CN102985529B - 改进地生产5’-黄苷一磷酸和5’-鸟苷一磷酸的微生物和使用其的5’-黄苷一磷酸和5’-鸟苷一磷酸的生产方法 - Google Patents

改进地生产5’-黄苷一磷酸和5’-鸟苷一磷酸的微生物和使用其的5’-黄苷一磷酸和5’-鸟苷一磷酸的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及改进地生产5’-黄苷一磷酸和5’-鸟苷一磷酸的微生物，并且更具体地，涉及具有与其固有活性相比增加的脯氨酸脱氢酶活性的棒状杆菌属某种(Corynebacterium sp.)的微生物，从由培养转化的微生物获得的培养基生产5’-黄苷一磷酸或5’-鸟苷一磷酸的方法，和该微生物用于生产5’-黄苷一磷酸或5’-鸟苷一磷酸的用途。

Description

改进地生产5’-黄苷一磷酸和5’-鸟苷一磷酸的微生物和使用其的5’-黄苷一磷酸和5’-鸟苷一磷酸的生产方法
背景技术
1、发明领域
本发明涉及具有与其内源活性相比增加的脯氨酸脱氢酶活性的棒状杆菌微生物，通过培养转化的微生物从培养液生产5’-黄苷一磷酸或5’-鸟苷一磷酸(5’-guanine monophosphate)的方法，和该微生物用于生产5’-黄苷一磷酸或5’-鸟苷一磷酸的用途。
2、相关技术的描述
5’-鸟苷一磷酸(GMP)是与肌苷一磷酸(IMP)一起广泛用作香味增强剂的食品添加剂。GMP其本身已知赋予类似蘑菇的味道，并且当与谷氨酸一钠(MSG)结合时增加其的味道强度。其通常与IMP结合使用。
迄今已知的制备GMP的方法的例子包括(1)酶降解从酵母细胞提取的RNA(核糖核酸)，(2)GMP直接微生物发酵，(3)鸟苷微生物发酵，随后化学磷酸化，(4)鸟苷微生物发酵，随后酶促磷酸化，(5)黄苷5’-一磷酸盐(XMP)微生物发酵，随后通过棒状杆菌菌株转变为GMP，和(6)XMP微生物发酵，随后通过大肠杆菌(Escherichia coli)将XMP转变为GMP。在它们中，方法(1)具有有限的材料供应的困难并且是在经济上无益的，方法(2)受到由于GMP的膜通透性具有低产率的缺点。因此，其他方法广泛用于工业应用中。
在上述方法中，当GMP通过将XMP转变为GMP而产生时，要求增加XMP生产率或连续供应在GMP转变期间用作辅因子的ATP。为了增加XMP生产率，常规方法通过突变产生耐鸟苷或XMP微生物。例如，韩国专利申请号10-1991-018061公开了能够以高产率生产XMP的XMP脱氨基酶(aminase)非活性菌株，其对于腺嘌呤和鸟嘌呤是半营养缺陷型的，耐受鸟苷类似物并对溶菌酶—一种破坏细胞壁的酶——非常敏感。此外，韩国专利申请号10-2001-000513公开了能够在培养基中以高浓度直接积聚XMP的产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)的菌株和利用其生产XMP的方法，其中菌株通过如下制备：用UV光照射母微生物，用诱变剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理，并选择耐受正缬氨酸的突变体，所述正缬氨酸为影响XMP生物合成的缬氨酸类似物。此外，韩国专利申请号10-2008-006537描述了增加XMP产率的方法，其中涉及XMP生物合成的purN和purH基因被修饰。
如以上所提及的，对于将XMP转变为GMP而言，关键是供应在GMP转变期间用作辅因子的ATP。用于XMP转变为GMP的大部分ATP由产XMP菌株供应。在该转变方法中，二甲苯增加了ATP和XMP的膜通透性，并且向培养基添加二甲苯允许ATP和XMP渗入产GMP的菌株，随后将XMP转变为GMP。因此，GMP生产的方法采取增加ATP生产率的策略。
从XMP转变为GMP由以下反应式表示：
XMP+ATP+NH3------------------>GMP+AMP+PPi
XMP脱氨基酶
即，作为辅因子的ATP的连续供应对于转变过程是必要的，其中XMP首先被产生并随后通过向包括XMP和微生物的培养基添加具有XMP脱氨基酶活性的酶或微生物转变为GMP。因此，提高产XMP菌株的ATP生产率是非常重要的。在转变过程中产生的AMP被再次用作ATP生产的底物。实际上，腺嘌呤基核苷酸对于在转变过程中的ATP生产是循环的。
因此，XMP生产率的改进对GMP的高生产产率是必要的，并且通过增加ATP生产率可改进XMP生产率。基于该背景，本发明人已经做了很多努力以开发增加ATP生产率的方法。结果，他们发现提高的脯氨酸脱氢酶活性通过增加ATP生产改进了XMP和GMP的生产产率。
因此，本发明人鉴定了负责改进XMP生产产率的基因，设计了包括该基因的载体，并制备了利用该载体转化的棒状杆菌属的微生物，并且他们发现XMP或GMP可以高产率由微生物生产，由此完成本发明。
发明内容
本发明的目的是提供用于生产5’-黄苷一磷酸或5’-鸟苷一磷酸的棒状杆菌微生物，其具有与其内源活性相比增加的脯氨酸脱氢酶活性。
本发明的另一个目的是提供通过培养微生物从培养液生产5’-黄苷一磷酸或5’-鸟苷一磷酸的方法。
本发明的另一个目的是提供该微生物用于生产5’-黄苷一磷酸或5’-鸟苷一磷酸的用途。
本发明的效果
由于改进的脯氨酸脱氢酶的活性，本发明的棒状杆菌微生物能够以比常规产XMP和GMP微生物高得多的产率生产XMP或GMP。因此，利用本发明的微生物可以以高产率生产XMP或GMP。
附图说明
图1是示意图，其显示了通过将putA基因克隆入pDZ载体制备的pDZ-putA载体的结构。
优选实施方式详述
在一方面中，为了实现以上目的，本发明涉及具有与其内源活性相比增加的脯氨酸脱氢酶活性的棒状杆菌微生物。
优选地，本发明提供具有与其内源活性相比增加的脯氨酸脱氢酶活性的棒状杆菌微生物，以显示5’-黄苷一磷酸(XMP)和5’-鸟苷一磷酸(GMP)的改进的生产率。
如本文所用的，术语“脯氨酸脱氢酶”是脯氨酸脱氢酶/δ-1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶，并且已知参与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径，精氨酸和脯氨酸代谢途径。本发明涉及通过增加相应酶的活性显示XMP和GMP的改进的生产产率的微生物。
如本文所用的，术语“内源活性”指的是在野生型微生物中固有的酶活性，和术语“与内源活性相比增加”指与固有活性相比增加的酶活性。本发明增加的酶活性包括基因产物的内源活性的改进、通过内部或外部因子的内源基因的扩增、基因拷贝数的增加或通过引入外来基因造成的活性增加，以及酶本身活性的增加，以实现超过固有功能的作用。增加的酶活性可非限制地通过在现有技术中已知的任何方法实现，例如，基因拷贝数的增加、启动子的置换或修饰，和通过突变造成的酶活性的增加，但该方法不限于这些实例。
通过本发明增加活性的脯氨酸脱氢酶可由棒状杆菌的putA基因进行编码。任何衍生物或类似物可被包括在本发明中，只要其是生物学上等同的基因或对应于该基因。任何基因被包括在本发明中，只要其显示与putA基因的活性基本上相同或相似的生物活性，并且具有与putA基因序列优选70％或更高、更优选80％或更高、甚至更优选90％或更高、甚至进一步更优选95％或更高和最优选98％或更高的同源性。优选地，本发明的putA基因可由SEQ ID NO.7的核苷酸序列编码。当基因的拷贝数通过内部或外部因子增加时，增加的拷贝数可根据需要和目的容易地由本领域技术人员确定。内源基因的扩增也可利用本领域已知的方法进行，例如，通过在合适的选择压力下进行培养，但内源基因的扩增方法不限于该实例。
在本发明的优选实例中，将携带编码脯氨酸脱氢酶的基因的载体引入棒状杆菌微生物，以产生具有超过内源活性的提高的转化微生物。
本发明的“棒状杆菌微生物”可非限制地为任何菌株，只要其在本领域是已知的并属于棒状杆菌属。优选地，其例子可包括产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，但可用于本发明的棒状杆菌属的微生物的类型不限于这些例子。详细地，棒状杆菌微生物包括产氨棒状杆菌ATCC6872、热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)FERM BP-1539、谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒状杆菌R、黄色短杆菌ATCC 14067、乳酸发酵短杆菌ATCC13869和其衍生物。优选的是从产氨棒状杆菌KCCM10530转化的产氨棒状杆菌KCJ-1346。具体地，本发明的菌株可为具有并入产氨棒状杆菌KCCM10530基因组的putA基因的两个或多个拷贝的菌株，其由将具有图1的酶切图的载体引入其中和通过培养用载体转化的微生物将putA基因的至少两个拷贝与内源基因同源重组产生。
如本文所用的，术语“5’-黄苷一磷酸(XMP)”是核酸生物合成中的中间产物并在动物和植物中具有生理意义。同样，在包括食品工业、制药工业和医疗工业在内的多种领域中得到应用。其为与谷氨酸一钠协同用作核酸基香味增强剂的食品添加剂。XMP为嘌呤核苷酸生物合成代谢中的中间产物，并且是生产5’-鸟苷一磷酸(GMP)的重要原材料。优选地，制备和培养具有改进的XMP生产率的转化微生物，以便从培养液获得XMP。结果，发现与常规微生物相比转化微生物显示高大约4.5％的XMP生产率，并且因此通过使用该微生物可增加XMP生产。
如本文所用的，术语“5’-鸟苷一磷酸(GMP)”为核苷酸之一，其由鸟苷和磷酸盐组成。其在核酸中被发现，并根据位置分成5’-、3’-和2’-型3种类型。在本发明中，5’-鸟苷一磷酸作为无色针状晶体被生产，并在体内以游离形式存在。它具有C10H14N5O8P的分子式。它的钠盐提供了香菇味道并因此被用作化学调味剂。GMP是提供蘑菇味道的核酸基香味增强剂之一。优选地，本发明确定了利用转化微生物以高产率生产5’-鸟苷一磷酸的方法，并发现与利用常规微生物的方法相比，该方法显示了大约7％GMP浓度的增加。
在本发明中，包括putA基因的载体被引入以制备具有改进的脯氨酸脱氢酶活性的微生物。关于本发明的目的，该载体可包括包含具有基本上等同于putA基因的生物活性的基因的载体。对本领域技术人员显而易见的是显示基本上等同于或类似于putA基因的生物功能的基因的序列可根据转化微生物的类型和特性而不同。优选地，本发明涉及包括SEQ ID NO.7的基因的重组载体，其具有图1的酶切图。本发明的SEQ ID NO.7的基因为棒状杆菌putA基因的野生型核苷酸序列。“putA基因”指编码脯氨酸脱氢酶的基因。在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的例子中，显示以上功能的基因已知为登录号NC_006958，并且其mRNA序列已知为YP_224396.1。
在优选实施方式中，本发明提供了包括由SEQ ID NO.7表示的putA基因的重组载体。本发明的载体可非限制地为通常用于本领域的任何载体，只要它能够包括putA基因。根据待用宿主的特性优选地选择最优载体。优选地，该载体为pDZ-putA。在本发明的优选实施例中，SEQ ID NO.7的putA基因被引入pDZ，由此制备pDZ-putA载体(图1)。
本发明的转化微生物可通过将putA基因引入宿主微生物进行制备。优选地，将该putA基因克隆入载体，该载体被转化入细胞。
该转化可非限制地通过任何方法进行，并且根据本领域已知的典型方法容易地进行。如本文所用的，术语“转化”指将DNA引入宿主细胞，以便DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合复制，和为由外来DNA摄取引起的人工遗传改变。典型的转化方法包括CaCl2沉淀、Hanahan方法——其中结合DMSO(二甲亚砜)作为还原材料改进CaCl2沉淀的作用、电穿孔、磷酸钙转染、原生质体融合、碳化硅纤维介导的转化、土壤杆菌属介导的转化、聚乙二醇(PEG)介导的转化、硫酸葡聚糖、lipofectamine和干燥/抑制介导的转化。利用本发明的pDZ-putA的转化不限于这些实例，而可非限制地利用本领域已知的任何方法实现。
如本文所用的，术语“载体”——其描述了能够将靶蛋白输送进入合适宿主细胞的重组载体，指的是遗传构建体，其包括基因插入物以被并入宿主细胞染色体这样的方式连接的必需调节元件。优选地，包括本发明的putA基因的重组载体可为包括图1的酶切图的重组载体。在本发明的优选实施方式中，该载体通过转化方法被引入产氨棒状杆菌KCCM10530，其随后在选择培养基中培养以允许通过同源重组由putA基因的两个拷贝置换内源基因，导致putA基因的两个拷贝插入染色体。因此，被命名为KCJ-1346的新型转化的微生物通过产氨棒状杆菌的转化而产生，其在2010年2月24日以登录号KCCM11068P被保藏在国际保藏单位(International Depository Authority)，韩国微生物保藏中心(KCCM,361-221,Yurim B/D,Hongie-1-dong,Seodaemun-gu,Seoul,Korea)中。
根据本发明，XMP或GMP可通过上述转化微生物的直接发酵以高产率在培养基中生产。优选地，用于该方法中的微生物为具有改进的脯氨酸脱氢酶活性的微生物，并且载体的putA基因被插入宿主微生物的染色体，由此增加XMP和GMP的生产。优选地，用于生产方法中的微生物可为具有登录号KCCM11068P的微生物。
在另一方面，本发明涉及通过培养根据本发明的微生物从培养液生产5’-黄苷一磷酸或5’-鸟苷一磷酸的方法。
优选地，本发明提供生产XMP的方法，其包括培养用包括putA基因的载体转化的菌株，以便获得XMP的步骤，并也提供了生产GMP的方法，其包括以下步骤：(a)培养用包括putA基因的载体转化的菌株；(b)添加XMP脱氨基酶至在步骤(a)中获得的菌株的培养液；和(c)从步骤(b)的培养液获得GMP。更优选地，提供可通过直接发酵保藏的微生物在培养基中以高产率直接积聚XMP而生产XMP的方法。另外，该转变过程通过以下进行：添加具有XMP脱氨基酶活性的酶或微生物，优选大肠杆菌至包括XMP和该转化微生物的培养基，并且随后，GMP从培养基中分离并纯化以便获得GMP。
在本发明中使用的培养基可非限制地为在本领域中通常使用的任何培养基。优选地，该培养基包含葡萄糖作为碳源和任选的合适量的多种其他碳源。对于在培养中的使用，培养基必须达到微生物生长的要求。棒状杆菌菌株的培养基是本领域已知的(例如，Manual of Methodsfor General Bacteriology.American Society for Bacteriology.WashingtonD.C.,USA,1981)。所用碳源的例子可包括糖和碳水化合物诸如葡萄糖、半乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖、木糖、海藻糖、核糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，油类和脂类诸如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油，脂肪酸诸如棕榈酸、硬脂酸和亚麻酸，醇类诸如甘油和乙醇，和有机酸诸如乙酸。这些碳源可单独使用或结合使用。所用氮源的例子可包括有机氮源诸如蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、麦芽膏、玉米浆、大豆和尿素，和无机氮源诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源也可单独使用或结合使用。培养基中所用磷源的例子可包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的钠盐。另外，培养基可包括生长需要的金属盐诸如硫酸镁和硫酸铁。除了以上材料，还可进一步包括必需要素诸如氨基酸和维生素或合适的前体。这些材料在培养期间可以以间歇方式或连续方式被适当地添加至培养基。
在培养期间，培养基的pH可由碱性化合物诸如氢氧化钠、氢氧化钾和氨水，或酸性化合物诸如磷酸和硫酸进行合适地调节。消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇酯可用于防止气泡的产生。培养基可被充入氧气或含氧气体(例如，空气)以保持需氧条件，或被充入氮气、氢气或二氧化碳气体以保持厌氧和微需氧条件。培养温度通常被保持在20℃至45℃，并且优选在30℃至35℃或35℃至37℃。培养可继续，直到获得最大量的期望材料，并优选地，它可在10至160小时内实现。
XMP或GMP可被分泌入培养基或保留在细胞内。生产本发明XMP或GMP的方法包括从细胞或培养基中回收XMP或GMP的步骤。从细胞或培养基中回收XMP或GMP的方法是本领域广泛已知的。回收XMP或GMP的方法可包括过滤、阴离子交换层析、结晶和HPLC，但不限于此。
在仍然另一个方面，本发明涉及根据本发明的微生物用于生产5’-黄苷一磷酸或5’-鸟苷一磷酸的用途。
生产5’-黄苷一磷酸或5’-鸟苷一磷酸的棒状杆菌微生物具有与其内源活性相比增加的脯氨酸脱氢酶活性，由于脯氨酸脱氢酶活性的改进，该微生物能够以高产率生产XMP或GMP，由此有效用于生产5’-黄苷一磷酸或5’-鸟苷一磷酸。
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅出于说明性的目的，并且本发明不意欲被这些实施例所限制。
实施例1:产XMP菌株产氨棒状杆菌KCCM10530衍生的putA的克隆和为了染色体组并入构建重组载体(pDZ-putA)
在该实施例中，在韩国专利公布号10-2007-94433中公开的pDZ载体用于实施基因的基因组并入。为了利用pDZ载体将基因并入棒状杆菌基因组，构建在两端上包括插入序列的pDZ载体，因为与并入染色体的区域具有同源性的序列必须被包括在pDZ载体中。
在该实施例中，为了扩增putA基因，基于NIH基因库获得putA基因(NCBI ID_3344496)的核苷酸序列。基于该序列，合成两对引物(SEQ ID NO.1至4)。
PCR在高保真DNA聚合酶PfuUltraTM(Stratagene,USA)的存在下，利用棒状杆菌KCCM10530的基因组作为模板，SEQ ID NO.1至4的寡核苷酸作为引物，在25个周期的PCR条件下进行，所述周期由以下组成：在95℃下变性30秒；在55℃退火30秒；和在68℃下聚合2分钟。如此获得的PCR产物为putA基因(putA-A、putA-B)的两个拷贝，每个4.4kb长，其分别利用SEQ ID NO.1和2和SEQ ID NO.3和4两个引物组进行扩增。
SEQ ID NO.1:CCCAAGCCTTGAGCGCGTCGGTCACTCAACTA
SEQ ID NO.2:CAGCCAATCTTGCAGCCAA
SEQ ID NO.3:TGAGCGTCGGTCACTCAACTA
SEQ ID NO.4:CGGGATCCCAGCCAATCTTGCAGTCCAA
在用限制酶(putA-A：HindIII，putA-B：BamHI)处理后，PCR产物putA-A、putA-B通过三件式连接(three-piece junction)被插入先前用HindIII和BamHI处理的pDZ载体。最终，获得其中以串联形式克隆的putA基因的两个拷贝的重组pDZ-putA载体。图1为示意图，其显示用于并入棒状杆菌基因组的pDZ-putA载体的结构。
实施例2:putA-插入的菌株的产生
pDZ-putA载体构建体被转化入KCCM10530菌株并经历与基因组的第二同源重组，以便在基因组上邻近putA基因的位置上插入putA基因的一个拷贝，如在实施例1中所描述的。因此，获得产XMP的产氨棒状杆菌KCJ-1346，所述棒状杆菌在其基因组上具有putA基因的两个拷贝。被命名为KCJ-1346的新型转化微生物在2010年2月24日以登录号KCCM11068P被保藏在国际保藏单位(International DepositoryAuthority)，韩国微生物保藏中心(KCCM,361-221,Yurim B/D,Hongie-1-dong,Seodaemun-gu,Seoul,Korea)中。利用PCR，利用一组引物(SEQ ID NO.5和6)，确定以串联方式插入putA基因的两个拷贝，所述引物靶向putA基因的两个拷贝的上游和下游的核苷酸序列。
SEQ ID NO.5:CGAACTACGTGGCACAGTTTG
SEQ ID NO.6:AGCAGGCCATTAAAACGACC
实施例3:putA-插入的菌株的XMP生产
培养在实施例2中制备的产XMP菌株产氨棒状杆菌KCJ-1346，以如下产生XMP。母菌株产氨棒状杆菌KCCM10530和菌株KCJ-1346被接种入各自14mL的管中，每个包含3mL的以下种子培养基，并在30℃下温育20小时，伴随在200rpm下振荡。随后，种子培养物以0.4mL的量被添加至在各自250mL的角挡板烧瓶(corner-baffle flask)中32mL的以下生产培养基(24mL的主培养基+8mL的附加培养基)，随后在30℃和230rpm下振荡培养96小时。此后，利用HPLC定量测量5’-黄苷一磷酸的生产。由产氨棒状杆菌KCCM10530和KCJ-1346生产的XMP量在下面的表1中给出。
[表1]
菌株 KCCM10530 KCJ-1346
(g/L) 28.6 29.9
种子培养基：葡萄糖30g/L、蛋白胨15g/L、酵母提取物15g/L、NaCl 2.5g/L、尿素3g/L、腺嘌呤150mg/L、鸟嘌呤150mg/L(pH 7.2)
生产培养基(主培养基)：葡萄糖80g/L、硫酸镁10g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸锌10mg/L、硫酸锰10mg/L、腺嘌呤30mg/L、鸟嘌呤30mg/L、生物素100μg/L、硫酸铜1mg/L、氯化硫胺5mg/L、氯化钙10mg/L(pH 7.2)。
生产培养基(附加培养基)：磷酸二氢钾10g/L、磷酸氢二钾10g/L、尿素7g/L、硫酸铵5g/L。
如表1所示的，发现与母菌株KCCM10530相比，KCJ-1346增加XMP生产1.3g/L，相应于4.5％的增加。
实施例4：putA-插入菌株的脯氨酸脱氢酶活性
在实施例2中制备的产XMP产氨棒状杆菌KCJ-134如下测定脯氨酸脱氢酶活性。该菌株被接种入培养基中，该培养基包含10g/L的细菌用蛋白胨，5g/L的细菌用牛肉膏、5g/L的细菌用酵母提取物、2.5g/L的NaCl、50mg/L的腺嘌呤和50mg/L的鸟嘌呤，并在30℃下温育12小时，直到获得OD 10。10mL的细胞培养物被回收，用包括50mMHEPES、10mM乙酸钾、10mM CaCl2和10mM MgCl2的缓冲液清洗两次，并悬浮在1mL的100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中。
在使用超声波仪破坏后，离心细胞溶解产物以分离上清液。重新离心该上清液，以提供随后悬浮在100μL的缓冲液中的团粒。10μL的该悬浮液被用作酶溶液。反应缓冲液通过混合100mM Tris-HCl(pH7.5)和50μM 2,6-二氯靛酚(dichloroindolphenol)(Cl2Ind)制备。Cl2Ind就在反应前被融化并混合。向980μL的反应混合物添加作为底物的10μL的100mM的脯氨酸和10μL酶溶液，随后在30℃下温育15分钟并振荡。通过测量减少的Cl2Ind的浓度测定酶活性。Cl2Ind在600nm下具有22cm-1mM-1的吸收系数。
[表2]
菌株 KCCM10530 KCJ-1346
减少的Cl2Ind(μM) 4.09 5.00
如表2所示，与母菌株KCCM10530相比，观察到KCJ-1346增加脯氨酸脱氢酶活性22％。
实施例5：putA-插入的菌株中的ATP水平
如下测量在实施例2中制备的产XMP菌株产氨棒状杆菌KCJ-1346的细胞内ATP水平。
母菌株产氨棒状杆菌KCCM10530和突变体KCJ-1346被接种入各自的14mL的管，每个包含3mL的以下种子培养基，并在30℃下温育20小时，并在200rpm下振荡。随后，种子培养物以0.4mL的量被添加至在各自250mL的角挡板烧瓶中25mL的种子培养基中，随后在30℃和230rpm下振荡培养物20小时。此后，测量细胞培养物的OD和细胞内ATP水平。
结果，发现与母菌株KCCM10530相比，本发明的突变体KCJ-1346以每OD高速率产生ATP，说明与已知菌株相比，本发明的突变体菌株可显示高的XMP和GMP生产率。结果显示在下面的表3中。
[表3]
如表3所示，与母菌株KCCM10530相比，KCJ-1346的每OD的细胞内ATP水平增加大约60％。
实施例6：putA-插入的菌株的XMP发酵和GMP生产
培养在实施例2中制备的产XMP菌株产氨棒状杆菌KCJ-1346以如下产生GMP。
母菌株产氨棒状杆菌KCCM-10530和突变体KCJ-1346被接种入各自14mL的管，每个包含3mL的以下种子培养基，并在30℃下温育20小时，并在200rpm下振荡。随后，种子培养物以0.4mL的量被添加至在各自250mL的角挡板烧瓶中32mL的以下生产培养基(24mL的主培养基+8mL的附加培养基)，随后在30℃和230rpm下振荡培养96小时。为了将产生的XMP转变为GMP，以下转变添加剂和大肠杆菌XMP脱氨基酶被添加至埃伦迈尔烧瓶(Erlenmeyer flask)中的发酵液，并且随后转变反应在40℃下进行2.5小时。
结果，发现与母菌株KCCM10530相比，本发明的突变体KCJ-1346增加转变率，转变率解释每消耗的XMP的GMP生产。因此，与常规菌株相比，本发明的突变体菌株显示了GMP生产率的改进。结果显示在以下的表4中。
[表4]
如表4所示，发现与母菌株KCCM10530相比，KCJ-1346增加转变率1.4％p和增加GMP水平6.9％。
种子培养基：葡萄糖30g/L、蛋白胨15g/L、酵母提取物15g/L、NaCl 2.5g/L、尿素3g/L、腺嘌呤150mg/L、鸟嘌呤150mg/L(pH 7.2)。
生产培养基(主培养基)：葡萄糖80g/L、硫酸镁10g/L、硫酸亚铁20mg/L、硫酸锌10mg/L、硫酸锰10mg/L、腺嘌呤30mg/L、鸟嘌呤30mg/L、生物素100μg/L、硫酸铜1mg/L、氯化硫胺5mg/L、氯化钙10mg/L(pH 7.2)。
生产培养基(附加培养基)：磷酸二氢钾10g/L、磷酸氢二钾10g/L、尿素7g/L、硫酸铵5g/L
转变添加剂：肌醇六磷酸1.8g/L、MgSO44.8g/L、nymeen 3ml/L、二甲苯2％、腺嘌呤100mg/L、Na2HPO47.7g/L、葡萄糖46g/L。

Claims (11)

1.用于生产5’-黄苷一磷酸或5’-鸟苷一磷酸的棒状杆菌(Corynebacterium)微生物，其具有与其内源活性相比增加的脯氨酸脱氢酶活性，其中所述脯氨酸脱氢酶通过棒状杆菌的putA基因编码，并且脯氨酸脱氢酶活性的增加通过增加putA基因的拷贝数或置换putA基因的启动子实现。
2.根据权利要求1所述的棒状杆菌微生物，其中所述脯氨酸脱氢酶活性通过棒状杆菌putA基因的表达水平的改进增加。
3.根据权利要求2所述的棒状杆菌微生物，其中所述putA基因是SEQ ID NO.7的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的棒状杆菌微生物，其中所述微生物通过引入包括putA基因的载体进行转化。
5.根据权利要求1所述的棒状杆菌微生物，其中所述微生物通过引入包括SEQ ID NO:7的putA基因的重组载体进行转化。
6.根据权利要求1所述的棒状杆菌微生物，其中所述微生物具有改进的ATP生产率。
7.根据权利要求1所述的棒状杆菌微生物，其中所述微生物为产氨棒状杆菌。
8.根据权利要求1所述的棒状杆菌微生物，其中所述微生物由登录号KCCM11068P确定。
9.通过培养权利要求1至8任一项所述的微生物从培养液生产5’-黄苷一磷酸(XMP)或5’-鸟苷一磷酸(GMP)的方法。
10.生产5’-鸟苷一磷酸的方法，包括：
(a)培养权利要求1至8中任一项所述的棒状杆菌微生物；
(b)添加5’-黄苷一磷酸脱氨基酶至在步骤(a)中获得的所述棒状杆菌微生物的培养液；和
(c)从步骤(b)的所述培养液获得5’-鸟苷一磷酸。
11.权利要求1的所述棒状杆菌微生物用于生产5’-黄苷一磷酸或5’-鸟苷一磷酸的用途。
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