JP2000135078A - 発酵法によるキサントシンの製造法 - Google Patents
発酵法によるキサントシンの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 キサントシンを発酵法により生産するに当た
り、好適な微生物を創製する。 【解決手段】 キサントシン・フォスフォリラーゼおよ
びグアノシンモノリン酸シンセターゼの活性が欠失し、
キサントシン生産能を有する、エシェリヒア属に属する
微生物を育種する。
り、好適な微生物を創製する。 【解決手段】 キサントシン・フォスフォリラーゼおよ
びグアノシンモノリン酸シンセターゼの活性が欠失し、
キサントシン生産能を有する、エシェリヒア属に属する
微生物を育種する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、プリンヌクレオシ
ドの一つであるキサントシンの製造法、および、その製
造に用いられる新規微生物に関する。
ドの一つであるキサントシンの製造法、および、その製
造に用いられる新規微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】発酵法によるキサントシンの生産に関し
ては、アデニン要求株、またはグアニン要求株、または
それにプリンアナログをはじめとする各種の薬剤耐性を
付与したバチルス属の微生物（特公昭４４-１７９９
４、特公昭４４-２０３９５、特公昭４７-５０３９６、
特開昭５０−１２６８８７、J.Gen.Appl.Microbiol.,1
8,19-27(1972)、Agric.Biol.Chem.,37,287(1973)、App
l.Environ.Microbiol.,34,337(1977)）、ブレビバクテ
リウム属の微生物（特公昭４４-２０３９０、特公昭４
７-３８１９８、特公昭４９-３９８３９）、セラチア属
の微生物（特公昭４４-２０３９４）、およびシュード
モナスやエシェリヒア属等の微生物（特公昭４８-３２
３４９）等を用いる方法が知られている。
ては、アデニン要求株、またはグアニン要求株、または
それにプリンアナログをはじめとする各種の薬剤耐性を
付与したバチルス属の微生物（特公昭４４-１７９９
４、特公昭４４-２０３９５、特公昭４７-５０３９６、
特開昭５０−１２６８８７、J.Gen.Appl.Microbiol.,1
8,19-27(1972)、Agric.Biol.Chem.,37,287(1973)、App
l.Environ.Microbiol.,34,337(1977)）、ブレビバクテ
リウム属の微生物（特公昭４４-２０３９０、特公昭４
７-３８１９８、特公昭４９-３９８３９）、セラチア属
の微生物（特公昭４４-２０３９４）、およびシュード
モナスやエシェリヒア属等の微生物（特公昭４８-３２
３４９）等を用いる方法が知られている。
【０００３】このような変異株を取得するには、従来、
紫外線照射やニトロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-
N-nitrosoguanidine）処理などの変異誘起処理を行い、
適当な選択培地を用いて、目的とする変異株を取得する
という方法が行われてきた。一方で、遺伝子工学技術を
用いたプリンヌクレオシド生産株の育種もバチルス属の
微生物（特開昭５８−１５８１９７、特開昭５８−１７
５４９３、特開昭５９−２８４７０、特開昭６０−１５
６３８８、特開平１−２７４７７、特開平１−１７４３
８５、特開平３−５８７８７、特開平３−１６４１８
５、特開平５−８４０６７、特開平５−１９２１６
４）、およびブレビバクテリウム属の微生物（特開昭６
３−２４８３９４）で行われているが、キサントシンの
生産性を高めた例はない。
紫外線照射やニトロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-
N-nitrosoguanidine）処理などの変異誘起処理を行い、
適当な選択培地を用いて、目的とする変異株を取得する
という方法が行われてきた。一方で、遺伝子工学技術を
用いたプリンヌクレオシド生産株の育種もバチルス属の
微生物（特開昭５８−１５８１９７、特開昭５８−１７
５４９３、特開昭５９−２８４７０、特開昭６０−１５
６３８８、特開平１−２７４７７、特開平１−１７４３
８５、特開平３−５８７８７、特開平３−１６４１８
５、特開平５−８４０６７、特開平５−１９２１６
４）、およびブレビバクテリウム属の微生物（特開昭６
３−２４８３９４）で行われているが、キサントシンの
生産性を高めた例はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】発酵法によってキサン
トシンを製造するために好適な微生物を創製することを
課題とする。
トシンを製造するために好適な微生物を創製することを
課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、特定の酵
素の遺伝子を欠失させることにより、エシェリヒア属細
菌にキサントシン生産能を付与することに成功し、本発
明を完成した。
素の遺伝子を欠失させることにより、エシェリヒア属細
菌にキサントシン生産能を付与することに成功し、本発
明を完成した。
【０００６】すなわち本発明は、キサントシン・フォス
フォリラーゼおよびグアノシンモノリン酸シンセターゼ
の活性が欠失し、キサントシン生産能を有する、エシェ
リヒア属に属する微生物（以下、本発明微生物ともい
う）を提供する。
フォリラーゼおよびグアノシンモノリン酸シンセターゼ
の活性が欠失し、キサントシン生産能を有する、エシェ
リヒア属に属する微生物（以下、本発明微生物ともい
う）を提供する。
【０００７】本発明微生物においては、プリンヌクレオ
シド生合成に関与する酵素の細胞内での活性が上昇し、
および／またはプリンヌクレオシド生合成から分岐して
他の代謝産物にいたる反応が遮断されていることが好ま
しい。また、プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素
の遺伝子の発現量が上昇することによって、および／ま
たはプリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の調節が
解除されることによって、プリンヌクレオシド生合成に
関与する酵素の細胞内での活性が上昇していることが好
ましい。
シド生合成に関与する酵素の細胞内での活性が上昇し、
および／またはプリンヌクレオシド生合成から分岐して
他の代謝産物にいたる反応が遮断されていることが好ま
しい。また、プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素
の遺伝子の発現量が上昇することによって、および／ま
たはプリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の調節が
解除されることによって、プリンヌクレオシド生合成に
関与する酵素の細胞内での活性が上昇していることが好
ましい。
【０００８】上記プリンヌクレオシド生合成に関与する
酵素の調節が解除される手段は、好ましくはプリン・リ
プレッサーの機能の欠失である。
酵素の調節が解除される手段は、好ましくはプリン・リ
プレッサーの機能の欠失である。
【０００９】上記プリンヌクレオシド生合成に関与する
酵素は、好ましくはホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰ
Ｐ）アミドトランスフェラーゼである。
酵素は、好ましくはホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰ
Ｐ）アミドトランスフェラーゼである。
【００１０】上記プリンヌクレオシド生合成から分岐し
て他の代謝産物にいたる反応は、好ましくはサクシニル
−アデノシンモノリン酸（ＡＭＰ）シンターゼ、プリン
ヌクレオシド・フォスフォリラーゼ、アデノシン・デア
ミナーゼ、６-フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ、フ
ォスフォグルコース・イソメラーゼ、アデニン・デアミ
ナーゼ、キサントシン・フォスフォリラーゼ、グアノシ
ンモノリン酸（ＧＭＰ）シンセターゼから選ばれる酵素
に触媒される反応である。
て他の代謝産物にいたる反応は、好ましくはサクシニル
−アデノシンモノリン酸（ＡＭＰ）シンターゼ、プリン
ヌクレオシド・フォスフォリラーゼ、アデノシン・デア
ミナーゼ、６-フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ、フ
ォスフォグルコース・イソメラーゼ、アデニン・デアミ
ナーゼ、キサントシン・フォスフォリラーゼ、グアノシ
ンモノリン酸（ＧＭＰ）シンセターゼから選ばれる酵素
に触媒される反応である。
【００１１】また本発明は、本発明微生物を培地に培養
し、キサントシンを生成蓄積せしめ、生成蓄積したキサ
ントシンを回収することを特徴とする発酵法によるキサ
ントシンの製造法を提供する。
し、キサントシンを生成蓄積せしめ、生成蓄積したキサ
ントシンを回収することを特徴とする発酵法によるキサ
ントシンの製造法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】（１）本発明微生物 本発明微生物は、キサントシン・フォスフォリラーゼお
よびグアノシンモノリン酸シンセターゼの活性が欠失
し、かつ、キサントシン生産能を有することを特徴とす
るエシェリヒア属に属する微生物である。
よびグアノシンモノリン酸シンセターゼの活性が欠失
し、かつ、キサントシン生産能を有することを特徴とす
るエシェリヒア属に属する微生物である。
【００１３】本発明にいうエシェリヒア属に属する微生
物の例としては、エシェリヒア・コリ(E.coli)等があげ
られる。E.coliを遺伝子工学的手法を用いて育種する場
合には、E.coli K12株及びその誘導体を用いることがで
きる。
物の例としては、エシェリヒア・コリ(E.coli)等があげ
られる。E.coliを遺伝子工学的手法を用いて育種する場
合には、E.coli K12株及びその誘導体を用いることがで
きる。
【００１４】本発明にいうキサントシン生産能とは、キ
サントシンを培地中に生産蓄積する能力を意味する。ま
た、キサントシン生産能を有するとは、そのエシェリヒ
ア属に属する微生物が、E.coliの野生株例えばW3110株
よりも多量にキサントシンを培地中に生産蓄積すること
を意味し、好ましくは、後記実施例１に記載した条件で
培養して１０mg/L以上、さらに好ましくは１００mg/L以
上のキサントシンを培地中に生産蓄積することを意味す
る。
サントシンを培地中に生産蓄積する能力を意味する。ま
た、キサントシン生産能を有するとは、そのエシェリヒ
ア属に属する微生物が、E.coliの野生株例えばW3110株
よりも多量にキサントシンを培地中に生産蓄積すること
を意味し、好ましくは、後記実施例１に記載した条件で
培養して１０mg/L以上、さらに好ましくは１００mg/L以
上のキサントシンを培地中に生産蓄積することを意味す
る。
【００１５】本発明にいうキサントシン・フォスフォリ
ラーゼおよびグアノシンモノリン酸シンセターゼの活性
の欠失とは、これらの酵素の活性が無いことだけでな
く、キサントシン生産能を獲得ないし向上させるのに有
効な程度にこれらの酵素の活性が低下していることも包
含する。
ラーゼおよびグアノシンモノリン酸シンセターゼの活性
の欠失とは、これらの酵素の活性が無いことだけでな
く、キサントシン生産能を獲得ないし向上させるのに有
効な程度にこれらの酵素の活性が低下していることも包
含する。
【００１６】キサントシン・フォスフォリラーゼおよび
グアノシンモノリン酸シンセターゼの活性を欠失させる
方法としては、特に限定はなく、例えば、これらの酵素
をコードする遺伝子に、これらの酵素の活性を欠失させ
る変異を生じさせる方法が挙げられる。
グアノシンモノリン酸シンセターゼの活性を欠失させる
方法としては、特に限定はなく、例えば、これらの酵素
をコードする遺伝子に、これらの酵素の活性を欠失させ
る変異を生じさせる方法が挙げられる。
【００１７】遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異
的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J., Methods in Enz
ymology, 154, 350(1987))、リコンビナントPCR法（PCR
Technology, Stockton Press(1989))、特定の部分のDN
Aを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシ
アミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外
線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸など
の化学薬剤で処理する方法がある。また、適当な制限酵
素サイトにDNAの付加や欠失を入れる方法がある。ま
た、相同組換え法(Experiments in Molecular Genetic
s, Cold Spring Habor Lab.(1972))を用いて染色体上の
特定の遺伝子を破壊する方法もある。
的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J., Methods in Enz
ymology, 154, 350(1987))、リコンビナントPCR法（PCR
Technology, Stockton Press(1989))、特定の部分のDN
Aを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシ
アミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外
線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸など
の化学薬剤で処理する方法がある。また、適当な制限酵
素サイトにDNAの付加や欠失を入れる方法がある。ま
た、相同組換え法(Experiments in Molecular Genetic
s, Cold Spring Habor Lab.(1972))を用いて染色体上の
特定の遺伝子を破壊する方法もある。
【００１８】具体的には、これらの酵素の遺伝子の公知
の塩基配列に基づいて、これらの酵素をコードするＤＮ
Ａを取得し、取得されたＤＮＡにこれらの酵素の活性が
欠失するような変異を導入し、変異を導入したＤＮＡを
相同組換えにより染色体ＤＮＡに組み込むことにより、
これらの酵素の活性が欠失した微生物を得ることができ
る。
の塩基配列に基づいて、これらの酵素をコードするＤＮ
Ａを取得し、取得されたＤＮＡにこれらの酵素の活性が
欠失するような変異を導入し、変異を導入したＤＮＡを
相同組換えにより染色体ＤＮＡに組み込むことにより、
これらの酵素の活性が欠失した微生物を得ることができ
る。
【００１９】キサントシンをキサンチンに分解するキサ
ントシンフォスフォリラーゼおよびGMPシンセターゼの
活性を欠失させることにより、キサントシン生産能を獲
得ないし向上させることができる。
ントシンフォスフォリラーゼおよびGMPシンセターゼの
活性を欠失させることにより、キサントシン生産能を獲
得ないし向上させることができる。
【００２０】なお、GMPシンセターゼの活性を欠失させ
るとグアニン要求株となるので、本発明微生物の生育に
は、培地中へのグアニンの添加が必要である。
るとグアニン要求株となるので、本発明微生物の生育に
は、培地中へのグアニンの添加が必要である。
【００２１】本発明微生物においては、プリンヌクレオ
シド生合成に関与する酵素の細胞内での活性が上昇し、
および／または、プリンヌクレオシド生合成から分岐し
て他の代謝産物にいたる反応が遮断されていることが好
ましい。プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の細
胞内での活性を上昇させるには、例として、プリンヌク
レオシド生合成に関与する酵素の遺伝子の発現量を上昇
させること、または、プリンヌクレオシド生合成に関与
する酵素の調節を解除すること、または、これらの組合
せが挙げられる。以下、これらの好ましい態様について
説明する。
シド生合成に関与する酵素の細胞内での活性が上昇し、
および／または、プリンヌクレオシド生合成から分岐し
て他の代謝産物にいたる反応が遮断されていることが好
ましい。プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の細
胞内での活性を上昇させるには、例として、プリンヌク
レオシド生合成に関与する酵素の遺伝子の発現量を上昇
させること、または、プリンヌクレオシド生合成に関与
する酵素の調節を解除すること、または、これらの組合
せが挙げられる。以下、これらの好ましい態様について
説明する。
【００２２】（２）プリンヌクレオシド生合成に関与す
る酵素の細胞内での活性が上昇した微生物 エシェリヒア属に属する微生物におけるプリンヌクレオ
シド生合成に関与する全酵素と、同酵素が触媒する全反
応はすでに明らかにされている(Escherichia coli and
Salmonella CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY second E
dition vol. 1and vol. 2 ASM PRESS WASHINGTON D.
C.)。これら酵素のうち、律速段階となっている反応を
触媒する酵素の酵素活性を上昇させることによって、キ
サントシン生産能を向上させることができる。そのよう
な律速段階となっている反応を触媒する酵素は、たとえ
ばＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ(PRPP amidotrans
ferase)である。
る酵素の細胞内での活性が上昇した微生物 エシェリヒア属に属する微生物におけるプリンヌクレオ
シド生合成に関与する全酵素と、同酵素が触媒する全反
応はすでに明らかにされている(Escherichia coli and
Salmonella CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY second E
dition vol. 1and vol. 2 ASM PRESS WASHINGTON D.
C.)。これら酵素のうち、律速段階となっている反応を
触媒する酵素の酵素活性を上昇させることによって、キ
サントシン生産能を向上させることができる。そのよう
な律速段階となっている反応を触媒する酵素は、たとえ
ばＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ(PRPP amidotrans
ferase)である。
【００２３】プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素
の酵素活性を上昇させる手段としては、酵素の遺伝子の
発現量を上昇させることが挙げられる。遺伝子の発現量
を上昇させる手段としては、遺伝子の調節領域の改良、
遺伝子のコピー数の上昇などが挙げられるが、これらに
限定されるものではない。調節領域の改良とは、遺伝子
の転写量を増加させる改変を加えることをいう。たとえ
ばプロモーターに変異を導入することによってプロモー
ター強化をおこない下流にある遺伝子の転写量を増加さ
せることができる。プロモーターに変異を導入する以外
にも、lac,trp,tac,trc,PLその他の微生物内で機能する
プロモーターを新たに導入してもよい。またはエンハン
サーを新たに導入することによって遺伝子の転写量を増
加させることができる。染色体ＤＮＡへのプロモーター
等の遺伝子の導入については、例えば特開平１−２１５
２８０号公報に記載されている。
の酵素活性を上昇させる手段としては、酵素の遺伝子の
発現量を上昇させることが挙げられる。遺伝子の発現量
を上昇させる手段としては、遺伝子の調節領域の改良、
遺伝子のコピー数の上昇などが挙げられるが、これらに
限定されるものではない。調節領域の改良とは、遺伝子
の転写量を増加させる改変を加えることをいう。たとえ
ばプロモーターに変異を導入することによってプロモー
ター強化をおこない下流にある遺伝子の転写量を増加さ
せることができる。プロモーターに変異を導入する以外
にも、lac,trp,tac,trc,PLその他の微生物内で機能する
プロモーターを新たに導入してもよい。またはエンハン
サーを新たに導入することによって遺伝子の転写量を増
加させることができる。染色体ＤＮＡへのプロモーター
等の遺伝子の導入については、例えば特開平１−２１５
２８０号公報に記載されている。
【００２４】また、遺伝子のコピー数の上昇は、具体的
には、遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換え
ＤＮＡを作製し、同組換えＤＮＡを微生物に保持させる
ことによって得られる。ここでベクターとは、プラスミ
ドやファージ等広く用いられているものを含むが、これ
ら以外にも、トランスポゾン(Berg,D.E. and Berg,C.
M., Bio/Technol., 1, 417(1983))やMuファージ（特開
平2-109985)も含む。遺伝子を相同組換え用プラスミド
等を用いた方法で染色体に組込んでコピー数を上昇させ
ることも可能である。
には、遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換え
ＤＮＡを作製し、同組換えＤＮＡを微生物に保持させる
ことによって得られる。ここでベクターとは、プラスミ
ドやファージ等広く用いられているものを含むが、これ
ら以外にも、トランスポゾン(Berg,D.E. and Berg,C.
M., Bio/Technol., 1, 417(1983))やMuファージ（特開
平2-109985)も含む。遺伝子を相同組換え用プラスミド
等を用いた方法で染色体に組込んでコピー数を上昇させ
ることも可能である。
【００２５】エシェリヒア属に属し、プリンヌクレオシ
ド生合成に関与する酵素の遺伝子の発現量を上昇した微
生物の誘導に当たっては、主としてE.coliの既知の遺伝
子情報に基づき、PCR(polymerase chain reaction)法を
用いて必要な遺伝子領域を増幅取得し育種に用いること
ができる。
ド生合成に関与する酵素の遺伝子の発現量を上昇した微
生物の誘導に当たっては、主としてE.coliの既知の遺伝
子情報に基づき、PCR(polymerase chain reaction)法を
用いて必要な遺伝子領域を増幅取得し育種に用いること
ができる。
【００２６】たとえばE.coli K12のW3110株（ATCC2732
5)の染色体DNAよりPCR法を用いてＰＲＰＰアミドトラン
スフェラーゼをコードする遺伝子であるpurFをクローニ
ングする。この際使用する染色体DNAはE.coli由来であ
ればどの菌株でもよい。purFはアデノシンモノリン酸(A
MP)やグアノシンモノリン酸(GMP)でフィードバック阻害
を受けるＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードす
る遺伝子を言い、遺伝的多形性などによる変異型も含
む。なお、遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異
によりタンパク質のアミノ酸配列が一部変化している現
象をいう。
5)の染色体DNAよりPCR法を用いてＰＲＰＰアミドトラン
スフェラーゼをコードする遺伝子であるpurFをクローニ
ングする。この際使用する染色体DNAはE.coli由来であ
ればどの菌株でもよい。purFはアデノシンモノリン酸(A
MP)やグアノシンモノリン酸(GMP)でフィードバック阻害
を受けるＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードす
る遺伝子を言い、遺伝的多形性などによる変異型も含
む。なお、遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異
によりタンパク質のアミノ酸配列が一部変化している現
象をいう。
【００２７】プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素
の細胞内での活性を上昇させる手段としては、酵素の構
造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの活性を
上昇させることも挙げられる。
の細胞内での活性を上昇させる手段としては、酵素の構
造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの活性を
上昇させることも挙げられる。
【００２８】プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素
の酵素活性を上昇させる手段としては、プリンヌクレオ
シド生合成に関与する酵素の調節を解除することも挙げ
られる。
の酵素活性を上昇させる手段としては、プリンヌクレオ
シド生合成に関与する酵素の調節を解除することも挙げ
られる。
【００２９】プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素
の調節とは、同酵素の活性を負に制御する仕組みをい
い、たとえば生合成経路中間体または最終産物によるフ
ィードバック阻害、アテニュエーション、転写抑制など
をさす。微生物が製造したプリンヌクレオシドは、同調
節を通じてプリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の
活性を阻害し、または、同酵素をコードする遺伝子の発
現を抑制する。したがって、微生物にキサントシンを生
産させるためには同調節を解除することが望ましい。
の調節とは、同酵素の活性を負に制御する仕組みをい
い、たとえば生合成経路中間体または最終産物によるフ
ィードバック阻害、アテニュエーション、転写抑制など
をさす。微生物が製造したプリンヌクレオシドは、同調
節を通じてプリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の
活性を阻害し、または、同酵素をコードする遺伝子の発
現を抑制する。したがって、微生物にキサントシンを生
産させるためには同調節を解除することが望ましい。
【００３０】上記調節を受けるプリンヌクレオシド生合
成に関与する酵素としては、AMPやGMPでフィードバック
阻害を受けるＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼがあげ
られる。そのほか、アデノシンジリン酸(ADP)によるフ
ィードバック阻害を受けるＰＲＰＰシンセターゼ（PRPP
synthetase）がある。またGMPによるフィードバック阻
害をイノシンモノリン酸（ＩＭＰ）デヒドロゲナーゼ
（IMP dehydrogenase, GuaB）とＧＭＰシンセターゼ(Gu
aA)が受けている。また、プリン・オペロン、guaBAは抑
制を受けている。
成に関与する酵素としては、AMPやGMPでフィードバック
阻害を受けるＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼがあげ
られる。そのほか、アデノシンジリン酸(ADP)によるフ
ィードバック阻害を受けるＰＲＰＰシンセターゼ（PRPP
synthetase）がある。またGMPによるフィードバック阻
害をイノシンモノリン酸（ＩＭＰ）デヒドロゲナーゼ
（IMP dehydrogenase, GuaB）とＧＭＰシンセターゼ(Gu
aA)が受けている。また、プリン・オペロン、guaBAは抑
制を受けている。
【００３１】調節を解除する方法としては、酵素をコー
ドする遺伝子またはその調節領域に変異を導入する方法
がある。同変異としては、フィードバック阻害を解除す
る変異があり、これは、通常には、構造遺伝子内の変異
である。また、同変異としては、アテニュエーションを
解除する変異があり、これは、通常には、アテニュエー
ター内の変異である。さらに、同変異としては、抑制を
解除する変異があり、これは、通常には、リプレッサー
と呼ばれる調節タンパク質をコードする遺伝子の変異、
またはオペレーター領域内の変異である。
ドする遺伝子またはその調節領域に変異を導入する方法
がある。同変異としては、フィードバック阻害を解除す
る変異があり、これは、通常には、構造遺伝子内の変異
である。また、同変異としては、アテニュエーションを
解除する変異があり、これは、通常には、アテニュエー
ター内の変異である。さらに、同変異としては、抑制を
解除する変異があり、これは、通常には、リプレッサー
と呼ばれる調節タンパク質をコードする遺伝子の変異、
またはオペレーター領域内の変異である。
【００３２】抑制を解除する変異としては、プリン・リ
プレッサーの機能を欠失させる、すなわちプリン・リプ
レッサーを不活化させる変異がある。同リプレッサー
は、プリンヌクレオチドが多量に存在する条件下でプリ
ンオペロンのオペレーター領域に結合し、結果として同
オペロンの転写が抑制される。同リプレッサーの不活化
は、抑制の解除につながる。
プレッサーの機能を欠失させる、すなわちプリン・リプ
レッサーを不活化させる変異がある。同リプレッサー
は、プリンヌクレオチドが多量に存在する条件下でプリ
ンオペロンのオペレーター領域に結合し、結果として同
オペロンの転写が抑制される。同リプレッサーの不活化
は、抑制の解除につながる。
【００３３】遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異
的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J., Methods in Enz
ymology, 154, 350(1987))、リコンビナントPCR法（PCR
Technology, Stockton Press(1989))、特定の部分のDN
Aを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシ
アミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外
線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸など
の化学薬剤で処理する方法がある。また遺伝子の機能を
完全に不活化する目的の場合には適当な制限酵素サイト
にDNAの付加や欠失を入れる方法がある。
的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J., Methods in Enz
ymology, 154, 350(1987))、リコンビナントPCR法（PCR
Technology, Stockton Press(1989))、特定の部分のDN
Aを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシ
アミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外
線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸など
の化学薬剤で処理する方法がある。また遺伝子の機能を
完全に不活化する目的の場合には適当な制限酵素サイト
にDNAの付加や欠失を入れる方法がある。
【００３４】プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素
の調節が解除されたものを選択する場合、酵素の発現量
を酵素活性を測定することによって調べるか、抗体を用
いて調べることができる。また、酵素の調節が解除され
た変異株を取得する一つの方法として、８−アザアデニ
ンや８−アザグアニンなどのプリンアナログを含む最小
培地で生育する菌株を選択し、酵素の発現量や活性の変
化を確認する方法がある。
の調節が解除されたものを選択する場合、酵素の発現量
を酵素活性を測定することによって調べるか、抗体を用
いて調べることができる。また、酵素の調節が解除され
た変異株を取得する一つの方法として、８−アザアデニ
ンや８−アザグアニンなどのプリンアナログを含む最小
培地で生育する菌株を選択し、酵素の発現量や活性の変
化を確認する方法がある。
【００３５】（３）プリンヌクレオシド生合成から分岐
して他の代謝産物にいたる反応を遮断した微生物 エシェリヒア属に属する微生物のプリンヌクレオシド生
合成経路は明らかになっており、プリンヌクレオシド生
合成に関与する全酵素と、同酵素が触媒する全反応はす
でに明らかにされている(Escherichia coli and Salmon
ella CELLULARAND MOLECULAR BIOLOGY second Edition
vol. 1 and vol. 2 ASM PRESS WASHINGTON D.C.)。これ
らに加え、他の代謝産物にいたる反応のいくつかは明ら
かになっている。
して他の代謝産物にいたる反応を遮断した微生物 エシェリヒア属に属する微生物のプリンヌクレオシド生
合成経路は明らかになっており、プリンヌクレオシド生
合成に関与する全酵素と、同酵素が触媒する全反応はす
でに明らかにされている(Escherichia coli and Salmon
ella CELLULARAND MOLECULAR BIOLOGY second Edition
vol. 1 and vol. 2 ASM PRESS WASHINGTON D.C.)。これ
らに加え、他の代謝産物にいたる反応のいくつかは明ら
かになっている。
【００３６】他の代謝産物にいたる反応が遮断された微
生物は、同代謝産物を要求するようになる可能性があ
る。同代謝産物を要求するようになった微生物を培養す
るためには、培地に栄養物質として同代謝産物あるいは
その中間体（前駆体）を添加する必要がある。したがっ
て、遮断されるべき反応を決定する際には、培地に新た
な同代謝産物を添加する必要が生じない反応を選択する
ことが望ましい。
生物は、同代謝産物を要求するようになる可能性があ
る。同代謝産物を要求するようになった微生物を培養す
るためには、培地に栄養物質として同代謝産物あるいは
その中間体（前駆体）を添加する必要がある。したがっ
て、遮断されるべき反応を決定する際には、培地に新た
な同代謝産物を添加する必要が生じない反応を選択する
ことが望ましい。
【００３７】また、他の代謝産物にいたる反応のうち、
いかなるものを遮断してもつねにプリンヌクレオシドの
生産能が向上するとはかぎらない。微生物がプリンヌク
レオシドを生産する時期に、プリンヌクレオシド中間体
あるいはプリンヌクレオシドを他の代謝産物に変換する
方向の反応が進行している場合に、同反応を遮断するこ
とがプリンヌクレオシド生産性向上につながる可能性が
ある。
いかなるものを遮断してもつねにプリンヌクレオシドの
生産能が向上するとはかぎらない。微生物がプリンヌク
レオシドを生産する時期に、プリンヌクレオシド中間体
あるいはプリンヌクレオシドを他の代謝産物に変換する
方向の反応が進行している場合に、同反応を遮断するこ
とがプリンヌクレオシド生産性向上につながる可能性が
ある。
【００３８】プリンヌクレオシド生合成経路から分岐し
て他の代謝産物にいたる反応のうち、それを遮断するこ
とによって実際にプリンヌクレオシド生産性向上につな
がるものは、プリンヌクレオシド生合成経路図がすでに
明らかになっているので、これに基づき予測される。
て他の代謝産物にいたる反応のうち、それを遮断するこ
とによって実際にプリンヌクレオシド生産性向上につな
がるものは、プリンヌクレオシド生合成経路図がすでに
明らかになっているので、これに基づき予測される。
【００３９】プリンヌクレオシド生合成から分岐して他
の代謝産物にいたる反応を遮断する方法としては、その
反応を触媒する酵素の活性を欠失させる方法があげられ
る。酵素の活性を欠失させるには、その酵素をコードす
る遺伝子を欠失させる方法や酵素を不活化させる方法が
あげられる。酵素を不活化させるには、その酵素をコー
ドする遺伝子に変異を導入するか、あるいはその酵素を
特異的に不活化する薬剤を添加する方法などがある。
の代謝産物にいたる反応を遮断する方法としては、その
反応を触媒する酵素の活性を欠失させる方法があげられ
る。酵素の活性を欠失させるには、その酵素をコードす
る遺伝子を欠失させる方法や酵素を不活化させる方法が
あげられる。酵素を不活化させるには、その酵素をコー
ドする遺伝子に変異を導入するか、あるいはその酵素を
特異的に不活化する薬剤を添加する方法などがある。
【００４０】プリンヌクレオシド生合成から分岐して他
の代謝産物にいたる反応のうち、それを遮断することに
よって実際にキサントシン生産性向上につながるものと
しては、サクシニル−ＡＭＰシンターゼ、プリンヌクレ
オシド・フォスフォリラーゼ、アデノシン・デアミナー
ゼ、６-フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ、フォスフ
ォグルコース・イソメラーゼ、アデニン・デアミナー
ゼ、キサントシン・フォスフォリラーゼ、ＧＭＰシンセ
ターゼから選ばれる酵素に触媒される反応があげられ
る。
の代謝産物にいたる反応のうち、それを遮断することに
よって実際にキサントシン生産性向上につながるものと
しては、サクシニル−ＡＭＰシンターゼ、プリンヌクレ
オシド・フォスフォリラーゼ、アデノシン・デアミナー
ゼ、６-フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ、フォスフ
ォグルコース・イソメラーゼ、アデニン・デアミナー
ゼ、キサントシン・フォスフォリラーゼ、ＧＭＰシンセ
ターゼから選ばれる酵素に触媒される反応があげられ
る。
【００４１】例えば、イノシンモノリン酸(IMP)からサ
クシニル-AMP(sAMP)への分岐およびキサントシンモノリ
ン酸(XMP)からグアノシンモノリン酸(GMP)への分岐を遮
断し、キサントシンからキサンチンへの転換を遮断する
と、同遮断の結果、IMPはsAMPへ、XMPはGMPへ転換され
ることがなくなり、キサントシンからキサンチンへ転換
されることがなくなる。そして、キサントシンが蓄積さ
れることが予想される。これらの有効性を確認するため
には目的に応じて取得した変異株を培養してキサントシ
ンの生産性を見ればよい。
クシニル-AMP(sAMP)への分岐およびキサントシンモノリ
ン酸(XMP)からグアノシンモノリン酸(GMP)への分岐を遮
断し、キサントシンからキサンチンへの転換を遮断する
と、同遮断の結果、IMPはsAMPへ、XMPはGMPへ転換され
ることがなくなり、キサントシンからキサンチンへ転換
されることがなくなる。そして、キサントシンが蓄積さ
れることが予想される。これらの有効性を確認するため
には目的に応じて取得した変異株を培養してキサントシ
ンの生産性を見ればよい。
【００４２】後述の実施例では、E. coliにおいてサク
シニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）を破壊してアデ
ニン要求性を付与したとき、E. coliのアデニン要求株
を生育させるのにアデニンないしはアデノシン等のAMP
系物質の培地への添加が必要となった。しかし、これら
の添加物質は、E. coliにおいてはただちにイノシンあ
るいはヒポキサンチンに転換され、AMP系物質の消失に
より、一定のところで生育が停止してしまう性質が見い
だされた。そこでその生育を維持させる手段として、E.
coliの代謝経路から判断してアデノシンからイノシンへ
の転換に関与するアデノシン・デアミナーゼあるいはア
デニンからヒポキサンチンへの転換に関与するアデニン
・デアミナーゼを不活化する必要性が予測された。この
ようにして、アデノシン・デアミナーゼあるいはアデニ
ン・デアミナーゼの不活化による効果は確認され、イノ
シンの蓄積向上効果が観察され、従ってキサントシン生
産における有効性が予測される。
シニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）を破壊してアデ
ニン要求性を付与したとき、E. coliのアデニン要求株
を生育させるのにアデニンないしはアデノシン等のAMP
系物質の培地への添加が必要となった。しかし、これら
の添加物質は、E. coliにおいてはただちにイノシンあ
るいはヒポキサンチンに転換され、AMP系物質の消失に
より、一定のところで生育が停止してしまう性質が見い
だされた。そこでその生育を維持させる手段として、E.
coliの代謝経路から判断してアデノシンからイノシンへ
の転換に関与するアデノシン・デアミナーゼあるいはア
デニンからヒポキサンチンへの転換に関与するアデニン
・デアミナーゼを不活化する必要性が予測された。この
ようにして、アデノシン・デアミナーゼあるいはアデニ
ン・デアミナーゼの不活化による効果は確認され、イノ
シンの蓄積向上効果が観察され、従ってキサントシン生
産における有効性が予測される。
【００４３】またプリンヌクレオシドを生産するのにグ
ルコース等の炭素原料が使用されるが、使用する炭素原
料や培養条件により、プリンヌクレオシド生合成にいた
る糖代謝系に差違が生じることが知られている。それゆ
え、プリンヌクレオシド生合成へと代謝系を有利に導く
ために、ペントースリン酸経路を優先させるように他へ
の分岐を遮断することが考えられる。その手段として、
６-フォスフォグルコン酸デヒドラーゼやフォスフォグ
ルコース・イソメラーゼを不活化することを行ったとこ
ろ、そのイノシン生産における有効性が確認され、従っ
てキサントシン生産における有効性が予測される。
ルコース等の炭素原料が使用されるが、使用する炭素原
料や培養条件により、プリンヌクレオシド生合成にいた
る糖代謝系に差違が生じることが知られている。それゆ
え、プリンヌクレオシド生合成へと代謝系を有利に導く
ために、ペントースリン酸経路を優先させるように他へ
の分岐を遮断することが考えられる。その手段として、
６-フォスフォグルコン酸デヒドラーゼやフォスフォグ
ルコース・イソメラーゼを不活化することを行ったとこ
ろ、そのイノシン生産における有効性が確認され、従っ
てキサントシン生産における有効性が予測される。
【００４４】（４）キサントシンの製造法 キサントシン生産能を有する微生物を用いて発酵法によ
ってキサントシンを製造する方法を以下説明する。
ってキサントシンを製造する方法を以下説明する。
【００４５】使用するキサントシン生産用培地は、炭素
源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他の有機
成分を含有する通常の培地でよい。炭素源としては、グ
ルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、
アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロー
ス、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、グリセロ
ール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール
類、グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸等の
有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム
等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒
素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることがで
きる。有機微量栄養素としては、ビタミンB1等のビタミ
ン類、アデニンやRNA等の核酸類などの要求物質または
酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これら
の他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸マグネ
シウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加され
る。
源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他の有機
成分を含有する通常の培地でよい。炭素源としては、グ
ルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、
アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロー
ス、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、グリセロ
ール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール
類、グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸等の
有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム
等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒
素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることがで
きる。有機微量栄養素としては、ビタミンB1等のビタミ
ン類、アデニンやRNA等の核酸類などの要求物質または
酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これら
の他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸マグネ
シウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加され
る。
【００４６】培養は好気的条件下で１６〜７２時間程度
実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養
中pHは５〜８に制御する。なお、pH調整には無機あるい
は有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニ
アガス等を使用することができる。
実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養
中pHは５〜８に制御する。なお、pH調整には無機あるい
は有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニ
アガス等を使用することができる。
【００４７】発酵液からのキサントシンの採取は、通
常、イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組
合せることにより実施できる。
常、イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組
合せることにより実施できる。
【００４８】（５）キサントシン生産菌の具体例 まずエシェリヒア・コリ(E.coli) K12のW3110株（ATCC2
7325)の染色体DNAよりPCR法を用いてＰＲＰＰアミドト
ランスフェラーゼ(PRPP amidotransferase)をコードす
る遺伝子であるpurF、プリン・リプレッサー（purine r
epressor)をコードする遺伝子であるpurR、プリンヌク
レオシド・フォスフォリラーゼ（purine nucleoside ph
osphorylase)をコードする遺伝子であるdeoD、サクシニ
ル−ＡＭＰシンターゼ（succinyl-AMP synthase)をコー
ドする遺伝子であるpurA、アデノシン・デアミナーゼ
（adenosine deaminase)をコードする遺伝子であるad
d、６-フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ(6-phosphogl
uconate grhydrase)をコードする遺伝子であるedd、フ
ォスフォグルコース・イソメラーゼ(phophoglucose iso
merase)をコードする遺伝子であるpgi、アデニン・デア
ミナーゼ(adenine deaminase)をコードする遺伝子であ
るyicP、キサントシン・フォスフォリラーゼ(xanthosin
e phosphorylase)をコードする遺伝子であるxapAおよび
ＧＭＰシンセターゼ(GMP synthetase)をコードする遺伝
子であるguaAをクローニングし、これらの遺伝子をそれ
ぞれの目的に応じて変異させる。この際使用する染色体
DNAはE.coli由来であればどの菌株由来でもよい。
7325)の染色体DNAよりPCR法を用いてＰＲＰＰアミドト
ランスフェラーゼ(PRPP amidotransferase)をコードす
る遺伝子であるpurF、プリン・リプレッサー（purine r
epressor)をコードする遺伝子であるpurR、プリンヌク
レオシド・フォスフォリラーゼ（purine nucleoside ph
osphorylase)をコードする遺伝子であるdeoD、サクシニ
ル−ＡＭＰシンターゼ（succinyl-AMP synthase)をコー
ドする遺伝子であるpurA、アデノシン・デアミナーゼ
（adenosine deaminase)をコードする遺伝子であるad
d、６-フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ(6-phosphogl
uconate grhydrase)をコードする遺伝子であるedd、フ
ォスフォグルコース・イソメラーゼ(phophoglucose iso
merase)をコードする遺伝子であるpgi、アデニン・デア
ミナーゼ(adenine deaminase)をコードする遺伝子であ
るyicP、キサントシン・フォスフォリラーゼ(xanthosin
e phosphorylase)をコードする遺伝子であるxapAおよび
ＧＭＰシンセターゼ(GMP synthetase)をコードする遺伝
子であるguaAをクローニングし、これらの遺伝子をそれ
ぞれの目的に応じて変異させる。この際使用する染色体
DNAはE.coli由来であればどの菌株由来でもよい。
【００４９】purFに導入する変異とは、purFを破壊する
ための変異と、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼのフ
ィードバック阻害を解除するための変異である。purRに
導入する変異とは、purRを破壊するための変異である。
deoDに導入する変異とは、deoDを破壊するための変異で
ある。purAに導入する変異とは、purAを破壊するための
変異である。addに導入する変異とは、addを破壊するた
めの変異である。eddに導入する変異とは、eddを破壊す
るための変異である。pgiに導入する変異とは、pgiを破
壊するための変異である。yicPに導入する変異とは、yi
cPを破壊するための変異である。xapAに導入する変異と
は、xapAを破壊するための変異である。guaAに導入する
変異とは、guaAを破壊するための変異である。
ための変異と、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼのフ
ィードバック阻害を解除するための変異である。purRに
導入する変異とは、purRを破壊するための変異である。
deoDに導入する変異とは、deoDを破壊するための変異で
ある。purAに導入する変異とは、purAを破壊するための
変異である。addに導入する変異とは、addを破壊するた
めの変異である。eddに導入する変異とは、eddを破壊す
るための変異である。pgiに導入する変異とは、pgiを破
壊するための変異である。yicPに導入する変異とは、yi
cPを破壊するための変異である。xapAに導入する変異と
は、xapAを破壊するための変異である。guaAに導入する
変異とは、guaAを破壊するための変異である。
【００５０】遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異
的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J., Methods in Enz
ymology, 154, 350(1987))、リコンビナントPCR法（PCR
Technology, Stockton Press(1989))、特定の部分のDN
Aを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシ
アミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外
線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸など
の化学薬剤で処理する方法がある。また遺伝子の機能を
完全に不活化する目的の場合には適当な制限酵素サイト
にDNAの付加や欠失を入れる方法がある。
的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J., Methods in Enz
ymology, 154, 350(1987))、リコンビナントPCR法（PCR
Technology, Stockton Press(1989))、特定の部分のDN
Aを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシ
アミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外
線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸など
の化学薬剤で処理する方法がある。また遺伝子の機能を
完全に不活化する目的の場合には適当な制限酵素サイト
にDNAの付加や欠失を入れる方法がある。
【００５１】次に、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ
のフィードバック阻害を解除するための変異が導入され
たpurFを組換えDNAとして適当な微生物に導入し、発現
させることにより、フィードバック阻害が実質的に解除
されたＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子(purF)
を保有する微生物を取得する。以上の方法で取得される
組換えDNAとは、フィードバック阻害を解除したＰＲＰ
Ｐアミドトランスフェラーゼ遺伝子(purF)等の有用遺伝
子をパッセンジャーとして、プラスミドやファージDNA
のベクターに組込んだものをいう。その際、該有用遺伝
子の発現を効率的に実施するために、lac,trp,tac,trc,
PLその他の微生物内で機能するプロモーターを用いても
よい。
のフィードバック阻害を解除するための変異が導入され
たpurFを組換えDNAとして適当な微生物に導入し、発現
させることにより、フィードバック阻害が実質的に解除
されたＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子(purF)
を保有する微生物を取得する。以上の方法で取得される
組換えDNAとは、フィードバック阻害を解除したＰＲＰ
Ｐアミドトランスフェラーゼ遺伝子(purF)等の有用遺伝
子をパッセンジャーとして、プラスミドやファージDNA
のベクターに組込んだものをいう。その際、該有用遺伝
子の発現を効率的に実施するために、lac,trp,tac,trc,
PLその他の微生物内で機能するプロモーターを用いても
よい。
【００５２】なお、ここでいう組換えDNAには、該有用
遺伝子をトランスポゾン(Berg,D.E.and Berg,C.M., Bio
/Technol., 1, 417(1983))、Muファージ（特開平2-1099
85)または相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染
色体に組込んだものも含まれる。
遺伝子をトランスポゾン(Berg,D.E.and Berg,C.M., Bio
/Technol., 1, 417(1983))、Muファージ（特開平2-1099
85)または相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染
色体に組込んだものも含まれる。
【００５３】相同組換え用プラスミドとしては、温度感
受性複製起点を有するプラスミドが使用される。温度感
受性複製起点を有するプラスミドは、許容温度（permis
sivetemperature）、例えば30℃付近では複製できる
が、非許容温度（non-permissive temperature）、例え
ば37℃〜42℃では複製できない。温度感受性複製起点を
有するプラスミドを用いた相同組換え法では、必要に応
じて、許容温度でプラスミドを複製させたり、非許容温
度でプラスミドを宿主から脱落させたりすることができ
る。後述の実施例では、相同組換え用プラスミドとし
て、pMAN997を使用したが、pMAN997はpMAN031(J.Bacter
iol., 162, 1196(1985))とpUC19（宝酒造社製）のそれ
ぞれVspＩ-HindIII断片を繋ぎ換えたものである（図
１）。
受性複製起点を有するプラスミドが使用される。温度感
受性複製起点を有するプラスミドは、許容温度（permis
sivetemperature）、例えば30℃付近では複製できる
が、非許容温度（non-permissive temperature）、例え
ば37℃〜42℃では複製できない。温度感受性複製起点を
有するプラスミドを用いた相同組換え法では、必要に応
じて、許容温度でプラスミドを複製させたり、非許容温
度でプラスミドを宿主から脱落させたりすることができ
る。後述の実施例では、相同組換え用プラスミドとし
て、pMAN997を使用したが、pMAN997はpMAN031(J.Bacter
iol., 162, 1196(1985))とpUC19（宝酒造社製）のそれ
ぞれVspＩ-HindIII断片を繋ぎ換えたものである（図
１）。
【００５４】また相同組換え法(Experiments in Molecu
lar Genetics, Cold Spring HaborLab.(1972))を用いて
染色体上の特定の遺伝子機能を不活化し、プリンヌクレ
オシドの生産能を向上させる。不活化される遺伝子と
は、その不活化によってプリンヌクレオシド生合成に関
与する酵素の遺伝子の発現量が上昇するものである。具
体的には、染色体上のプリン・リプレッサー遺伝子(pur
R)を破壊してＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子
(purF)を始めとするプリンヌクレオチド生合成遺伝子の
発現抑制機構の解除を行う。
lar Genetics, Cold Spring HaborLab.(1972))を用いて
染色体上の特定の遺伝子機能を不活化し、プリンヌクレ
オシドの生産能を向上させる。不活化される遺伝子と
は、その不活化によってプリンヌクレオシド生合成に関
与する酵素の遺伝子の発現量が上昇するものである。具
体的には、染色体上のプリン・リプレッサー遺伝子(pur
R)を破壊してＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子
(purF)を始めとするプリンヌクレオチド生合成遺伝子の
発現抑制機構の解除を行う。
【００５５】さらに、プリンヌクレオシド生合成から分
岐して他の代謝産物にいたる反応を触媒する酵素をコー
ドする遺伝子を破壊する。具体的には、プリンヌクレオ
シド・フォスフォリラーゼ遺伝子(deoD）を破壊して、
イノシン、キサントシンおよびグアノシンのヒポキサン
チン、キサンチンおよびグアニンへの分解を抑制する。
また、サクシニル−ＡＭＰシンターゼ遺伝子(purA)を破
壊して、アデニン要求性を付与する。さらに、アデノシ
ン・デアミナーゼ遺伝子(add)を破壊してアデノシンか
らイノシンへの転換を抑制する。６-フォスフォグルコ
ン酸デヒドラーゼ遺伝子(edd)を破壊して、糖がエント
ナー・ドゥドロフ(Entner-Doudoroff)経路で代謝される
のを抑制する。フォスフォグルコース・イソメラーゼ遺
伝子(pgi)を破壊して、糖が解糖経路で代謝されるのを
抑制し、ペントースリン酸経路への流入を計る。アデニ
ン・デアミナーゼ遺伝子(yicP)を破壊し、アデニンから
ヒポキサンチンへの転換を抑制する。キサントシン・フ
ォスフォリラーゼ遺伝子(xapA)を破壊して、キサントシ
ンからキサンチンへの誘導分解を抑制するとともにイノ
シンやグアノシンのヒポキサンチンやグアニンへの分解
を抑制する。ＧＭＰシンセターゼ遺伝子(guaA)を破壊し
てXMPからGMPへの転換を抑制する。もちろん、当該遺伝
子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソ
グアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理して、目的の
遺伝子の機能を不活化することも行われる。
岐して他の代謝産物にいたる反応を触媒する酵素をコー
ドする遺伝子を破壊する。具体的には、プリンヌクレオ
シド・フォスフォリラーゼ遺伝子(deoD）を破壊して、
イノシン、キサントシンおよびグアノシンのヒポキサン
チン、キサンチンおよびグアニンへの分解を抑制する。
また、サクシニル−ＡＭＰシンターゼ遺伝子(purA)を破
壊して、アデニン要求性を付与する。さらに、アデノシ
ン・デアミナーゼ遺伝子(add)を破壊してアデノシンか
らイノシンへの転換を抑制する。６-フォスフォグルコ
ン酸デヒドラーゼ遺伝子(edd)を破壊して、糖がエント
ナー・ドゥドロフ(Entner-Doudoroff)経路で代謝される
のを抑制する。フォスフォグルコース・イソメラーゼ遺
伝子(pgi)を破壊して、糖が解糖経路で代謝されるのを
抑制し、ペントースリン酸経路への流入を計る。アデニ
ン・デアミナーゼ遺伝子(yicP)を破壊し、アデニンから
ヒポキサンチンへの転換を抑制する。キサントシン・フ
ォスフォリラーゼ遺伝子(xapA)を破壊して、キサントシ
ンからキサンチンへの誘導分解を抑制するとともにイノ
シンやグアノシンのヒポキサンチンやグアニンへの分解
を抑制する。ＧＭＰシンセターゼ遺伝子(guaA)を破壊し
てXMPからGMPへの転換を抑制する。もちろん、当該遺伝
子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソ
グアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理して、目的の
遺伝子の機能を不活化することも行われる。
【００５６】組換えDNAを有する微生物としては、該Ｐ
ＲＰＰアミドトランスフェラーゼ等の目的の酵素をコー
ドする遺伝子が発現するエシェリヒア属に属する微生物
を用いる。
ＲＰＰアミドトランスフェラーゼ等の目的の酵素をコー
ドする遺伝子が発現するエシェリヒア属に属する微生物
を用いる。
【００５７】また該ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ
遺伝子(purF)の効率的活用のために他の有用遺伝子、例
えばPRPPからIMP生合成に関わるpurF以外の遺伝子(pur
D,purT,purL,purM,purK,purE,purC,purB,purH)、ＩＭＰ
デヒドロゲナーゼ遺伝子(guaB)やＰＲＰＰシンセターゼ
遺伝子(prs)等と組合せて利用するとよい。その際、こ
れらの有用遺伝子は該ＰＲＰＰアミドトランスフェラー
ゼ遺伝子(purF)と同じく、宿主の染色体上に存在して
も、プラスミドやファージ上に存在してもよい。
遺伝子(purF)の効率的活用のために他の有用遺伝子、例
えばPRPPからIMP生合成に関わるpurF以外の遺伝子(pur
D,purT,purL,purM,purK,purE,purC,purB,purH)、ＩＭＰ
デヒドロゲナーゼ遺伝子(guaB)やＰＲＰＰシンセターゼ
遺伝子(prs)等と組合せて利用するとよい。その際、こ
れらの有用遺伝子は該ＰＲＰＰアミドトランスフェラー
ゼ遺伝子(purF)と同じく、宿主の染色体上に存在して
も、プラスミドやファージ上に存在してもよい。
【００５８】以上の方法で取得されるpurA（サクシニル
−ＡＭＰシンターゼ遺伝子）欠失、および／あるいはde
oD（プリンヌクレオシド・フォスフォリラーゼ遺伝子）
欠失、および／あるいはpurR（プリン・リプレッサー遺
伝子）欠失、および／あるいはadd（アデノシン・デア
ミナーゼ遺伝子）欠失、および／あるいはedd（６-フォ
スフォグルコン酸デヒドラーゼ遺伝子）欠失、および／
あるいはpgi（フォスフォグルコース・イソメラーゼ遺
伝子）欠失、および／あるいはyicP（アデニン・デアミ
ナーゼ遺伝子）欠失、および／あるいはxapA（キサント
シン・フォスフォリラーゼ遺伝子）欠失、および／ある
いはguaA（ＧＭＰシンセターゼ遺伝子）欠失を有する微
生物、あるいは脱感作型ＰＲＰＰアミドトランスフェラ
ーゼ遺伝子(purF)を含む組換えDNAで形質転換された本
微生物を培養し、培養液に目的のキサントシンを生成蓄
積せしめ、これを採取する。
−ＡＭＰシンターゼ遺伝子）欠失、および／あるいはde
oD（プリンヌクレオシド・フォスフォリラーゼ遺伝子）
欠失、および／あるいはpurR（プリン・リプレッサー遺
伝子）欠失、および／あるいはadd（アデノシン・デア
ミナーゼ遺伝子）欠失、および／あるいはedd（６-フォ
スフォグルコン酸デヒドラーゼ遺伝子）欠失、および／
あるいはpgi（フォスフォグルコース・イソメラーゼ遺
伝子）欠失、および／あるいはyicP（アデニン・デアミ
ナーゼ遺伝子）欠失、および／あるいはxapA（キサント
シン・フォスフォリラーゼ遺伝子）欠失、および／ある
いはguaA（ＧＭＰシンセターゼ遺伝子）欠失を有する微
生物、あるいは脱感作型ＰＲＰＰアミドトランスフェラ
ーゼ遺伝子(purF)を含む組換えDNAで形質転換された本
微生物を培養し、培養液に目的のキサントシンを生成蓄
積せしめ、これを採取する。
【００５９】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００６０】
【実施例１】1)ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝
子(purF)欠失株の取得 E.coli K12のW3110株(ATCC27325)の染色体DNAを鋳型と
して用い、遺伝子データバンク（GenBank Accession N
o.M26893）の情報に基づき作製された、CTCCTGCAGAACGA
GGAAAAAGACGTATG（配列番号１）とCTCAAGCTTTCATCCTTCG
TTATGCATTTCG（配列番号２）の塩基配列を有する29mer
と31merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55
℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Mo
del9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと翻訳終止コ
ドンをカバーするpurF構造遺伝子領域の約1530bpの増幅
断片をpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にクローン
化した。本ベクターはPCR産物増幅断片をそのままクロ
ーニングすることができ、また、クローニングサイトの
両近傍に制限酵素サイトとしてEcoRIサイトが存在す
る。またPCR用プライマーにはPstIサイトとHindIIIサイ
トがそれぞれデザインされている。
子(purF)欠失株の取得 E.coli K12のW3110株(ATCC27325)の染色体DNAを鋳型と
して用い、遺伝子データバンク（GenBank Accession N
o.M26893）の情報に基づき作製された、CTCCTGCAGAACGA
GGAAAAAGACGTATG（配列番号１）とCTCAAGCTTTCATCCTTCG
TTATGCATTTCG（配列番号２）の塩基配列を有する29mer
と31merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55
℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Mo
del9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと翻訳終止コ
ドンをカバーするpurF構造遺伝子領域の約1530bpの増幅
断片をpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にクローン
化した。本ベクターはPCR産物増幅断片をそのままクロ
ーニングすることができ、また、クローニングサイトの
両近傍に制限酵素サイトとしてEcoRIサイトが存在す
る。またPCR用プライマーにはPstIサイトとHindIIIサイ
トがそれぞれデザインされている。
【００６１】クローン化された1530bpのpurF断片の5'側
から約880bpの位置にBglIIサイトが１ヶ所あるが、pCRT
MIIベクターそのものにもBglIIサイトが１ヶ所あるの
で、プラスミドをBglIIで部分消化し、T4 DNAポリメラ
ーゼで平滑末端化した後に、T4DNAリガーゼで連結し
た。このライゲイション液でE.coli HB101のコンピテン
ト細胞(competent cell)を形質転換し、アンピシリン25
μg/mlを含むLB(トリプトン 1％,イーストエキストラク
ト 0.5％,NaCl 0.1％,グルコース 0.1％,pH7)寒天プレ
ートに生育する形質転換体を得た。18クローンの形質転
換体からプラスミドDNAを調製し、この中からEcoRI消化
で約1550bpの断片が得られ、かつBglIIで本断片が切断
されないプラスミドDNA(pCRTMIIpurF'#14)を選択した。
本プラスミドDNAが有するpurFはBglIIサイトでフレーム
シフトが生じることになり、コードされる酵素は機能を
持たなくなると予測される（図２）。
から約880bpの位置にBglIIサイトが１ヶ所あるが、pCRT
MIIベクターそのものにもBglIIサイトが１ヶ所あるの
で、プラスミドをBglIIで部分消化し、T4 DNAポリメラ
ーゼで平滑末端化した後に、T4DNAリガーゼで連結し
た。このライゲイション液でE.coli HB101のコンピテン
ト細胞(competent cell)を形質転換し、アンピシリン25
μg/mlを含むLB(トリプトン 1％,イーストエキストラク
ト 0.5％,NaCl 0.1％,グルコース 0.1％,pH7)寒天プレ
ートに生育する形質転換体を得た。18クローンの形質転
換体からプラスミドDNAを調製し、この中からEcoRI消化
で約1550bpの断片が得られ、かつBglIIで本断片が切断
されないプラスミドDNA(pCRTMIIpurF'#14)を選択した。
本プラスミドDNAが有するpurFはBglIIサイトでフレーム
シフトが生じることになり、コードされる酵素は機能を
持たなくなると予測される（図２）。
【００６２】次に、pCRTMIIpurF'#14をEcoRＩ消化し、p
urFを含む約1.6Kbの断片を調製した。この断片を温度感
受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターで
あるpMAN997（図１に示されるように、pMAN031(J.Bacte
riol., 162, 1196(1985))とpUC10(宝酒造社製)のそれぞ
れのVspI-HindIII断片を繋ぎ換えたもの）のEcoRＩサイ
トに挿入し、プラスミドpMAN997purF'#14を得た。プラ
スミドpMAN997purF'#14でE.coli W3110（野生株）を30
℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシ
リン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一
晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニー
が得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プ
レートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さら
にもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操
作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色
体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラ
スミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこ
のクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で
一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種
し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングル
コロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)
し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロ
ニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コ
ロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートと
アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育さ
せ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性
のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクロ
ーンの中から最小培地(1L当たりNa2HPO4 6.8g, KH2PO4
3g, NaCl 0.5g, NH4Cl 1g, MgSO4・7H2O 0.5g, CaCl2・2H
2O 15mg, チアミンHCl 2mg,グルコース 0.2g)に生育せ
ず、ヒポキサンチン 50mg/L添加最小培地には生育する
クローンを選択した。さらにはこれらの目的クローンの
染色体DNAからPCRによりpurFを含む約1.5kb断片を増幅
させ、BglIIで切断されないことを確認した。以上を満
足するクローンをpurF欠失株とし、ここではF-2-51株と
した。
urFを含む約1.6Kbの断片を調製した。この断片を温度感
受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターで
あるpMAN997（図１に示されるように、pMAN031(J.Bacte
riol., 162, 1196(1985))とpUC10(宝酒造社製)のそれぞ
れのVspI-HindIII断片を繋ぎ換えたもの）のEcoRＩサイ
トに挿入し、プラスミドpMAN997purF'#14を得た。プラ
スミドpMAN997purF'#14でE.coli W3110（野生株）を30
℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシ
リン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一
晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニー
が得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プ
レートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さら
にもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操
作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色
体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラ
スミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこ
のクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で
一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種
し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングル
コロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)
し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロ
ニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コ
ロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートと
アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育さ
せ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性
のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクロ
ーンの中から最小培地(1L当たりNa2HPO4 6.8g, KH2PO4
3g, NaCl 0.5g, NH4Cl 1g, MgSO4・7H2O 0.5g, CaCl2・2H
2O 15mg, チアミンHCl 2mg,グルコース 0.2g)に生育せ
ず、ヒポキサンチン 50mg/L添加最小培地には生育する
クローンを選択した。さらにはこれらの目的クローンの
染色体DNAからPCRによりpurFを含む約1.5kb断片を増幅
させ、BglIIで切断されないことを確認した。以上を満
足するクローンをpurF欠失株とし、ここではF-2-51株と
した。
【００６３】2)サクシニル−ＡＭＰシンターゼ遺伝子(p
urA)欠失株の取得 W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバ
ンク（GenBank Accession No.J04199）の情報に基づき
作製された、CTCGAGCTCATGGGTAACAACGTCGTCGTAC（配列
番号３）とCTCGTCGACTTACGCGTCGAACGGGTCGCGC（配列番
号４）の塩基配列を有する31merと31merの両端プライマ
ーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min;72℃,2min; 30
サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社
製)）で行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするpurA構
造遺伝子領域の約1300bpの増幅断片をpUC18ベクター
（宝酒造社製）のSacＩサイトとSalＩサイトの間にクロ
ーン化した。なお、PCR用プライマーにはSacIサイトとS
alIサイトがそれぞれデザインされている。クローン化
されたpurA断片の約1300bpの5'側から約520bpと710bpの
位置にそれぞれHpaＩサイトおよびSnaBＩサイトが１ヶ
所あるのでプラスミドをHpaＩおよびSnaBＩで消化し、
約190bp断片を除去したものを得る目的でT4 DNAリガー
ゼで連結した。このライゲイション液でE.coli JM109の
コンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/ml
を含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。18
クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、こ
の中からFspＩでは切断せず、SacＩおよびSalＩでの切
断で約1100bpの断片が得られるプラスミドDNA(pUC18pur
A'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するpurAはHpa
ＩサイトおよびSnaBＩサイトの間で欠失が生じることに
なり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測さ
れる（図２）。
urA)欠失株の取得 W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバ
ンク（GenBank Accession No.J04199）の情報に基づき
作製された、CTCGAGCTCATGGGTAACAACGTCGTCGTAC（配列
番号３）とCTCGTCGACTTACGCGTCGAACGGGTCGCGC（配列番
号４）の塩基配列を有する31merと31merの両端プライマ
ーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min;72℃,2min; 30
サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社
製)）で行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするpurA構
造遺伝子領域の約1300bpの増幅断片をpUC18ベクター
（宝酒造社製）のSacＩサイトとSalＩサイトの間にクロ
ーン化した。なお、PCR用プライマーにはSacIサイトとS
alIサイトがそれぞれデザインされている。クローン化
されたpurA断片の約1300bpの5'側から約520bpと710bpの
位置にそれぞれHpaＩサイトおよびSnaBＩサイトが１ヶ
所あるのでプラスミドをHpaＩおよびSnaBＩで消化し、
約190bp断片を除去したものを得る目的でT4 DNAリガー
ゼで連結した。このライゲイション液でE.coli JM109の
コンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/ml
を含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。18
クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、こ
の中からFspＩでは切断せず、SacＩおよびSalＩでの切
断で約1100bpの断片が得られるプラスミドDNA(pUC18pur
A'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するpurAはHpa
ＩサイトおよびSnaBＩサイトの間で欠失が生じることに
なり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測さ
れる（図２）。
【００６４】次に、pUC18purA'#1をSacＩとSalＩとで消
化し、purAを含む約1.1Kbの断片を調製した。この断片
を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベ
クターであるpMAN997（上述）のSacＩサイトとSalＩサ
イトの間に挿入し、プラスミドpMAN997purA'#1を得た。
プラスミドpMAN997purA'#1でF-2-51株（purF-）を30℃
で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリ
ン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩
培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが
得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレ
ートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらに
もう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作
を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体
に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラス
ミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこの
クローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一
晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種
し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングル
コロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)
し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロ
ニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コ
ロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートと
アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育さ
せ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性
のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクロ
ーンの中からヒポキサンチン 50mg/L添加最小培地に生
育せず、アデニン 50mg/L添加最小培地には生育するク
ローンを選択した。さらにはこれらの目的クローンの染
色体DNAからPCRによりpurA約1.1kb断片を増幅させ、野
生型(約1.3kb)よりサイズが小さいこと、およびFspＩで
切断されないことを確認した。以上を満足するクローン
をpurA欠失株とし、ここではFA-31株とした。
化し、purAを含む約1.1Kbの断片を調製した。この断片
を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベ
クターであるpMAN997（上述）のSacＩサイトとSalＩサ
イトの間に挿入し、プラスミドpMAN997purA'#1を得た。
プラスミドpMAN997purA'#1でF-2-51株（purF-）を30℃
で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリ
ン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩
培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが
得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレ
ートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらに
もう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作
を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体
に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラス
ミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこの
クローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一
晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種
し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングル
コロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)
し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロ
ニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コ
ロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートと
アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育さ
せ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性
のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクロ
ーンの中からヒポキサンチン 50mg/L添加最小培地に生
育せず、アデニン 50mg/L添加最小培地には生育するク
ローンを選択した。さらにはこれらの目的クローンの染
色体DNAからPCRによりpurA約1.1kb断片を増幅させ、野
生型(約1.3kb)よりサイズが小さいこと、およびFspＩで
切断されないことを確認した。以上を満足するクローン
をpurA欠失株とし、ここではFA-31株とした。
【００６５】3)プリンヌクレオシド・フォスフォリラー
ゼ遺伝子(deoD)欠失株の取得 W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバ
ンク（E.coli Gene Bank）において「deoD」をキーワー
ドにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTC
GACGCGGGTCTGGAACTGTTCGAC（配列番号５）とCTCGCATGCC
CGTGCTTTACCAAAGCGAATC（配列番号６）の塩基配列を有
する30merと31merの両端プライマーによるPCR法（94℃,
30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR
System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと
翻訳終止コドンをカバーするdeoD構造遺伝子領域を含む
約1350bpの増幅断片をpCRTMIIベクター（Invitrogen社
製）にクローン化した。本ベクターにはクローニングサ
イトの両近傍に制限酵素サイトとしてEcoRIサイトが存
在する。またPCR用プライマーにはSalＩサイトとSphＩ
サイトがそれぞれデザインされている。クローン化され
たdeoD断片の約1350bpの5’側から約680bpの位置にHpa
Ｉサイトが１ヶ所あるのでプラスミドをHpaＩで消化
し、消化されたプラスミドと10merのClaＩリンカーとを
混合してT4 DNAリガーゼ反応を行った。この結果、HpaI
サイトにClaIサイトが挿入された。このライゲイション
液でE.coli HB101のコンピテント細胞を形質転換し、ア
ンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形
質転換体を得た。16クローンの形質転換体からプラスミ
ドDNAを調製し、この中からHpaＩでは切断されず、Cla
Ｉで切断されるプラスミドDNA(pCRTMIIdeoD'#16)を選択
した。本プラスミドDNAが有するdeoDはHpaＩサイトでフ
レームシフトが生じることになり、コードされる酵素は
機能を持たなくなると予測される（図２）。
ゼ遺伝子(deoD)欠失株の取得 W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバ
ンク（E.coli Gene Bank）において「deoD」をキーワー
ドにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTC
GACGCGGGTCTGGAACTGTTCGAC（配列番号５）とCTCGCATGCC
CGTGCTTTACCAAAGCGAATC（配列番号６）の塩基配列を有
する30merと31merの両端プライマーによるPCR法（94℃,
30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR
System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと
翻訳終止コドンをカバーするdeoD構造遺伝子領域を含む
約1350bpの増幅断片をpCRTMIIベクター（Invitrogen社
製）にクローン化した。本ベクターにはクローニングサ
イトの両近傍に制限酵素サイトとしてEcoRIサイトが存
在する。またPCR用プライマーにはSalＩサイトとSphＩ
サイトがそれぞれデザインされている。クローン化され
たdeoD断片の約1350bpの5’側から約680bpの位置にHpa
Ｉサイトが１ヶ所あるのでプラスミドをHpaＩで消化
し、消化されたプラスミドと10merのClaＩリンカーとを
混合してT4 DNAリガーゼ反応を行った。この結果、HpaI
サイトにClaIサイトが挿入された。このライゲイション
液でE.coli HB101のコンピテント細胞を形質転換し、ア
ンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形
質転換体を得た。16クローンの形質転換体からプラスミ
ドDNAを調製し、この中からHpaＩでは切断されず、Cla
Ｉで切断されるプラスミドDNA(pCRTMIIdeoD'#16)を選択
した。本プラスミドDNAが有するdeoDはHpaＩサイトでフ
レームシフトが生じることになり、コードされる酵素は
機能を持たなくなると予測される（図２）。
【００６６】次に、pCRTMIIdeoD'#16をEcoRＩ消化し、d
eoDを含む約1.35Kbの断片を調製した。この断片を温度
感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクター
であるpMAN997（上述）のEcoRＩサイトに挿入し、プラ
スミドpMAN997deoD'#16を得た。プラスミドpMAN997deo
D'#16でFA-31株(purF-,purA-)を30℃で形質転換し、得
られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含む
LB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこ
れらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにア
ンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42
℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で
生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同
組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクロ
ーンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中
に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個
をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、
LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時
間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られ
るように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレー
トに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現
したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックア
ップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μ
g/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレート
にのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選ん
だ。さらにアンピシリン感受性のクローンをイノシン 1
g/L添加LB培地に生育させ、これらの培養液を薄層クロ
マトグラムにより分析して、イノシンがヒポキサンチン
に分解していないクローンを選択した。さらにはこれら
の目的クローンの染色体DNAからPCRによりdeoDを含む約
1.35kb断片を増幅させ、ClaＩで切断されるがHpaＩで切
断されないことを確認した。以上を満足するクローンを
deoD欠失株とし、FA-31株(purF-,purA-)由来のものをFA
D-25株とした。
eoDを含む約1.35Kbの断片を調製した。この断片を温度
感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクター
であるpMAN997（上述）のEcoRＩサイトに挿入し、プラ
スミドpMAN997deoD'#16を得た。プラスミドpMAN997deo
D'#16でFA-31株(purF-,purA-)を30℃で形質転換し、得
られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含む
LB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこ
れらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにア
ンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42
℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で
生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同
組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクロ
ーンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中
に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個
をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、
LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時
間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られ
るように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレー
トに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現
したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックア
ップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μ
g/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレート
にのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選ん
だ。さらにアンピシリン感受性のクローンをイノシン 1
g/L添加LB培地に生育させ、これらの培養液を薄層クロ
マトグラムにより分析して、イノシンがヒポキサンチン
に分解していないクローンを選択した。さらにはこれら
の目的クローンの染色体DNAからPCRによりdeoDを含む約
1.35kb断片を増幅させ、ClaＩで切断されるがHpaＩで切
断されないことを確認した。以上を満足するクローンを
deoD欠失株とし、FA-31株(purF-,purA-)由来のものをFA
D-25株とした。
【００６７】4)プリン・リプレッサー遺伝子(purR)欠失
株の取得 W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバ
ンク（E.coli Gene Bank）において「purR」をキーワー
ドにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTC
GACGAAAGTAGAAGCGTCATCAG（配列番号７）とCTCGCATGCTT
AACGACGATAGTCGCGG（配列番号８）の29merと28merの両
端プライマーによるPCR法（94℃,30sec;55℃,1min; 72
℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ー
キンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーす
るpurR構造遺伝子領域およびATGの5'上流域約800bpを含
む約1.8kbの増幅断片をpUC19ベクター（宝酒造社製）の
SalＩサイトとSphＩサイトの間にクローニングした。PC
R用プライマーにはSalＩサイトとSphＩサイトがそれぞ
れデザインされており、このサイトがクローニングに利
用された。クローン化されたpurR断片の約1.8kbの5’側
から約810bpの位置にPmaCＩサイト（purR構造遺伝子領
域でのＮ末端近傍）が１ヶ所あるのでプラスミドをPmaC
Ｉで消化した。消化されたプラスミドと8merのBglIIリ
ンカーを混合してT4 DNAリガーゼ反応を行った。この結
果、PmaCIサイトにBglIIサイトが挿入された。このライ
ゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質
転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに
生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体か
らプラスミドDNAを調製し、この中からPmaCＩでは切断
されず、BglIIで切断されるプラスミドDNA(pUC19purR'#
2)を選択した。本プラスミドDNAが有するpurRはPmaCＩ
サイトでフレームシフトが生じることになり、コードさ
れる酵素は機能を持たなくなると予測される（図２）。
株の取得 W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバ
ンク（E.coli Gene Bank）において「purR」をキーワー
ドにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTC
GACGAAAGTAGAAGCGTCATCAG（配列番号７）とCTCGCATGCTT
AACGACGATAGTCGCGG（配列番号８）の29merと28merの両
端プライマーによるPCR法（94℃,30sec;55℃,1min; 72
℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ー
キンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーす
るpurR構造遺伝子領域およびATGの5'上流域約800bpを含
む約1.8kbの増幅断片をpUC19ベクター（宝酒造社製）の
SalＩサイトとSphＩサイトの間にクローニングした。PC
R用プライマーにはSalＩサイトとSphＩサイトがそれぞ
れデザインされており、このサイトがクローニングに利
用された。クローン化されたpurR断片の約1.8kbの5’側
から約810bpの位置にPmaCＩサイト（purR構造遺伝子領
域でのＮ末端近傍）が１ヶ所あるのでプラスミドをPmaC
Ｉで消化した。消化されたプラスミドと8merのBglIIリ
ンカーを混合してT4 DNAリガーゼ反応を行った。この結
果、PmaCIサイトにBglIIサイトが挿入された。このライ
ゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質
転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに
生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体か
らプラスミドDNAを調製し、この中からPmaCＩでは切断
されず、BglIIで切断されるプラスミドDNA(pUC19purR'#
2)を選択した。本プラスミドDNAが有するpurRはPmaCＩ
サイトでフレームシフトが生じることになり、コードさ
れる酵素は機能を持たなくなると予測される（図２）。
【００６８】次に、pUC19purR'#2をSacＩとSphＩで消化
し、purRを含む約1.8Kbの断片を調製した。この断片を
温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベク
ターであるpMAN997（上述）のSacＩサイトとSphＩサイ
トの間に挿入し、プラスミドpMAN997purR'#2を得た。プ
ラスミドpMAN997purR'#2でFAD-25株(purF-,purA-,deo
D -)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個を
アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、
30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングル
コロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含む
LB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得
た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニー
を得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全
体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クロー
ンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認し
た。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布
し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験
管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これ
をシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5
〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩
培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無
作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒
天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレー
トに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシ
リン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感
受性のクローンの中から10クローンを適当に選び、これ
らの染色体DNAからPCRによりpurRを含む約1.8kb断片を
増幅させ、BglIIで切断されるがPmaCＩで切断されない
クローンを選択した。これらのクローンをpurR欠失株と
し、FAD-25株(purF-,purA-,deoD-)由来のものをFADR-8
株とした。なお、purRが破壊された株では、ＰＲＰＰア
ミドトランスフェラーゼ活性がpurR非破壊株に比べて増
大していることが、deoDおよびpurRが欠失したpurF+株
や、purA、deoDおよびpurRが欠失したpurF+株を用いて
確認された。ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ活性の
測定はL.J.Messengerら(J.Biol.Chem., 254, 3382(197
9))の方法に従って行った。
し、purRを含む約1.8Kbの断片を調製した。この断片を
温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベク
ターであるpMAN997（上述）のSacＩサイトとSphＩサイ
トの間に挿入し、プラスミドpMAN997purR'#2を得た。プ
ラスミドpMAN997purR'#2でFAD-25株(purF-,purA-,deo
D -)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個を
アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、
30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングル
コロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含む
LB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得
た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニー
を得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全
体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クロー
ンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認し
た。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布
し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験
管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これ
をシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5
〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩
培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無
作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒
天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレー
トに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシ
リン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感
受性のクローンの中から10クローンを適当に選び、これ
らの染色体DNAからPCRによりpurRを含む約1.8kb断片を
増幅させ、BglIIで切断されるがPmaCＩで切断されない
クローンを選択した。これらのクローンをpurR欠失株と
し、FAD-25株(purF-,purA-,deoD-)由来のものをFADR-8
株とした。なお、purRが破壊された株では、ＰＲＰＰア
ミドトランスフェラーゼ活性がpurR非破壊株に比べて増
大していることが、deoDおよびpurRが欠失したpurF+株
や、purA、deoDおよびpurRが欠失したpurF+株を用いて
確認された。ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ活性の
測定はL.J.Messengerら(J.Biol.Chem., 254, 3382(197
9))の方法に従って行った。
【００６９】5)アデノシン・デアミナーゼ遺伝子(add)
欠失株の取得 W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバ
ンク（E.coli Gene Bank）において「add」をキーワー
ドにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTC
GACGGCTGGATGCCTTACGCATC（配列番号９）とCTCGCATGCAG
TCAGCACGGTATATCGTG（配列番号１０）の塩基配列を有す
る29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30
sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR Sy
stem Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終
止コドンをカバーするadd構造遺伝子領域およびATGの5'
上流域約420bpおよび翻訳終止コドンの下流域約370bpを
含む約1.8kbの増幅断片をpUC19ベクター（宝酒造社製）
のSalＩサイトとSphＩサイトの間にクローニングした。
PCR用プライマーにはSalＩサイトとSphＩサイトがそれ
ぞれデザインされており、このサイトをクローニングに
利用した。クローン化されたadd断片の約1.8kbの5'側か
ら約880bpの位置にStuＩサイトが１ヶ所あるのでプラス
ミドをStuＩで消化した。消化されたプラスミドと8mer
のBglIIリンカーとを混合し、T4 DNAリガーゼ反応を行
った。この結果、StuIサイトにBglIIサイトが挿入され
た。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテン
ト細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒
天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの
形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からStu
Ｉでは切断されず、BglIIで切断されるプラスミドDNA(p
UC19add'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するadd
はStuＩサイトでフレームシフトが生じることになり、
コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される
（図２）。
欠失株の取得 W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバ
ンク（E.coli Gene Bank）において「add」をキーワー
ドにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTC
GACGGCTGGATGCCTTACGCATC（配列番号９）とCTCGCATGCAG
TCAGCACGGTATATCGTG（配列番号１０）の塩基配列を有す
る29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30
sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR Sy
stem Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終
止コドンをカバーするadd構造遺伝子領域およびATGの5'
上流域約420bpおよび翻訳終止コドンの下流域約370bpを
含む約1.8kbの増幅断片をpUC19ベクター（宝酒造社製）
のSalＩサイトとSphＩサイトの間にクローニングした。
PCR用プライマーにはSalＩサイトとSphＩサイトがそれ
ぞれデザインされており、このサイトをクローニングに
利用した。クローン化されたadd断片の約1.8kbの5'側か
ら約880bpの位置にStuＩサイトが１ヶ所あるのでプラス
ミドをStuＩで消化した。消化されたプラスミドと8mer
のBglIIリンカーとを混合し、T4 DNAリガーゼ反応を行
った。この結果、StuIサイトにBglIIサイトが挿入され
た。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテン
ト細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒
天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの
形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からStu
Ｉでは切断されず、BglIIで切断されるプラスミドDNA(p
UC19add'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するadd
はStuＩサイトでフレームシフトが生じることになり、
コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される
（図２）。
【００７０】次に、pUC19add'#1をSacＩとSphＩで消化
し、addを含む約1.8Kbの断片を調製した。この断片を温
度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクタ
ーであるpMAN997（上述）のSacＩサイトとSphＩサイト
の間に挿入し、プラスミドpMAN997add'#１を得た。プラ
スミドpMAN997add'#１でFADR-8株(purF-,purA-,deoD-,p
urR-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個
をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布
し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシン
グルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを
含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニー
を得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロ
ニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミ
ド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本ク
ローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認
した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗
布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試
験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。こ
れをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-
5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩
培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無
作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒
天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレー
トに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシ
リン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感
受性のクローンをアデノシン1.5g/L添加LB培地に生育さ
せ、これらの培養液を薄層クロマトグラムにより分析し
て、アデノシンがイノシンに転換していないクローンを
選択した。さらにこれらの目的クローンの染色体DNAか
らPCRによりaddを含む約1.8kb断片を増幅させ、BglIIで
切断されるがStuＩで切断されないことを確認した。こ
れらのクローンをadd欠失株とし、FADR-8株(purF-,purA
-,deoD-,purR-)由来のものをFADRadd-8-3株とした。
し、addを含む約1.8Kbの断片を調製した。この断片を温
度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクタ
ーであるpMAN997（上述）のSacＩサイトとSphＩサイト
の間に挿入し、プラスミドpMAN997add'#１を得た。プラ
スミドpMAN997add'#１でFADR-8株(purF-,purA-,deoD-,p
urR-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個
をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布
し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシン
グルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを
含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニー
を得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロ
ニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミ
ド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本ク
ローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認
した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗
布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試
験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。こ
れをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-
5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩
培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無
作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒
天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレー
トに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシ
リン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感
受性のクローンをアデノシン1.5g/L添加LB培地に生育さ
せ、これらの培養液を薄層クロマトグラムにより分析し
て、アデノシンがイノシンに転換していないクローンを
選択した。さらにこれらの目的クローンの染色体DNAか
らPCRによりaddを含む約1.8kb断片を増幅させ、BglIIで
切断されるがStuＩで切断されないことを確認した。こ
れらのクローンをadd欠失株とし、FADR-8株(purF-,purA
-,deoD-,purR-)由来のものをFADRadd-8-3株とした。
【００７１】6)ＧＭＰシンセターゼ遺伝子(guaA)欠失株
の取得 W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバ
ンク（E.coli Gene Bank）において「guaA」をキーワー
ドにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGCA
TGCAGGATATTGCCCATGCTACGTATCG（配列番号１１）とCTCA
AGCTTCAGGGTCAAATCATTCCCAC（配列番号１２）の塩基配
列を有する34merと29merの両端プライマーによるPCR法
（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene A
mp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、gu
aBAを含む約3.2kbをpUC18にクローン化した。PCR用プラ
イマーにはSphＩサイトとHindIIIサイトがそれぞれデザ
インされている。次に本クローンをPstI処理し、クロー
ン化guaBA断片の5'側から約850bpの位置にあるPstIサイ
トとpUC18上のPstIサイトによって切り出される約850bp
断片を除去したプラスミドを調製した。本プラスミド上
に搭載されているguaBA領域はATGと翻訳終止コドンをカ
バーするguaA構造遺伝子領域およびATGの5'上流域約700
bpおよび翻訳終止コドンの下流域約10bpを含む約2.3 kb
である。このguaA断片の約2.3kbの5'側から約950bpと12
50bpの位置にSphＩサイトが２ヶ所あるのでプラスミド
をSphＩで消化した。約300bp断片を除去したプラスミド
DNA断片のセルフライゲイションをT4 DNAリガーゼで行
った。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテ
ント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB
寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローン
の形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からS
phＩ消化で300bpの切断断片が生じず、PstIとHindIIIで
の消化で約2.0kb断片が生じるプラスミドDNA(pUC18gua
A'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するguaAはSph
Ｉサイトでフレームシフトが生じることになり、コード
される酵素は機能を持たなくなると予測される（図
２）。
の取得 W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバ
ンク（E.coli Gene Bank）において「guaA」をキーワー
ドにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGCA
TGCAGGATATTGCCCATGCTACGTATCG（配列番号１１）とCTCA
AGCTTCAGGGTCAAATCATTCCCAC（配列番号１２）の塩基配
列を有する34merと29merの両端プライマーによるPCR法
（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene A
mp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、gu
aBAを含む約3.2kbをpUC18にクローン化した。PCR用プラ
イマーにはSphＩサイトとHindIIIサイトがそれぞれデザ
インされている。次に本クローンをPstI処理し、クロー
ン化guaBA断片の5'側から約850bpの位置にあるPstIサイ
トとpUC18上のPstIサイトによって切り出される約850bp
断片を除去したプラスミドを調製した。本プラスミド上
に搭載されているguaBA領域はATGと翻訳終止コドンをカ
バーするguaA構造遺伝子領域およびATGの5'上流域約700
bpおよび翻訳終止コドンの下流域約10bpを含む約2.3 kb
である。このguaA断片の約2.3kbの5'側から約950bpと12
50bpの位置にSphＩサイトが２ヶ所あるのでプラスミド
をSphＩで消化した。約300bp断片を除去したプラスミド
DNA断片のセルフライゲイションをT4 DNAリガーゼで行
った。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテ
ント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB
寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローン
の形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からS
phＩ消化で300bpの切断断片が生じず、PstIとHindIIIで
の消化で約2.0kb断片が生じるプラスミドDNA(pUC18gua
A'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するguaAはSph
Ｉサイトでフレームシフトが生じることになり、コード
される酵素は機能を持たなくなると予測される（図
２）。
【００７２】次に、pUC18guaA'#1をPstＩとHindIIIで消
化し、guaAを含む約2.0Kbの断片を調製した。この断片
を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベ
クターであるpMAN997（上述）のPstＩサイトとHindIII
サイトの間に挿入し、プラスミドpMAN997guaA'#１を得
た。プラスミドpMAN997guaA'#１でFADRadd-8-3株(pur
F -,purA-,deoD-,purR-,add-)を30℃で形質転換し、得ら
れたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB
寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれ
らの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアン
ピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃
で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生
育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組
換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクロー
ンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に
持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個を
LB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB
液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、
振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるよ
うに適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに
塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現した
コロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップ
してそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/ml
を含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにの
み生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。こ
れらのクローンの染色体DNAから、先に示したPCRプライ
マーを用いたPCRによりguaBA断片を増幅させ、約2.9kb
断片が生じるクローンをguaA欠失株とし、FADRadd-8-3
株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)由来のものをFADRad
dguaA株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,guaA-)とし
た。
化し、guaAを含む約2.0Kbの断片を調製した。この断片
を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベ
クターであるpMAN997（上述）のPstＩサイトとHindIII
サイトの間に挿入し、プラスミドpMAN997guaA'#１を得
た。プラスミドpMAN997guaA'#１でFADRadd-8-3株(pur
F -,purA-,deoD-,purR-,add-)を30℃で形質転換し、得ら
れたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB
寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれ
らの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアン
ピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃
で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生
育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組
換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクロー
ンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に
持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個を
LB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB
液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、
振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるよ
うに適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに
塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現した
コロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップ
してそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/ml
を含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにの
み生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。こ
れらのクローンの染色体DNAから、先に示したPCRプライ
マーを用いたPCRによりguaBA断片を増幅させ、約2.9kb
断片が生じるクローンをguaA欠失株とし、FADRadd-8-3
株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)由来のものをFADRad
dguaA株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,guaA-)とし
た。
【００７３】7)脱感作型ＰＲＰＰアミドトランスフェラ
ーゼ遺伝子(purF)の作製 1)でpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にクローン化
した約1530bpのpurFを搭載したプラスミドよりPstＩとH
indIIIでの消化によりpurF断片を切り出し、変異導入用
プラスミドpKF18（宝酒造社製）のマルチクローニング
サイトのPstＩサイトとHindIIIサイトの間に挿入し直
し、目的のクローンを得た(pKFpurF)。G.Zhouら(J.Bio
l.Chem., 269, 6784(1994))により、ＰＲＰＰアミドト
ランスフェラーゼ(PurF)の326番目のLys(K)をGln(Q)
に、さらに410番目のPro(P)をTrp(W)に変異したものが
いずれもGMPおよびAMPのフィードバック阻害に対して脱
感作されていることが示されている。そこで、ＰＲＰＰ
アミドトランスフェラーゼ(PurF)の326番目のLys(K)をG
ln(Q)に、410番目のPro(P)をTrp(W)に変異できるような
遺伝子置換を行うために以下の合成DNAプライマーを作
製し、Site-directed Mutagenesis System Mutan-Super
Express Km（宝酒造社製）のプロトコールに従って、p
KFpurFに部位特異的変異を導入した。
ーゼ遺伝子(purF)の作製 1)でpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にクローン化
した約1530bpのpurFを搭載したプラスミドよりPstＩとH
indIIIでの消化によりpurF断片を切り出し、変異導入用
プラスミドpKF18（宝酒造社製）のマルチクローニング
サイトのPstＩサイトとHindIIIサイトの間に挿入し直
し、目的のクローンを得た(pKFpurF)。G.Zhouら(J.Bio
l.Chem., 269, 6784(1994))により、ＰＲＰＰアミドト
ランスフェラーゼ(PurF)の326番目のLys(K)をGln(Q)
に、さらに410番目のPro(P)をTrp(W)に変異したものが
いずれもGMPおよびAMPのフィードバック阻害に対して脱
感作されていることが示されている。そこで、ＰＲＰＰ
アミドトランスフェラーゼ(PurF)の326番目のLys(K)をG
ln(Q)に、410番目のPro(P)をTrp(W)に変異できるような
遺伝子置換を行うために以下の合成DNAプライマーを作
製し、Site-directed Mutagenesis System Mutan-Super
Express Km（宝酒造社製）のプロトコールに従って、p
KFpurFに部位特異的変異を導入した。
【００７４】K326Q変異用プライマー；5'-GGGCTTCGTT C
AG AACCGCTATGTTGG-3'（配列番号１３） P410W変異用プライマー；5'-TATGGTATTGATATG TGG AGCG
CCACGGAAC-3'（配列番号１４）
AG AACCGCTATGTTGG-3'（配列番号１３） P410W変異用プライマー；5'-TATGGTATTGATATG TGG AGCG
CCACGGAAC-3'（配列番号１４）
【００７５】変異導入操作後、得られた形質転換体のそ
れぞれ6クローンずつを無作為にピックアップし、プラ
スミドを調製し、変異導入個所周辺の塩基配列を解析し
た結果、目的のものが得られたことが確認された。得ら
れたプラスミドはそれぞれpKFpurFKQおよびPKFpurFPWと
した。さらにpKFpurFKQにP410W(410Pro→Trp)の変異を
同じ方法で導入し、二つの変異を同時に持つ変異型プラ
スミドpKFpurFKQPWも作製した。また本pKFpurFKQ、pKFp
urFPW、およびpKFpurFKQPWはpKF18由来のlacp/o（ラク
トースオペロンのプロモーター）の下流に変異型（脱感
作型）のpurFが挿入されており、本プロモーターの支配
下にpurFが発現する。
れぞれ6クローンずつを無作為にピックアップし、プラ
スミドを調製し、変異導入個所周辺の塩基配列を解析し
た結果、目的のものが得られたことが確認された。得ら
れたプラスミドはそれぞれpKFpurFKQおよびPKFpurFPWと
した。さらにpKFpurFKQにP410W(410Pro→Trp)の変異を
同じ方法で導入し、二つの変異を同時に持つ変異型プラ
スミドpKFpurFKQPWも作製した。また本pKFpurFKQ、pKFp
urFPW、およびpKFpurFKQPWはpKF18由来のlacp/o（ラク
トースオペロンのプロモーター）の下流に変異型（脱感
作型）のpurFが挿入されており、本プロモーターの支配
下にpurFが発現する。
【００７６】またこれらのプラスミドでE.coli JM109を
形質転換した組換え体をLB液体培地で8時間培養した後
に菌体を集め、粗酵素抽出液を調製した。これらのＰＲ
ＰＰアミドトランスフェラーゼ活性およびAMPやGMPによ
る阻害度の測定をL.J.Messengerら(J.Biol.Chem., 254,
3382(1979))の方法に従って行った。その結果を表１に
示した。
形質転換した組換え体をLB液体培地で8時間培養した後
に菌体を集め、粗酵素抽出液を調製した。これらのＰＲ
ＰＰアミドトランスフェラーゼ活性およびAMPやGMPによ
る阻害度の測定をL.J.Messengerら(J.Biol.Chem., 254,
3382(1979))の方法に従って行った。その結果を表１に
示した。
【００７７】
【表１】
【００７８】8)変異型purFプラスミド導入株のプリンヌ
クレオシド生産評価 4)、5)および6)で作製したFADR-8株(purF-,purA-,deo
D-,purR-)、FADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,a
dd-)およびFADRaddguaA株(purF-,purA-,deoD-,purR-,ad
d-,guaA-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、
これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。
クレオシド生産評価 4)、5)および6)で作製したFADR-8株(purF-,purA-,deo
D-,purR-)、FADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,a
dd-)およびFADRaddguaA株(purF-,purA-,deoD-,purR-,ad
d-,guaA-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、
これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。
【００７９】以下に、プリンヌクレオシド生産能の評価
のための、プリンヌクレオシド生産用の基本培地および
培養方法ならびに分析方法を示す。
のための、プリンヌクレオシド生産用の基本培地および
培養方法ならびに分析方法を示す。
【００８０】1.基本培地：ＭＳ培地 最終濃度 グルコース 40g/L（別殺菌） (NH4)2SO4 16g/L KH2PO4 1g/L MgSO4・7H2O 1g/L FeSO4・7H2O 0.01g/L MnSO4・4H2O 0.01g/Lイーストエキストラクト (YE) 2g/L CaCO3 30g/L（別殺菌）
【００８１】２．培養方法 （坂口フラスコ） リフレッシュ（refresh）培養； 保存状態の菌を接種 LB寒天培地（必要に応じて薬剤添加） 37℃、一晩培養 種（seed）培養； リフレッシュ培養した菌を接種 LB液体培地（必要に応じて薬剤添加） 37℃、一晩培養 主（main）培養； 種培養液体培地から2％接種 MS培地（必要に応じてアデニン、グアニン、薬剤添加) 37℃、20ml/500ml容坂口フラスコ
【００８２】３．分析方法 培養液500μlを経時的にサンプリングし、15,000rpm、5
min間遠心し、その上清液をH2Oにて4倍希釈後、HPLC分
析する。特記しない限り、培養３日後の培地当たりのプ
リンヌクレオシド蓄積量として評価する。
min間遠心し、その上清液をH2Oにて4倍希釈後、HPLC分
析する。特記しない限り、培養３日後の培地当たりのプ
リンヌクレオシド蓄積量として評価する。
【００８３】分析条件： カラム： Asahipak GS-220 (7.6mmID×500mmL) 緩衝液： 0.2M NaH2PO4(pH3.98)リン酸にてpH調整 温度： 55℃ 流速： 1.5ml/min 検出： UV254nm 保持時間 (min) イノシン 16.35 ヒポキサンチン 19.22 キサントシン 20.04 キサンチン 24.03 グアノシン 20.82 グアニン 23.50 アデニン 24.90 アデノシン 26.04
【００８４】プリンヌクレオシド生産能の評価結果を表
２に示す。MS培地に表２に示した量でアデニンとグアニ
ンが添加されている。guaA欠失によってキサントシンの
生成は見られず、わずかなキサンチンの生成が認められ
た。deoD欠失にもかかわらず、キサントシンがキサンチ
ンに分解されるものと考えられる。
２に示す。MS培地に表２に示した量でアデニンとグアニ
ンが添加されている。guaA欠失によってキサントシンの
生成は見られず、わずかなキサンチンの生成が認められ
た。deoD欠失にもかかわらず、キサントシンがキサンチ
ンに分解されるものと考えられる。
【００８５】
【表２】
【００８６】
【実施例２】1)６-フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ
遺伝子(edd)欠失株の取得 W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバ
ンク（E.coli Gene Bank）において「edd」をキーワー
ドにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGAA
TTCGGATATCTGGAAGAAGAGGG（配列番号１５）とCTCAAGCTT
GGAATAGTCCCTTCGGTAGC（配列番号１６）の塩基配列を有
する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,
30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR
System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳
終止コドンをカバーするedd構造遺伝子領域およびATGの
5'上流域約810bpおよび翻訳終止コドンの下流域約360bp
を含む約3.0kbの増幅断片をそのままpCRTMIIベクター
（Invitrogen社製）にクローン化した。本ベクターはPC
R産物増幅断片をそのままクローニングすることがで
き、またクローニングサイトの両近傍に制限酵素サイト
としてEcoRIサイトが存在する。またPCR用プライマーに
はBamHＩサイトとHindIIIサイトがそれぞれデザインさ
れている。クローン化されたedd断片の約3.0kbの5'側か
ら約660bpと1900bpの位置にStuＩサイトが２ヶ所あるの
でプラスミドをStuＩで消化した。約1.25kbのStuI断片
を除去したベクター側のセルフライゲイションをT4 DNA
リガーゼで行った。このライゲイション液でE.coli HB1
01のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μ
g/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得
た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製
し、この中からStuＩでは1.25kbの断片が切りだされな
いプラスミドDNA(pCRTMIIedd'#1)を選択した。本プラス
ミドDNAが有するeddはプロモーター領域を含むタンパク
質コード領域が除去されており、酵素が生成しなくなる
と予測される（図２）。
遺伝子(edd)欠失株の取得 W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバ
ンク（E.coli Gene Bank）において「edd」をキーワー
ドにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGAA
TTCGGATATCTGGAAGAAGAGGG（配列番号１５）とCTCAAGCTT
GGAATAGTCCCTTCGGTAGC（配列番号１６）の塩基配列を有
する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,
30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR
System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳
終止コドンをカバーするedd構造遺伝子領域およびATGの
5'上流域約810bpおよび翻訳終止コドンの下流域約360bp
を含む約3.0kbの増幅断片をそのままpCRTMIIベクター
（Invitrogen社製）にクローン化した。本ベクターはPC
R産物増幅断片をそのままクローニングすることがで
き、またクローニングサイトの両近傍に制限酵素サイト
としてEcoRIサイトが存在する。またPCR用プライマーに
はBamHＩサイトとHindIIIサイトがそれぞれデザインさ
れている。クローン化されたedd断片の約3.0kbの5'側か
ら約660bpと1900bpの位置にStuＩサイトが２ヶ所あるの
でプラスミドをStuＩで消化した。約1.25kbのStuI断片
を除去したベクター側のセルフライゲイションをT4 DNA
リガーゼで行った。このライゲイション液でE.coli HB1
01のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μ
g/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得
た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製
し、この中からStuＩでは1.25kbの断片が切りだされな
いプラスミドDNA(pCRTMIIedd'#1)を選択した。本プラス
ミドDNAが有するeddはプロモーター領域を含むタンパク
質コード領域が除去されており、酵素が生成しなくなる
と予測される（図２）。
【００８７】次に、pCRTMIIedd'#1をEcoRI消化し、edd
の一部とその近傍を含む約1.75Kbの断片を調製した。こ
の断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換
え用ベクターであるpMAN997（上述）のEcoRIサイトに挿
入し、プラスミドpMAN997edd'#１を得た。プラスミドpM
AN997edd'#１でFADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR
-,add-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数
個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布
し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシン
グルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを
含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニー
を得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロ
ニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミ
ド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本ク
ローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認
した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗
布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試
験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。こ
れをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10
-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一
晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から
無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB
寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレ
ートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピ
シリン感受性のクローンを選んだ。これらのクローンの
染色体DNAから、先に示したPCRプライマーを用いたPCR
によりedd領域を増幅させ、増幅断片サイズが野生型の
約3.0kbではなく、欠失型の約1.75kbであるクローンを
選択した。これらのクローンをedd欠失株とし、FADRadd
edd株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-)とした。
の一部とその近傍を含む約1.75Kbの断片を調製した。こ
の断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換
え用ベクターであるpMAN997（上述）のEcoRIサイトに挿
入し、プラスミドpMAN997edd'#１を得た。プラスミドpM
AN997edd'#１でFADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR
-,add-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数
個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布
し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシン
グルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを
含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニー
を得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロ
ニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミ
ド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本ク
ローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認
した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗
布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試
験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。こ
れをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10
-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一
晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から
無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB
寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレ
ートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピ
シリン感受性のクローンを選んだ。これらのクローンの
染色体DNAから、先に示したPCRプライマーを用いたPCR
によりedd領域を増幅させ、増幅断片サイズが野生型の
約3.0kbではなく、欠失型の約1.75kbであるクローンを
選択した。これらのクローンをedd欠失株とし、FADRadd
edd株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-)とした。
【００８８】2)アデニン・デアミナーゼ遺伝子(yicP)欠
失株の取得 遺伝子データバンク（E.coli Gene Bank）において、Ba
cillus subtilis由来のアデニン・デアミナーゼと相同
性の高いORF(open reading frame,構造遺伝子）とし
て、yicPが登録されている。そこで、W3110株の染色体D
NAを鋳型として用い、「yicP」をキーワードにして検索
される情報に基づいて作製された、CTCCTGCAGCGACGTTTT
CTTTTATGACA（配列番号１７）とCTCAAGCTTCGTAACTGGTGA
CTTTTGCC（配列番号１８）の塩基配列を有する29merと2
9merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,
1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model
9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンを
カバーするyicP構造遺伝子領域およびATGの5'上流域約5
0bpおよび翻訳終止コドンの下流域約40bpを含む約1.9kb
断片を増幅した。またPCR用プライマーにはPstＩサイト
とHindIIIサイトがそれぞれデザインされている。このP
CR産物をPstIとHindIIIで切断後、pUC18ベクター（宝酒
造社製）のPstＩサイトとHindIIIサイトの間にクローン
化した。クローン化されたyicP断片の約1.9kbの5’側か
ら約540bpと590bpの位置にHapIサイトとEcoRVサイトが
それぞれ１ヶ所あるのでプラスミドをHapIとEcoRVで消
化した後、HapI-EcoRV切断断片の47bpを除去したDNAの
セルフライゲイションをT4 DNAリガーゼで行った。この
ライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を
形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレー
トに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換
体からプラスミドDNAを調製し、この中からHapIあるい
はEcoRV消化で切断されないプラスミドDNA(pUC18yicP'#
1)を選択した。本プラスミドDNAが有するyicPはHapI-Ec
oRVサイト間の47bpを欠失することでフレームシフトが
生じることになり、コードされる酵素は機能を持たなく
なると予測される（図２）。
失株の取得 遺伝子データバンク（E.coli Gene Bank）において、Ba
cillus subtilis由来のアデニン・デアミナーゼと相同
性の高いORF(open reading frame,構造遺伝子）とし
て、yicPが登録されている。そこで、W3110株の染色体D
NAを鋳型として用い、「yicP」をキーワードにして検索
される情報に基づいて作製された、CTCCTGCAGCGACGTTTT
CTTTTATGACA（配列番号１７）とCTCAAGCTTCGTAACTGGTGA
CTTTTGCC（配列番号１８）の塩基配列を有する29merと2
9merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,
1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model
9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンを
カバーするyicP構造遺伝子領域およびATGの5'上流域約5
0bpおよび翻訳終止コドンの下流域約40bpを含む約1.9kb
断片を増幅した。またPCR用プライマーにはPstＩサイト
とHindIIIサイトがそれぞれデザインされている。このP
CR産物をPstIとHindIIIで切断後、pUC18ベクター（宝酒
造社製）のPstＩサイトとHindIIIサイトの間にクローン
化した。クローン化されたyicP断片の約1.9kbの5’側か
ら約540bpと590bpの位置にHapIサイトとEcoRVサイトが
それぞれ１ヶ所あるのでプラスミドをHapIとEcoRVで消
化した後、HapI-EcoRV切断断片の47bpを除去したDNAの
セルフライゲイションをT4 DNAリガーゼで行った。この
ライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を
形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレー
トに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換
体からプラスミドDNAを調製し、この中からHapIあるい
はEcoRV消化で切断されないプラスミドDNA(pUC18yicP'#
1)を選択した。本プラスミドDNAが有するyicPはHapI-Ec
oRVサイト間の47bpを欠失することでフレームシフトが
生じることになり、コードされる酵素は機能を持たなく
なると予測される（図２）。
【００８９】次に、pUC18yicP'#1をPstIとHindIIIで消
化し、yicP構造遺伝子を含む約1.9Kbの断片を調製し
た。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相
同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）のPstIサイ
トとHindIIIサイトの間に挿入し、プラスミドpMAN997yi
cP'#１を得た。プラスミドpMAN997yicP'#１でFADRadded
d株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-)を30℃で形質
転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μ
g/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養し
た。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られ
るようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに
塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一
度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り
返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込
まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを
細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクロー
ンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養
した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃
で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニー
が得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒
天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得
た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーを
ピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシ
リン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天
プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローン
を選んだ。これらのクローンの染色体DNAから先に示し
たPCRプライマーを用いたPCRによりyicP領域を増幅さ
せ、増幅断片がHapIあるいはEcoRVで切断されないクロ
ーンを選択した。またこれらクローンではアデニン・デ
アミナーゼ活性が検出されないことを確認した。アデニ
ン・デアミナーゼ活性はPER NYGAARDら(J.Bacteriol.,1
78,846-853(1996))の方法に従って測定した。これらの
クローンをyicP欠失株とし、FADRaddeddyicP株(purF-,p
urA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-)とした。
化し、yicP構造遺伝子を含む約1.9Kbの断片を調製し
た。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相
同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）のPstIサイ
トとHindIIIサイトの間に挿入し、プラスミドpMAN997yi
cP'#１を得た。プラスミドpMAN997yicP'#１でFADRadded
d株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-)を30℃で形質
転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μ
g/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養し
た。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られ
るようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに
塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一
度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り
返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込
まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを
細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクロー
ンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養
した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃
で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニー
が得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒
天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得
た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーを
ピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシ
リン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天
プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローン
を選んだ。これらのクローンの染色体DNAから先に示し
たPCRプライマーを用いたPCRによりyicP領域を増幅さ
せ、増幅断片がHapIあるいはEcoRVで切断されないクロ
ーンを選択した。またこれらクローンではアデニン・デ
アミナーゼ活性が検出されないことを確認した。アデニ
ン・デアミナーゼ活性はPER NYGAARDら(J.Bacteriol.,1
78,846-853(1996))の方法に従って測定した。これらの
クローンをyicP欠失株とし、FADRaddeddyicP株(purF-,p
urA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-)とした。
【００９０】3)フォスフォグルコース・イソメラーゼ遺
伝子(pgi)欠失株の取得 W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバ
ンク（E.coli Gene Bank）において「pgi」をキーワー
ドにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTC
GACTCCATTTTCAGCCTTGGCAC（配列番号１９）とCTCGCATGC
GTCGCATCAGGCATCGGTTG（配列番号２０）の塩基配列を有
する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,
30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR
System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳
終止コドンをカバーするpgi構造遺伝子領域を含む約2.2
kbの増幅断片をpUC18ベクター（宝酒造社製）のSalＩサ
イトとSphＩサイトの間にクローン化した。またPCR用プ
ライマーにはSalＩサイトとSphＩサイトがそれぞれデザ
インされている。クローン化されたpgi断片の約2.2kbの
5'側から約1170bpと1660bpの位置にBssHIIサイトとMluI
サイトがそれぞれ１ヶ所あるのでプラスミドをBssHIIと
MluIで消化した後、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し
た。BssHIIとMluI間の約500bpの断片を除去したベクタ
ー側のセルフライゲイションをT4 DNAリガーゼで行っ
た。このライゲイション液でE.coliJM109のコンピテン
ト細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒
天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの
形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からSal
I-SphI処理で約1.7kbの断片が切りだされるプラスミドD
NA(pUC18pgi'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有する
pgiはBssHIIサイトとMluIサイトの間で欠失が生じるこ
とになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予
測される（図２）。
伝子(pgi)欠失株の取得 W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバ
ンク（E.coli Gene Bank）において「pgi」をキーワー
ドにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTC
GACTCCATTTTCAGCCTTGGCAC（配列番号１９）とCTCGCATGC
GTCGCATCAGGCATCGGTTG（配列番号２０）の塩基配列を有
する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,
30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR
System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳
終止コドンをカバーするpgi構造遺伝子領域を含む約2.2
kbの増幅断片をpUC18ベクター（宝酒造社製）のSalＩサ
イトとSphＩサイトの間にクローン化した。またPCR用プ
ライマーにはSalＩサイトとSphＩサイトがそれぞれデザ
インされている。クローン化されたpgi断片の約2.2kbの
5'側から約1170bpと1660bpの位置にBssHIIサイトとMluI
サイトがそれぞれ１ヶ所あるのでプラスミドをBssHIIと
MluIで消化した後、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し
た。BssHIIとMluI間の約500bpの断片を除去したベクタ
ー側のセルフライゲイションをT4 DNAリガーゼで行っ
た。このライゲイション液でE.coliJM109のコンピテン
ト細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒
天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの
形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からSal
I-SphI処理で約1.7kbの断片が切りだされるプラスミドD
NA(pUC18pgi'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有する
pgiはBssHIIサイトとMluIサイトの間で欠失が生じるこ
とになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予
測される（図２）。
【００９１】次に、pUC18pgi'#1をSalIとSphIで消化
し、pgiを含む約1.7Kbの断片を調製した。この断片を温
度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクタ
ーであるpMAN997（上述）のSalIサイトとSphIサイトの
間に挿入し、プラスミドpMAN997pgi'#１を得た。プラス
ミドpMAN997pgi'#１でFADRaddeddyicP株(purF-,purA-,d
eoD-,purR-,add-,edd-,yicP-)を30℃で形質転換し、そ
れぞれ得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/
mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養し
た。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られ
るようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに
塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一
度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り
返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込
まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを
細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクロー
ンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養
した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃
で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニー
が得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒
天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得
た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーを
ピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシ
リン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天
プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローン
を選んだ。これらのクローンの染色体DNAから先に示し
たPCRプライマーを用いたPCRによりpgi領域を増幅さ
せ、増幅断片サイズが野生型の約2.2kbではなく、欠失
型の約1.7kbであるクローンを選択した。これらのクロ
ーンをpgi欠失株とし、FADRaddeddyicPpgi株(purF-,pur
A-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-)とした。
し、pgiを含む約1.7Kbの断片を調製した。この断片を温
度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクタ
ーであるpMAN997（上述）のSalIサイトとSphIサイトの
間に挿入し、プラスミドpMAN997pgi'#１を得た。プラス
ミドpMAN997pgi'#１でFADRaddeddyicP株(purF-,purA-,d
eoD-,purR-,add-,edd-,yicP-)を30℃で形質転換し、そ
れぞれ得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/
mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養し
た。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られ
るようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに
塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一
度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り
返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込
まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを
細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクロー
ンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養
した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃
で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニー
が得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒
天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得
た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーを
ピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシ
リン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天
プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローン
を選んだ。これらのクローンの染色体DNAから先に示し
たPCRプライマーを用いたPCRによりpgi領域を増幅さ
せ、増幅断片サイズが野生型の約2.2kbではなく、欠失
型の約1.7kbであるクローンを選択した。これらのクロ
ーンをpgi欠失株とし、FADRaddeddyicPpgi株(purF-,pur
A-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-)とした。
【００９２】4)キサントシン・フォスフォリラーゼ遺伝
子(xapA)欠失株の取得 遺伝子データバンク（E.coli Gene Bank）において「xa
pA」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製
された、４種類のプライマーによるCross-overPCR法に
より、一段階操作にて変異不活化遺伝子を構築した。使
用したプライマーを以下に示す。
子(xapA)欠失株の取得 遺伝子データバンク（E.coli Gene Bank）において「xa
pA」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製
された、４種類のプライマーによるCross-overPCR法に
より、一段階操作にて変異不活化遺伝子を構築した。使
用したプライマーを以下に示す。
【００９３】N-out:5'-CGCGGATCCGCGACATAGCCGTTGTCGCC
-3'（配列番号２１） N-in: 5'-CCCATCCACTAAACTTAAACATCGTGGCGTGAAATCAGG-
3'（配列番号２２） C-in: 5'-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCATCAACCTTATTTGTGG-
3'（配列番号２３） C-out:5'-CGCAAGCTTCAAACTCCGGGTTACGGGCG-3'（配列番
号２４）
-3'（配列番号２１） N-in: 5'-CCCATCCACTAAACTTAAACATCGTGGCGTGAAATCAGG-
3'（配列番号２２） C-in: 5'-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCATCAACCTTATTTGTGG-
3'（配列番号２３） C-out:5'-CGCAAGCTTCAAACTCCGGGTTACGGGCG-3'（配列番
号２４）
【００９４】まず、W3110株の染色体DNAを鋳型として用
い、N-out(29mer)とN-in(39mer)およびC-in(39mer)とC-
out(29mer)の両端プライマーにより、それぞれPCR法（9
4℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp
PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、２つ
のPCR産物（ともに約850bp断片）を得、次に２つのPCR
産物を混合して、再度N-outとC-outを両端プライマーと
してPCRを行い、xapA構造遺伝子領域を含む遺伝子領域
が約2.4kb断片（野生型のサイズ）から約1.7kb断片に短
縮した遺伝子断片を増幅した。またN-outとC-outのPCR
用プライマーにはBamHＩサイトとHindIIIサイトがそれ
ぞれデザインされている。このPCR産物をBamHIとHindII
Iで切断後、この断片と温度感受性複製起点(tsori)を有
する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）をBam
HIとHindIIIで切断したプラスミドとのライゲイション
をT4 DNAリガーゼで行った。このライゲイション液でE.
coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシ
リン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換
体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNA
を調製し、この中からBamHIとHindIIIでの消化で約1.7k
bの切断断片が生じるプラスミドDNA(pMAN997xapA'#1)を
選択した。本プラスミドDNAが有するxapAは、構造遺伝
子の約700bpを欠失することで、コードされる酵素は機
能を持たなくなると予測される（図２）。
い、N-out(29mer)とN-in(39mer)およびC-in(39mer)とC-
out(29mer)の両端プライマーにより、それぞれPCR法（9
4℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp
PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、２つ
のPCR産物（ともに約850bp断片）を得、次に２つのPCR
産物を混合して、再度N-outとC-outを両端プライマーと
してPCRを行い、xapA構造遺伝子領域を含む遺伝子領域
が約2.4kb断片（野生型のサイズ）から約1.7kb断片に短
縮した遺伝子断片を増幅した。またN-outとC-outのPCR
用プライマーにはBamHＩサイトとHindIIIサイトがそれ
ぞれデザインされている。このPCR産物をBamHIとHindII
Iで切断後、この断片と温度感受性複製起点(tsori)を有
する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）をBam
HIとHindIIIで切断したプラスミドとのライゲイション
をT4 DNAリガーゼで行った。このライゲイション液でE.
coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシ
リン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換
体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNA
を調製し、この中からBamHIとHindIIIでの消化で約1.7k
bの切断断片が生じるプラスミドDNA(pMAN997xapA'#1)を
選択した。本プラスミドDNAが有するxapAは、構造遺伝
子の約700bpを欠失することで、コードされる酵素は機
能を持たなくなると予測される（図２）。
【００９５】このプラスミドpMAN997xapA'#１でFADRadd
eddyicPpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yic
P-,pgi-)を30℃で形質転換し、それぞれ得られたコロニ
ーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレー
トに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌
体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25
μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育する
コロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシン
グルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えにより
プラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択し
た。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないこ
とを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレ
ートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地
（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培
養した。これをシングルコロニーが得られるように適当
に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、
42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニー
の中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれ
ぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB
寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育す
るアンピシリン感受性のクローンを選んだ。これらのク
ローンの染色体DNAから先に示したN-outとC-outのPCRプ
ライマーを用いたPCRによりxapA領域を増幅させ、増幅
断片サイズが約1.7kbのクローンを選択した。これらの
クローンをxapA欠失株とし、FADRaddeddyicPpgixapA株
(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,xapA
-)とした。このxapA欠失株はキサントシンの添加培養に
よって、培地中にキサンチンの生成が認められず、また
キサントシン・フォスフォリラーゼが誘導されていない
ことも確認できた。キサントシン・フォスフォリラーゼ
活性はK.Hammer-Jespersenら(Molec.Gen.Genet.,179,34
1-348(1980))の方法に従って測定した。
eddyicPpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yic
P-,pgi-)を30℃で形質転換し、それぞれ得られたコロニ
ーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレー
トに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌
体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25
μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育する
コロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシン
グルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えにより
プラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択し
た。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないこ
とを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレ
ートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地
（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培
養した。これをシングルコロニーが得られるように適当
に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、
42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニー
の中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれ
ぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB
寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育す
るアンピシリン感受性のクローンを選んだ。これらのク
ローンの染色体DNAから先に示したN-outとC-outのPCRプ
ライマーを用いたPCRによりxapA領域を増幅させ、増幅
断片サイズが約1.7kbのクローンを選択した。これらの
クローンをxapA欠失株とし、FADRaddeddyicPpgixapA株
(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,xapA
-)とした。このxapA欠失株はキサントシンの添加培養に
よって、培地中にキサンチンの生成が認められず、また
キサントシン・フォスフォリラーゼが誘導されていない
ことも確認できた。キサントシン・フォスフォリラーゼ
活性はK.Hammer-Jespersenら(Molec.Gen.Genet.,179,34
1-348(1980))の方法に従って測定した。
【００９６】5)ＧＭＰシンセターゼ遺伝子(guaA)欠失株
の取得 実施例１の6)で調製した温度感受性複製起点(tsori)を
有する相同組換え用プラスミドpMAN997guaA'#１でFADRa
ddeddyicPpgixapA株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,ed
d-,yicP-,pgi-,xapA-)を30℃で形質転換し、得られたコ
ロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プ
レートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培
養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリ
ン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育
するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育する
シングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えに
よりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選
択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たな
いことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天
プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培
地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう
培養した。これをシングルコロニーが得られるように適
当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布
し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロ
ニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして
それぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含
むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生
育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。これら
のクローンの染色体DNAから、先に示したPCRプライマー
を用いたPCRによりguaBA断片を増幅させ、約2.9kb断片
が生じるクローンをguaA欠失株とし、FADRaddeddyicPpg
ixapA株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP -,pg
i-,xapA-)由来のものをFADRaddeddyicPpgixapAguaA株(p
urF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,xapA-,
guaA-)とした。
の取得 実施例１の6)で調製した温度感受性複製起点(tsori)を
有する相同組換え用プラスミドpMAN997guaA'#１でFADRa
ddeddyicPpgixapA株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,ed
d-,yicP-,pgi-,xapA-)を30℃で形質転換し、得られたコ
ロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プ
レートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培
養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリ
ン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育
するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育する
シングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えに
よりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選
択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たな
いことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天
プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培
地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう
培養した。これをシングルコロニーが得られるように適
当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布
し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロ
ニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして
それぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含
むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生
育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。これら
のクローンの染色体DNAから、先に示したPCRプライマー
を用いたPCRによりguaBA断片を増幅させ、約2.9kb断片
が生じるクローンをguaA欠失株とし、FADRaddeddyicPpg
ixapA株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP -,pg
i-,xapA-)由来のものをFADRaddeddyicPpgixapAguaA株(p
urF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,xapA-,
guaA-)とした。
【００９７】6)脱感作型purFプラスミド導入によるプリ
ンヌクレオシド生産評価 4)および5)で作製したFADRaddeddyicPpgixapA株(purF-,
purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,xapA-)およ
びFADRaddeddyicPpgixapAguaA株(purF-,purA-,deoD-,pu
rR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,xapA-,guaA-)にそれぞれpKF
purFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプ
リンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシ
ド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は
実施例１と同じであるが、MS培地中のイーストエキスト
ラクト量（基本は0.2％）を0.8%と増量した培地も使用
した。イーストエキストラクト(YE)量と添加したアデニ
ンとグアニン量は表３に示してある。1)〜3)で作製した
宿主株も対照区として評価した。
ンヌクレオシド生産評価 4)および5)で作製したFADRaddeddyicPpgixapA株(purF-,
purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,xapA-)およ
びFADRaddeddyicPpgixapAguaA株(purF-,purA-,deoD-,pu
rR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,xapA-,guaA-)にそれぞれpKF
purFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプ
リンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシ
ド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は
実施例１と同じであるが、MS培地中のイーストエキスト
ラクト量（基本は0.2％）を0.8%と増量した培地も使用
した。イーストエキストラクト(YE)量と添加したアデニ
ンとグアニン量は表３に示してある。1)〜3)で作製した
宿主株も対照区として評価した。
【００９８】プリンヌクレオシド生産能の評価結果を表
３に示す。xapAとguaAを欠失することにより、イノシン
生産は減少するもののキサントシンの顕著な蓄積が認め
られた。またキサンチンの生成はほとんど認められなか
った。キサントシン・フォスフォリラーゼはキサントシ
ンの存在下で誘導されるキサントシン分解酵素であるの
で、guaAを欠失しても生成したキサントシンがキサンチ
ンに速やかに分解される。従って、xapA欠失でない場合
はキサントシンとして蓄積せずにキサンチンとして蓄積
すると考えられる（表２）。
３に示す。xapAとguaAを欠失することにより、イノシン
生産は減少するもののキサントシンの顕著な蓄積が認め
られた。またキサンチンの生成はほとんど認められなか
った。キサントシン・フォスフォリラーゼはキサントシ
ンの存在下で誘導されるキサントシン分解酵素であるの
で、guaAを欠失しても生成したキサントシンがキサンチ
ンに速やかに分解される。従って、xapA欠失でない場合
はキサントシンとして蓄積せずにキサンチンとして蓄積
すると考えられる（表２）。
【００９９】以上の結果からpurA欠失、deoD欠失、purR
欠失、add欠失、edd欠失、yicP欠失、pgi欠失、xapA欠
失およびpurFの脱感作はイノシン等のプリンヌクレオシ
ドの生産性を増大する因子であり、キサントシンそのも
のの生産性を付与し、増大する因子としてはxapA欠失が
必要条件であり、またguaA欠失も有効な要件と考えられ
る。
欠失、add欠失、edd欠失、yicP欠失、pgi欠失、xapA欠
失およびpurFの脱感作はイノシン等のプリンヌクレオシ
ドの生産性を増大する因子であり、キサントシンそのも
のの生産性を付与し、増大する因子としてはxapA欠失が
必要条件であり、またguaA欠失も有効な要件と考えられ
る。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
【発明の効果】本発明によれば、キサントシンを発酵法
により生産するために好適なキサントシン生産菌を創成
することができる。
により生産するために好適なキサントシン生産菌を創成
することができる。
【０１０２】
【配列表】 <110> 味の素株式会社 <120> 発酵法によるキサントシンの製造法 <130> P-5957 <160> 24 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 ctcctgcaga acgaggaaaa agacgtatg 29 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 ctcaagcttt catccttcgt tatgcatttc g 31 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 ctcgagctca tgggtaacaa cgtcgtcgta c 31 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 ctcgtcgact tacgcgtcga acgggtcgcg c 31 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 ctcgtcgacg cgggtctgga actgttcgac 30 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 ctcgcatgcc cgtgctttac caaagcgaat c 31 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 7 ctcgtcgacg aaagtagaag cgtcatcag 29 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 8 ctcgcatgct taacgacgat agtcgcgg 28 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 9 ctcgtcgacg gctggatgcc ttacgcatc 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 10 ctcgcatgca gtcagcacgg tatatcgtg 29 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 11 ctcgcatgca ggatattgcc catgctacgt atcg 34 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 12 ctcaagcttc agggtcaaat cattcccac 29 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 13gggcttcgtt cagaaccgct atgttgg
27 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 14 tatggtattg atatgtggag cgccacggaa c 31 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 15 ctcgaattcg gatatctgga agaagaggg 29 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 16 ctcaagcttg gaatagtccc ttcggtagc 29 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 17 ctcctgcagc gacgttttct tttatgaca 29 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 18 ctcaagcttc gtaactggtg acttttgcc 29 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 19 ctcgtcgact ccattttcag ccttggcac 29 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 20 ctcgcatgcg tcgcatcagg catcggttg 29 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 21 cgcggatccg cgacatagcc gttgtcgcc 29 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 22 cccatccact aaacttaaac atcgtggcgt gaaatcagg 39 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 23 tgtttaagtt tagtggatgg gcatcaacct tatttgtgg 39 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 24 cgcaagcttc aaactccggg ttacgggcg 29
27 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 14 tatggtattg atatgtggag cgccacggaa c 31 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 15 ctcgaattcg gatatctgga agaagaggg 29 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 16 ctcaagcttg gaatagtccc ttcggtagc 29 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 17 ctcctgcagc gacgttttct tttatgaca 29 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 18 ctcaagcttc gtaactggtg acttttgcc 29 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 19 ctcgtcgact ccattttcag ccttggcac 29 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 20 ctcgcatgcg tcgcatcagg catcggttg 29 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 21 cgcggatccg cgacatagcc gttgtcgcc 29 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 22 cccatccact aaacttaaac atcgtggcgt gaaatcagg 39 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 23 tgtttaagtt tagtggatgg gcatcaacct tatttgtgg 39 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 24 cgcaagcttc aaactccggg ttacgggcg 29
【図１】pMAN997の構築を示す。
【図２】相同組換え用遺伝子の構造を示す。図中の数字
は、取得された断片の長さ(bp)および5'側からの位置を
示す。
は、取得された断片の長さ(bp)および5'側からの位置を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 島岡 恵 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 竹中 康浩 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 山本 洋子 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 倉橋 修 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 BA71 BA80 CA04 CA06 DA06 EA04 GA11 HA20 4B064 AF33 CA02 CA19 CC24 DA01 DA10 4B065 AA26X AA26Y AB01 AC14 AC20 BA02 CA19 CA41 CA44
Claims (7)
- 【請求項１】 キサントシン・フォスフォリラーゼおよ
びグアノシンモノリン酸シンセターゼの活性が欠失し、
キサントシン生産能を有する、エシェリヒア属に属する
微生物。 - 【請求項２】 プリンヌクレオシド生合成に関与する酵
素の細胞内での活性が上昇し、および／または、プリン
ヌクレオシド生合成から分岐して他の代謝産物にいたる
反応が遮断されている請求項１記載の微生物。 - 【請求項３】 プリンヌクレオシド生合成に関与する酵
素の遺伝子の発現量が上昇することによって、および／
または、プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の調
節が解除されることによって、前記プリンヌクレオシド
生合成に関与する酵素の細胞内での活性が上昇している
請求項２記載の微生物。 - 【請求項４】 プリン・リプレッサーの機能の欠失によ
り、前記プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の調
節が解除されている請求項３記載の微生物。 - 【請求項５】 前記プリンヌクレオシド生合成に関与す
る酵素がホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェ
ラーゼである請求項２〜４のいずれか一項に記載の微生
物。 - 【請求項６】 前記プリンヌクレオシド生合成から分岐
して他の代謝産物にいたる反応が、サクシニル−アデノ
シンモノリン酸シンターゼ、プリンヌクレオシド・フォ
スフォリラーゼ、アデノシン・デアミナーゼ、６-フォ
スフォグルコン酸デヒドラーゼ、フォスフォグルコース
・イソメラーゼ、アデニン・デアミナーゼ、キサントシ
ン・フォスフォリラーゼ、グアノシンモノリン酸シンセ
ターゼから選ばれる酵素に触媒される反応である請求項
２〜５のいずれか一項に記載の微生物。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか一項に記載の微
生物を培地に培養し、キサントシンを生成蓄積せしめ、
生成蓄積したキサントシンを回収することを特徴とする
発酵法によるキサントシンの製造法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP30879598A JP3965804B2 (ja) | 1998-10-29 | 1998-10-29 | 発酵法によるキサントシンの製造法 |
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| JP30879598A JP3965804B2 (ja) | 1998-10-29 | 1998-10-29 | 発酵法によるキサントシンの製造法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000135078A true JP2000135078A (ja) | 2000-05-16 |
| JP3965804B2 JP3965804B2 (ja) | 2007-08-29 |
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ID=17985411
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30879598A Expired - Fee Related JP3965804B2 (ja) | 1998-10-29 | 1998-10-29 | 発酵法によるキサントシンの製造法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3965804B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007117078A (ja) * | 2005-03-10 | 2007-05-17 | Ajinomoto Co Inc | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| WO2008020595A1 (fr) * | 2006-08-15 | 2008-02-21 | Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. | Procédé innovant d'utilisation d'un mutant microbien |
| US8298791B2 (en) | 2005-03-10 | 2012-10-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
-
1998
- 1998-10-29 JP JP30879598A patent/JP3965804B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
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| US8298791B2 (en) | 2005-03-10 | 2012-10-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| WO2008020595A1 (fr) * | 2006-08-15 | 2008-02-21 | Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. | Procédé innovant d'utilisation d'un mutant microbien |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3965804B2 (ja) | 2007-08-29 |
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