CN101104865B

CN101104865B - 属于芽孢杆菌属的肌苷生产细菌和生产肌苷的方法

Info

Publication number: CN101104865B
Application number: CN2007101274653A
Authority: CN
Inventors: 富永美佐; 岛崎敬士; 松野洁; 山下穰
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-02-17
Filing date: 2004-02-17
Publication date: 2011-11-02
Anticipated expiration: 2024-02-17
Also published as: CN1536072A; CN101104865A; BRPI0400268A; JP4352716B2; JP2004242610A; US20040166575A1; KR20040074954A; EP1447442A1; CN100374549C

Abstract

本发明涉及属于芽孢杆菌属的肌苷生产细菌和生产肌苷的方法。具体地，本发明涉及从芽孢杆菌群中筛选出在含有6-乙氧基嘌呤的培养基中表现为有利生长的菌株，并从获得的菌株中筛选出表现为肌苷生产能力高的一种菌株，以获得肌苷生产能力改善的芽孢杆菌。

Description

属于芽孢杆菌属的肌苷生产细菌和生产肌苷的方法

本申请是申请日为2004年2月17日的中国专利申请200410030235.1“属于芽孢杆菌属的肌苷生产细菌和生产肌苷的方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种生产肌苷的方法，肌苷是一种重要的物质，可用作合成原料以生产5’-肌苷酸，本发明还涉及一种用来生产肌苷的新的微生物。

背景技术

存在已知的利用芽孢杆菌属微生物发酵生产肌苷的方法，所述的微生物是腺嘌呤营养缺陷型菌株或者进一步被赋予了对各种物质，包括嘌呤类似物抗性的腺嘌呤营养缺陷型菌株(日本专利公开(KOKOKU)号38-23099，54-17033，55-2956，55-45199，57-14160，5741915和日本专利待审公开(KOKAI)号59-42895)，短杆菌属微生物(日本专利公开(KOKOKU)号51-5075，58-17592，Agric.Biol.Chem.，42，399(1978))，等等。

为获得这样的突变菌株，常规使用的一种方法是进行诱变处理如紫外线照射或者亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)处理，用合适的选择培养基筛选目标突变菌株。另一方面，已经在芽孢杆菌属微生物运用基因工程技术繁育产核酸菌株(日本专利待审公开(KOKAI)号58-158197，58-175493，59-28470，60-156388，1-27477，1-174385，3-58787，3-164185，5-84067，5-192164，11-346778(美国专利号6,284,495))和短杆菌属微生物(日本专利待审公开(KOKAI)号63-248394)。特别地，例如，已经公开了一种用嘌呤操纵子的阻遏蛋白基因(purR)被破坏的杆状细菌，来有效地生产核酸化合物如次黄嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤和腺嘌呤的方法(日本专利待审公开(KOKAI)号11-346778(美国专利号6,284,495))。

此外，对于枯草芽孢杆菌来说，除嘌呤操纵子的基因外，已得知前述的阻遏蛋白控制参与腺嘌呤生物合成的purA基因和参与嘧啶生物合成的嘧啶操纵子的基因的表达(H.Zalkin et al.，J.Bacteriol.，179，7394-7402，1997)。

此外，对于大肠杆菌来说，已知通过破坏琥珀酰-AMP合酶基因(purA)而赋予腺嘌呤营养缺陷型来改善其嘌呤核苷生产的能力(国际专利公开WO99/03988)。而且，也已知通过破坏嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)而阻遏肌苷和鸟苷降解为次黄嘌呤和鸟嘌呤来改善嘌呤核苷生产的能力(国际专利公开WO99/03988)。

发明内容

本发明的一个目的是制备出一种适用于通过发酵生产肌苷的微生物并且提供一种使用该微生物生产肌苷的方法。

本发明的进一步目的是提供一种经过修饰而使受6-乙氧基嘌呤生长抑制减少，且其具有肌苷生产能力的芽孢杆菌。

本发明的进一步目的是提供上述的芽孢杆菌，其是源自属于芽孢杆菌属的亲本菌株的一种突变菌株，且在含有6-乙氧基嘌呤的培养基中培养时显示出相对于亲本菌株有利的生长。

本发明的进一步目的是提供上述的细菌，其中培养基具有2000mg/L含量的乙氧基嘌呤。

本发明的进一步目的是提供上述的细菌，其中培养基是固体培养基。

本发明的进一步目的是提供上述的细菌，其中通过接种细菌悬液至含有6-乙氧基嘌呤的固体培养基和不含6-乙氧基嘌呤的固体培养基中培养细菌时，细菌显示出80或更高的相对生长度，相对生长度由以下等式定义：

相对生长度(％)＝[在含有6-乙氧基嘌呤的培养基中观测的菌落直径(mm)]/[在不含有6-乙氧基嘌呤的培养基中观测的菌落直径(mm)]×100

本发明的进一步目的是提供上述的细菌，其中含有6-乙氧基嘌呤的固体培养基具有2000mg/L含量的6-乙氧基嘌呤。

本发明的进一步目的是提供上述的细菌，其中固体培养基是基本培养基。

本发明的进一步目的是提供上述的细菌，其一个或者多个基因缺陷，这些基因负作用于肌苷的生物合成或者参与肌苷的降解，并选自嘌呤操纵子阻遏蛋白基因、琥珀酰-AMP合酶基因和嘌呤核苷磷酸化酶基因。

本发明的更进一步目的是提供一种生产肌苷生产能力改善的芽孢杆菌的方法，该方法包括从芽孢杆菌群中选择在含有6-乙氧基嘌呤的培养基中表现为有利生长的菌株，并从获得的菌株中选择显示出肌苷生产能力高的菌株。

本发明的更进一步目的是提供上述的方法，其中芽孢杆菌群是通过诱变处理属于芽孢杆菌属的亲本菌株获得的。

依照本发明，提供了一种具有肌苷生产能力的微生物和一种使用该微生物生产肌苷的方法。

附图说明

图1是表示一种6-乙氧基嘌呤抗性菌株的肌苷(HxR)和次黄嘌呤(Hyp)生产量的图表。

具体实施方式

为达到上述目的，本发明的发明人进行了研究。结果，通过修饰芽孢杆菌而使受6-乙氧基嘌呤生长抑制减少，能够改善芽孢杆菌的肌苷生产能力，发明人因此完成了本发明。

本发明的芽孢杆菌是经过修饰而使受6-乙氧基嘌呤生长抑制减少，且其具有肌苷生产能力。

本文使用的“肌苷生产能力”的表述是指本发明的芽孢杆菌具有的一种使肌苷在培养基中积累的能力，其量足以能够从培养基中收集肌苷。例如，当细菌在培养基中培养时，有4g/L或者更多的肌苷和相当肌苷含量的次黄嘌呤。

芽孢杆菌的例子包括但不限于枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，短小芽孢杆菌等等。

枯草芽孢杆菌的例子包括但不限于枯草芽孢杆菌168Marburg菌株(ATCC6051)、枯草芽孢杆菌PY79(Plasmid，1984，12，1-9)等等，解淀粉芽孢杆菌的例子包括但不限于解淀粉芽孢杆菌T(ATCC23842)，解淀粉芽孢杆菌N(ATCC23845)等等。

本发明的芽孢杆菌可以通过修饰具有肌苷生产能力的菌株致使受6-乙氧基嘌呤生长抑制减少而获得。本发明的芽孢杆菌也可以通过修饰已修饰过的菌株致使受6-乙氧基嘌呤生长抑制减少而获得，以便赋予肌苷生产能力或者改善其肌苷生产能力。

通过例如赋予芽孢杆菌腺嘌呤营养缺陷或者，除了腺嘌呤营养缺陷以外，对药物如嘌呤类似物的抗性，可以获得具有肌苷生产能力的芽孢杆菌(日本专利公开号38-23099，54-17033，55-2956，55-45199，57-14160，57-41915和日本专利待审公开号59-42895)。通过紫外线照射或者用典型诱变处理使用的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或者EMS(乙基甲烷磺酸)处理，可以获得具有上述营养缺陷或药物抗性的芽孢杆菌。

繁育具有肌苷生产能力的芽孢杆菌的方法包括下面例子。例如，方法包含使参与肌苷生物合成的酶增加细胞内活性，特别地，增加上述酶的基因表达。短语“增加细胞内活性”是指增加活性至比没有修饰过的芽孢杆菌如野生型芽孢杆菌更高的水平。例子包括但不限于增加每个细胞的酶分子数量，增加每个酶分子比活性等等。

参与肌苷生物合成的酶的例子包括，例如，磷酸核糖焦磷酸(PRPP)转酰胺酶、磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成酶、腺苷脱氨酶等等。

此外，例子也包括参与去除肌苷生物合成的酶的调节，特别地，一种去除该酶的反馈抑制的方法(WO99/03988)。去除如上面提到的参与肌苷生物合成这样的酶调节的方法的例子包括，例如，嘌呤阻遏蛋白的去除(美国专利号6,284,495)。去除嘌呤阻遏蛋白方法的例子包括破坏编码嘌呤阻遏蛋白的基因(purR，GenBank登记号Z99104)。

此外，通过阻断从肌苷生物合成分支并产生另外代谢产物的反应，也可以增加肌苷生产能力(WO99/03988)。从肌苷生物合成分支并产生另外代谢产物的反应的例子包括由例如琥珀酰-腺苷单磷酸基(AMP)合酶、肌苷-鸟苷激酶、6-磷酸葡糖酸脱水酶、磷酸葡糖异构酶等等催化的反应。琥珀酰-腺苷单磷酸基(AMP)合酶是由purA编码的(GenBank登记号Z99104)。

此外，通过削弱肌苷掺入细胞也可以提高肌苷生产能力。通过阻断参与肌苷掺入细胞的反应可以削弱肌苷掺入细胞。上述参与肌苷掺入细胞的反应的例子包括由例如核苷通透酶催化的反应。

此外，通过减少或者消除肌苷降解活性也可以改善肌苷生产能力(WO99/03988)。减少或者消除肌苷降解活性的方法的例子包括破坏编码嘌呤核苷磷酸化酶的基因(deoD)的方法。

增加芽孢杆菌细胞中目标酶的活性可以通过提高编码该酶的基因的表达而达到。提高基因表达可以通过增加基因的拷贝数而达到。例如，编码上述酶的基因片段可以连接到芽孢在杆菌中起作用的载体，优选多拷贝类型载体，以制备重组DNA，其然后用来转化宿主芽孢杆菌。

对于待导入的基因，任何源自芽孢杆菌的基因和源自其它生物体如埃希氏菌属细菌的基因可以使用，只要该基因在芽孢杆菌中起作用。

目的基因可以通过例如使用芽孢杆菌染色体DNA作为模板的PCR方法(多聚酶链式反应，见White，T.J.et al.，Trends Genet.，5，185(1989))获得。染色体DNA可以通过例如Saito和Miura的方法(见H.Saito和K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，Text for Bioengineering Experiments，由生物科学和生物工程协会主编，日本，pp.97-98，Baifukan，1992)或者相似方法，从作为DNA供体的细菌中制备得到。PCR引物的制备可以基于芽孢杆菌的已知基因序列或者基于在序列已知的其它细菌的基因中保守区的信息或者相似情况。

将目的基因导入芽孢杆菌的自主复制载体的例子包括，例如，pUB110、pC194、pE194等等。此外，用于将目的基因掺入到染色体DNA的载体的例子包括大肠杆菌载体，如pHSG398(Takara Shuzo)和pBluescript SK-(Stratagene)。

为制备重组DNA，目的基因可以通过使用适合目的基因末端的限制酶消化载体而连接到能在芽孢杆菌中起作用的载体上。典型的连接是通过使用连接酶如T4DNA连接酶进行的。

为将上述制备的重组DNA导入芽孢杆菌中，可以使用任何已知的转化方法。例子包括，例如，从生长期细胞制备感受态细胞，随后将DNA导入其中(Dubunau和Davidoff Abelson，J.Mol.Biol.，56，209(1971)；Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F.E.，Gene，1，153(1977))，将宿主细胞制备成能容易掺入重组DNA的原生质体或者原生质球的方法，然后将重组DNA导入DNA-受体细胞进行(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979))。

通过允许存在于芽孢杆菌染色体DNA上的基因多重拷贝，也可以增加目的基因的拷贝数。目的基因的多重拷贝可能是通过例如同源重组导入芽孢杆菌的染色体DNA。这可以通过靶向以多重拷贝数出现在染色体DNA上的序列而完成。重复DNA或者出现在转座元件末端的反向重复单位可以用作以多重拷贝数出现在染色体DNA上的序列。

除了上述基因扩增方法外，通过将表达调节序列如染色体DNA或者质粒上的目的基因的启动子用更强启动子取代，可以增强目标酶的活性。此外，也有可能通过将几个核苷酸的核苷酸取代导入目的基因的启动子区，以致于修饰成更强的启动子。该表达调节序列的修饰可能与目的基因拷贝数的增加相结合。

表达调节序列的取代可以通过例如与下面描述的基因取代相同的方式进行。

减少芽孢杆菌目标酶活性的方法的例子包括用紫外线照射或者典型诱变处理中使用的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或者EMS(乙基甲烷磺酸)处理杆菌，选择出表现为目标酶活性减少的突变菌株。此外，利用基因重组技术(分子遗传实验，冷泉港实验室出版(1972)；Matsuyama，S.&Mizushima，S.，J.Bacteriol.，162，1196(1985))进行同源重组，将染色体上编码目标酶的基因取代为不正常起作用的相应基因(以下也指“破坏型基因”)，也可以获得目标酶活性减少的芽孢杆菌。

将宿主染色体上正常基因取代为破坏型基因可以按如下进行。在下面的例子中，以purR基因的破坏作为例子。然而，其它基因，例如purA和deoD的破坏也可以类似方式进行。

同源重组是一种现象，即当含有和染色体序列同源的序列的质粒或者类似物被导入细胞时，致使在同源序列的位点上发生一定频率的重组，被导入的质粒作为一个整体结合到染色体上。之后，如果染色体上同源序列的位点上引起进一步重组，该质粒就又从染色体上去除。这时，导入突变的基因可能被固定到染色体上，依据重组发生的位点，本来的基因可能随质粒被除去。

通过选择该菌株，可以获得缺陷型purR基因取代染色体上正常purR基因的菌株。

使用线性DNA的方法、使用包括温度敏感型复制控制区的质粒的方法等等的同源重组破坏基因的方法是已知的。此外，使用含有插入标志基因如药物抗性基因的purR基因的质粒，可以破坏purR基因，且其不能在目标微生物细胞中复制。也就是说，用上面提到的该质粒转化的且因此获得药物抗性的转化体，在其染色体DNA中掺入了标志基因。由于通过purR基因序列在其两末端和purR基因在染色体上的同源重组，标志基因很有可能被掺入，就可以有效地选择出基因破坏型菌株。

特别地，用限制性内切酶消化和重连接后的去除purR基因的特定区域，将另一种DNA片段(标志基因等)插入purR基因，经定点诱变(Kramer，W.和Frits，H.J.，酶学方法，154，350(1987))，或者用化学试剂如硫代硫酸钠和羟胺(Shortle，D.和Nathans，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，270(1978))处理引起purR基因的编码区、启动子区或者类似区域核苷酸序列中的一个或多个核苷酸取代、缺失、插入、添加或者倒置，从而减少或消除所编码阻遏蛋白的活性，或者减少或消除purR基因的转录，可以获得用作基因破坏的破坏型purR基因。在这些方法中，去除用限制性内切酶消化和重连接后的purR基因的特定区域的方法或者将另一种DNA片段插入purR基因的方法由于可靠性和稳定性而更优选。

基于已知的purR基因核苷酸序列制备的寡核苷酸用作引物进行PCR，可以从具有嘌呤操纵子的微生物的染色体DNA中获得purR基因。通过基于已知的purR基因的核苷酸序列制备的寡核苷酸作为探针的杂交方法，也可以从具有嘌呤操纵子的微生物的染色体DNA文库中获得purR基因。已报道了枯草芽孢杆菌168Marburg菌株(GenBank登记号D26185(编码区相应于核苷酸编号118041至118898位)，DDBJ登记号Z99104(编码区相应于核苷酸编号54439至55296位))purR基因的核苷酸序列。purR基因的核苷酸序列和由该基因编码的氨基酸序列示于SEQ ID NOS：11和12。

用于PCR的引物可以是任何允许purR基因扩增的引物，具体的例子包括具有如SEQ ID NOS：1和2所示核苷酸序列的寡核苷酸。

同样，用于purA基因扩增的引物的例子包括具有如SEQ ID NOS：3和4所示核苷酸序列的寡核苷酸，用于deoD基因扩增的引物的例子包括具有如SEQ IDNOS：5至8所示核苷酸序列的寡核苷酸。已报道了purA基因和deoD基因的核苷酸序列如DDBJ登记号Z99104。

purA基因的核苷酸序列和由该基因编码的氨基酸序列示于SEQ ID NOS：13和14。此外，deoD基因的核苷酸序列和由该基因编码的氨基酸序列示于SEQ IDNOS：15和16。

本发明使用的purR、purA和deoD基因的每一个是不必要求具有全部长度来制备其破坏型基因，其可以具有需要引起基因破坏的长度。此外，用于获得每个基因的微生物不是特别限制的，只要该基因和用于制备基因破坏型菌株的微生物的同源基因具有一定程度的同源性，所述同源程度可引起同源重组。然而，通常优选使用源自和目标芽孢杆菌相同细菌的基因。

和芽孢杆菌的purR、purA或deoD基因可能引起同源重组的DNA的例子包括编码如SEQ ID NOS：12、14或者16所示的包括取代、缺失、插入或者添加一个或者几个氨基酸残基的氨基酸序列的DNA。上面提到的“几个”氨基酸残基的数目是，例如，2到50，优选2到30，更优选2到10。

和上述芽孢杆菌的purR、purA或deoD基因能引起同源重组的DNA的具体例子包括与SEQ ID NOS：11、13或者15所示核苷酸序列具有例如70％或者以上，优选80％或者以上，更优选90％或者以上，最优选95％或者以上同源性的DNA。更具体地，这些例子包括在严紧条件下可与SEQ ID NOS：11、13或者15所示核苷酸序列杂交的DNA。严紧条件的例子包括盐浓度为1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS的水溶液，60℃下进行洗涤的条件。

上面提到的标志基因的例子包括药物抗性基因如壮观霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因。通过从芽孢杆菌遗传库中心(BGSC)商业性获得的来自大肠杆菌ECE101菌株的pDG1726质粒，并从该质粒中切除盒形式的抗性基因，可以获得粪肠球菌的壮观霉素抗性基因。此外，通过从芽孢杆菌遗传库中心(BGSC)商业性获得的大肠杆菌ECE91菌株中制备pDG646质粒，并从该质粒中切除盒形式的抗性基因，可以获得金黄色葡萄球菌的红霉素抗性基因。此外，用含有源自粪链球菌(其可以从芽孢杆菌遗传库中心商业性获得的大肠杆菌ECE94菌株中制备)的卡那霉素抗性基因的pDG783质粒作为模板和如SEQID NOS：9和10所示的引物进行PCR，可以获得卡那霉素抗性基因。

当药物抗性基因用作标志基因时，将药物抗性基因插入到purR基因的适当位点，用获得的质粒转化微生物，并选择表现药物抗性的转化体，可以获得purR基因破坏型菌株。通过用Southern印迹或者PCR分析染色体上的purR基因或者标志基因，可以确定染色体上purR基因的破坏。上述壮观霉素抗性基因、红霉素抗性基因或者卡那霉素抗性基因掺入到染色体DNA，可以通过用能扩增这些基因的引物进行PCR而确定。

以下将解释芽孢杆菌中受6-乙氧基嘌呤生长抑制的减少。如果6-乙氧基嘌呤存在于培养基中，芽孢杆菌的生长就被抑制。也就是说，如果芽孢杆菌在含有6-乙氧基嘌呤的培养基中培养，则该芽孢杆菌不会生长或者相对于在不含6-乙氧基嘌呤的培养基中培养的细菌生长变得缓慢。特别地，当该细菌在固体培养基中培养一段时间后，例如在含有6-乙氧基嘌呤的培养基中的菌落直径就会相对于在不含6-乙氧基嘌呤的培养基中所观测到的变小。另一方面，本发明的芽孢杆菌被修饰后，则减少了上述受6-乙氧基嘌呤的生长抑制。

如上所述经修饰的致使受6-乙氧基嘌呤的生长抑制减少的芽孢杆菌中，其肌苷生产能力相对于没有修饰的菌株则提高了。因此，可以将涉及6-乙氧基嘌呤的特性应用到芽孢杆菌中的肌苷生产细菌的育种。也就是说，通过从芽孢杆菌群中选择在含有6-乙氧基嘌呤的培养基中显示有利生长的菌株，并从获得的菌株中选择显示高肌苷生产能力的菌株，可以生产肌苷生产能力改善的芽孢杆菌。

可以获得作为源自亲本菌株芽孢杆菌的突变菌株的本发明的芽孢杆菌。获得该突变菌株的诱变处理没有特别限定，其例子包括但不限于用紫外线照射处理或者用通常进行诱变处理使用的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸处理。

选择受6-乙氧基嘌呤生长抑制减少的突变菌株，例如当它们培养在含有6-乙氧基嘌呤的培养基中时，相对于没有修饰的菌株例如亲本菌株，显示出更有利生长。也就是说，与亲本菌株相比，可以说本发明的芽孢杆菌中，对6-乙氧基嘌呤的敏感性减少，或者对6-乙氧基嘌呤的抗性增加。

上述培养基的例子包括但不限于基本培养基。基本培养基的例子包括，例如，具有以下成分的培养基：20g/L葡萄糖，5g/L氯化铵，4g/L磷酸二氢钾，0.01g/L硫酸亚铁，0.01g/L硫酸锰，0.5g/L柠檬酸钠，pH7.0。

本发明中，基本培养基如果需要可以含有生长必需的营养物。例如，许多肌苷生产菌株是腺嘌呤营养缺陷型的，因此培养基中可加入生长所需浓度的腺嘌呤。然而，如果腺嘌呤的量太大，某种嘌呤类似物的生长抑制作用就可能减少，因此优选限定腺嘌呤的量。特别地，优选的浓度约0.1g/L。

可以在液体培养基或者固体培养基中选择目标突变菌株或者评价所获得突变菌株受6-乙氧基嘌呤的生长抑制。当使用固体培养基时，例如，突变菌株和亲本菌株都培养在液体培养基中直到达到对数生长期或者稳定期，然后该液体培养液用培养基、氯化钠溶液等稀释，获得的细胞悬液应用于含有6-乙氧基嘌呤的固体培养基，突变菌株和亲本菌株在相同条件下培养。培养通常在最适生长温度左右的温度下进行，例如，34℃，培养一到三天。然后，如果形成的突变菌株的菌落比亲本菌株的大，则突变菌株的生长比亲本菌株更有利，且受6-乙氧基嘌呤的生长抑制减少。加入培养基中的乙氧基嘌呤的量是，例如，1000mg/L或更多，优选约2000mg/L。

此外，当使用液体培养基时，则培养突变菌株和亲本菌株的细胞悬液，并与上述相同的方式进行稀释，且每个接种在含有6-乙氧基嘌呤的液体培养基中。细胞培养在最适生长温度左右的温度下，例如，34℃，几个小时到一天，优选约6个小时。加入培养基中的乙氧基嘌呤的量是，例如，500mg/L或者更多。如果与亲本菌株相比，至少在对数生长期或者稳定期，突变菌株显示出更高的培养基的光密度(OD)或者混浊度，则生长评价为有利。特别地，如果细胞更快地达到对数生长期，或者如果最大OD值更高，则生长更有利。上述对数生长期是指在生长曲线上细胞数呈对数增加的时期。稳定期是指对数生长期过后的时期，细胞分裂和生长都已停止，且再也看不到细胞数增加(生物化学词典，第三版，东京Kagaku Dojin)。

当使用液体培养基时，可能相对于使用固体培养基时更难检测受6-乙氧基嘌呤生长抑制的差异。本发明中，使用液体培养基即使不能检测到受6-乙氧基嘌呤生长抑制的差异，只要突变菌株与固体培养基上的亲本菌株相比显示出更有利的生长，就本发明而言，突变菌株为显示出有利生长的菌株。

此外，通过将突变菌株的悬液应用到含有6-乙氧基嘌呤的固体培养基和不含6-乙氧基嘌呤的固体培养基，经上述相同的条件下培养后，比较出现的菌落的大小，也可以评价受6-乙氧基嘌呤生长抑制的程度。例如，当源自枯草芽孢杆菌168Marburg菌株且purR、purA和deoD三重缺陷的菌株培养在含有2000mg/L的6-乙氧基嘌呤的培养基中时，则根据上述等式计算的相对生长程度：在培养时间为42到45小时下为约40至60，或者在培养时间为48到66小时下为约50至70，然而，在实施例部分中获得的突变菌株在培养时间为42到52小时且含有相同量的6-乙氧基嘌呤下，显示出约80到100的相对生长程度。因此，通过用相对生长程度作为一种指标，可以不与亲本菌株对照而评价受6-乙氧基嘌呤的生长抑制。然而，通过比较亲本菌株和突变菌株的相对生长程度，也可以评价受6-乙氧基嘌呤的生长抑制。

通过在合适的培养基中培养如上所述获得的本发明的芽孢杆菌，可以在培养基中生产和积累肌苷。

至于本发明中使用的培养基，可以用常规方式，使用含有碳源、氮源和矿物盐，根据需要也可以含有有机微量营养物如氨基酸和维生素的典型培养基进行培养。可以使用合成培养基或者天然培养基。只要能被培养的菌株利用，任何种类的碳源和氮源都可以使用。

作为碳源，可以使用糖类如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解产物和糖蜜，也可以单独或者和其它碳源结合使用有机酸如醋酸和柠檬酸。

作为氮源，可以使用氨、铵盐如硫酸铵、碳酸胺、氯化铵、磷酸铵和醋酸铵、硝酸盐等等。

作为有机微量营养物，可以使用氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸、含有这些物质的如蛋白胨、水解酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白水解产物等等。当使用生长需要氨基酸等的营养缺陷型突变菌株时，则需要补充所需的营养物。

作为矿物盐，可以使用磷酸盐、镁盐、钙盐、亚铁盐、锰盐等等。

虽然根据使用的芽孢杆菌类型，可以改变培养条件，例如枯草芽孢杆菌进行通气培养，但发酵温度控制在20至50℃，pH4至9。当培养过程中pH下降时，培养基用碱如氨气中和。在上述培养方式下，经40小时至3天培养后，培养液中就积累了肌苷。

完成培养后，可以用常规方式收集培养液中已积累的肌苷。例如，可以通过沉淀、离子交换层析等等分离肌苷。

此外，如果使本发明使用的微生物产生编码核苷酶或者核苷酸酶的基因缺陷，则可以积累相应的核苷或者核苷酸。此外，如果赋予肌苷营养缺陷，则可以积累参与其生物合成途径的前体或者相关物质。

此外，通过允许嘌呤核苷磷酸化酶和/或磷酸核糖转移酶作用于按本发明的方法获得的肌苷，可以获得5’-肌苷酸。

实施例

以下，根据下面非限制性的实施例，将更具体地解释本发明。

实施例1

按如下制备源自枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌168Marburg菌株，ATCC6051)，嘌呤操纵子阻遏蛋白基因(purR)、琥珀酰-AMP合酶基因(purA)和嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)缺陷的重组体。

(1)嘌呤操纵子阻遏蛋白基因(purR)缺陷型菌株的获得

基于基因数据库的信息(GenBank登记号Z99104)，制备具有如下核苷酸序列的PCR引物，每个引物是28-聚体。

CTCAAGCTTGAAGTTGCGATGATCAAAA(SEQ ID NO：1)

CTCCTGCAGACATATTGTTGACGATAAT(SEQ ID NO：2)

枯草芽孢杆菌168Marburg菌株染色体DNA用作模板，和上述引物一起进行PCR(一个循环由94℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟组成，使用GeneAmpPCR系统模型9600(Perkin-Elmer)重复30个循环)，以获得覆盖SD-ATG和翻译终止密码子的purR基因区的约0.9kb的扩增片段。

在上述PCR引物的5’-末端，分别设计一个HindIII位点和Pst I位点。用HindIII和Pst I处理PCR扩增片段，然后用T4DNA连接酶将其连接到用相同限制酶消化的可在大肠杆菌中复制的pHSG398载体(Takara Shuzo)上，以获得pHSG398BSPR质粒。

存在于purR结构基因的独特的EcoRV和Hinc II位点之间的purR结构基因中约0.3kb的内部序列，通过用EcoRV和Hinc II处理将其从pHSG398BSPR质粒中去除。然后，源自粪肠球菌且被克隆入pDG1726质粒(其可以从杆菌遗传库中心(俄亥俄州大学，生物化学系(美国，俄亥俄州43210，哥伦布，西第十二大街484))购买的大肠杆菌ECE101菌株中制备)的壮观霉素抗性基因(1.2kb)，以EcoRV-Hinc II片段形式被切下，插入到上述pHSG398BSPR的限制酶位点之间。

将得到的质粒pHSG398purR∷spc用于转化根据Dubunau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，56，209(1971))制备的枯草芽孢杆菌168Marburg菌株的感受态细胞，选择生长在含有100μg/ml壮观霉素的LB(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，pH7)琼脂平板上的菌落。从这些菌落中制备染色体DNA，通过上述PCR方法识别这样的药株，其中通过双交叉重组，用壮观霉素抗性基因(purR∷spc)取代3内部序列的PurR基因的purR基因来取代染色体上的purR基因。如上所述获得的一个重组菌株被命名为KMBS4。

(2)琥珀酰-AMP合酶基因(purA)缺陷型菌株的获得

基于基因数据库的信息(GenBank登记号Z99104)，制备具有如下核苷酸序列的PCR引物，每个引物是29-聚体。

CTCGTCGACAAAACGAATGGAAGCGAACG(SEQ ID NO：3)

CTCGCATGCAGACCAACTTATATGCGGCT(SEQ ID NO：4)

枯草芽孢杆菌168Marburg菌株染色体DNA用作模板，和上述引物一起进行PCR(一个循环由94℃30秒、55℃1分钟和72℃2分钟组成，使用Gene AmpPCR系统模型9600(Perkin-Elmer)重复30个循环)，以获得覆盖SD-ATG和翻译终止密码子的purA基因区的约0.9kb的扩增片段。

在上述PCR引物的5’末端，分别设计一个Sal I位点和Sph I位点。用SalI和Sph I处理PCR扩增片段，然后用T4DNA连接酶将其连接到用相同限制酶消化的可在大肠杆菌中复制的pSTV28载体(Takara Shuzo)上，以获得pSTV28BSPA质粒。

存在于purA结构基因的独特的Mlu I位点和Bgl II位点之间的purA结构基因中约0.4kb的内部序列，通过用Mlu I和BglII处理将其从pSTV28BSPA质粒中除去，并用Klenow片段将含有该质粒结构的DNA片段的两末端变成平末端。源自金黄色葡萄球菌且被克隆入pDG646质粒(其可以从杆菌遗传库中心购买的大肠杆菌ECE91菌株中制备)的红霉素抗性基因(1.6kb)，通过用HindIII处理pDG646质粒切下后，用T4DNA连接酶连接至该DNA片段，并用Klenow片段将其两末端变成平端。

得到的质粒pSTV28purA∷ern用于转化根据Dubunau和Davidoff-Abelson的方法(J.MolBiol.，56，209(1971))制备的KMBS4菌株的感受态细胞，菌落生长在含有0.1μg/ml红霉素和125μg/ml林可霉素的LB琼脂平板上。从这些菌落中制备染色体DNA，通过上述PCR方法识别这样的菌株，其中通过双交叉重组采用已用红霉素抗性基因(purA∷erm)取代内部序列形成的purA基因，来取代染色体上的purA基因(purR∷spc，purA∷erm)。如上所述获得的重组菌株变成腺嘌呤营养缺陷型菌株，其中一个菌株被指定为KMBS13。

(3)嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)缺陷型菌株的获得

(i)deoD5’-末端区的克隆

基于基因数据库的信息(GenBank登记号Z99104)，制备具有如下核苷酸序列的PCR引物，其分别为29-聚体和28-聚体。

CTCGAATTCCAGCGGAATATTCTTTCCCG(SEQ ID NO：5)

CTCGGATCCCGGCAAAAGCACAGTATCC(SEQ ID ON：6)

枯草芽孢杆菌168Marburg菌株染色体DNA用作模板，和上述引物一起进行PCR(一个循环由94℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟组成，使用GeneAmpPCR系统模型9600(Perkin-Elmer)重复30个循环)，以获得含有deoD基因翻译起始密码子上游约310bp和其下游约60bp的扩增片段。

在上述PCR引物的5’-末端，分别设计一个EcoR I位点和BamH I位点。用EcoR I和BamH I处理PCR扩增片段，然后用T4DNA连接酶将其连接到用相同限制酶消化的pSTV28载体(Takara Shuzo)上，以获得pSTV28DON质粒。

(ii)deoD3’-末端区的克隆

CTCAAGCTTATGGTTTCCAGACCATCGACT(SEQ ID NO：7)

CTCGGATCCCATGATATGATAGAAGTGG(SEQ ID NO：8)

枯草芽孢杆菌168Marburg菌株染色体DNA用作模板，和上述引物一起进行PCR(一个循环由94℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟组成，使用GeneAmpPCR系统模型9600(Perkin-Elmer)重复30个循环)，以获得含有deoD基因翻译终止密码子上游约40bp和其下游约320bp的扩增片段。

在上述PCR引物的5’-末端，分别设计一个HindIII位点和BamH I位点。用HindIII和BamH I处理PCR扩增片段，然后用T4DNA连接酶将其连接到用相同限制酶消化的pSTV28DON质粒上，以获得pSTV28DONC质粒。

(iii)卡那霉素抗性基因插入deoD

基于基因数据库的信息(GenBank登记号V01547)，制备具有如下核苷酸序列的PCR引物，每个引物是33-聚体。

CCTGGATCCGAGGTGATAGGTAAGATTATACCG(SEQ ID NO：9)

CTCGGATCCGGCGCTCGGGACCCCTATCTAGCG(SEQ ID NO：10)

含有源自粪链球菌(芽孢杆菌遗传库中心)的卡那霉素抗性基因的pDG783质粒用作模板，和上述引物一起进行PCR(一个循环由94℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟，使用Gene Amp PCR系统模型9600(Perkin-Elmer)重复30个循环)，以获得覆盖SD-ATG和翻译终止密码子的卡那霉素抗性基因区的约1.5kb的扩增片段。

在PCR引物的每个5’-末端，设计一个BamH I位点。用BamH I处理PCR扩增片段，并插入到pSTV28DONC质粒中唯一的BamH I位点。

将得到的质粒pSTV28deoD∷kan用于转化根据Dubunau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，56，209(1971))制备的KMBS13菌株的感受态细胞，菌落生长在含有5μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上。从这些菌落中制备染色体DNA，采用上述PCR方法识别这样的菌株：其中采用两次重组(purR∷spcpurA∷erm deoD∷kan)用卡那霉素抗性基因(deoD∷kan)取代内部序列形成的deoD基因，来取代染色体上的deoD基因。如上所述获得的一个双重组菌株被指定为KMBS16。

实施例2：6-乙氧基嘌呤抗性菌株的选择

(1)6-乙氧基嘌呤抗性菌株的筛选

嘌呤操纵子阻遏蛋白基因(purR)、琥珀酰-AMP合酶基因(purA)和嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)缺陷的枯草芽孢杆菌重组菌株KMBS16，用400μg/ml亚硝基胍(NTG)在37℃下处理30分钟。然后，将NTG处理后的细胞悬液涂到含有2000mg/L6-乙氧基嘌呤的基本培养基(20g/L葡萄糖，5g/L氯化铵，4g/L磷酸二氢钾，0.01g/L硫酸亚铁，0.01g/L硫酸锰，0.5g/L柠檬酸钠，1.0g/LL-谷氨酸，0.1g/L腺嘌呤，50mg/L色氨酸，pH7.0)平板上，将细胞在37℃培养24小时。在含有2000mg/L6-乙氧基嘌呤的平板上显示出有利生长的菌落中，选择10个菌株并指定为EP1到EP10菌株。给予EP1菌株专有号AJ13937。该菌株于2001年12月25日保藏于独立的管理机构即独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，并获得保藏号FERM P-18665。然后，根据布达佩斯条约规定于2004年1月14日将其转移至国际保藏，并获得保藏号FERM BP-08595。

当研究上面获得的乙氧基嘌呤抗性菌株针对各种常规用于繁育已知的肌苷生产细菌的药物的抗性时，其显示出趋同于亲本菌株的特性。

(2)6-乙氧基嘌呤抗性程度的测定

详细检测如上所述获得的突变菌株的6-乙氧基嘌呤抗性的程度。亲本菌株和突变菌株是腺嘌呤营养缺陷型，且使用的药物是嘌呤类似物。因此，加入基本培养基中腺嘌呤的量被限制到所需的基本水平(该实施例中为2mg/L)。

6-乙氧基嘌呤抗性菌株(EP1菌株和EP2菌株)和亲本菌株KMBS16都接种在液体基本培养基中，34℃培养过夜。通过离心从培养液中分离细胞，用基本培养基洗三次，再用相同的培养基悬浮细胞。悬浮液用相同的培养基进行适当稀释，并涂到基本培养基平板上，基本培养基平板含有2000mg/L6-乙氧基嘌呤，且细胞在34℃下培养。24小时后，小菌落被确认为EP1菌株和EP2菌株，而没有菌落被确认为亲本菌株KMBS16。之后继续培养，经48小时到66小时后测量出几个单菌落的直径。给每个菌株计算菌落直径的平均值，并根据上述等式计算相对生长程度。

如上所述测量的菌落直径和相对生长程度示于表1至3中。在该表中，符号“-”表示不能确认出任何菌落，而符号“±”表示菌落模糊而不能测量出直径。

表1：不含6-乙氧基嘌呤的基本培养基平板上菌落的直径

表2：含有6-乙氧基嘌呤(2000μg/mL)的基本培养基平板上菌落的直径

表3：相对生长程度

实施例3：6-乙氧基嘌呤抗性菌株生产嘌呤核酸

6-乙氧基嘌呤抗性菌株(EP1菌株)和亲本菌株KMBS16都均一地涂铺到LB培养基平板上，且37℃培养过夜。平板1/6的细胞接种到装有20ml发酵培养基的500-ml容量的烧瓶中，加入50g/L浓度的碳酸钙于培养基后，细胞在37℃下摇动培养。开始培养后，培养基进行时程采样，并用已知的方法测量培养液中含有的肌苷和次黄嘌呤的量。所有6-乙氧基嘌呤抗性菌株相对于亲本菌株KMBS16显示出更高的肌苷和次黄嘌呤的积累。作为代表性的例子，显示了42小时后测量的结果(图1)。

[发酵培养基成分]

葡萄糖 80g/L

KH₂PO₄ 1g/L

NH₄Cl 32g/L

Mameno(T-N)^* 1.35g/L

DL-甲硫氨酸 0.3g/L

L-色氨酸 0.02g/L

腺嘌呤 0.1g/L

MgSO₄ 0.4g/L

FeSO₄ 0.01g/L

MnSO₄　　　　　　　　　　　　　　　　0.01g/L

GD113 0.01ml/L

(用KOH调节至pH7.0)

碳酸钙 50g/L

^*：大豆蛋白水解产物

^**消泡剂

序列表

<110>Ajinomoto Co.，Inc.

<120>属于芽孢杆菌属的肌苷生产细菌和生产肌苷的方法

<130>0P1633

<150>日本2003-37760

<151>2003-02-17

<160>16

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>1

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>2

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>3

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>4

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>5

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明；引物

<400>6

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明；引物

<400>7

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>8

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>9

<210>10

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>10

<210>11

<211>1200

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<220>

<221>CDS

<222>(259)..(1113)

<400>11

<210>12

<211>285

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌

<400>12

<210>13

<211>1490

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(101)..(1393)

<400>13

<210>14

<211>430

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌

<400>14

<210>15

<211>899

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(101)..(802)

<400>15

<210>16

<211>233

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌

<400>16

Claims

1. 一种生产肌苷的方法，包括在培养基中培养一种芽孢杆菌以便在培养基中积累肌苷，并且从培养基收集肌苷，其中所述芽孢杆菌经过修饰致使受6-乙氧基嘌呤的生长抑制减少，并具有肌苷生产能力，其中所述芽孢杆菌为一种源自属于芽孢杆菌属的亲本菌株的突变菌株，且当培养在含有6-乙氧基嘌呤的培养基中时，其相对于亲本菌株显示出有利的生长。

2. 权利要求1的方法，其中培养基具有2000mg/L含量的6-乙氧基嘌呤。

3. 权利要求1的方法，其中培养基是固体培养基。

4. 权利要求1的方法，其中通过将该芽孢杆菌悬液加到含有6-乙氧基嘌呤的固体培养基和不含6-乙氧基嘌呤的固体培养基来培养该芽孢杆菌时，该芽孢杆菌显示出80或者更高的相对生长程度，相对生长程度由如下等式定义：

相对生长程度(％)＝[在含有6-乙氧基嘌呤的培养基中观测的菌落直径(mm)]/[在不含有6-乙氧基嘌呤的培养基中观测的菌落直径(mm)]×100。

5. 权利要求4的方法，其中含有6-乙氧基嘌呤的固体培养基具有2000mg/L含量的6-乙氧基嘌呤。

6. 权利要求5的方法，其中固体培养基为基本培养基。

7. 权利要求1的方法，其中所述芽孢杆菌一个或者多个负作用于肌苷生物合成或者参与肌苷降解的基因是缺陷的，所述基因选自嘌呤操纵子阻遏蛋白基因、琥珀酰-AMP合酶基因和嘌呤核苷磷酸化酶基因。

8. 一种生产5′-肌苷酸的方法，包括通过权利要求1—7的任一项的方法生产肌苷，并且使嘌呤核苷磷酸化酶、磷酸核糖转移酶或其组合作用于肌苷，以生产5’-肌苷酸。