CN110234767A

CN110234767A - 生产l-精氨酸的棒状杆菌属的微生物和使用其生产l-精氨酸的方法

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Publication number: CN110234767A
Application number: CN201880005103.3A
Authority: CN
Inventors: 金善慧; 金亨俊; H·吴; 尹炳勋; 姜旻景
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2019-09-13
Anticipated expiration: 2038-12-18
Also published as: BR112019015993B1; PH12019500940A1; JP2020504598A; CL2019002319A1; US11345940B2; MX2019009383A; IL266290A; AU2018353929A1; PE20191702A1; TWI736816B; AR114561A1; WO2019124932A2; CN110234767B; KR101999454B1; US20210139937A1; BR112019015993A2; JP6806895B2; IL266290B2; WO2019124932A3; RU2716573C1

Abstract

本公开内容涉及生产L‑精氨酸的棒状杆菌属的微生物，以及使用其生产L‑精氨酸的方法。

Description

生产L-精氨酸的棒状杆菌属的微生物和使用其生产L-精氨酸的方法

技术领域

本公开内容涉及生产L-精氨酸的棒状杆菌属(genus Corynebacterium)的微生物，和使用其生产L-精氨酸的方法。

背景技术

L-精氨酸以其游离形式包含在植物种子或大蒜中，并且除了用于氨基酸强化膳食补充剂以外，还广泛用于药物、食品等。L-精氨酸的药物应用的实例包括肝功能增强剂、脑功能增强剂、男性不育的治疗剂(therapeutics)和一般氨基酸制剂。应用L-精氨酸的食品中的代表是鱼酱添加剂、保健饮料添加剂和高血压患者的盐替代品。因此，L-精氨酸是最近引起了非常大的关注的物质。

棒状杆菌属(特别是谷氨酸棒状杆菌)的微生物是广泛用于生产L-氨基酸的革兰氏阳性微生物。对于L-精氨酸的生产，主要使用靶标材料(target material)特异性方法，比如增加编码酶——其主要参与棒状杆菌(Corynebacterium)菌株中的L-精氨酸合成——的基因表达的方法，或缺失对于L-精氨酸生物合成不必需的基因的方法(韩国专利号10-1102263)。然而，对能够以高产率有效地生产L-精氨酸的方法的研究仍然存在增长的需求。

在这种情况下，本发明人已经进行了大量努力以开发能够以高效率生产L-精氨酸的微生物，并且结果，他们已经通过确认在棒状杆菌属的微生物——其中缺失了编码功能未知的蛋白质的基因——中增加了L-精氨酸的生产产量(production yield)来完成本公开内容。

发明内容

技术问题

本公开内容的目的是提供生产L-精氨酸的棒状杆菌属的微生物，其中包括SEQ IDNO：1的氨基酸序列的蛋白质被灭活。

本公开内容的另一个目的是提供通过使用微生物生产L-精氨酸的方法。

技术方案

在下文中将详细描述本公开内容。同时，本文公开的解释和示例性实施方式中的每个可以应用于其他解释和示例性实施方式。即，本文公开的各种因素的所有组合都属于本公开内容的范围。此外，本公开内容的范围不应受下文提供的具体公开内容的限制。

为了实现上述目的，本公开内容的一个方面提供了生产L-精氨酸的棒状杆菌属的微生物，其中包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质被灭活。

如本文所使用，术语“L-精氨酸”是指具有化学式C₆H₁₄N₄O₂的L-氨基酸，并且是存在于所有生物体中的条件必需氨基酸。已知L-精氨酸主要由棒状杆菌属的微生物产生，但是已知这些受到细胞内精氨酸的反馈抑制(Vehary Sakanyan,et al.,Microbiology,142:9-108,1996)。因此，已知这些微生物在以高产率生产L-精氨酸上具有局限性。本发明人惊奇地发现，当包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质(其功能未知)被灭活时，L-精氨酸的产生增加，从而提供用于生产L-精氨酸的新型微生物。

如本文所使用，术语“包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质”指固有地存在于棒状杆菌属的微生物中的蛋白质或假定蛋白质，该蛋白质的功能是未知的。例如，包括SEQID NO：1的氨基酸序列的蛋白质可以是由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成(基本上由其组成)的蛋白质，但是不限于此。

另外，虽然在本公开内容中描述为“由具体SEQ ID NO组成的蛋白质”，但是这种表达不排除蛋白质中的突变，其可以通过在相应的SEQ ID NO的氨基酸序列的上游或下游的无意义序列添加，或其中天然发生的突变，或其中的沉默突变而发生，只要具有这种突变的蛋白质具有与由相应的SEQ ID NO的氨基酸序列组成的蛋白质相同的活性或对应于由相应的SEQ ID NO的氨基酸序列组成的蛋白质的活性。即使当存在序列添加或突变时，它显然也属于本公开内容的范围。

在一个示例性实施方式中，包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质可以包括与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的氨基酸序列。包括与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的氨基酸序列的蛋白质可以包括：包括具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少80％，具体地至少83％、至少84％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％或至少97％同源性的氨基酸序列的蛋白质。显然，具有其中序列被部分缺失、修饰、取代或插入的氨基酸序列的蛋白质包括在本公开内容的范围内，只要与该序列具有同源性的序列显示实际上等同或对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的生物活性。

另外，包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质可以由包括SEQ ID NO：2的多核苷酸序列的基因编码。另外，该蛋白质可以由基因——由SEQ ID NO：2的多核苷酸序列组成或基本上由SEQ ID NO：2的多核苷酸序列组成——编码，但是不限于此。

另外，本公开内容的蛋白质不仅可以由包括SEQ ID NO：2的多核苷酸序列的基因编码，而且还可以由包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的多核苷酸的基因编码。

具体而言，能够编码蛋白质(包括与上述SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的氨基酸序列)的多核苷酸序列可以包括在本公开内容的范围内，但是蛋白质可以由包括与上述SEQ ID NO：2的多核苷酸序列具有至少80％，特别是至少83％、至少84％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％或至少97％同源性的多核苷酸序列的基因编码。另外，基于遗传密码简并性，编码相同氨基酸序列的序列的变体还可以包括在本公开内容的范围内。

如本文所使用，术语“同源性”是指与给定氨基酸序列或核苷酸序列的同一性，并且同源性可以表示为百分比。在本公开内容中，与给定氨基酸序列或多核苷酸序列具有相同或相似活性的同源序列表示为“％同源性”。

例如，通过使用算法BLAST(参见Karlin and Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或FASTA(参见Pearson,Methods Enzymol.,183,63,(1990))可以确定与氨基酸序列或核苷酸序列的同源性。基于算法BLAST，已经开发了称为BLASTN或BLASTX的程序(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

如本文所使用，术语“灭活”意思是与亲本菌株、天然菌株或修饰前的菌株相比，蛋白质完全没有表达，或蛋白质被表达但是展现没有活性或活性降低。降低是包括以下的指概念：由于编码蛋白质的基因的修饰、缺失等使蛋白质的活性与在微生物中最初具有的蛋白质活性相比降低的情况、由于抑制编码蛋白质的基因的表达或抑制编码蛋白质的基因的翻译使细胞中的整体蛋白质活性水平低于天然菌株或修饰前的菌株的整体蛋白质活性水平的情况、或其组合。

在本公开内容中，首次鉴定出蛋白质的灭活与L-精氨酸的生产能力相关。

在本公开内容中，灭活可以通过本领域公知的各种方法来完成。该方法的实例可以包括1)缺失编码蛋白质的基因的全部或部分的方法；2)修饰表达控制序列从而使编码蛋白质的基因的表达降低的方法；3)修饰编码蛋白质的基因的序列从而去除或减弱蛋白质的活性的方法；4)引入反义寡核苷酸(例如，反义RNA)的方法，该反义寡核苷酸互补地结合编码蛋白质的基因的转录物；5)通过在编码蛋白质的基因的SD序列的前端添加SD序列及其互补序列，形成二级结构，使核糖体不可能附着的方法；6)逆转录工程(RTE)的方法，该方法在编码蛋白质的基因的多核苷酸序列的开放阅读框(ORF)的3'末端添加逆转录的启动子等，并且还可以包括它们的组合，但是不具体限于此。

具体而言，通过施加本领域公知的各种方法可以实现修饰表达控制序列的方法。例如，该方法可以通过如下来进行：经由缺失、插入、非保守或保守取代或其组合诱导多核苷酸序列中的表达控制序列的修饰，以进一步减弱表达控制序列的活性，或者用具有更弱活性的多核苷酸序列取代表达控制序列。表达控制序列可以包括启动子、操纵基因序列、编码核糖体结合区的序列，以及控制转录和翻译终止的序列，但是不限于此。

此外，修饰核苷酸序列的方法可以通过如下来进行：经由缺失、插入、非保守或保守取代或其组合诱导核苷酸序列中的序列修饰来进一步减弱酶活性；或者用改善为具有更弱活性的核苷酸序列或改善为没有活性的核苷酸序列来取代核苷酸序列，但是不限于此。

另外，缺失编码蛋白质的部分或全部基因的方法可以通过用多核苷酸或标记基因——其中部分核苷酸序列缺失——经由用于将染色体插入微生物中的载体来取代编码染色体内的内源靶蛋白的多核苷酸来进行。在缺失部分或全部多核苷酸的方法的示例性实施方式中，可以使用通过同源重组缺失多核苷酸的方法，但是不限于此。

另外，缺失部分或全部基因的方法可以通过使用光(比如UV)或化学品诱导突变，并通过从获得的突变体中选择具有缺失的靶基因的菌株来进行。缺失基因的方法可以包括使用遗传重组技术的方法。例如，将与靶基因具有同源性的核苷酸序列或包括该核苷酸序列的载体引入微生物中以引起同源重组。此外，待引入的核苷酸序列或载体可以包括显性选择标记。

如本文所使用，术语“生产L-精氨酸的微生物”或“具有L-精氨酸生产能力的微生物”是指天然具有生产L-精氨酸的能力的微生物或通过将生产L-精氨酸的能力赋予没有能力生产L-精氨酸的亲本菌株而制备的微生物。例如，通过使包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质的活性灭活和/或通过增强编码生物合成L-精氨酸的酶的基因的表达，可以赋予生产L-精氨酸的能力。

本文中生物合成L-精氨酸的酶的实例包括N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(ArgC)、鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(ArgD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)、精氨基琥珀酸合成酶(ArgG)、精氨基琥珀酸裂解酶(argH)和氨甲酰基磷酸合成酶。将这些酶置于Arg操纵子(argCJBDFRGH)中，并由argR编码的精氨酸阻抑物调节(J Bacteriol.2002Dec；184(23):6602-14.)。因此，可以通过减弱精氨酸阻抑物(US2002-0045223)或过表达至少一种生物合成基因来赋予生产L-精氨酸的能力。

在本公开内容中，生产L-精氨酸的微生物是其中包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质被灭活的微生物。另外，为了本公开内容的目的，微生物可以是通过使包括SEQ IDNO：1的氨基酸序列的蛋白质灭活能够生产L-精氨酸的任何微生物。作为具体实例，微生物可以包括微生物菌株，比如埃希氏菌属的微生物、沙雷氏菌属的微生物、欧文氏菌属的微生物、肠杆菌属(genus Enterobacteria)的微生物、沙门氏菌属的微生物、链霉菌属的微生物、假单胞菌属的微生物、短杆菌属的微生物或棒状杆菌属的微生物，并且具体地可以是棒状杆菌属的微生物。为了本公开内容的目的，微生物可以是生产L-精氨酸的棒状杆菌属的微生物。

“生产L-精氨酸的棒状杆菌属的微生物”是指棒状杆菌属的微生物，其天然地具有生产L-精氨酸的能力或由于修饰而具有生产L-精氨酸的能力。已经得知棒状杆菌属的微生物可以生产L-精氨酸。然而，其生产L-精氨酸的能力非常低，并且尚未揭示生产中涉及的基因或机制。因此，在本公开内容中，生产L-精氨酸的棒状杆菌属的微生物是指天然微生物本身或棒状杆菌属的微生物，其中涉及L-精氨酸生产机制的外源基因的活性被增强或灭活，以便具有改善的生产L-精氨酸的能力。

在本公开内容中，“棒状杆菌属的微生物”可以包括棒状杆菌属的所有微生物。具体而言，该微生物可以是谷氨酸棒状杆菌、产氨棒状杆菌、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、马里斯棒状杆菌(Corynebacterium maris)、Corynebacterium lubricantis、Corynebacterium doosanense、多毛棒状杆菌、膀胱炎棒状杆菌、Corynebacterium uterequi、牛肾盂炎棒状杆菌或乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，并且更具体地可以是谷氨酸棒状杆菌。

本公开内容提供了用于生产L-精氨酸的方法，包括：在培养基中培养根据本公开内容的微生物。

根据本公开内容的微生物是如上所述的。

在本公开内容的方法中，可以使用本领域已知的任何培养条件和培养方法进行棒状杆菌属的微生物的培养。

如本文所使用，术语“培养”意指微生物在适当地人工控制的环境条件下生长。在本公开中，培养生产L-精氨酸的棒状杆菌属的微生物的方法可以使用本领域广泛已知的方法进行。具体而言，可以使用分批过程或连续过程，比如补料分批过程或重复的补料分批过程进行培养，但是培养不限于此。

为了用于培养，培养基必须满足所用菌株的要求。适合用于培养棒状杆菌(Corynebacteria)菌株的培养基(Culture media)是本领域公知的(例如，Manual ofMethods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology,Washington D.C.,USA,1981)。

在培养基中可以使用的糖源包括糖和碳水化合物，比如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉或纤维素；油和脂肪，比如大豆油、葵花油、蓖麻油或椰子油；脂肪酸，比如棕榈酸、硬脂酸或亚麻油酸；醇类比如甘油或乙醇；和有机酸，比如乙酸。这些物质可以单独使用或在混合物中使用，但是不限于此。

可以使用的氮源包括含有机氮的化合物，比如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粕和尿素，或无机化合物，比如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源也可以单独使用或作为混合物使用，但是不限于此。

可以使用的磷源包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的钠盐。此外，培养基可含有生长所需要的金属盐，比如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上面提到的物质之外，还可以使用必需的生长物质，比如氨基酸和维生素。此外，可以将合适的前体添加到培养基中。所述物质可以在培养期间通过合适的方法以分批或连续方式添加到培养物中。

培养产物的pH可以通过使用碱性化合物，比如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水；或酸性化合物，比如磷酸或硫酸，以合适的方式来控制。通过使用消泡剂(比如脂肪酸聚乙二醇酯)可以控制发泡。通过将氧气或含氧的气体混合物(例如空气)引入培养物中可以维持需氧条件。培养温度通常为20℃至45℃，具体是25℃至40℃。可以继续培养直至产生期望量的L-氨基酸。具体而言，培养时间可以是10小时至160小时。

在本公开内容的方法中，培养可以连续地或以分批过程或以补料分批或重复补料分批过程进行。可以使用本领域公知的任何方法进行该培养。

可以通过本领域已知的常规方法进行L-精氨酸与培养产物的分离。对于上述分离方法，可以使用方法比如离心、过滤、离子交换色谱、结晶等。例如，可以通过离子交换色谱分离上清液，该上清液通过在低速下离心培养产物并除去生物质获得，但是该方法不限于此。

在本公开内容的方法中，在培养后可以进一步包括从微生物或培养基中回收L-精氨酸。

回收可以包括纯化过程。

有益效果

生产L-精氨酸的本公开内容的微生物可以高效率地生产L-精氨酸。此外，生产的L-精氨酸不仅可以应用于动物饲料或动物饲料添加剂，而且还可以应用于各种产品，比如人类食品或食品添加剂、药品等。

具体实施方式

在下文中，将结合所附示例性实施方式详细描述本公开内容。然而，本文公开的示例性实施方式仅用于示意性目的，并且不应解释为限制本公开内容的范围。

实施例1：使用转座子构建随机突变体文库

为了获得具有增加的L-精氨酸生产能力的菌株，以下述方式构建载体文库。

首先，使用谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P(韩国专利号0791659)作为亲本菌株，通过电脉冲方法将使用EZ-Tn5^TM<R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome^TM试剂盒(Epicentre)获得的质粒转化入亲本菌株中(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541-545)。然后，将菌株涂布(spread)在含有卡那霉素(25mg/L)的复合培养基平板上，并且从而获得约20,000个菌落。

<复合培养基平板(pH 7.0)>

10g葡萄糖、10g蛋白胨、5g牛肉膏、5g酵母提取物、18.5g脑心浸液、2.5g NaCl、2g尿素、91g山梨糖醇、20g琼脂(每升蒸馏水)

实施例2：使用转座子筛选随机突变体文库

将实施例1中获得的约20,000个菌落中的每一个接种到300μL下述选择性培养基上，并在30℃下，以1,000rpm在96深孔板中培养，持续约24小时。

<选择性培养基(pH 8.0)>

10g葡萄糖、5.5g硫酸铵、1.2g MgSO₄7H₂O、0.8g KH₂PO₄、16.4g K₂HPO₄、100μg生物素、1mg硫胺素HCl、2mg泛酸钙，2mg烟酰胺(每升蒸馏水)

为了分析培养物中产生的L-精氨酸的量，使用了茚三酮方法(Moore,S.,Stein,W.H.,Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of aminoacids.J.Biol.Chem.1948,176,367-388)。

在培养完成之后，使10μL培养上清液与190μL茚三酮反应溶液在65℃下反应30分钟，并且然后用分光光度计测量波长570nm处的吸光度。基于测量结果，选择显示比用作对照的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P菌株更高吸光度的约60个菌落作为突变株。确认其他菌落显示与用作对照的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P菌株相似或比其更低的吸光度。

以与上述相同的方式再次培养如上述所选择的约60个菌株，并且然后经历茚三酮反应。结果，选择与用作亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P菌株相比，具有增加的L-精氨酸生产能力的前十种突变株。

实施例3：分析选择的随机突变株的L-精氨酸生产能力

为了最终从实施例2中选择的10种突变体中选择L-精氨酸生产能力可再生产地(reproducibly)增加的菌株，使用以下培养基进行烧瓶培养。在完成培养后，通过HPLC分析了培养物中L-精氨酸的浓度。将由每种突变株产生的L-精氨酸的浓度显示在以下表1中。

<生产培养基(pH 7.0)>

6％葡萄糖、3％硫酸铵、0.1％磷酸二氢钾、0.2％七水硫酸镁、1.5％玉米浆(CSL)、1％NaCl、0.5％酵母提取物、100mg/L生物素、3％CaCO₃(每升蒸馏水)

[表1]由10种选择的随机突变株产生的L-精氨酸的浓度

在10种选择的突变株中，最终选择KCCM10741P/mt-10作为其L-精氨酸生产能力显著增加的菌株。

实施例4：鉴定最终选择的菌株的L-精氨酸生产能力增加的原因

在该实施例中，为了鉴定通过随机插入转座子而缺失的基因，对在实施例3中最终选择的突变株进行实验。

从KCCM10741P/mt-10中提取基因组DNA，消化，并且然后连接，并将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中。将转化的大肠杆菌细胞涂布(plated)在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。选择20个转化的菌落，并且然后获得包含未知基因部分的质粒。使用EZ-Tn5^TM<R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome^TM试剂盒的引物1(SEQ ID NO：3)和引物2(SEQ ID NO：4)分析核苷酸序列。结果确认，缺失的和灭活的基因具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列，该SEQID NO：2的核苷酸序列编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

引物1(SEQ ID NO：3)：ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC

引物2(SEQ ID NO：4)：CTACCCTGTGGAACACCTACATCT

因此，为了确认包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质是否对蛋白质灭活之后生产L-精氨酸的能力有影响，选择上述基因作为缺失的候选基因。

实施例5：构建缺失包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因的重组载体

在该实施例中，为了确认包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因的灭活和L-精氨酸的产生的影响，构建了在生产L-精氨酸的棒状杆菌菌株的染色体上缺失实施例4中选择的基因的重组质粒。

首先，为了制备能够缺失棒状杆菌属的微生物染色体上的基因的重组载体，合成了表2中显示的引物3至6。

[表2]

具体而言，为了缺失基因的ORF区(SEQ ID NO：2)，合成了引物3(SEQ ID NO：5)、引物4(SEQ ID NO：6)、引物5(SEQ ID NO：7)和引物6(SEQ ID NO：8)，使得XhoI限制酶位点存在于5'末端和3'末端二者。使用上述引物3至6，利用谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P的染色体DNA作为模板，进行PCR。结果确认，对应于该部分——其中编码由该基因编码的蛋白质——的前部和后部的每个DNA片段分别被扩增500bp。在此，在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行总共30个循环的PCR：在94℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分钟。其后，在72℃下进行聚合反应，持续7分钟。接下来，用XhoI限制酶处理不能在谷氨酸棒状杆菌中复制的pDZ载体(韩国专利号10-0924065)，并且然后融合克隆获得的PCR产物。使用 HD克隆试剂盒(Clontech)进行融合克隆。其后，将所得物转化到大肠杆菌DH5α中，并且然后涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。

通过PCR选择用其中具有插入了期望基因的质粒转化的菌落，并且然后使用质粒提取技术分离质粒。质粒命名为“pDZ-ΔRS1”。

实施例6：构建谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P(其中缺失包括SEQ IDNO：2的核苷酸序列的基因)，并且评估构建的菌株的L-精氨酸生产能力

基于生产L-精氨酸的棒状杆菌属的菌株(其为KCCM10741P菌株)，构建了其中缺失包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因的菌株，并且评估了构建的菌株的L-精氨酸生产能力。

具体而言，通过染色体上的同源重组将实施例5中制备的重组质粒pDZ-△RS1转化入谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P——其为生产L-精氨酸的菌株(van der Rest等,ApplMicrobiol Biotechnol 52:541-545,1999)中。

接下来，使转化体在包含4％蔗糖的固体培养基平板上生长，以允许进行二次重组。在完成二次重组后，使用引物3和引物6通过PCR来确认转化的谷氨酸棒状杆菌菌株的染色体上的基因缺失。将重组菌株命名为“谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P-RS1”。

为了分析L-精氨酸生产能力，以下述方式培养构建的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P-RS1菌株和亲本菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P。

将亲本菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P和实施例6中构建的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P-RS1菌株中的每一个接种到包含25mL下述种子培养基(seed medium)的250mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养，持续20小时。接下来，将1mL的种子培养物中的每一个接种到包含24mL下述生产培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养，持续72小时。种子培养基的组成和生产培养基的组成如下。

<种子培养基(pH 7.0)>

20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH₂PO₄、8gK₂HPO₄、0.5gMgSO₄·7H₂O、100μg生物素、1mg硫胺素HCl、2mg泛酸钙、2mg烟酰胺(每升蒸馏水)

<生产培养基(pH 7.0)>

6％葡萄糖、3％硫酸铵、0.1％磷酸二氢钾、0.2％七水硫酸镁、1.5％玉米浆(CSL)、1％NaCl、0.5％酵母提取物、100mg/L生物素(每升蒸馏水)

在培养完成后，通过HPLC测量产生的L-精氨酸的量，并且将分析的L-精氨酸的浓度显示在以下表3中。

[表3]谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P——其中缺失包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因——的L-精氨酸生产能力的分析

基于上述结果确认，与亲本菌株相比，KCCM10741P-RS1——其中基因从谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P(即，生产L-精氨酸的菌株)中缺失——具有平均增加了25％的L-精氨酸生产能力。

将KCCM10741P-RS1菌株命名为“CA06-2830”，并且2017年12月15日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)，该中心是布达佩斯条约下的国际保藏机构，并且分配的登录号为KCCM12187P。

因此，确认了通过从棒状杆菌属的微生物中缺失包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因，可以提高L-精氨酸生产能力。

实施例7：构建用于减弱包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因的重组载体

为了构建能够减弱在棒状杆菌属的菌株的染色体上包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因的重组载体，将该基因的起始密码子由ATG替换为TTG以减弱该基因。此外，为了构建其片段，合成以下表4中显示的引物3和引物7至9。

[表4]

为了扩增该基因的ORF区(SEQ ID NO：2)，合成了引物3(SEQ ID NO：5)、引物7(SEQID NO：9)、引物8(SEQ ID NO：10)和引物9(SEQ ID NO：11)，使得XhoI限制酶位点存在于5'末端和3'末端二者。使用引物3、引物7、引物8和引物9，利用谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P的染色体DNA作为模板进行PCR。在此，在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行总共30个循环的PCR：在94℃下变性30秒，在56℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分钟。此后，在72℃下进行聚合反应，持续7分钟。接下来，用XhoI限制酶处理不能在谷氨酸棒状杆菌中复制的pDZ载体(韩国专利号10-0924065)，并且然后融合克隆获得的PCR产物。使用 HD克隆试剂盒(Clontech)进行融合克隆。然后，将所得物转化入大肠杆菌DH5α中，并且然后涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上。

通过PCR选择用具有其中插入了期望基因的质粒转化的菌落，并且然后使用质粒提取技术分离质粒。该质粒命名为“pDZ-ΔRS2”。

实施例8：构建谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P，其中包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因被减弱，并且评估构建的菌株的L-精氨酸生产能力

通过染色体上的同源重组将实施例7中制备的重组质粒pDZ-△RS2转化入谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P——其为生产L-精氨酸的菌株(van der Rest等,Appl MicrobiolBiotechnol 52:541-545,1999)中。

接下来，使转化体在含有4％蔗糖的固体培养基平板上生长，以允许进行二次重组。使用引物3和引物9分析在二次重组后获得的转化的谷氨酸棒状杆菌菌株的核苷酸序列，以鉴定菌株——其中包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因的起始密码子被TTG取代。将重组菌株命名为“谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P-RS2”。

为了分析L-精氨酸生产能力，以与实施例6中相同的方式培养亲本菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P和上述构建的谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P-RS2菌株中的每一个。其后，通过HPLC测量产生的L-精氨酸的量，并且将分析的L-精氨酸的浓度显示在以下表5中。

[表5]谷氨酸棒状杆菌KCCM10741P——其中包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因被减弱——的L-精氨酸生产能力的分析

如上述结果显示，确认当生产L-精氨酸的菌株KCCM10741P中包括SEQID NO：2的核苷酸序列的基因减弱时，该菌株的L-精氨酸生产能力平均增加了12％。

因此，确认了通过减弱棒状杆菌属的微生物中包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因的表达，可以提高L-精氨酸生产能力。

从以上结果可以看出，在缺失或减弱包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因的菌株中，L-精氨酸生产能力增加，这表明当由该基因编码的蛋白质的活性被灭活时，L-精氨酸可以在微生物中大量产生。

虽然已经参考具体地示意性实施方式描述了本公开内容，但是本公开内容所属领域的技术人员将理解，本公开内容可以在不背离本公开内容的技术精神或必要特征的情况下以其他特定形式实施。因此，上述实施方式在所有方面都被认为是示意性的而非限制性的。此外，本公开内容的范围由所附权利要求书限定，而不是由详细描述限定，并且应当理解，源自本公开内容的含义和范围及其等同物的所有修改或变化都包括在所附权利要求书的范围内。

[登录号]

保藏机构：韩国微生物保藏中心(KCCM)(国际保藏机构)

登录号：KCCM12187P

保藏日期：2017年12月15日

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 生产L-精氨酸的棒状杆菌属的微生物和使用其生产L-精氨酸的方法

<130> OPA18459

<150> KR 10-2017-0175046

<151> 2017-12-19

<160> 11

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 356

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒状杆菌

<400> 1

Val Leu Leu Arg Ala Glu Glu Val Val Arg Gln Gly Gln Arg Gly Ile

1 5 10 15

Lys Leu His Val Glu Ala Gln His Glu His His His His Arg His Leu

20 25 30

Ser Thr Ile Lys Glu Leu Leu Val Asn Ala Asp Ile Pro Ala Gln Thr

35 40 45

Lys Gln Asp Ala Leu Gly Val Phe Glu Leu Ile Ala Ile Ala Glu Gly

50 55 60

Lys Val His Gly Ile Glu Pro Glu Lys Ile His Phe His Glu Val Gly

65 70 75 80

Ala Trp Asp Ser Ile Ala Asp Ile Val Gly Val Cys Glu Ala Ile Arg

85 90 95

Gln Leu Asn Pro Gly Leu Ile Ala Ala Ser Pro Ile Ala Leu Gly Phe

100 105 110

Gly Arg Ile Lys Ala Ala His Gly Asp Ile Pro Val Pro Val Pro Ala

115 120 125

Val Ala Glu Leu Val Lys Gly Trp Pro Thr Gln Thr Gly Ala Leu Met

130 135 140

Glu Ser Thr Glu Pro Val Gly Glu Leu Ala Thr Pro Thr Gly Val Ala

145 150 155 160

Leu Ile Arg His Phe Ala Thr Gln Asp Gly Pro Phe Pro Gly Gly Ile

165 170 175

Ile Asn Glu Val Gly Ile Gly Ala Gly Thr Lys Asp Thr Ala Gly Arg

180 185 190

Pro Asn Val Val Arg Ala Val Leu Phe Ser Thr Ser Gly Lys Ala Ala

195 200 205

Ser Asn Pro Asp Thr Arg Thr Leu Val Gln Leu Glu Ala Asn Val Asp

210 215 220

Asp Gln Asp Pro Arg Leu Trp Pro Gly Val Ile Glu Ser Leu Phe Ala

225 230 235 240

Ala Gly Ala Val Ala Ala Trp Leu Thr Pro Ile Leu Met Lys Lys Gly

245 250 255

Arg Pro Ala His Thr Val Ser Ala Leu Val Asp Ser Ser Glu Val Glu

260 265 270

Ala Val Lys Thr Ala Leu Phe Ala Ala Thr Thr Thr Phe Gly Val Arg

275 280 285

Ser Trp Glu Val Gln Arg Glu Gly Leu Asp Arg Arg Phe Glu Gln Val

290 295 300

Glu Val Asp Gly Arg Thr Ile Asn Ile Lys Ile Gly Ser Arg Asn Gly

305 310 315 320

His Asp Ile Ser Ala Gln Pro Glu Phe Glu Asp Ile Arg Ser Ala Ala

325 330 335

Val Ala Leu Gly Ile Ser Glu Arg Glu Val Val Ala Arg Ile Pro Gln

340 345 350

Gly Thr Thr Glu

355

<210> 2

<211> 1071

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌

<400> 2

gtgcttttga gagcagaaga ggtagtgcgc caaggccaac gaggcatcaa actacatgta 60

gaagcacaac atgaacacca ccatcaccgc catttgagca ccattaaaga actgcttgtc 120

aatgctgaca tccctgcaca aaccaagcag gatgccttag gcgtttttga actcatcgct 180

atcgctgaag gaaaagtcca cggcatcgag ccggagaaaa tccacttcca tgaggtagga 240

gcttgggatt ccatcgcaga cattgtgggt gtgtgcgaag cgatcaggca gcttaaccca 300

ggtttgattg ctgcatctcc gattgcttta ggattcggac gcatcaaggc agctcacgga 360

gacattccag tgccagttcc agcagtggca gagctggtga aaggctggcc cacccaaacc 420

ggagctctta tggagagcac cgaacctgtt ggtgaattag ccaccccaac tggtgttgcg 480

ttgatccgtc actttgccac ccaagatggc cctttcccag gtggcatcat caatgaagtc 540

ggtatcggcg caggaactaa ggacaccgca gggcgtccca atgtggtgcg cgcggtcctg 600

ttcagcacct ccggtaaggc tgcctcaaac ccagacaccc gtaccctcgt gcaattggaa 660

gccaacgttg atgatcaaga cccacggctg tggccaggag taatagagag cctctttgcc 720

gctggcgcag tagctgcatg gctgactcca attttgatga agaagggccg tcctgcacat 780

acggtgtcag cattggtgga tagctccgag gtggaagcag tgaaaaccgc attatttgca 840

gccaccacga cttttggggt cagatcatgg gaagtccagc gagaagggtt ggatcgtcgt 900

ttcgaacaag tcgaggtgga cggacgcacc atcaacatca agattggctc ccgaaatggc 960

cacgacatca gtgcacagcc cgagtttgaa gatattcggt ctgcagcggt ggccttggga 1020

atttcagaga gggaagttgt ggcaagaatt ccgcaaggca ccactgagta a 1071

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物1

<400> 3

acctacaaca aagctctcat caacc 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物2

<400> 4

ctaccctgtg gaacacctac atct 24

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物3

<400> 5

ccgctcgaga catcgaaatc gtaagggta 29

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物4

<400> 6

cagcattgac aagcagttct 20

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物5

<400> 7

agaactgctt gtcaatgctg ggccctttcc caggtggcat 40

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物6

<400> 8

ccgctcgaga aggccaccgc tgcagaccg 29

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物7

<400> 9

gatccacagt cccaatattc tcgcttcttc 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物8

<400> 10

gaagaagcga gaatattggg actgtggatc 30

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物9

<400> 11

ccgctcgagc agcattgaca agcagttct 29

PCT/RO/134表

Claims

1.一种生产L-精氨酸的棒状杆菌属的微生物，其中包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质被灭活。

2.根据权利要求1所述的棒状杆菌属的微生物，其中所述蛋白质通过由SEQ ID NO：2的核苷酸序列组成的基因编码。

3.根据权利要求1所述的棒状杆菌属的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌。

4.用于生产L-精氨酸的方法，其包括：

在培养基中培养根据权利要求1至3中任一项所述的微生物。

5.根据权利要求4所述的用于生产L-精氨酸的方法，其进一步包括：

从所述微生物或所述培养基回收L-精氨酸。