CN109929787A - 产生imp的微生物及利用其生产imp的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及产生5’‑肌苷酸的棒状杆菌属的微生物，其具有增强的IMP输出蛋白的活性；以及利用其制备5’‑肌苷酸的方法。

Description

产生IMP的微生物及利用其生产IMP的方法
技术领域
本公开内容涉及具有增强的IMP输出蛋白活性的产生5’-肌苷酸的棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物以及利用该微生物生产5’-肌苷酸的方法。
背景技术
5’-肌苷酸(以下称为“IMP”)，是一种基于核酸的物质，是核酸代谢途径中的中间体，并且用于各种领域如食品、药物和各种医疗应用。特别地，IMP与5’-鸟嘌呤单磷酸(以下称为“GMP”)一起被广泛用作食品调味添加剂或食品。虽然已知IMP本身具有牛肉味道，但也已知的是其增强了谷氨酸一钠(MSG)的风味；因此，IMP作为一种可口的基于核酸的调味品引起了诸多关注。
用于制备IMP的方法的例子包括对从酵母细胞提取的核糖核酸进行酶促降解的方法(日本专利公开第1614/1957号)、对通过发酵产生的肌苷进行化学磷酸化的方法(Agri.Biol.Chem.，36，1511等)、以及培养直接产生IMP的微生物并在培养基中回收IMP的方法。在这些方法中，使用最广泛的是使用能够直接生产IMP的微生物的方法。
为了使用通过微生物发酵直接生产IMP的方法以高产率生产IMP，IMP应当被顺利地输出。为了实现这样的目的，本发明人进行了广泛的研究，并研究了涉及IMP输出能力的输出蛋白；结果他们识别了参与IMP输出的蛋白质ImpE1和ImpE2。已经确认，当参与IMP输出的蛋白质ImpE1和ImpE2的活性增强时，IMP浓度增加，由此完成了本公开内容。
发明内容
[技术问题]
本公开内容的一个目的是提供产生IMP的棒状杆菌属的微生物，其具有增强的IMP输出蛋白活性。
本公开内容的另一目的是提供用于制备IMP的方法，所述方法包括：在培养基中培养棒状杆菌属微生物；以及从微生物或培养基中回收IMP。
[技术解决方案]
在下文中，将详细描述本公开内容。同时，本公开内容中公开的每个描述和实施方案可以分别应用于其他描述和实施方案。即，本公开内容中公开的各种要素的所有组合均落入本公开内容的范围内。此外，以下公开的具体描述不应被解释为限制本公开内容的范围。
为了实现上述目的，本公开内容的一个方面是提供一种产生IMP的棒状杆菌属的微生物，其具有增强的IMP输出蛋白活性。
如本文所用的，术语“5’-肌苷酸输出蛋白”是指参与5’-肌苷酸(IMP)的胞外输出的蛋白质。对于本公开内容的目的，上述术语可与具有IMP输出能力的蛋白、具有5’-肌苷酸输出能力的蛋白、IMP输出蛋白等互换使用，并且可以具体表示为ImpE，更具体地为ImpE1和ImpE2，但不限于此。另外，该蛋白质可以来源于棒状杆菌属，具体为停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)，但不限于此。例如，明显的是可以使用来源于停滞棒杆菌的具有IMP输出能力和与之相对应的效果的蛋白质作为本公开内容的蛋白质。
该蛋白质可以由例如SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列组成，但包括与该蛋白质具有相同活性的序列，并且本领域技术人员可以从众所周知的数据库NCBI的GenBank获得序列信息。另外，该蛋白质可以包括SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，但不限于此。具体而言，IMP输出蛋白可以包含SEQ ID NO：1或2、或与SEQ IDNO：1或2具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的多肽。另外，明显的是，可以使用一些序列缺失、修饰、替代或增加的蛋白质作为本公开内容的蛋白质，只要其氨基酸序列具有上述同源性并表现出对应于该蛋白质的效果即可。
另外，明显的是，还可以包括如下多核苷酸；其可以通过密码子简并性翻译成由SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列组成的蛋白质或翻译成与其具有同源性的蛋白质。例如，蛋白质可以由SEQ ID NO：3或4的多核苷酸序列组成。另外，可以包括而不限于以下序列：其通过与可由已知基因序列制备的探针(例如与全部或部分核苷酸序列的互补序列)在严格条件下杂交来编码具有由SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列组成的蛋白质的活性的蛋白质。术语“严格条件”是指允许多核苷酸之间进行特异性杂交的条件。这些条件在文献中具体描述(例如，J.Sambrook等，Sangdong)。例如，严格条件可以包括其中具有高同源性(例如，40％或更多、具体地90％或更多、更具体地95％或更多、甚至更具体地97％或更多且最具体地99％或更多)的基因可以在它们之间杂交而具有较低同源性的基因不能彼此杂交的条件；或针对常规的southern杂交的条件(即在对应于60℃、1×SSC和0.1％SDS；具体地在60℃、0.1×SSC和0.1％SDS；并且更具体地在68℃、0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度和温度下洗涤一次并且具体地洗涤两次或三次的条件)。
杂交需要两个核酸具有互补序列，但是，碱基之间的错配也是可能的，其取决于杂交的严格程度。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开内容还可以包括基本上相似的核酸序列以及与整个序列互补的分离核酸片段。
具体地，可以使用包括在55℃Tm值下的杂交步骤的杂交条件及使用上述条件来检测具有同源性的多核苷酸。此外，该Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此；并且可以由本领域技术人员根据其目的适当地调整。
杂交多核苷酸的合适严格性取决于多核苷酸的长度和互补性，并且变量是本领域公知的(请参阅Sambrook等，同上，9.50-9.51，11.7-11.8)。
术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性的百分比。该术语是指给定的氨基酸序列或核苷酸序列一致的程度，并且可以以百分比表示。在本公开内容中，具有与给定氨基酸或核苷酸序列相同或相似的活性的同源序列表示为“％同源性”。从一个部分到另一个部分的序列之间的同源性可以通过本领域已知的技术来确定。可以通过例如标准软件，特别是计算参数如分数、同一性、相似性等的BLAST 2.0，或通过在Southern杂交实验中在限定的严格条件下比较序列和定义本领域技术范围内的合适杂交条件来确定同源性序列，并且可以通过本领域技术人员熟知的方法确定同源性序列(即，J.Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratorypress，Cold Spring Harbor，纽约，1989；FM Ausubel等Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，Inc.，纽约)。
如本文所用的，术语“活性增强”是指引入蛋白质的活性，或者指与内源性活性或微生物修饰之前的活性相比改善了活性。活性的“引入”是指出现了特定蛋白质的活性，其是非天然地或人工地遗传给微生物的。“内源性活性”是指当通过由天然或人工因素引起的遗传变异转化微生物时转化前的亲本菌株原来具有的特定蛋白质的活性。
例如，活性增强可以包括通过将外源性IMP输出蛋白引入宿主细胞或增加内源性IMP输出蛋白的活性来增强活性。
具体而言，在本公开内容中，活性的增强可以通过以下方法进行：
1)增加编码酶的多核苷酸的拷贝数；
2)修饰用于增加多核苷酸表达的表达调控序列；
3)修饰染色体上的多核苷酸序列以增强酶的活性；或者
4)它们的组合，所述方法不限于此。
在上述方法1)中，可以通过将多核苷酸可操作地连接至载体或通过将其插入宿主细胞的染色体中来增加编码酶的多核苷酸的拷贝数，但不限于此于此。另外，在一个实施方案中，可以通过将表现出酶活性的外源多核苷酸或其中针对上述多核苷酸优化了密码子的变体形式多核苷酸引入宿主细胞来增加拷贝数。可以使用外源性多核苷酸，而不限其来源或序列，只要其显示出相同/相似的酶活性即可。本领域技术人员可以通过适当选择已知的转化方法来实施引入，并且可以通过在宿主细胞中表达所引入的多核苷酸生产酶来增加其活性。
另外，2)用于增加多核苷酸表达的表达调控序列的修饰，可以通过以下进行，但不限于此：可以通过经由缺失、插入、非保守或保守替换核苷酸序列或其组合引起对表达调控序列的修饰；或通过用具有更强活性的核苷酸序列替代表达调控序列。表达调控序列包括但不特别限于启动子、操纵子序列、用于编码核糖体结合位点的序列和调控转录和翻译终止的序列。具体而言，可以在多核苷酸表达单元的上游连接异源强启动子而不是原始启动子，并且强启动子的实例可以包括CJ7启动子、lysCP1启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动子等。编码酶的多核苷酸的表达速率可以通过将启动子与多核苷酸可操作地连接来提高，但不限于此。
此外，3)染色体上的多核苷酸序列的修饰可以通过以下进行，但并不特别限于此：通过经由缺失、插入、非保守或保守性替换多核苷酸序列或其组合引起表达调控序列上的变异以便进一步增强多核苷酸序列的活性，或者通过用经修饰以具有更强活性的多核苷酸序列取代该序列。
最后，4)可以通过应用如下方法中的一种或多种方法来实施通过1)至3)的组合进行用于增强的修饰方法：增加编码酶的多核苷酸的拷贝数的方法、修饰用于增强多核苷酸表达的多核苷酸序列的方法、和修饰染色体上的多核苷酸序列并修饰显示出酶活性的外源多核苷酸或其中密码子被优化的变体形式的多核苷酸的方法。
如本文所用的，术语“载体”是指含有编码期望蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，其可操作地连接至合适的调控序列，使得期望蛋白质在合适的宿主细胞中表达。调控序列可以包括能够起始转录的启动子，用于调控转录的任何操纵子序列、编码合适mRNA核糖体结合位点的序列、以及调控转录和翻译终止的序列。在合适的宿主细胞中转化后，载体可以被复制或执行其功能，而不管宿主基因组如何，或者可以被整合到基因组本身中。
用于本公开内容的载体不受特别限制，只要其可以在宿主细胞中表达即可，并且可以使用本领域已知的任何载体。常用载体的实例包括天然或重组的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A作为噬菌体载体或粘粒载体；并且可以使用基于pBR、基于pUC、基于pBluescriptII、基于pGEM、基于pTZ、基于pCL和基于pET的质粒载体作为质粒载体。具体而言，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、和pCC1BAC载体，但载体不限于此。
可以在本公开中使用的载体不受特别限制，并且可以使用已知的表达载体。另外，可以通过用于胞内染色体插入的载体将编码目标蛋白质的多核苷酸插入染色体中。可以通过任何方法、例如通过同源重组来将多核苷酸插入染色体中，但不限于此。该载体还可以包括用于指示载体插入染色体中的选择标志物。为了适应于指示用载体转化的细胞即靶基因是否插入宿主细胞的基因组中，选择标志物可以为细胞提供显示耐药性、细胞毒性剂抗性、营养缺陷型或可选择性的表型表达如表面蛋白表达的能力。在其中选择剂进行处理的环境中，只有表达选择标志物的细胞才存活或表达另一表型，因此可以选择转化的细胞。
如本文所用，术语“转化”是指将含有编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞中，使得由该多核苷酸编码的蛋白能够在宿主细胞中表达。转化的多核苷酸就可以是任意一种，而与位置无关，只要该多肽能够在宿主细胞中表达即可，不论该多核苷酸是插入并置于宿主细胞的染色体中或位于染色体的外部。另外，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任意的形状被引入，只要多核苷酸能够被导入待表达的宿主细胞中即可。例如，可以将多核苷酸作为表达盒形式引入宿主细胞中，所述表达盒形式是包括自身表达所需的所有因子的基因结构。表达盒可以包括可操作地连接至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是执行自我复制的表达载体。另外，可以将多核苷酸本身引入宿主细胞中以与宿主细胞中表达所需的序列可操作地连接，但不限于此。转化方法包括将核酸引入细胞中的任意方法，并且可以通过选择本领域已知的合适标准技术来进行。例如，该方法的实例可以包括电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀，显微注射、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术和乙酸锂-DMSO技术，但不限于此。
另外，术语“可操作地连接”是指起始和介导编码本公开内容的靶蛋白的多核苷酸的转录的启动子序列与多核苷酸序列之间的功能连接。可以使用本领域已知的基因重组技术来制备可操作的连接，并且可以使用本领域已知的限制性内切酶和连接酶进行位点特异性DNA剪切和连接，但不限于此。
如本文所用的，术语“产生IMP的棒状杆菌属的微生物”是指具有通过其天然形式或变种产生IMP的能力的棒状杆菌属的微生物。具体而言，在本公开内容中，产生IMP的棒状杆菌属的微生物是指通过插入与天然菌株本身或外源性IMP的产生机制相关的基因，或通过增强或削弱内源性基因的活性而具有提高的产生IMP的能力的微生物。更具体而言，产生IMP的棒状杆菌属的微生物是指与转化前的亲本菌株或未经修饰的微生物相比产生IMP的能力得到提高的微生物。
在本公开内容中，“棒状杆菌属的微生物”可以具体为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、Corynebacterium efficiens、停滞棒杆菌等，但不限于此。更具体而言，在本公开内容中，棒状杆菌属的微生物可以是停滞棒杆菌。棒状杆菌属的微生物的一个具体实例可以是停滞棒杆菌，其中通过增强具有将IMP输出到细胞外部的功能的蛋白质的活性来提高产生IMP的能力，但不限于此。
本公开内容的另一方面提供了一种用于制备IMP的方法，所述方法包括：在培养基中培养具有增强的IMP输出蛋白活性的棒状杆菌属的微生物；以及从微生物和/或培养基中回收IMP。
在该方法中，可以通过本领域已知的分批培养、连续培养和补料分批培养来培养微生物。此外，关于培养条件，可以使用碱性化合物(即，氢氧化钠、氢氧化钾或氨水)或酸性化合物(即磷酸或硫酸)来维持合适的pH(即pH 5至9，具体地pH 6至8，并且最具体地pH6.8)。另外，可以通过将氧气或含氧气体混合物引入培养物中来保持需氧条件。培养温度可保持在20℃至45℃，特别是25℃至40℃。此外，培养时间可为约10至160小时。然而，培养条件不限于此。可以将通过上述培养产生的IMP分泌到培养基中或可以将其保留在细胞内。
此外，用于培养的培养基可以单独或以组合方式包含糖和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如甘油和乙醇)和有机酸(例如乙酸)作为碳源，但是培养基不限于此。另外，用于培养的培养基可以单独或以组合方式包含含氮有机化合物(例如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆(corn solution)、豆粕粉和尿素)、或无机化合物(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)作为氮源，但培养基不限于此。另外，用于培养的培养基可以单独或以组合方式包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与其对应的含钠盐作为磷源，但培养基不限于此。另外，培养基可以包含其他必需的生长模拟物质，包括金属盐(例如硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。
用于回收由上述培养方法产生的IMP的本公开方法可以根据培养方法使用本领域已知的合适方法来从培养基中收集期望的IMP。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的合适方法从培养基或微生物中回收期望的IMP。
另外，上述回收方法可以包括纯化过程，并且可以使用本领域已知的合适方法来进行。因此，回收的IMP可以为纯化形式或为含有IMP的微生物发酵肉汤。
[有利效果]
在本公开内容中，可以使用具有增强的IMP输出蛋白活性的、产生IMP的棒状杆菌属的微生物来制备IMP。
具体实施方式
在下文中，将结合示例性实施方案详细地描述本公开内容。然而，本文公开的示例性实施方案仅用于举例说明的目的，而不应被解释为限制本公开内容的范围。
实施例1：生成基因组DNA文库
生成停滞棒杆菌ATCC6872的基因组DNA文库以识别参与IMP输出的棒状杆菌的膜蛋白。
之后，由于棒状杆菌属的野生型菌株不能产生IMP或产生非常少量的IMP，所以制备了源自ATCC6872的具有产生IMP能力的菌株CJI0323以确认产生IMP的能力。ATCC6872的基因组DNA文库被转化到了所制备的菌株CJI0323中，然后筛选出参与IMP输出的野生型膜蛋白。具体实验如下。
实施例1-1：选择产生IMP的菌株CJI0323
为了制备源自ATCC6872的产生IMP的菌株，将ATCC6872(107个细胞/mL至108个细胞/mL)悬浮于磷酸盐缓冲液(pH 7.0)或柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)中，然后通过UV处理来诱导突变。用0.85％的盐水溶液将产物洗涤两次，然后稀释并涂布在培养基上，所述培养基为含有待对抗的适当浓度物质的、含有1.7％琼脂的基本培养基。之后获得菌落。将每个菌落在营养培养基中培养并在种子培养基中培养24小时。在发酵培养基中培养3至4天后，选择在培养基中累积产生的IMP量最高的菌落。为了产生高浓度的IMP生产菌株以及提供腺嘌呤营养缺陷型、鸟嘌呤渗漏、溶菌酶易感性、3，4-二氢脯氨酸抗性、链霉素抗性、氮杂环丁烷羧酸抗性、硫代脯氨酸抗性、重氮丝氨酸抗性、磺胺脒抗性、正缬氨酸抗性和甲氧苄氨嘧啶抗性，对每种物质依次进行上述操作。最终选择对上述物质有抗性并且具有优良IMP生产能力的CJI0323。下表1显示了ATCC6872与CJI0323的抗性比较。
[表1]
性能 ATCC6872 CJI0323
腺嘌呤营养缺陷型 非营养缺陷型 营养缺陷型
鸟嘌呤渗漏 非营养缺陷型 渗漏缺陷型
溶菌酶易感性 80μg/mL 8μg/mL
3，4-二氢脯氨酸抗性 1000μg/mL 3500μg/mL
链霉素抗性 500μg/mL 2000μg/mL
氮杂环丁烷羧酸抗性 5mg/mL 30mg/mL
硫代脯氨酸抗性 10μg/mL 100μg/mL
重氮丝氨酸抗性 25μg/mL 100μg/mL
磺胺脒抗性 50μg/mL 200μg/mL
正缬氨酸抗性 0.2mg/mL 2mg/mL
甲氧苄氨嘧啶抗性 20μg/mL 100μg/mL
培养基的组成如下：
-基本培养基：2％葡萄糖、0.3％硫酸钠、0.1％KH2SO4、0.3％K2HPO4、0.3％硫酸镁、氯化钙(10mg/L)、硫酸铁(10mg/L)、硫酸锌1mg/L)、氯化锰(3.6mg/L)、L-半胱氨酸(20mg/L)、泛酸钙(10mg/L)、盐酸硫胺素(5mg/L)、生物素(30μg/L)、腺嘌呤(20mg/L)、鸟嘌呤(20mg/L)，pH7.3
-营养培养基：1％蛋白胨、1％肉汁、0.25％氯化钠、1％酵母提取物、2％琼脂、pH7.2
-种子培养基：1％葡萄糖、1％蛋白胨、1％肉汁、1％酵母提取物、0.25％氯化钠、腺嘌呤(100mg/L)、鸟嘌呤(100mg/L)，pH7.5
-发酵培养基：0.1％谷氨酸钠、1％氯化铵、1.2％硫酸镁、0.01％氯化钙、硫酸铁(20mg/L)、硫酸锰(20mg/L)、硫酸锌(20mg/L)、硫酸铜(5mg/L)、L-半胱氨酸(23mg/L)、丙氨酸(24mg/L)、烟酸(8mg/L)、生物素(45μg/L)、盐酸硫胺素(5mg/L)、腺嘌呤(30mg/L)、1.9％磷酸(85％)、2.55％葡萄糖、1.45％果糖
实施例1-2：CJI0323发酵效价的实验
将种子培养基(2mL)分配到试管(18mm直径)中，然后高压蒸汽灭菌并各自用ATCC6872和CJI0323接种。之后，将产物在30℃振荡培养24小时，然后将其用作种子培养液。将发酵培养基(29mL)分配到锥形烧瓶(250mL)中并在121℃高压蒸汽灭菌15分钟。之后，将每个种子培养液(2mL)接种到其中，然后将产物培养3天。培养条件设定为170转每分，温度为30℃，pH为7.5。
培养后，使用HPLC(SHIMAZDU LC20A)测量产生的IMP的量，并且将培养结果示于下表2中。
[表2]
菌株 IMP(g/L)
ATCC6872 0
CJI0323 9.52
实施例1-3：发现输出蛋白
通过在补充有1.7％琼脂的基本培养基中另外添加IMP来确定表现出菌株CJI0323生长抑制的筛选条件。使用电穿孔(van der Rest等，1999)将ATCC6872的基因组文库质粒转化到菌株CJI0323中。选择了其中在补充有过量IMP的培养基条件下生长减少被解除的菌落。从选择的菌落获得质粒并通过测序技术进行分析。综上所述，在添加过量IMP的条件下，识别了一种参与解除生长减少的膜蛋白。
这一种棒状杆菌属膜蛋白被识别为SEQ ID NO：2的氨基酸序列和SEQ ID NO：4的核苷酸序列(NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795121、MFS转运蛋白)。该膜蛋白被称为MFS转运蛋白，但其特定功能尚未被证实，并且其在IMP输出方面的功能仍然未知。在本公开内容中，将该膜蛋白命名为ImpE2(WT)。
实施例2：识别ImpE1和ImpE2
实施例2-1：确认impE1和impE2
为了检查膜蛋白ImpE2的功能，在NCBI(NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795121、MFS转运蛋白)中识别出了SEQ ID NO：4的基因结构。已证实，SEQ ID NO：4(impE2)与位于impE2(NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795119，转录调节子)上游的基因的ORF的7bp起始部分有重叠。由位于impE2上游的基因或相应基因编码的蛋白质的功能尚未得到证实；在本公开内容中，将这样的蛋白质命名为ImpE1(WT)(SEQ ID NO：1的氨基酸序列和SEQ ID NO：3的核苷酸序列)。
实施例2-2：制备impE1或impE2缺陷型载体
为了确定参与解除IMP引起的生长减少并且通过实施例1和2-1识别的ImpE1或ImpE2缺失时IMP输出能力是否降低，尝试对每个基因制备缺陷型载体。
使用ATCC6872的基因组DNA作为模板通过PCR获限制性内切酶得用于构建载体的基因片段。
具体地，使用SEQ ID NO：5和6的引物以及SEQ ID NO：7和8的引物对impE1进行PCR；以及使用SEQ ID NO：9和10的引物和SEQ ID NO：11和12的引物对impE2进行PCR(表3)。
[表3]
所使用的引物是基于在NIH GenBank登记的停滞棒杆菌(ATCC6872)基因(NCBIGenbank：NZ_CP014279)的信息和与其相邻的碱基序列制作的。
PCR按如下进行：在94℃变性5分钟，然后重复25次循环，包括在94℃变性30秒、在52℃退火3分钟、和在72℃聚合1分钟，然后在72℃聚合5分钟。使用基因impE1的两个片段作为模板进行重叠聚合酶链式反应，其使用SEQ ID NO：5和6的引物以及SEQ ID NO：7和8的引物进行增强。结果，获得了多核苷酸模板(1.8kbp)。将所获得的基因片段用限制性内切酶XbaI消化。使用pDZ载体(韩国专利第10-0924065号和国际专利公开第2008-033001号)制备pDZ-ΔimpE1，其是利用T4连接酶、通过用限制酶XbaI消化基因片段而获得的。此外，使用通过SEQ ID NO：9和10的引物增强的基因impE2的片段和通过SEQ ID NO：11和12的引物增强的基因impE2的两个片段作为模板进行重叠聚合酶链式反应，并获得多核苷酸模板(1.7kbp)。将所获得的基因片段用限制性内切酶XbaI和SpeI消化。使用T4连接酶将基因片段克隆到用限制性酶XbaI消化的pDZ载体中，然后制备pDZ-ΔimpE2。
实施例2-3：制备impE1和impE2缺陷型载体
由于编码参与解除IMP引起的生长减少的蛋白质的基因impE1和impE2重叠，因此需要同时调控两种基因。因此，尝试制备其中impE1和impE2均缺失的载体。
对于impE1和impE2的PCR，使用SEQ ID NO：5和13的引物以及SEQ ID NO：14和12的引物。使用的引物是基于在NIH GenBank登记的停滞棒杆菌(ATCC6872)基因(NCBIGenbank：NZ_CP014279)的信息和与其相邻的碱基序列制作的。使用通过SEQ ID NO：5和13的引物增强的基因impE1的片段和通过SEQ ID NO：14和12的引物增强的基因impE2的两个片段作为模板进行重叠聚合酶链式反应，并且获得多核苷酸模板(2.0kbp)。将所获得的基因片段分别用XbaI和SpeI消化。使用T4连接酶将基因片段克隆到用限制性酶XbaI消化的pDZ载体中，然后制备pDZ-ΔimpE1E2。
实施例2-4：制备impE1-和impE2-缺陷型菌株
通过电穿孔(使用Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545中公开的转化方法)将实施例2-2中制备的两种质粒和实施例2-3中制备的一种质粒各自转化到CJI0323中。在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中载体通过同源序列重组插入到染色体上的菌株。对所选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO：5和8、SEQ ID NO：9和12、和SEQ ID NO：5和12的引物对进行PCR来确定最终转化的菌株中的基因缺陷。
将所选择的菌株命名为CJI0323_ΔimpE1、CJI0323_ΔimpE2和CJI0323_ΔimpE1E2。另外，评估了上述菌株产生IMP的能力。
将种子培养基(2mL)分配到试管(18mm直径)中，然后进行高压蒸汽灭菌，并分别接种CJI0323、CJI0323_ΔimpE1、CJI0323_ΔimpE2和CJI0323_ΔimpE1E2。之后，将产物在30℃振荡培养24小时，然后用作种子培养液。将发酵培养基(29mL)分配到用于摇动的锥形烧瓶(250mL)中并在121℃高压蒸汽灭菌15分钟。之后，将每种种子培养液(2mL)接种到培养液中，并且将产物培养3天。培养条件设定为170转每分，温度为30℃，pH为7.5。
在培养完成后，通过HPLC测量产生的IMP的量，并且将培养结果示于下表4中。
[表4]
菌株 IMP(g/L)
CJI0323 9.52
CJI0323_ΔimpE1 1.92
CJI0323_ΔimpE2 1.88
CJI0323_ΔimpE1E2 1.80
将每种菌株中累积的IMP量与亲本菌株停滞棒杆菌CJI0323进行比较。结果发现，如上表4所示，与亲本菌株相比，在相同条件下，菌株CJI0323_ΔimpE1、CJI0323_ΔimpE2和CJI0323_ΔimpE1E2的IMP浓度降低约8g/L，其确认ImpE1和ImpE2是参与IMP输出的蛋白质。
实施例3：增强野生型impE1和impE2
棒状杆菌属的野生型菌株不能产生IMP或产生非常少量的IMP。因此，在产生IMP的菌株CJI0323中，敲除蛋白质ImpE并随后通过导入野生型蛋白质ImpE来恢复，并进一步增强了ImpE的活性；由此确认输出IMP的能力得到提高。
实施例3-1：制备引入野生型impE1-和impE2的载体
为了确认当预期参与IMP输出的ImpE1和ImpE2的活性增强时输出的IMP能力是否增加，尝试制备其中引入CJI0323的野生型ImpE的菌株。利用ATCC6872基因组DNA作为模板通过PCR获得用于制备载体的基因片段。对于野生型impE1和impE2的PCR，使用SEQ ID NO：5和12的引物。用限制性内切酶XbaI和SpeI处理通过SEQ ID NO：5和12的引物增强的野生型impE1-impE2基因的全部片段，然后将其克隆到pDZ载体的XbaI限制性内切酶位点中来制备pDZ-impE1E2(WT)。
实施例3-2：制备野生型impE1增强的载体
为了确认当预期参与IMP输出的ImpE1的活性增强时输出IMP的能力是否增加，尝试为每种基因制备增强载体。使用“增加拷贝数”法(其为一种增强方法)进行以下实验。然而，基因impE1和impE2重叠，其确认了由于impE1或impE1和impE2整合的拷贝数增加引起的IMP生产能力增加，随后确认在impE2的拷贝数增加时的效果。
用ATCC6872基因组DNA作为模板，通过PCR获得用于制备载体的基因片段。为了增强impE1，使用SEQ ID NO：15和16的引物进行增强，该引物包括被认为是启动子区域的impE1上游约370bp。用限制性酶XbaI处理增强的impE1基因片段，然后克隆到pDZ载体的XbaI限制性内切酶位点中来制备pDZ-impE1(WT)2-1。之后，为了制备两个拷贝的载体，用SEQ ID NO：17和18的一对引物对impE1进行PCR。用DNA限制性内切酶NotI消化所获得的每个DNA片段并克隆到用相同的DNA限制性内切酶消化的pDZ-impE1(WT)2-1中。将所制备的载体命名为pDZ-impE1(WT)2X。
实施例3-3：制备野生型impE1-和impE2-增强载体
尝试通过制备其中impE1和impE2均得到增强的菌株来确认效果。对于野生型impE1和impE2的PCR，使用SEQ ID NO：15和19的引物来增强野生型impE1和impE2。用限制性内切酶XbaI处理增强的基因片段，然后克隆到pDZ载体的XbaI限制性内切酶位点中来制备pDZ-impE1E2(WT)2-1。之后，为了制备两个拷贝的载体，用SEQ ID NO：17和20的一对引物对impE1E2进行PCR。用DNA限制性内切酶NotI消化所获得的每个DNA片段，并将其克隆到用相同的DNA限制性内切酶消化的pDZ-impE1E2(WT)2-1中。将制备的载体命名为pDZ-impE1E2(WT)2X。
[表5]
实施例3-4：评价引入/增强野生型impE1和impE2的菌株
通过电穿孔(使用Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545)将在实施例3-1中制备的pDZ-impE1E2(WT)转化到CJI0323_ΔimpE1E2中。之后，在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中载体通过同源序列重组插入到染色体上的菌株。对所选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO：5和12的引物对进行PCR来确定最终转化的菌株中的基因导入。之后，评价所制备的菌株CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)，以确定将野生型impE1和impE2导入菌株CJI0323中时的IMP生产能力。
另外，使用电穿孔将载体pDZ-impE1(WT)2X和pDZ-impE1E2(WT)2X转化到菌株CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)中，然后在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中载体通过同源序列重组将插入到染色体上的菌株。对所选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO：15和18以及SEQ ID NO：15和20的引物对进行PCR来确定最终转化的菌株中的基因增强。以与实施例2-4中相同的方式培养CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(，WT)、CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_impE1(WT)2X、和CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_impE1E2(WT)2X以获得菌株，并且评价上述菌株的IMP生产能力。在完成培养后，通过HPLC测量所产生的IMP的量，并且将培养结果示于下表6中。
[表6]
菌株 IMP(g/L)
CJI0323_ΔimpE1E2 1.80
CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT) 2.32
CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_impE1(WT)2X 2.52
CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_impE1E2(WT)2X 2.97
将每个菌株中的累积IMP量与亲本菌株停滞棒杆菌CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)的累积IMP量进行比较。结果发现，如上表6所示，其中在相同的条件下同时增强ImpE1或ImpE1和ImpE2的活性的菌株的IMP浓度增加高达28％。对于不产生IMP或产生微量IMP的棒状杆菌属的微生物，由于蛋白质ImpE活性增加引起的IMP产生增加可被认为非常有意义。
所制备的菌株CJI0323和CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_impE1E2(WT)2X(CJI2236)根据布达佩斯条约分别于2017年11月7日和2017年10月25日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)。另外，将菌株分别命名为KCCM12151P和KCCM12137P。
实施例4：增强野生型impE1和impE2启动子
实施例4-1：制备野生型impE1或impE2的增强型启动子
为了确认当预期参与IMP输出的ImpE1和ImpE2的活性增强时输出IMP的能力是否增加，尝试制备用增强型启动子替换每个基因的启动子的载体。用ATCC6872基因组DNA作为模板通过PCR来获得用于制备载体的基因片段。
对于增强型启动子，使用据报道在停滞棒杆菌中强表达的Pcj7启动子(韩国未决公开专利公开第10-0620092号)。
对于impE1的PCR，使用限制性内切酶XbaI和NdeI处理使用SEQ ID NO：21和22的引物以及SEQ ID NO：23和24的引物增强的每个基因片段，然后克隆到pDZ载体的XbaI限制性内切酶位点中。为了增强Pcj7基因片段，将利用ATCC6872基因组DNA作为模板、用SEQ IDNO：29和30的引物进行PCR得到的片段用NdeI进行处理，并将所制备的载体用NdeI处理来制备载体pDZ-Pcj7_impE1(WT)。
对于impE2的PCR，将使用SEQ ID NO：25和26的引物以及SEQ ID NO：27和28的引物增强的每个基因片段使用限制性内切酶XbaI和NdeI进行处理，然后将其克隆到pDZ载体的XbaI限制性内切酶位点。将获得的Pcj7基因片段和所制备的载体用NdeI处理来制备载体pDZ-Pcj7_impE2(WT)。
[表7]
实施例4-2：评价其中野生型impE1和impE2启动子被替换的菌株
通过电穿孔(使用Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545中公开的转化方法)将实施例4-1中制备的两种质粒中的每一种质粒转化到实施例3-3中制备的菌株CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)中。之后，在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中载体通过同源序列重组插入到染色体上的菌株。对所选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO：21和24以及SEQ ID NO：25和28的引物对进行PCR来确定最终转化的菌株中的基因增强。将上述制备的两个菌株命名为CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)和CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE2(WT)。此外，基于所制备的菌株，转化CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)、pDZ-Pcj7_impE2(WT)。之后，在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中载体通过重组同源序列插入到染色体上的菌株。对所选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NOS：25和28的引物对进行PCR来确定最终转化的菌株中的基因增强。将以上制备的菌株命名为CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)_Pcj7/impE2(WT)。之后，以与实施例2-4中相同的方式培养所制备的每个菌株CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)、CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE2(WT)和CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)_Pcj7/ impE2(WT)，然后评价其IMP生产率。
在完成培养后，通过HPLC测量产生的IMP的量，并将培养结果示于下表8中。
[表8]
菌株 IMP(g/L)
CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT) 2.32
CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT) 2.47
CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE2(WT) 2.81
CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)_Pcj7/impE2(WT) 2.97
将每种菌株中的累积IMP量与亲本菌株停滞棒杆菌CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)的累积IMP量进行比较。结果发现，如上表8所示，在相同条件下，其中ImpE1和/或ImpE2的活性增强的菌株的IMP浓度增加高达28％。由于蛋白质ImpE活性增加引起的IMP生产能力增加可以认为非常有意义。
实施例5：增强基于IMP生产菌株的impE1和imppE2
实施例5-1：制备基于IMP生产菌株的impE1和impE2
为了证实impE1和impE2的增强效果，制备生产IMP的菌株，其中对应于ATCC6872中IMP降解途径的腺苷酸琥珀酸合成酶和IMP脱氢酶的活性被削弱。通过将编码上述两种酶的基因purA和guaB的每个核苷酸序列中的第一个碱基从‘a’改为‘t’来改变起始密码子。将ATCC6872中两种基因的表达被削弱的菌株被命名为CJI9088。通过电穿孔将实施例3-3中制备的载体pDZ-impE1(WT)2X和pDZ-impE1E2(WT)2X转化到菌株CJI9088中，并且在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中载体通过重组同源序列插入到染色体上的菌株。对所选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO：5和12的引物对进行PCR来确定最终转化的菌株中的基因导入。
评价了CJI9088和所制备的菌株CJI9088_impE1(WT)2X和CJI9088_impE1E2(WT)2X的IMP生产率。培养完成后，通过HPLC测量IMP生产能力，并且将培养结果显示在下表9中。
[表9]
菌株 IMP(g/L)
CJI9088 0.52
CJI9088_impE1(WT)2X 0.68
CJI9088_impE1E2(WT)2X 0.87
作为确认培养基中的IMP累积量的结果，已经发现，IMP生产能力与亲本菌株CJI9088相比增加了高达67％。从以上结果确认，通过增强输出IMP的本公开内容的蛋白质(ImpE)的活性，可以提高IMP生产能力。
根据前述内容，本公开所属领域的普通技术人员将能够理解，在不修改本公开内容的技术构思或基本特征的情况下，可以以其他具体形式来实施本公开内容。就这点而言，本文公开的示例性实施方案仅用于说明目的，而不应被解释为限制本公开内容的范围。相反，本公开内容旨在不仅覆盖示例性实施方案，而且还覆盖可包括在由所附权利要求限定的本公开内容的精神和范围内的各种替代、修改、等同物和其他实施方案。
[登录号]
保藏机构：韩国微生物保藏中心
登录号：KCCM12151P
保藏日期：2017年11月7日
[登录号]
保藏机构：韩国微生物保藏中心
登录号：KCCM12137P
保藏日期：2017年10月25日

Claims (4)

1.一种产生5’-肌苷酸的棒状杆菌属的微生物，所述微生物的具有SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的蛋白质具有增强的活性。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述产生5’-肌苷酸的棒状杆菌属的微生物是停滞棒杆菌。
3.一种制备5’-肌苷酸的方法，其包括：
在培养基中培养权利要求1所述的微生物；和
从所述微生物或所述培养基中回收5’-肌苷酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述产生5’-肌苷酸的棒状杆菌属的微生物是停滞棒杆菌。
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