CN102549144A - 具有提高的5＇-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物及使用该微生物产生核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物以及产生5′-肌苷酸的方法，其中，编码嘌呤生物合成酶的基因的表达水平相比内在表达水平增加，所述产生5′-肌苷酸的方法包括培养具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物的步骤。

Description

具有提高的5＇-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物及使用该微生物产生核酸的方法
技术领域
本发明涉及具有5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物以及产生5′-肌苷酸的方法，其中，编码嘌呤生物合成酶的基因的表达水平相比内在表达水平增加，产生5′-肌苷酸的方法包括培养具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物的步骤。
背景技术
核酸类物质之一的5′-肌苷酸(5′-inosinic acid)是核酸生物合成代谢系统的中间物质，其不仅在动植物体内起到重要的生理作用，还应用于食品、医药品以及其他多种医疗用途中。尤其，将5′-肌苷酸与谷氨酸单钠(MSG)一起使用时具有协同提味效果，从而其是作为精味性调味料而备受瞩目的核酸类调味料之一。
制造5′-肌苷酸的方法包括：对于从酵母细胞提取的核糖核酸进行酶促分解的方法(日本专利公开公报第1614/1957号等)；将通过发酵所产生的肌苷以化学方法磷酸化的方法(Agri.Biol.Chem.，36，1511(1972)等)；以及培养能够产生5′-肌苷酸的微生物并回收积聚在培养基中的肌苷一磷酸(IMP)的方法等。目前使用的最多的方法为利用微生物来产生5′-肌苷酸的方法。棒状杆菌(Corynebacterium)属菌株被广泛地用作产生5′-肌苷酸的微生物，例如，公开了培养产氨短杆菌菌株来产生5′-肌苷酸的方法(韩国专利公开第2003-0042972号)等。
为了提高利用微生物来产生5′-肌苷酸的产量，通过增加或者降低参与5′-肌苷酸的生物合成途径或者分解途径的酶的活性或者表达来开发菌株。韩国专利第785248号公开了其中编码嘌呤生物合成途径加上的磷酸核糖氨基咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶的基因purC被超表达的微生物及利用该微生物产生5′-肌苷酸的方法。此外，韩国专利第857379号公开了其中purKE编码的磷酸核糖氨基咪唑羧化酶被超表达的产氨短杆菌菌株与使用该产氨短杆菌菌株来高产地产生高浓度的IMP的法。
但是依然存在对于开发能够以更高的产量产生5′-肌苷酸的菌株与利用其产生5′-肌苷酸的方法的需求。
对此，本发明的发明人进行研究以开发能够以高生产力产生5′-肌苷酸的菌株，发现将参与嘌呤生物合成途径的主要酶的活性同时提高为相比内在活性更高时5′-肌苷酸的生产力得以提高的现象，从而完成了本发明。
发明内容
本发明提供具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物。
本发明的另一目的在于提供利用具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物来产生5′-肌苷酸的方法。
为了达到如上所述的目的，本发明提供具有产5′-肌苷酸的生产力的棒状杆菌属微生物，其中，编码嘌呤生物合成酶的基因的表达水平相比内在表达水平增加。
本发明的棒状杆菌属微生物的编码嘌呤生物合成酶的基因的表达水平相比内在表达水平增加，从而具有相比母株提高的5′-肌苷酸生产力。
在本发明中，“嘌呤生物合成酶”是指对于将嘌呤碱基作为最终产物生成的嘌呤生物合成途径中的反应进行催化的酶，包含：磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶、磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶II、磷酸核糖氨基咪唑合成酶、磷酸核糖氨基咪唑羧化酶、磷酸核糖氨基咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶、肌苷酸环式水解酶、磷酸核糖焦磷酸激酶等。
在本发明的一具体实例中，嘌呤生物合成酶可以是磷酸核糖焦磷酸激酶与选自以下的一种或多种酶的组合：磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶、磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶II、磷酸核糖氨基咪唑合成酶、磷酸核糖氨基咪唑羧化酶、磷酸核糖氨基咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶和肌苷酸环式水解酶。
在本发明的一具体实例中，表达水平相比内在水平增加的编码嘌呤生物合成酶的基因可以是下述基因的组合：编码磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰酶的基因，即SEQ ID NO.36的purN；编码磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶的基因，即SEQ ID NO.37的purS；编码磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶II的基因，即SEQ ID NO.38的purL；编码磷酸核糖氨基咪唑羧化酶的基因，即SEQ ID NO.40的purKE；编码磷酸核糖氨基咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶的基因，即SEQ ID NO.41的purC；编码肌苷酸环式水解酶的基因，即SEQ ID NO.42的purH；以及编码磷酸核糖焦磷酸激酶的基因，即SEQ ID NO.43的prs。
在本发明的一具体实例中，表达水平相比内在水平增加的编码嘌呤生物合成酶的基因可以是下述基因的组合：编码磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶的基因，即SEQ ID NO.35的purF；编码磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰酶的基因，即SEQ ID NO.36的purN；编码磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶的基因，即SEQ ID NO.37的purS；编码磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶II的基因，即SEQ ID NO.38的purL；编码磷酸核糖氨基咪唑合成酶的基因，即SEQ ID NO.39的purM；编码磷酸核糖氨基咪唑羧化酶的基因，即SEQ ID NO.40的purKE；编码磷酸核糖氨基咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶的基因，即SEQ ID NO.41的purC；编码肌苷酸环式水解酶的基因，即SEQ ID NO.42的purH；以及编码磷酸核糖焦磷酸激酶的基因，即SEQ ID NO.43的prs。
在本发明中“相比内在表达水平增加”是指，以与在微生物中天然表达的水平或者在母株中表达的水平相比更高的量表达的现象，包括：编码该酶的基因的数量(拷贝数量)的增加以及由此引发的表达水平的增加或者由于基因突变而引起表达水平的增加或者由这两种引起的表达水平的增加。
在本发明的一具体实例中，编码嘌呤生物合成酶的基因的表达水平的增加包括：从外部额外导入该基因到菌株或扩增内在基因从而使得基因的拷贝数量增加，或者由于导入到转录或者翻译控制序列的变异从而使转录效率或者翻译效率增加的情况，但是并不限于此。根据本领域的公知技术，可以简单地完成内在基因的扩增，例如，在适当的选择性压力下培养的方法等。
在本发明的一具体实例中，可以通过从细胞外部额外导入编码嘌呤生物合成酶的基因或者扩增编码嘌呤生物合成酶的内在基因来增加所述编码嘌呤生物合成酶的基因的表达水平。
在本发明的一具体实例中，在具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物中，通过从外部导入编码嘌呤生物合成酶的基因的除了相应的内在基因之外的一个以上的拷贝，从而表达水平相比内在水平增加的编码嘌呤生物合成酶的基因可以存在两个以上的拷贝。
在本发明的一具体实例中，在具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物中，将编码嘌呤生物合成酶的基因从外部导入是通过利用重组载体的转化实现的，所述重组载体包含连续排列的相应基因的两个拷贝。
在本发明的一具体实例中，根据导入的基因，制备具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物所使用的重组载体可以选自分别具有图2至图7的酶切图谱的pDZ-2purFM、pDZ-2purNH、pDZ-2purSL、pDZ-2purKE、pDZ-2purC以及pDZ-2prs。
在本发明的一具体实例中，具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物可以来自能够产生5′-肌苷酸的棒状杆菌微生物。例如，根据本发明的具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物可以来自：产氨短杆菌ATCC6872、嗜热产氨棒状杆菌(thermoaminogenes)FERM BP-1539、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869以及由此制备的菌株。
在本发明的一具体实例中，具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物可以包含编码嘌呤生物合成酶的基因的两个以上拷贝。
在本发明的一具体实例中，具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物可以是产氨短杆菌，更优选地，可以为转化的产氨短杆菌，所述转化的产氨短杆菌是将prs基因与一种以上选自purF、purN、purS、purL、purM、purKE、purC和purH的的基因的组合的内在活性增加从而高浓度地产生5′-肌苷酸的产氨短杆菌。
在本发明的一具体实例中，具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物可以是下述的菌株：向产生5′-肌苷酸的产氨短杆菌CJIP2401(KCCM-10610)菌株依次或者组合导入分别具有图2、图3、图4、图5、图6和图7的酶切图谱的重组载体pDZ-2purFM、重组载体pDZ-2purNH、重组载体pDZ-2purSL、重组载体pDZ-2purKE、重组载体pDZ-2purC、重组载体pDZ-2prs，所导入的purF、purN、purS、purL、purM、purKE、purC、purH和prs基因的两个拷贝中的一个根据同源重组而置换相应的内在基因，从而，purF、purN、purS、purL、purM、purKE、purC、purH个和prs基因的每个能够以分别两个拷贝插入到染色体内。
在本发明的一具体实例中，具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物可以是包含编码嘌呤生物合成酶的基因的两个拷贝的产氨短杆菌，优选地，可以是产氨短杆菌CN01-0120，所述编码嘌呤生物合成酶的基因可以是选自下述基因的组合：编码磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰酶的基因，即SEQ ID NO.36的purN；编码磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶的基因，即SEQ ID NO.37的purS；编码磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶II的基因，即SEQ ID NO.38的purL；编码磷酸核糖氨基咪唑羧化酶的基因，即SEQ ID NO.40的purKE；编码磷酸核糖氨基咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶的基因，即SEQ ID NO.41的purC；编码肌苷酸环式水解酶的基因，即SEQ ID NO.42的purH；以及编码磷酸核糖焦磷酸激酶的基因，即SEQ ID NO.43的prs。
在本发明的一具体实例中，具有提高的5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物可以是包含编码嘌呤生物合成酶的基因的两个拷贝的产氨短杆菌，优选地，可以是产氨短杆菌CN01-0316(KCCM 10992P)，所述编码嘌呤生物合成酶的基因可以是选自下述基因的组合：编码磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶的基因，即SEQ ID NO.35的purF；编码磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰酶的基因，即SEQ ID NO.36的purN；编码磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶的基因，即SEQ ID NO.37的purS；编码磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶II的基因，即SEQ ID NO.38的purL；编码磷酸核糖氨基咪唑合成酶的基因，即SEQ ID NO.39的purM；编码磷酸核糖氨基咪唑羧化酶的基因，即SEQ ID NO.40的purKE；编码磷酸核糖氨基咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶的基因，即SEQ ID NO.41的purC；编码肌苷酸环式水解酶的基因，即SEQ ID NO.42的purH；以及编码磷酸核糖焦磷酸激酶的基因，即SEQ ID NO.43的prs。
并且，本发明提供产生5′-肌苷酸的方法，包括：培养具有5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物，其中编码嘌呤生物合成酶的基因的表达水平相比内在表达水平增加；以及从所述培养基中回收5′-肌苷酸。
在本发明的产生5′-肌苷酸的方法中，用于培养棒状杆菌属微生物的培养基和其他培养条件可以与通常用于培养棒状杆菌属微生物的培养基和其他培养条件相同，所属技术领域的技术人员能够简单地选择并调整。并且，培养方法也可以使用所属技术领域中公知的任意的培养方法，例如可以使用分批培养、连续培养以及流加培养方法等，但是并不限于此。
在本发明的一具体实例中，具有5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物可以是产氨短杆菌。
在本发明的一具体实例中，具有5′-肌苷酸生产力的棒状杆菌属微生物可以是产氨短杆菌CN01-0120或者产氨短杆菌CN01-0316(KCCM10992P)。
在本发明的一具体实例中，培养棒状杆菌属微生物的步骤通过下述方式完成：有氧条件下，在包含适当的碳源、氮源、氨基酸、维生素等的常规培养基内通过调整温度、pH等来培养菌株。
作为碳源则可以使用如葡萄糖、果糖等碳水化合物，作为氮源则可以使用如氨、氯化铵、硫酸铵等各种无机氮源以及蛋白胨、NZ-胺、肉类提取物、酵母提取物、玉米浆、干酪素水解物、鱼类或者其降解产物、脱脂大豆饼或者其降解产物等有机氮源。作为无机化合物则可以使用磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等，除此之外，根据需求可以添加维生素与营养缺陷型碱基等。
培养是在有氧条件下实施的，例如，根据震荡培养或者通气搅拌培养，优选为在28至36℃的温度下实施。优选地，培养基的pH在培养期间维持在6至8的范围。培养可以实施4至6天。
下面通过实施例进一步详细地说明本发明。但是，实施例仅是示例性地示出本发明，因此不能解释为实施例对本发明的范围加以限制。
发明效果
根据本发明，利用具有5′-肌苷酸的生产力的棒状杆菌属微生物能够以高浓度以及高产量产生5′-肌苷酸并因此能够降低成本，其中编码参与嘌呤生物合成的主要酶的基因的表达水平相比内在表达水平增加。
附图说明
图1图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ载体；
图2图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2purFM；
图3图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2purNH；
图4图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2purSL；
图5图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2purKE；
图6图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2purC；
图7图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2prs。
实施例
实施例1.利用用于插入染色体的载体(pDZ)插入嘌呤生物合成基因以及根据该插入开发5′-肌苷酸高产菌株
为了向产氨短杆菌菌株的染色体插入外源基因，利用了包含该基因的两个连续拷贝的基于pDZ的重组载体。pDZ载体是用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，根据韩国专利公开第2008-0025355号中公开的方法来制备pDZ载体，通过引用将其并入本文。图1简要地图示了pDZ载体的结构。
在下述的(1)至(6)中，制备了能够用于将编码嘌呤生物合成酶的基因插入棒状杆菌属微生物的染色体内从而将每个基因的拷贝数量增加为2个的重组载体。如下所述地进行各个重组载体的转化以及选择转化体。
通过电穿孔法(electroporation)用重组pDZ载体转化产5′-肌苷酸的菌株，即产氨短杆菌CJIP2401(KCCM-10610)之后，从含有25mg/l卡那霉素(kanamycin)的选出培养基中选出其中载体内的基因通过同源重组而插入染色体内的菌株，所述重组pDZ载体包含编码所需嘌呤生物合成途径上的酶的基因。在含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的固体培养基(肉汁为1％、酵母提取物为1％、蛋白胨为1％、氯化钠为0.25％、腺嘌呤为1％、鸟嘌呤为1％、琼脂糖为1.5％)中，根据菌落颜色确认载体向染色体内成功的插入。即，将蓝色菌落作为载体插入染色体内的转化体而选出。在营养培养基(葡萄糖为1％、肉汁为1％、酵母提取物为1％、蛋白胨为1％、氯化钠为0.25％、腺嘌呤为1％、鸟嘌呤为1％)中振荡培氧(30℃、8小时)由于第一次交换(crossover)而载体插入染色体内的菌株之后，分别稀释到10-4-10-10，以涂抹在含有X-gal的固体培养基上。选出与大部分菌落带有蓝色相比，以低比率显现的白色菌落，从而选出了由于第二次交换而将插入至染色体上的载体序列去除的菌株。通过对抗生素，即卡那霉素的敏感性测试以及通过PCR的基因结构确认过程，从而将选出的菌株鉴定为最终菌株。
(1)purFM基因的克隆及重组载体(pDZ-2purFM)的制备
在棒状杆菌属微生物的染色体上，purF基因与purM基因位于接近的距离处，从而，为了同时表达两个基因，制备了包含所述两个基因与启动子部分的purFM载体。
从具有5′-肌苷酸生产力的产氨短杆菌CJIP2401菌株分离染色体，并且将其作为模板进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，简称为PCR)而得到purFM，即包含连续排列的purF与purM的片段。聚合酶则使用了PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)，并且聚合酶链反应重复了30个循环，所述循环是指由在96℃下的30秒的变性、在53℃下的30秒的退火(annealing)以及在72℃下的2分钟的聚合反应构成的循环。因此，得到了包含启动子部分的两个purFM基因(purFM-A、purFM-B)。将SEQ ID NO.1与2用作引物扩增purFM-A，将SEQ ID NO.3与4用作引物扩增purFM-B。利用TOPO Cloning Kit(Invitrogen)将扩增产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，从而分别得到了pCR-purFM-A与pCR-purFM-B载体。使用分别包含在purFM-A与purFM-B的各个末端的限制性内切酶(purFM-A：EcoRI+XbaI，purFM-B：XbaI+HindIII)对所述pCR载体进行处理，从而从所述pCR载体分离各自的purFM基因。然后，通过3片段连接反应(3-pieceligation)克隆已用限制性内切酶EcoRI与HindIII处理的pDZ载体，从而最终制备了连续克隆两个purFM基因的pDZ-2purFM重组载体。图2是图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2purFM的示意图。
通过电穿孔法用pDZ-2purFM载体转化5′-肌苷酸生产菌株，即产氨短杆菌CJIP2401菌株，经过第二次交换过程，在染色体上邻近内在purFM基因的位置处额外插入一个purFM基因，从而得到了总拷贝数增加至两个的菌株。通过PCR利用能够扩增两个purFM连接部分的SEQ ID NO.5与6的引物来最终确认连续插入的purFM基因。
(2)purNH基因的克隆及重组载体(pDZ-2purNH)的制备，purNH插入菌株的开发
在棒状杆菌属微生物的染色体上，purN基因与purH基因位于接近的距离处，从而，为了同时表达两个基因，制备了包含启动子部分的purNH载体。
从具有5′-肌苷酸生产力的产氨短杆菌CJIP2401菌株分离染色体，并且将其作为模板进行聚合酶链反应而得到purNH，即包含连续排列的purN与purH的片段。聚合酶则使用了PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)，并且聚合酶链反应重复了30个循环，所述循环是指由在96℃下的30秒的变性、在53℃下的30秒的退火(annealing)以及在72℃下的2分钟的聚合反应构成的循环。因此，得到了包含启动子部分的两个purNH基因(purNH-A、purNH-B)。将SEQ ID NO.7与8用作引物扩增purNH-A，将SEQ ID NO.8与9用作引物扩增purNH-B。利用TOPO Cloning Kit将扩增产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，从而得到了pCR-purNH-A与pCR-purNH-B载体。用分别包含在purNH-A与purNH-B的各个末端的限制性内切酶(purNH-A：BamHI+SalI，purNH-B：SalI)对所述pCR载体进行处理，从而从所述pCR载体分离各自的purNH基因。然后，通过3片段连接反应克隆已用限制性内切酶BamHI与SalI处理的pDZ载体，从而最终制备了连续克隆两个purNH基因的pDZ-2purNH重组载体。图3是图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2purNH的示意图。
通过电穿孔法用所述pDZ-2purNH载体转化5′-肌苷酸生产菌株，即产氨短杆菌CJIP2401菌株，经过第二次交换过程，在染色体上邻近内在purNH基因的位置处额外插入一个purNH基因，从而得到了总拷贝数增加至两个的菌株。通过PCR利用能够扩增两个purNH连接部分的SEQ ID NO.10与11的引物来最终确认连续插入的purNH基因。
(3)purSL基因的克隆及重组载体(pDZ-2purSL)的制备，purSL插入菌株的开发
在棒状杆菌属微生物的染色体上，purS基因与purL基因位于接近的距离处，为了同时表达两个基因，制备了包含启动子部分的purSL载体。
从具有5′-肌苷酸生产力的产氨短杆菌CJIP2401菌株分离染色体，并且将其作为模板进行聚合酶链反应而得到purSL，即包含连续排列的purS与purL的片段。聚合酶则使用了PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)，并且聚合酶链反应重复了30个循环，所述循环是指由在96℃下的30秒的变性、在53℃下的30秒的退火以及在72℃下的2分钟的聚合反应构成的循环。因此，得到了包含启动子部分的两个purSL基因(purSL-A、purSL-B)。SEQ ID NO.12与13用作引物扩增purSL-A，将SEQ ID NO.14与15用作引物扩增purSL-B。利用TOPOCloning Kit将扩增产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，从而得到了pCR-purSL-A与pCR-purSL-B载体。用分别包含在purSL-A与purSL-B的各个末端的限制性内切酶(purSL-A：BamHI+SalI，purSL-B：SalI+BamHI)对所述pCR载体进行处理，从而从所述pCR载体分离各自的purSL。然后，通过3片段连接反应克隆已用限制性内切酶BamHI处理的pDZ载体，从而最终制备了连续克隆两个purSL基因的pDZ-2purSL重组载体。图4是图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2purSL的示意图。
通过电穿孔法用所述pDZ-2purSL载体转化5′-肌苷酸生产菌株，即产氨短杆菌CJIP2401菌株，经过第二次交换过程，在染色体上邻近内在purSL基因的位置处额外插入一个purSL基因，从而得到了总拷贝数增加至两个的菌株。通过PCR利用能够扩增两个purSL连接部分的SEQ ID NO.16与17的引物来最终确认连续插入的purSL基因。
(4)purKE基因的克隆及重组载体(pDZ-2purKE)的制备，purKE插入菌株的开发
在棒状杆菌属微生物的染色体上，purK基因与purE基因位于接近的距离处，从而，为了同时表达两个基因，制备了包含启动子部分的purKE载体。
从具有5′-肌苷酸生产力的产氨短杆菌CJIP2401菌株分离染色体，并且将其作为模板进行聚合酶链反应而得到purKE，即包含连续排列的purK与purH的片段。聚合酶则使用了PfuUltraTM高保真DNA聚合酶，并且聚合酶链反应重复了30个循环，所述循环是指由在96℃下的30秒的变性、在53℃下的30秒的退火以及在72℃下的2分钟的聚合反应构成的循环。因此，得到了包含启动子部分的两个purKE基因(purKE-A、purKE-B)。将SEQ ID NO.18与19用作引物扩增purKE-A，将SEQ ID NO.20与21用作引物扩增purKE-B。利用TOPOCloning Kit将扩增产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，从而得到了pCR-purKE-A与pCR-purKE-B载体。用分别包含在purKE-A与purKE-B的各个末端的限制性内切酶(purKE-A：BamHI+KpnI，purKE-B：KpnI+XbaI)对所述pCR载体进行处理，从而从所述pCR载体分离各自的purKE基因。然后，通过3片段连接反应克隆已用限制性内切酶BamHI与XbaI处理的pDZ载体，从而最终制备了连续克隆两个purKE基因的pDZ-2purKE重组载体。图5是图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2purKE的示意图。
通过电穿孔法用所述pDZ-2purKE载体转化5′-肌苷酸生产菌株，即产氨短杆菌CJIP2401菌株，经过第二次交换过程，在染色体上邻近内在purKE基因的位置处额外插入一个purKE基因，从而得到了总拷贝数增加至两个的菌株。通过PCR利用能够扩增两个purKE连接部分的SEQ ID NO.22与23的引物来最终确认连续插入的purKE基因。
(5)purC基因的克隆及重组载体(pDZ-2purC)的制备，purC插入菌株的开发
从产氨短杆菌CJIP2401菌株分离染色体，并且将其作为模板进行聚合酶链反应而得到purC。聚合酶则使用了PfuUltraTM高保真DNA聚合酶，并且聚合酶链反应重复了30个循环，所述循环是指由在96℃下的30秒的变性、在53℃下的30秒的退火以及在72℃下的2分钟的聚合反应构成的循环。因此，得到了包含启动子部分的两个purC基因(purC-A、purC-B)。将SEQ ID NO.24与25用作引物扩增purC-A，将SEQ ID NO.25与26用作引物扩增purC-B。利用TOPO Cloning Kit将扩增产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，从而得到了pCR-purC-A与pCR-purC-B载体。用分别包含在purC-A与purC-B的各个末端的限制性内切酶(purC-A：BamHI+SalI，purC-B：SalI)对所述pCR载体进行处理，从而从所述pCR载体分离各自的purC基因。然后，通过3片段连接反应克隆已用限制性内切酶BamHI与SalI处理的pDZ载体，从而最终制备了连续克隆两个purC基因的pDZ-2purC重组载体。图6是图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2purC的示意图。
通过电穿孔法用所述pDZ-2purC载体转化5′-肌苷酸生产菌株，即产氨短杆菌CJIP2401菌株，经过第二次交换过程，在染色体上邻近内在purC基因的位置处额外插入一个purC基因，从而得到了总拷贝数增加至两个的菌株。通过PCR利用能够扩增两个purC连接部分的SEQID NO.27与28的引物来最终确认连续插入的purC基因。
(6)prs基因的克隆及重组载体(pDZ-2prs)的制备，prs插入菌株的开发
从产氨短杆菌CJIP2401菌株分离染色体，并且将其作为模板进行聚合酶链反应而得到prs。聚合酶则使用了PfuUltraTM高保真DNA聚合酶，并且聚合酶链反应重复了30个循环，所述循环是指由在96℃下的30秒的变性、在53℃下的30秒的退火以及在72℃下的2分钟的聚合反应构成的循环。因此，得到了包含启动子部分的两个prs基因(prs-A、prs-B)。将SEQ ID NO.29与30用作引物扩增prs-A，将SEQID NO.31与32用作引物扩增prs-B。利用TOPO Cloning Kit将扩增产物克隆进大肠杆菌载体pCR2.1，从而得到了pCR-prs-A与pCR-prs-B载体。用分别包含在prs-A与prs-B的各个末端的限制性内切酶(prs-A：BamHI+SpeI，prs-B：SpeI+PstI)对所述pCR载体进行处理，从而从所述pCR载体分离各自的prs基因。然后，通过3片段连接反应克隆已用限制性内切酶BamHI与PstI处理的pDZ载体，从而最终制备了连续克隆两个prs基因的pDZ-2prs重组载体。图7是图示用于插入棒状杆菌属微生物的染色体内的载体，即pDZ-2prs的示意图。
通过电穿孔法用所述pDZ-2prs载体转化5′-肌苷酸生产菌株，即产氨短杆菌CJIP2401菌株，经过第二次交换过程，在染色体上邻近内在prs基因的位置处额外插入一个prs基因，从而得到了总拷贝数增加至两个的菌株。通过PCR利用能够扩增两个prs连接部分的SEQ IDNO.33与34的引物来最终确认连续插入的prs基因。
(7)通过增强嘌呤生物合成基因开发5′-肌苷酸高产菌株
将(1)至(6)中制备的pDZ-2purFM、pDZ-2purNH、pDZ-2purSL、pDZ-2purKE、pDZ-2purC以及pDZ-2prs载体的组合导入产生5′-肌苷酸的产氨短杆菌CJIP2401菌株。任意选择了载体的导入顺序，导入方法及鉴定则如上所述。
将产氨短杆菌CJIP2401用作母株，分别用由pDZ-2purNH、pDZ-2purSL、pDZ-2purKE、pDZ-2purC与pDZ-2prs构成的组合以及曲pDZ-2purNH、pDZ-2purSL、pDZ-2purKE、pDZ-2purC、pDZ-2purFM与pDZ-2prs构成的组合实施了转化，从而得到了分别包含编码参与嘌呤生物合成途径的主要酶的基因的2个拷贝的产氨短杆菌CN01-0120(2purNH+2purSL+2purKE+2purC+2prs)与产氨短杆菌CN01-0316(2purNH+2purSL+2purKE+2purC+2purFM+2prs)。
实施例2.重组产氨短杆菌的发酵效价测试
将具有如下所示组成的3ml种子培养基散布到直径为18mm的试管中并实施高压灭菌之后，接种母株，即产氨短杆菌CJIP2401菌株和实施例1中制备的产氨短杆菌CN01-0120以及产氨短杆菌CN01-0316，并且在30℃温度下震荡培养24小时，以用作种子培养基。具有如下所示组成的27ml发酵培养基散布到500ml的用于震荡的锥形烧瓶中，在120℃温度下实施10分钟的高压灭菌之后，接种3ml的所述种子培养基并培养5至6日。培养条件调节成如下：转数为200rpm、温度为32℃、pH值为7.2。
所述种子培养基以及发酵培养基的组成如下。
种子培养基：葡萄糖为1％、蛋白胨为1％、肉汁为1％、酵母提取物为1％、氯化钠为0.25％、腺嘌呤为100mg/l、鸟嘌呤为100mg/l、pH为7.2。
烧瓶发酵培养基：谷氨酸钠为0.1％、氯化铵为1％、硫酸镁为1.2％、氯化钙为0.01％、硫酸铁为20mg/l、硫酸锰为20mg/l、硫酸锌为20mg/l、硫酸铜为5mg/l、L-半胱氨酸为23mg/l、丙氨酸为24mg/l、尼克酸为8mg/l、生物素为45μg/l、盐酸硫胺素为5mg/l、腺嘌呤为30mg/l、磷酸(85％)为1.9％、葡萄糖为4.2％、原糖为2.4％。
完成培养之后，利用HPLC法测量5′-肌苷酸生产力，下表显示了培养基中的5′-肌苷酸的积聚量。
表1
Figure BPA00001449452300151
比较培养基内的5′-肌苷酸的积聚量与母株，即产氨短杆菌CJIP2401菌株的5′-肌苷酸的积聚量，确认了下述的现象：在相同条件下，与母株，即产氨短杆菌CJIP2401菌株相比，产氨短杆菌CN01-0120与产氨短杆菌CN01-0316菌株在单位时间内5′-肌苷酸的生产力增加10.9-11.4％。
基于布达佩斯条约，于2009年2月19日在位于首尔西大门区弘济1栋的“韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms，简称为KCCM)”保藏了保藏号为“KCCM 10992P”的被确认为通过增加嘌呤生物合成酶的活性而具有提高的5′-肌苷酸生产力的产氨短杆菌CN01-0316。
序列表
附加的序列表中记载了在本说明书中描述的SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.43的序列。

Claims (11)

1.产5′-肌苷酸的棒状杆菌属微生物，其中编码嘌呤生物合成酶的基因的表达水平相比内在表达水平增加，其中所述嘌呤生物合成酶是磷酸核糖焦磷酸激酶和选自以下的一种或多种酶的组合：磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶、磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶II、磷酸核糖氨基咪唑合成酶、磷酸核糖氨基咪唑羧化酶、磷酸核糖氨基咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶和肌苷酸环式水解酶。
2.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述编码嘌呤生物合成酶的基因是下述基因的组合：
编码磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰酶的基因，即SEQ ID NO.36的purN；
编码磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶的基因，即SEQ ID NO.37的purS；
编码磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶II的基因，即SEQ ID NO.38的purL；
编码磷酸核糖氨基咪唑羧化酶的基因，即SEQ ID NO.40的purKE；
编码磷酸核糖氨基咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶的基因，即SEQ IDNO.41的purC；
编码肌苷酸环式水解酶的基因，即SEQ ID NO.42的purH；以及
编码磷酸核糖焦磷酸激酶的基因，即SEQ ID NO.43的prs。
3.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述编码嘌呤生物合成酶的基因是下述基因的组合：
编码磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶的基因，即SEQ ID NO.35的purF；
编码磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰酶的基因，即SEQ ID NO.36的purN；
编码磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶的基因，即SEQ ID NO.37的purS；
编码磷酸核糖甲酰甘氨脒合成酶II的基因，即SEQ ID NO.38的purL；
编码磷酸核糖氨基咪唑合成酶的基因，即SEQ ID NO.39的purM；
编码磷酸核糖氨基咪唑羧化酶的基因，即SEQ ID NO.40的purKE；
编码磷酸核糖氨基咪唑琥珀酸甲酰胺合成酶的基因，即SEQ IDNO.41的purC；
编码肌苷酸环式水解酶的基因，即SEQ ID NO.42的purH；以及
编码磷酸核糖焦磷酸激酶的基因，即SEQ ID NO.43的prs。
4.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其特征在于，
通过从细胞外部额外导入编码嘌呤生物合成酶的基因或者扩增编码嘌呤生物合成酶的内在基因，从而增加所述编码嘌呤生物合成酶的基因的表达水平。
5.根据权利要求4所述的棒状杆菌属微生物，其特征在于，
通过从外部向细胞内导入嘌呤生物合成酶的基因的除了相应的内在基因之外的一个或多个拷贝，所述编码嘌呤生物合成酶的基因存在两个或更多个拷贝。
6.根据权利要求5所述的棒状杆菌属微生物，其特征在于，
将所述编码嘌呤生物合成酶的基因导入细胞内是通过利用重组载体的转化实现的，所述重组载体包含连续排列的相应基因的两个拷贝。
7.根据权利要求6所述的棒状杆菌属微生物，其特征在于，
所述重组载体选自分别具有图2至图7的酶切图谱的pDZ-2purFM、pDZ-2purNH、pDZ-2purSL、pDZ-2purKE、pDZ-2purC以及pDZ-2prs。
8.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其特征在于，
所述棒状杆菌属微生物是产氨短杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)。
9.根据权利要求2所述的棒状杆菌属微生物，其特征在于，
所述棒状杆菌属微生物是产氨短杆菌CN01-0120(Corynebacterium ammoniagenes CN01-0120)。
10.根据权利要求3所述的棒状杆菌属微生物，其特征在于，
所述棒状杆菌属微生物是产氨短杆菌CN01-0316(Corynebacterium ammoniagenes CN01-0316)(KCCM 10992P)。
11.产生5′-肌苷酸的方法，包括：
培养权利要求1至10中任一项所述的棒状杆菌属微生物；以及
从所述培养基中回收5′-肌苷酸。
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