Ile Gly Glu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Val Pro

115 120 125

Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Val Trp Asn Lys Leu Ala Ala

130 135 140

Gly Ser Phe Glu Ala Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly

145 150 155 160

His Ile Gly Thr Gln Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Tyr

165 170 175

Val Tyr Phe Tyr Asp Ile Glu Asn Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Thr

180 185 190

Gln Val Gln His Leu Ser Asp Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser

195 200 205

Leu His Val Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lys Asn Met Met Gly Ala Lys

210 215 220

Glu Ile Ser Leu Met Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg

225 230 235 240

Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Asp Ala Leu Ala Ser Lys

245 250 255

His Leu Ala Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Thr Glu Pro Ala Thr

260 265 270

Asn Ser Asp Pro Phe Thr Ser Pro Leu Cys Glu Phe Asp Asn Val Leu

275 280 285

Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Gln Glu Ala Gln Glu Asn Ile

290 295 300

Gly Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu Ile Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser

305 310 315 320

Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Leu His Val

325 330 335

Gly Gly Arg Leu Met His Ile His Glu Asn Arg Pro Gly Val Leu Thr

340 345 350

Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Glu Gln Gly Val Asn Ile Ala Ala Gln

355 360 365

Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Gln Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu

370 375 380

Ala Asp Glu Asp Val Ala Glu Lys Ala Leu Gln Ala Met Lys Ala Ile

385 390 395 400

Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr

405 410

<210> 27

<211> 1233

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1233)

<223> SerA

<400> 27

atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60

caaaaggcgc tggaaagcct tcgtgcagct ggttacacca acatcgaatt tcacaaaggc 120

gcgctggatg atgaacaatt aaaagaatcc atccgcgatg cccacttcat cggcctgcga 180

tcccgtaccc atctgactga agacgtgatc aacgccgcag aaaaactggt cgctattggc 240

tgtttctgta tcggaacaaa ccaggttgat ctggatgcgg cggcaaagcg cgggatcccg 300

gtatttaacg caccgttctc aaatacgcgc tctgttgcgg agctggtgat tggcgaactg 360

ctgctgctat tgcgcggcgt gccggaagcc aatgctaaag cgcaccgtgg cgtgtggaac 420

aaactggcgg cgggttcttt tgaagcgcgc ggcaaaaagc tgggtatcat cggctacggt 480

catattggta cgcaattggg cattctggct gaatcgctgg gaatgtatgt ttacttttat 540

gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600

ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660

atgggcgcga aagaaatttc actaatgaag cccggctcgc tgctgattaa tgcttcgcgc 720

ggtactgtgg tggatattcc ggcgctgtgt gatgcgctgg cgagcaaaca tctggcgggg 780

gcggcaatcg acgtattccc gacggaaccg gcgaccaata gcgatccatt tacctctccg 840

ctgtgtgaat tcgacaacgt ccttctgacg ccacacattg gcggttcgac tcaggaagcg 900

caggagaata tcggcctgga agttgcgggt aaattgatca agtattctga caatggctca 960

acgctctctg cggtgaactt cccggaagtc tcgctgccac tgcacggtgg gcgtcgtctg 1020

atgcacatcc acgaaaaccg tccgggcgtg ctaactgcgc tgaacaaaat cttcgccgag 1080

cagggcgtca acatcgccgc gcaatatctg caaacttccg cccagatggg ttatgtggtt 1140

attgatattg aagccgacga agacgttgcc gaaaaagcgc tgcaggcaat gaaagctatt 1200

ccgggtacca ttcgcgcccg tctgctgtac taa 1233

<210> 28

<211> 1593

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(E235K), SerA(E235K)

<400> 28

atgagccaga atggccgtcc ggtagtcctc atcgccgata agcttgcgca gtccactgtt 60

gacgcgcttg gagatgcagt agaagtccgt tgggttgacg gacctaaccg cccagaactg 120

cttgatgcag ttaaggaagc ggacgcactg ctcgtgcgtt ctgctaccac tgtcgatgct 180

gaagtcatcg ccgctgcccc taacttgaag atcgtcggtc gtgccggcgt gggcttggac 240

aacgttgaca tccctgctgc cactgaagct ggcgtcatgg ttgctaacgc accgacctct 300

aatattcact ccgcttgtga gcacgcaatt tctttgctgc tgtctactgc tcgccagatc 360

cctgctgctg atgcgacgct gcgtgagggc gagtggaagc ggtcttcttt caacggtgtg 420

gaaattttcg gaaaaactgt cggtatcgtc ggttttggcc acattggtca gttgtttgct 480

cagcgtcttg ctgcgtttga gaccaccatt gttgcttacg atccttacgc taaccctgct 540

cgtgcggctc agctgaacgt tgagttggtt gagttggatg agctgatgag ccgttctgac 600

tttgtcacca ttcaccttcc taagaccaag gaaactgctg gcatgtttga tgcgcagctc 660

cttgctaagt ccaagaaggg ccagatcatc atcaacgctg ctcgtggtgg ccttgttgat 720

gagcaggctt tggctgatgc gattgagtcc ggtcacattc gtggcgctgg tttcgatgtg 780

tactccaccg agccttgcac tgattctcct ttgttcaagt tgcctcaggt tgttgtgact 840

cctcacttgg gtgcttctac tgaagaggct caggatcgtg cgggtactga cgttgctgat 900

tctgtgctca aggcgctggc tggcgagttc gtggcggatg ctgtgaacgt ttccggtggt 960

cgcgtgggcg aaaaggttgc tgtgtggatg gatctggctc gcaagcttgg tcttcttgct 1020

ggcaagcttg tcgacgccgc cccagtctcc attgaggttg aggctcgagg cgagctttct 1080

tccgagcagg tcgatgcact tggtttgtcc gctgttcgtg gtttgttctc cggaattatc 1140

gaagagtccg ttactttcgt caacgctcct cgcattgctg aagagcgtgg cctggacatc 1200

tccgtgaaga ccaactctga gtctgttact caccgttccg tcctgcaggt caaggtcatt 1260

actggcagcg gcgcgagcgc aactgttgtt ggtgccctga ctggtcttga gcgcgttgag 1320

aagatcaccc gcatcaatgg ccgtggcctg gatctgcgcg cagagggtct gaacctcttc 1380

ctgcagtaca ctgacgctcc tggtgcactg ggtaccgttg gtaccaagct gggtgctgct 1440

ggcatcaaca tcgaggctgc tgcgttgact caggctgaga agggtgacgg cgctgtcctg 1500

atcctgcgtg ttgagtccgc tgtctctgaa gagctggaag ctgaaatcaa cgctgagttg 1560

ggtgctactt ccttccaggt tgatcttgac taa 1593

<210> 29

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(197Δ), SerA(197Δ)

<400> 29

atgagccaga atggccgtcc ggtagtcctc atcgccgata agcttgcgca gtccactgtt 60

gacgcgcttg gagatgcagt agaagtccgt tgggttgacg gacctaaccg cccagaactg 120

cttgatgcag ttaaggaagc ggacgcactg ctcgtgcgtt ctgctaccac tgtcgatgct 180

gaagtcatcg ccgctgcccc taacttgaag atcgtcggtc gtgccggcgt gggcttggac 240

aacgttgaca tccctgctgc cactgaagct ggcgtcatgg ttgctaacgc accgacctct 300

aatattcact ccgcttgtga gcacgcaatt tctttgctgc tgtctactgc tcgccagatc 360

cctgctgctg atgcgacgct gcgtgagggc gagtggaagc ggtcttcttt caacggtgtg 420

gaaattttcg gaaaaactgt cggtatcgtc ggttttggcc acattggtca gttgtttgct 480

cagcgtcttg ctgcgtttga gaccaccatt gttgcttacg atccttacgc taaccctgct 540

cgtgcggctc agctgaacgt tgagttggtt gagttggatg agctgatgag ccgttctgac 600

tttgtcacca ttcaccttcc taagaccaag gaaactgctg gcatgtttga tgcgcagctc 660

cttgctaagt ccaagaaggg ccagatcatc atcaacgctg ctcgtggtgg ccttgttgat 720

gagcaggctt tggctgatgc gattgagtcc ggtcacattc gtggcgctgg tttcgatgtg 780

tactccaccg agccttgcac tgattctcct ttgttcaagt tgcctcaggt tgttgtgact 840

cctcacttgg gtgcttctac tgaagaggct caggatcgtg cgggtactga cgttgctgat 900

tctgtgctca aggcgctggc tggcgagttc gtggcggatg ctgtgaacgt ttccggtggt 960

cgcgtgggcg aagaggttgc tgtgtggatg gatctggctt aa 1002

<210> 30

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(G336V), SerA(G336V)

<400> 30

atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60

caaaaggcgc tggaaagcct tcgtgcagct ggttacacca acatcgaatt tcacaaaggc 120

gcgctggatg atgaacaatt aaaagaatcc atccgcgatg cccacttcat cggcctgcga 180

tcccgtaccc atctgactga agacgtgatc aacgccgcag aaaaactggt cgctattggc 240

tgtttctgta tcggaacaaa ccaggttgat ctggatgcgg cggcaaagcg cgggatcccg 300

gtatttaacg caccgttctc aaatacgcgc tctgttgcgg agctggtgat tggcgaactg 360

ctgctgctat tgcgcggcgt gccggaagcc aatgctaaag cgcaccgtgg cgtgtggaac 420

aaactggcgg cgggttcttt tgaagcgcgc ggcaaaaagc tgggtatcat cggctacggt 480

catattggta cgcaattggg cattctggct gaatcgctgg gaatgtatgt ttacttttat 540

gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600

ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660

atgggcgcga aagaaatttc actaatgaag cccggctcgc tgctgattaa tgcttcgcgc 720

ggtactgtgg tggatattcc ggcgctgtgt gatgcgctgg cgagcaaaca tctggcgggg 780

gcggcaatcg acgtattccc gacggaaccg gcgaccaata gcgatccatt tacctctccg 840

ctgtgtgaat tcgacaacgt ccttctgacg ccacacattg gcggttcgac tcaggaagcg 900

caggagaata tcggcctgga agttgcgggt aaattgatca agtattctga caatggctca 960

acgctctctg cggtgaactt cccggaagtc tcgctgccac tgcacgttgg gcgtcgtctg 1020

atgcacatcc acgaaaaccg tccgggcgtg ctaactgcgc tgaacaaaat cttcgccgag 1080

cagggcgtca acatcgccgc gcaatatctg caaacttccg cccagatggg ttatgtggtt 1140

attgatattg aagccgacga agacgttgcc gaaaaagcgc tgcaggcaat gaaagctatt 1200

ccgggtacca ttcgcgcccg tctgctgtac taa 1233

<210> 31

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serA*(G336V,G337V)

<400> 31

atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60

caaaaggcgc tggaaagcct tcgtgcagct ggttacacca acatcgaatt tcacaaaggc 120

gcgctggatg atgaacaatt aaaagaatcc atccgcgatg cccacttcat cggcctgcga 180

tcccgtaccc atctgactga agacgtgatc aacgccgcag aaaaactggt cgctattggc 240

tgtttctgta tcggaacaaa ccaggttgat ctggatgcgg cggcaaagcg cgggatcccg 300

gtatttaacg caccgttctc aaatacgcgc tctgttgcgg agctggtgat tggcgaactg 360

ctgctgctat tgcgcggcgt gccggaagcc aatgctaaag cgcaccgtgg cgtgtggaac 420

aaactggcgg cgggttcttt tgaagcgcgc ggcaaaaagc tgggtatcat cggctacggt 480

catattggta cgcaattggg cattctggct gaatcgctgg gaatgtatgt ttacttttat 540

gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600

ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660

atgggcgcga aagaaatttc actaatgaag cccggctcgc tgctgattaa tgcttcgcgc 720

ggtactgtgg tggatattcc ggcgctgtgt gatgcgctgg cgagcaaaca tctggcgggg 780

gcggcaatcg acgtattccc gacggaaccg gcgaccaata gcgatccatt tacctctccg 840

ctgtgtgaat tcgacaacgt ccttctgacg ccacacattg gcggttcgac tcaggaagcg 900

caggagaata tcggcctgga agttgcgggt aaattgatca agtattctga caatggctca 960

acgctctctg cggtgaactt cccggaagtc tcgctgccac tgcacgttgt gcgtcgtctg 1020

atgcacatcc acgaaaaccg tccgggcgtg ctaactgcgc tgaacaaaat cttcgccgag 1080

cagggcgtca acatcgccgc gcaatatctg caaacttccg cccagatggg ttatgtggtt 1140

attgatattg aagccgacga agacgttgcc gaaaaagcgc tgcaggcaat gaaagctatt 1200

ccgggtacca ttcgcgcccg tctgctgtac taa 1233

<210> 32

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> serA*(G336V,R338G)

<400> 32

atggcaaagg tatcgctgga gaaagacaag attaagtttc tgctggtaga aggcgtgcac 60

caaaaggcgc tggaaagcct tcgtgcagct ggttacacca acatcgaatt tcacaaaggc 120

gcgctggatg atgaacaatt aaaagaatcc atccgcgatg cccacttcat cggcctgcga 180

tcccgtaccc atctgactga agacgtgatc aacgccgcag aaaaactggt cgctattggc 240

tgtttctgta tcggaacaaa ccaggttgat ctggatgcgg cggcaaagcg cgggatcccg 300

gtatttaacg caccgttctc aaatacgcgc tctgttgcgg agctggtgat tggcgaactg 360

ctgctgctat tgcgcggcgt gccggaagcc aatgctaaag cgcaccgtgg cgtgtggaac 420

aaactggcgg cgggttcttt tgaagcgcgc ggcaaaaagc tgggtatcat cggctacggt 480

catattggta cgcaattggg cattctggct gaatcgctgg gaatgtatgt ttacttttat 540

gatattgaaa ataaactgcc gctgggcaac gccactcagg tacagcatct ttctgacctg 600

ctgaatatga gcgatgtggt gagtctgcat gtaccagaga atccgtccac caaaaatatg 660

atgggcgcga aagaaatttc actaatgaag cccggctcgc tgctgattaa tgcttcgcgc 720

ggtactgtgg tggatattcc ggcgctgtgt gatgcgctgg cgagcaaaca tctggcgggg 780

gcggcaatcg acgtattccc gacggaaccg gcgaccaata gcgatccatt tacctctccg 840

ctgtgtgaat tcgacaacgt ccttctgacg ccacacattg gcggttcgac tcaggaagcg 900

caggagaata tcggcctgga agttgcgggt aaattgatca agtattctga caatggctca 960

acgctctctg cggtgaactt cccggaagtc tcgctgccac tgcacgttgg gggtcgtctg 1020

atgcacatcc acgaaaaccg tccgggcgtg ctaactgcgc tgaacaaaat cttcgccgag 1080

cagggcgtca acatcgccgc gcaatatctg caaacttccg cccagatggg ttatgtggtt 1140

attgatattg aagccgacga agacgttgcc gaaaaagcgc tgcaggcaat gaaagctatt 1200

ccgggtacca ttcgcgcccg tctgctgtac taa 1233

<210> 33

<211> 362

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(362)

<223> 3-磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸转氨酶, SerC

<400> 33

Met Ala Gln Ile Phe Asn Phe Ser Ser Gly Pro Ala Met Leu Pro Ala

1 5 10 15

Glu Val Leu Lys Gln Ala Gln Gln Glu Leu Arg Asp Trp Asn Gly Leu

20 25 30

Gly Thr Ser Val Met Glu Val Ser His Arg Gly Lys Glu Phe Ile Gln

35 40 45

Val Ala Glu Glu Ala Glu Lys Asp Phe Arg Asp Leu Leu Asn Val Pro

50 55 60

Ser Asn Tyr Lys Val Leu Phe Cys His Gly Gly Gly Arg Gly Gln Phe

65 70 75 80

Ala Ala Val Pro Leu Asn Ile Leu Gly Asp Lys Thr Thr Ala Asp Tyr

85 90 95

Val Asp Ala Gly Tyr Trp Ala Ala Ser Ala Ile Lys Glu Ala Lys Lys

100 105 110

Tyr Cys Thr Pro Asn Val Phe Asp Ala Lys Val Thr Val Asp Gly Leu

115 120 125

Arg Ala Val Lys Pro Met Arg Glu Trp Gln Leu Ser Asp Asn Ala Ala

130 135 140

Tyr Met His Tyr Cys Pro Asn Glu Thr Ile Asp Gly Ile Ala Ile Asp

145 150 155 160

Glu Thr Pro Asp Phe Gly Ala Asp Val Val Val Ala Ala Asp Phe Ser

165 170 175

Ser Thr Ile Leu Ser Arg Pro Ile Asp Val Ser Arg Tyr Gly Val Ile

180 185 190

Tyr Ala Gly Ala Gln Lys Asn Ile Gly Pro Ala Gly Leu Thr Ile Val

195 200 205

Ile Val Arg Glu Asp Leu Leu Gly Lys Ala Asn Ile Ala Cys Pro Ser

210 215 220

Ile Leu Asp Tyr Ser Ile Leu Asn Asp Asn Gly Ser Met Phe Asn Thr

225 230 235 240

Pro Pro Thr Phe Ala Trp Tyr Leu Ser Gly Leu Val Phe Lys Trp Leu

245 250 255

Lys Ala Asn Gly Gly Val Ala Glu Met Asp Lys Ile Asn Gln Gln Lys

260 265 270

Ala Glu Leu Leu Tyr Gly Val Ile Asp Asn Ser Asp Phe Tyr Arg Asn

275 280 285

Asp Val Ala Lys Ala Asn Arg Ser Arg Met Asn Val Pro Phe Gln Leu

290 295 300

Ala Asp Ser Ala Leu Asp Lys Leu Phe Leu Glu Glu Ser Phe Ala Ala

305 310 315 320

Gly Leu His Ala Leu Lys Gly His Arg Val Val Gly Gly Met Arg Ala

325 330 335

Ser Ile Tyr Asn Ala Met Pro Leu Glu Gly Val Lys Ala Leu Thr Asp

340 345 350

Phe Met Val Glu Phe Glu Arg Arg His Gly

355 360

<210> 34

<211> 1089

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(1089)

<223> 3-磷酸丝氨酸/磷酸羟基苏氨酸转氨酶, SerC

<400> 34

atggctcaaa tcttcaattt tagttctggt ccggcaatgc taccggcaga ggtgcttaaa 60

caggctcaac aggaactgcg cgactggaac ggtcttggta cgtcggtgat ggaagtgagt 120

caccgtggca aagagttcat tcaggttgca gaggaagccg agaaggattt tcgcgatctt 180

cttaatgtcc cctccaacta caaggtatta ttctgccatg gcggtggtcg cggtcagttt 240

gctgcggtac cgctgaatat tctcggtgat aaaaccaccg cagattatgt tgatgccggt 300

tactgggcgg caagtgccat taaagaagcg aaaaaatact gcacgcctaa tgtctttgac 360

gccaaagtga ctgttgatgg tctgcgcgcg gttaagccaa tgcgtgaatg gcaactctct 420

gataatgctg cttatatgca ttattgcccg aatgaaacca tcgatggtat cgccatcgac 480

gaaacgccag acttcggcgc agatgtggtg gtcgccgctg acttctcttc aaccattctt 540

tcccgtccga ttgacgtcag ccgttatggt gtaatttacg ctggcgcgca gaaaaatatc 600

ggcccggctg gcctgacaat cgtcatcgtt cgtgaagatt tgctgggcaa agcgaatatc 660

gcgtgtccgt cgattctgga ttattccatc ctcaacgata acggctccat gtttaacacg 720

ccgccgacat ttgcctggta tctatctggt ctggtcttta aatggctgaa agcgaacggc 780

ggtgtagctg aaatggataa aatcaatcag caaaaagcag aactgctata tggggtgatt 840

gataacagcg atttctaccg caatgacgtg gcgaaagcta accgttcgcg gatgaacgtg 900

ccgttccagt tggcggacag tgcgcttgac aaattgttcc ttgaagagtc ttttgctgct 960

ggccttcatg cactgaaagg tcaccgtgtg gtcggcggaa tgcgcgcttc tatttataac 1020

gccatgccgc tggaaggcgt taaagcgctg acagacttca tggttgagtt cgaacgccgt 1080

cacggttaa 1089

Claims

1.能够生产O-磷酸丝氨酸(OPS)的微生物，其中具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列并且能够输出O-磷酸丝氨酸的多肽的活性相比于其内源活性被增强。

2.权利要求1所述的微生物，其中磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)的活性相比于其内源活性被进一步减弱。

3.权利要求1所述的微生物，其中磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)或磷酸丝氨酸转氨酶(SerC)的活性相比于其内源活性被进一步增强。

4.权利要求1所述的微生物，其中能够生产O-磷酸丝氨酸的所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。

5.生产O-磷酸丝氨酸(OPS)的方法，包括：

在培养基中培养能够生产O-磷酸丝氨酸的微生物，所述微生物中具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列并且能够输出O-磷酸丝氨酸的多肽的活性被增强；和

从能够生产O-磷酸丝氨酸的所述微生物或其培养基中分离O-磷酸丝氨酸。

6.权利要求5所述的方法，其中，在能够生产O-磷酸丝氨酸的所述微生物中，磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)的活性相比于其内源活性被进一步减弱。

7.权利要求5所述的方法，其中，在能够生产O-磷酸丝氨酸的所述微生物中，磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)或磷酸丝氨酸转氨酶(SerC)的活性相比于其内源活性被进一步增强。

8.权利要求5所述的方法，其中能够生产O-磷酸丝氨酸的所述微生物是大肠杆菌。

9.生产半胱氨酸或其衍生物的方法，包括：

a)通过在培养基中培养根据权利要求1至4中任一项所述的微生物来生产O-磷酸丝氨酸(OPS)；和

b)在O-磷酸丝氨酸硫化氢解酶(OPSS)或能够表达其的微生物的存在下，使a)中产生的所述O-磷酸丝氨酸(OPS)或含有其的培养物与硫化物反应。

10.权利要求9所述的方法，其中所述硫化物是选自Na₂S、NaSH、(NH₄)₂S、H₂S和Na₂S₂O₃中的至少一种。