JP4375405B2 - 発酵法によるプリンヌクレオシドの製造法 - Google Patents
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Description
本発明は５’−イノシン酸および５’−グアニル酸の合成原料として重要な物質であるイノシンおよびグアノシン等のプリンヌクレオシドの製造法に関する。
発酵法によるイノシンおよびグアノシンの生産に関しては、アデニン要求株である、またはそれにプリンアナログをはじめとする各種の薬剤に対する耐性を付与したバチルス属の微生物（特許文献１〜８）、およびブレビバクテリウム属の微生物（特許文献９〜１０、非特許文献１）等を用いる方法が知られている。
このような変異株を取得するには、従来、紫外線照射やニトロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）処理などの変異誘起処理を行い、適当な選択培地を用いて、目的とする変異株を取得するという方法が行われてきた。一方で、遺伝子工学技術を用いた生産株の育種もバチルス属の微生物（特許文献１１〜２０）、およびブレビバクテリウム属の微生物（特許文献２１）で行われている。
特公昭３８−２３０３９
特公昭５４−１７０３３
特公昭５５−２９５６
特公昭５５−４５１９９
特開昭５６−１６２９９８
特公昭５７−１４１６０
特公昭５７−４１９１５
特開昭５９−４２８９５
特公昭５１−５０７５
特公昭５８−１７５９２
Agric.Biol.Chem., 42, 399(1978)
特開昭５８−１５８１９７
特開昭５８−１７５４９３
特開昭５９−２８４７０
特開昭６０−１５６３８８
特開平１−２７４７７
特開平１−１７４３８５
特開平３−５８７８７
特開平３−１６４１８５
特開平５−８４０６７
特開平５−１９２１６４
特開昭６３−２４８３９４
本発明は、発酵法によってプリンヌクレオシドを製造するために好適な微生物を創製し、それによってプリヌクレオシドの優れた製造法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために、発酵法によりプリンヌクレオシドを製造するために従来用いられてきた微生物とは属を異にするエシェリヒア属細菌にプリンヌクレオシド生産能を付与することを着想し、これを実現することに成功し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、エシェリヒア属に属し、プリンヌクレオシド生産能を有する微生物を提供する。
詳しくは、当該微生物として、プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の細胞内での活性が上昇することによってプリンヌクレオシド生産能を獲得した当該微生物を提供する。より詳しくは、プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の遺伝子の発現量が上昇することによってプリンヌクレオシド生産能を獲得した当該微生物、および、プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の調節が解除されることによってプリンヌクレオシド生産能を獲得した当該微生物を提供する。
プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の調節は、たとえばフィードバック阻害が解除されることによって解除される。
上記プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素とは、たとえばホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）アミドトランスフェラーゼおよびホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）シンセターゼである。
上記プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の調節を解除する手段としては、たとえばプリン・リプレッサーの欠失がある。
さらに本発明は、プリンヌクレオシド生合成から分岐して他の代謝産物にいたる反応が遮断されることによってプリンヌクレオシド生産能を獲得した当該微生物を提供する。
上記プリンヌクレオシド生合成から分岐して他の代謝産物にいたる反応は、たとえばサクシニル−アデノシンモノリン酸（ＡＭＰ）シンターゼ、プリンヌクレオシド・フォスフォリラーゼ、アデノシン・デアミナーゼ、イノシン−グアノシン・キナーゼ、グアノシンモノリン酸（ＧＭＰ）リダクターゼ、６−フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ、フォスフォグルコース・イソメラーゼ、アデニン・デアミナーゼ、キサントシン・フォスフォリラーゼから選ばれる酵素に触媒される反応がある。
さらに、本発明は、プリンヌクレオシドの細胞内へ取り込みを弱化することによってプリンヌクレオシド生産能を強化した当該微生物を提供する。
プリンヌクレオシドの細胞内へ取り込みは、プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応を遮断することによって弱化することができる。上記プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応は、たとえばヌクレオシドパーミアーゼに触媒される反応である。
また本発明は、上記微生物を培地に培養し、プリンヌクレオシドを生成蓄積せしめ、プリンヌクレオシドを回収することを特徴とする発酵法によるプリンヌクレオシドの製造法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）エシェリヒア属に属し、プリンヌクレオシド生産能を有する微生物
本発明にいうエシェリヒア属に属する微生物の例としては、エシェリヒア・コリ(E.coli) 等があげられる。E.coliを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、E.coli K12株及びその誘導体を用いることができる。
本発明にいうエシェリヒア属に属する微生物の例としては、エシェリヒア・コリ(E.coli) 等があげられる。E.coliを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、E.coli K12株及びその誘導体を用いることができる。
本発明にいうプリンヌクレオシドとは、たとえばイノシン、グアノシン、アデノシン等を含む。
本発明にいうプリンヌクレオシド生産能とは、プリンヌクレオシドを培地中に生産蓄積する能力を意味する。また、プリンヌクレオシド生産能を有するとは、そのエシェリヒア属に属する微生物が、E.coliの野生株例えばW3110株よりも多量にプリンヌクレオシドを培地中に生産蓄積することを意味し、好ましくは、後記実施例１に記載した条件で培養して50 mg/L以上、さらに好ましくは100 mg/L以上、さらになお好ましくは200mg/L以上、もっとも好ましくは500 mg/L以上のイノシンを培地中に生産蓄積することを意味する。
エシェリヒア属に属し、プリンヌクレオシド生産能を有する微生物を育種するには、プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の細胞内での活性を上昇させることによる育種、一例として、プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の遺伝子の発現量を上昇させることによる育種を採用できる。あるいは、プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の調節を解除することによる育種も採用できる。
さらに、プリンヌクレオシド生合成から分岐して他の代謝産物にいたる反応が遮断されることによる育種、および、プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みを弱化することによる育種も採用できる。
（２）プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の細胞内での活性が上昇した微生物
エシェリヒア属に属する微生物におけるプリンヌクレオシド生合成に関与する全酵素と、同酵素が触媒する全反応はすでに明らかにされている(Escherichia coli and Salmonella CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY second Edition vol. 1 and vol. 2 ASM PRESS WASHINGTON D.C.)。これら酵素のうち、律速段階となっている反応を触媒する酵素の酵素活性を上昇させることによって、プリンヌクレオシド生産能を付与することができる。そのような律速段階となっている反応を触媒する酵素は、たとえばＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ(PRPP amidotransferase)やＰＲＰＰシンセターゼ(PRPP synthetase)である。
エシェリヒア属に属する微生物におけるプリンヌクレオシド生合成に関与する全酵素と、同酵素が触媒する全反応はすでに明らかにされている(Escherichia coli and Salmonella CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY second Edition vol. 1 and vol. 2 ASM PRESS WASHINGTON D.C.)。これら酵素のうち、律速段階となっている反応を触媒する酵素の酵素活性を上昇させることによって、プリンヌクレオシド生産能を付与することができる。そのような律速段階となっている反応を触媒する酵素は、たとえばＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ(PRPP amidotransferase)やＰＲＰＰシンセターゼ(PRPP synthetase)である。
プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の細胞内での活性を上昇させる手段を、以下例を挙げて説明するが、これらに限定されるものではない。
プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の細胞内での活性を上昇させる手段としては、酵素の遺伝子の発現量を上昇させることが挙げられる。
遺伝子の発現量を上昇させる手段としては、遺伝子の調節領域の改良、遺伝子のコピー数の上昇などが挙げられるが、これらに限定されるものでない。
調節領域の改良とは、遺伝子の転写量を増加させる改変を加えることをいう。たとえばプロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化をおこない下流にある遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモーターに変異を導入する以外にも、lac,trp,tac,trc,PLその他の微生物内で機能するプロモーターを新たに導入してもよい。あるいは、エンハンサーを新たに導入することによって遺伝子の転写量を増加させることができる。染色体ＤＮＡへのプロモーター等の遺伝子の導入については、例えば特開平１−２１５２８０号公報に記載されている。
遺伝子のコピー数の上昇は、具体的には、遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換えＤＮＡを作製し、同組換えＤＮＡを微生物に保持させることによって得られる。ここでベクターとは、プラスミドやファージ等広く用いられているものを含むが、これら以外
にも、トランソポゾン(Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417(1983))やMuファージ（特開平2-109985)も含む。遺伝子を相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染色体に組込んでコピー数を上昇させることも可能である。
にも、トランソポゾン(Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417(1983))やMuファージ（特開平2-109985)も含む。遺伝子を相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染色体に組込んでコピー数を上昇させることも可能である。
エシェリヒア属に属し、プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の遺伝子の発現量の上昇した微生物の誘導に当たっては、主としてE.coliの既知の遺伝子情報に基づき、PCR(polymerase chain reaction)法を用いて必要な遺伝子領域を増幅取得し育種に用いることができる。
たとえばE.coli K12のW3110株（ATCC27325)の染色体DNAよりPCR法を用いてＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるpurFをクローニングする。この際使用する染色体DNAはE.coli由来であればどの菌株でもよい。purFはアデノシンモノリン酸(AMP)やグアノシンモノリン酸(GMP)でフィードバック阻害を受けるＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードする遺伝子を言い、遺伝的多形性などによる変異型も含む。なお、遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異によりタンパク質のアミノ酸配列が一部変化している現象をいう。
プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の細胞内での活性を上昇させる手段としては、酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの活性を上昇させることも挙げられる。
プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の細胞内での活性を上昇させる手段としては、プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の調節を解除することも挙げられる。
プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の調節とは、同酵素の活性を負に制御する仕組みをいい、たとえば生合成経路中間体または最終産物によるフィードバック阻害、アテニュエーション、転写抑制などをさす。微生物が製造したプリンヌクレオシドは、同調節を通じてプリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の活性を阻害し、または、同酵素をコードする遺伝子の発現を抑制する。したがって、微生物にプリンヌクレオシドを生産させるためには同調節を解除することが望ましい。
上記調節を受けるプリンヌクレオシド生合成に関与する酵素は、AMPやGMPでフィードバック阻害を受けるＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼやアデノシンジリン酸(ADP)によるフィードバック阻害を受けるＰＲＰＰシンセターゼがあげられる。そのほか、GMPによるフィードバック阻害をイノシンモノリン酸デヒドロゲナーゼ（IMP dehydrogenase: guaB）とＧＭＰシンセターゼ(GMP synthetase: guaA)とが受けている。また、プリン・オペロン、guaBAは抑制を受けている。
調節を解除する方法としては、酵素をコードする遺伝子またはその調節領域に変異を導入する方法がある。同変異としては、フィードバック阻害を解除する変異があり、これは、通常には、構造遺伝子内の変異である。また、同変異としては、アテニュエーションを解除する変異があり、これは、通常には、アテニュエーター内の変異である。さらに、同変異としては、抑制を解除する変異があり、これは、通常には、リプレッサーと呼ばれる調節タンパク質をコードする遺伝子の変異、またはオペレーター領域内の変異である。
抑制を解除する変異としては、プリン・リプレッサーを不活化させる変異がある。同リプレッサーは、プリンヌクレオチドが多量に存在する条件下でプリンオペロンのオペレーター領域に結合し、結果として同オペロンの転写が抑制される。同リプレッサーの不活化は、抑制の解除につながる。
遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350(1987))、リコンビナントPCR法（PCR Technology, Stockton Press(1989))、特定の部分のDNAを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法がある。また遺伝子の機能を完全に不活化する目的の場合には適当な制限酵素サイトにDNAの付加や欠失を入れる方法がある。
プリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の調節が解除されたものを選択する場合、酵素の発現量を酵素活性を測定することによって調べるか、抗体を用いて調べることができる。また、酵素の調節が解除された変異株を取得する一つの方法として、８−アザアデニンや８−アザグアニンなどのプリンアナログを含む最小培地で生育する菌株を選択し、酵素の発現量や活性の変化を確認する方法がある。
（３）プリンヌクレオシド生合成から分岐して他の代謝産物にいたる反応を遮断することによってプリンヌクレオシド生産能を獲得した微生物
エシェリヒア属に属する微生物のプリンヌクレオシド生合成経路は明らかになっており、プリンヌクレオシド生合成に関与する全酵素と、同酵素が触媒する全反応はすでに明らかにされている(Escherichia coli and Salmonella CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY second Edition vol. 1 and vol. 2 ASM PRESS WASHINGTON D.C.)。これらに加え、他の代謝産物にいたる反応のいくつかは明らかになっている。
エシェリヒア属に属する微生物のプリンヌクレオシド生合成経路は明らかになっており、プリンヌクレオシド生合成に関与する全酵素と、同酵素が触媒する全反応はすでに明らかにされている(Escherichia coli and Salmonella CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY second Edition vol. 1 and vol. 2 ASM PRESS WASHINGTON D.C.)。これらに加え、他の代謝産物にいたる反応のいくつかは明らかになっている。
他の代謝産物にいたる反応が遮断された微生物は、同代謝産物を要求するようになる可能性がある。同代謝産物を要求するようになった微生物を培養するためには、培地に栄養物質として同代謝産物あるいはその中間体（前駆体）を添加する必要がある。したがって、遮断されるべき反応を決定する際には、培地に新たな同代謝産物を添加する必要が生じない反応を選択することが望ましい。
また、他の代謝産物にいたる反応のうち、いかなるものを遮断してもつねにプリンヌクレオシドの生産能が向上するとはかぎらない。微生物がプリンヌクレオシドを生産する時期に、プリンヌクレオシド中間体あるいはプリンヌクレオシドを他の代謝産物に変換する方向の反応が進行している場合に、同反応を遮断することがプリンヌクレオシド生産性向上につながる可能性がある。
プリンヌクレオシド生合成経路から分岐して他の代謝産物にいたる反応のうち、それを遮断することによって実際にプリンヌクレオシド生産性向上につながるものは、プリンヌクレオシド生合成経路図がすでに明らかになっているので、これに基づき予測される。
プリンヌクレオシド生合成から分岐して他の代謝産物にいたる反応を遮断する方法としては、その反応を触媒する酵素を欠失させるか、あるいは、その反応を触媒する酵素を不活化させる方法などがあげられる。酵素を欠失させるには、その酵素をコードする遺伝子を欠失させる方法があげられる。酵素を不活化させるには、その酵素をコードする遺伝子に変異を導入するか、あるいはその酵素を特異的に不活化する薬剤を添加する方法などがある。
プリンヌクレオシド生合成から分岐して他の代謝産物にいたる反応のうち、それを遮断することによって実際にプリンヌクレオシド生産性向上につながるものとしては、サクシニル−ＡＭＰシンターゼ、プリンヌクレオシド・フォスフォリラーゼ、アデノシン・デアミナーゼ、イノシン−グアノシン・キナーゼ、ＧＭＰリダクターゼ、６−フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ、フォスフォグルコース・イソメラーゼ、アデニン・デアミナーゼ、キサントシン・フォスフォリラーゼから選ばれる酵素に触媒される反応があげられる。
例えば、IMPからサクシニルAMPへの分岐を遮断し、かつイノシンからヒポキサンチンへの転換を遮断すると、同遮断の結果IMPはAMPへ転換されることがなくなり、かつイノシンからヒポキサンチンへ転換されることがなくなる。そして、イノシンが蓄積されることが予想される。これらの有効性を確認するためには目的に応じて取得した変異株を培養してイノシンの生産性を見ればよい。
後述の実施例では、E. coliにおいてサクシニル−ＡＭＰシンターゼ遺伝子（purA 遺伝子）を破壊してアデニン要求性を付与したとき、E. coliのアデニン要求株を生育させるのにアデニンないしはアデノシン等のAMP系物質の培地への添加が必要となった。しかし、これらの添加物質は、E. coliにおいてはただちにイノシンあるいはヒポキサンチンに転換され、AMP系物質の消化により、一定のところで生育が停止してしまう性質が見いだされた。そこでその生育を維持させる手段として、E. coliの代謝経路から判断してアデノシンからイノシンへの転換に関与するアデノシン・デアミナーゼあるいはアデニンからヒポキサンチンへの転換に関与するアデニン・デアミナーゼを不活化する必要性が予測された。このようにして、アデノシン・デアミナーゼあるいはアデニン・デアミナーゼの不活化による効果は確認され、イノシンの蓄積向上効果が観察された。
またＧＭＰレダクターゼはＧＭＰをＩＭＰに転換する反応に関わるが、ＧＭＰレダクターゼを不活化することによりグアノシンの生産性向上が予想される。後述の実施例に示すように若干のグアノシン蓄積向上が認められた。
またプリンヌクレオシドを生産するのにグルコース等の炭素源が使用されるが、使用する炭素源や培養条件により、プリンヌクレオシド生合成にいたる糖代謝系に差違が生じることが知られている。それゆえ、プリンヌクレオシド生合成へと代謝系を有利に導くために、ペントースリン酸経路を優先させるように他への分岐を遮断することが考えられる。その手段として、６−フォスフォグルコン酸デヒドラーゼやフォスフォグルコース・イソメラーゼを不活化することを行ったところ、そのイノシン生産への有効性が確認された。
（４）プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みを弱化することによってプリンヌクレオシドの生産能を獲得した微生物
細胞外に排出したプリンヌクレオシドをふたたび細胞内へ取り込むことはプリンヌクレオシドを蓄積する上では、エネルギー的に不合理なことと考えられるので、プリンヌクレオシドの取り込みを弱化することは有効なことである。
細胞外に排出したプリンヌクレオシドをふたたび細胞内へ取り込むことはプリンヌクレオシドを蓄積する上では、エネルギー的に不合理なことと考えられるので、プリンヌクレオシドの取り込みを弱化することは有効なことである。
プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みを弱化させる手段としては、プリンヌクレオシドの細胞透過性に関与する反応を遮断することが挙げられる。反応の遮断は上記（３）に説明したのと同様にして行うことができる。
例えば、プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与するパーミアーゼの一つであるヌクレオシドパーミアーゼを不活化することによってイノシンの蓄積向上効果が観察された。
（５）プリンヌクレオシドの製造法
プリンヌクレオシド生産能を獲得した微生物を用いて発酵法によってプリンヌクレオシドを製造する方法を以下説明する。
プリンヌクレオシド生産能を獲得した微生物を用いて発酵法によってプリンヌクレオシドを製造する方法を以下説明する。
使用するプリンヌクレオシド生産用培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地でよい。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハ
ロース、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養素としては、ビタミンB1等のビタミン類、アデニンやRNA等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
ロース、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養素としては、ビタミンB1等のビタミン類、アデニンやRNA等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
培養は好気的条件下で１６〜７２時間程度実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中pHは５〜８に制御する。なお、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニアガス等を使用することができる。
発酵液からのプリンヌクレオシドの採取は通常、イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組合せることにより実施できる。
（６）プリンヌクレオシド生産菌の具体例
まずエシェリヒア・コリ(E.coli) K12のW3110株（ATCC27325)の染色体DNAよりPCR法を用いてＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ(PRPP amidotransferase)をコードする遺伝子であるpurF、プリン・リプレッサー（purine repressor)をコードする遺伝子であるpurR、プリンヌクレオシド・フォスフォリラーゼ（purine nucleoside phosphorylase)をコードする遺伝子であるdeoD、サクシニル−ＡＭＰシンターゼ（succinyl-AMP synthase)をコードする遺伝子であるpurA、アデノシン・デアミナーゼ（adenosine deaminase)をコードする遺伝子であるadd、イノシン−グアノシン・キナーゼ(inosine-guanosine kinase)をコードする遺伝子であるgsk、ＧＭＰレダクターゼ(GMP reductase)をコードする遺伝子であるguaC、６−フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ(6-phosphogluconate dehydrase)をコードする遺伝子であるedd、フォスフォグルコース・イソメラーゼ(phophoglucose isomerase)をコードする遺伝子であるpgi、アデニン・デアミナーゼ(adenine deaminase)をコードする遺伝子であるyicP、ＰＲＰＰシンセターゼ(PRPP synthetase)をコードする遺伝子であるprs、キサントシン・フォスフォリラーゼ(xanthosine phosphorylase)をコードする遺伝子であるxapAおよびヌクレオシド・パーミアーゼ(nucleoside permiase)をコードする遺伝子であるnupGをクローニングし、これらの遺伝子をそれぞれの目的に応じて変異させる。この際使用する染色体DNAはE.coli由来であればどの菌株でもよい。
まずエシェリヒア・コリ(E.coli) K12のW3110株（ATCC27325)の染色体DNAよりPCR法を用いてＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ(PRPP amidotransferase)をコードする遺伝子であるpurF、プリン・リプレッサー（purine repressor)をコードする遺伝子であるpurR、プリンヌクレオシド・フォスフォリラーゼ（purine nucleoside phosphorylase)をコードする遺伝子であるdeoD、サクシニル−ＡＭＰシンターゼ（succinyl-AMP synthase)をコードする遺伝子であるpurA、アデノシン・デアミナーゼ（adenosine deaminase)をコードする遺伝子であるadd、イノシン−グアノシン・キナーゼ(inosine-guanosine kinase)をコードする遺伝子であるgsk、ＧＭＰレダクターゼ(GMP reductase)をコードする遺伝子であるguaC、６−フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ(6-phosphogluconate dehydrase)をコードする遺伝子であるedd、フォスフォグルコース・イソメラーゼ(phophoglucose isomerase)をコードする遺伝子であるpgi、アデニン・デアミナーゼ(adenine deaminase)をコードする遺伝子であるyicP、ＰＲＰＰシンセターゼ(PRPP synthetase)をコードする遺伝子であるprs、キサントシン・フォスフォリラーゼ(xanthosine phosphorylase)をコードする遺伝子であるxapAおよびヌクレオシド・パーミアーゼ(nucleoside permiase)をコードする遺伝子であるnupGをクローニングし、これらの遺伝子をそれぞれの目的に応じて変異させる。この際使用する染色体DNAはE.coli由来であればどの菌株でもよい。
purFに導入する変異とは、purFを破壊するための変異と、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼのフィードバック阻害を解除するための変異である。purRに導入する変異とは、purRを破壊するための変異である。deoDに導入する変異とは、deoDを破壊するための変異である。purAに導入する変異とは、purAを破壊するための変異である。addに導入する変異とは、addを破壊するための変異である。gskに導入する変異とは、gskを破壊するための変異である。
guaCに導入する変異とは、guaCを破壊するための変異である。eddに導入する変異とは、eddを破壊するための変異である。pgiに導入する変異とは、pgiを破壊するための変異である。yicPに導入する変異とは、yicPを破壊するための変異である。prsに導入する変異とは、ＰＲＰＰシンセターゼのフィードバック阻害を解除するための変異である。xapAに導入する変異とは、xapAを破壊するための変異である。nupGに導入する変異とは、nupGを破壊するための変異である。
遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350(1987))、リコンビナントPCR法（PCR Technology, Stock
ton Press(1989))、特定の部分のDNAを化学合成する方法あるいは当該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤処理をする方法がある。また遺伝子の機能を完全に不活化する目的の場合には適当な制限酵素サイトにDNAの付加や欠失を入れる方法がある。
ton Press(1989))、特定の部分のDNAを化学合成する方法あるいは当該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤処理をする方法がある。また遺伝子の機能を完全に不活化する目的の場合には適当な制限酵素サイトにDNAの付加や欠失を入れる方法がある。
次に、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼおよびＰＲＰＰシンセターゼのフィードバック阻害を解除するための変異が導入されたpurFおよびprsを組換えDNAとして適当な微生物に導入し、発現させることにより、フィードバック阻害が実質的に解除されたＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子(purF)およびＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子(prs)を保有する微生物を取得する。以上の方法で取得される組換えDNAとは、フィードバック阻害を解除したＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子(purF)およびＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子(prs)等の有用遺伝子をパッセンジャーとして、プラスミドやファージDNAのベクターに組込んだものをいう。その際、該有用遺伝子の発現を効率的に実施するために、lac,trp,tac,trc,PLその他の微生物内で機能するプロモーターを用いてもよい。
なお、ここでいう組換えDNAには、該有用遺伝子をトランスポゾン(Berg,D.E. and Berg,C.M., Bio/Technol., 1, 417(1983))、Muファージ（特開平2-109985)または相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染色体に組込んだものも含まれる。
相同組換え用プラスミドとしては、温度感受性複製起点を有するプラスミドが使用される。温度感受性複製起点を有するプラスミドは、許容温度（permissive temperature）、例えば30℃付近では複製できるが、非許容温度（non-permissive temperature）、例えば37℃〜42℃では複製できない。温度感受性複製起点を有するプラスミドを用いた相同組換え法では、必要に応じて、許容温度でプラスミドを複製させたり、非許容温度でプラスミドを宿主から脱落させたりすることができる。後述の実施例では、相同組換え用プラスミドとして、pMAN997を使用したが、pMAN997はpMAN031(J.Bacteriol., 162, 1196(1985))とpUC19（宝酒造社製）のそれぞれVspＩ-HindIII断片を繋ぎ換えたものである（図１）。
また相同組換え法(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab.(1972))を用いて染色体上の特定の遺伝子機能を不活化し、プリンヌクレオシドの生産能を向上させた。不活化される遺伝子とは、その不活化によってプリンヌクレオシド生合成に関与する酵素の遺伝子の発現量が上昇するものである。具体的には、染色体上のプリン・リプレッサー遺伝子(purR)を破壊してＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子(purF)を始めとするプリンヌクレオチド生合成遺伝子の発現抑制機構の解除を行った。
さらに、プリンヌクレオシド生合成から分岐して他の代謝産物にいたる反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を破壊した。具体的には、プリンヌクレオシド・フォスフォリラーゼ遺伝子(deoD）を破壊して、イノシンおよびグアノシンのヒポキサンチンおよびグアニンへの分解を抑制した。また、サクシニル−ＡＭＰシンターゼ遺伝子(purA)を破壊して、アデニン要求性を付与した。さらに、アデノシン・デアミナーゼ遺伝子(add)を破壊してアデノシンからイノシンへの転換を抑制した。イノシン−グアノシン・キナーゼ遺伝子(gsk)を破壊してイノシンおよびグアノシンからIMPおよびGMPへの転換を抑制した。ＧＭＰリダクターゼ遺伝子(guaC)を破壊してGMPからIMPへの転換を抑制した。6-フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ遺伝子(edd)を破壊して、糖がエントナー−ドゥドロフ(Entner-Doudoroff)経路で代謝されるのを抑制した。フォスフォグルコース・イソメラーゼ遺伝子(pgi)を破壊して、糖が解糖経路で代謝されるのを抑制し、ペントースリン酸経路への流入を計った。アデニン・デアミナーゼ遺伝子(yicP)を破壊し、アデニンからヒポキサンチンへの転換を抑制した。キサントシン・フォスフォリラーゼ遺伝子(xapA)を破壊して、キサントシンからキサンチンへの誘導分解を抑制するとともにイノシンやグアノシンのヒポキサンチンやグアニンへの分解を抑制した。もちろん、当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照
射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤処理して、目的の遺伝子の機能を不活化することも行われる。
射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤処理して、目的の遺伝子の機能を不活化することも行われる。
組換えDNAを有する微生物としては、該ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ等の目的の酵素をコードする遺伝子が発現するエシェリヒア属に属する微生物を用いた。
また該ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子(purF)の効率的活用のために他の有用遺伝子、例えばPRPPからIMP生合成に関わるpurF以外の遺伝子(purD,purT,purL,purM,purK,purE,purC,purB,purH)、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ遺伝子(guaB)、ＧＭＰシンセターゼ遺伝子(guaA)やＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子(prs)等と組合せて利用するとよい。その際、これらの有用遺伝子は該ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子(purF)と同じく、宿主の染色体上に存在しても、プラスミドやファージ上に存在してもよい。
以上の方法で取得されるpurA（サクシニル−ＡＭＰシンターゼ遺伝子）欠失、および／またはdeoD（プリンヌクレオシド・フォスフォリラーゼ遺伝子）欠失、および／またはpurR（プリン・リプレッサー遺伝子）欠失、および／または脱感作型purF（ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子）、および／またはadd（アデノシン・デアミナーゼ遺伝子）欠失、および／またはgsk（イノシン−グアノシン・キナーゼ遺伝子）欠失、および／またはguaC（ＧＭＰリダクターゼ遺伝子）欠失、および／またはedd（6-フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ遺伝子）欠失、および／またはpgi（フォスフォグルコース・イソメラーゼ遺伝子）欠失、および／またはyicP（アデニン・デアミナーゼ遺伝子）欠失、および／またはxapA（キサントシン・フォスフォリラーゼ遺伝子）欠失、および／またはnupG（ヌクレオシドパーミアーゼ遺伝子）欠失を有する微生物、あるいは脱感作型ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子(purF)、および／または脱感作型prs（ＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子）を含む組換えDNAで形質転換された本微生物を培養し、培養液に目的のイノシンおよびグアノシン等のプリンヌクレオシドを生成蓄積せしめ、これを採取する。
[実施例１]
1)ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子(purF)欠失株の取得
E. coli K12のW3110株(ATCC27325)の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（GenBank Accession No.M26893）の情報に基づき作製された、CTCCTGCAGAACGAGGAAAAAGACGTATG（配列番号１）とCTCAAGCTTTCATCCTTCGTTATGCATTTCG（配列番号２）の塩基配列を有する29merと31merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min;
30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと翻訳終止コドンをカバーするpurF構造遺伝子領域の約1530bpの増幅断片をpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にクローン化した。本ベクターにはPCR産物増幅断片をそのままクローニングすることができ、また、クローニングサイトの両近傍に制限酵素サイトとしてEcoRIサイトが存在する。またPCR用プライマーにはPstIサイトとHindIIIサイトがそれぞれデザインされている。
1)ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子(purF)欠失株の取得
E. coli K12のW3110株(ATCC27325)の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（GenBank Accession No.M26893）の情報に基づき作製された、CTCCTGCAGAACGAGGAAAAAGACGTATG（配列番号１）とCTCAAGCTTTCATCCTTCGTTATGCATTTCG（配列番号２）の塩基配列を有する29merと31merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min;
30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと翻訳終止コドンをカバーするpurF構造遺伝子領域の約1530bpの増幅断片をpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にクローン化した。本ベクターにはPCR産物増幅断片をそのままクローニングすることができ、また、クローニングサイトの両近傍に制限酵素サイトとしてEcoRIサイトが存在する。またPCR用プライマーにはPstIサイトとHindIIIサイトがそれぞれデザインされている。
クローン化された1530bpのpurF断片の5'側から約880bpの位置にBglIIサイトが１ヶ所あるが、pCRTMIIベクターそのものにもBglIIサイトが１ヶ所あるので、プラスミドをBglIIで部分消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化した後に、T4 DNA リガーゼで連結した。このライゲイション液でE.coli HB101のコンピテント細胞(competent cell)を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB(トリプトン 1％,イーストエキストラクト 0.5％,NaCl 0.1％,グルコース 0.1％,pH7)寒天プレートに生育する形質転換体を得た。18クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からEcoRI消化で約1550bpの断片が得られ、かつBglIIで本断片が切断されないプラスミドDNA(pCRTMIIpurF'#14)を選択した。本プラスミドDNAが有するpurFはBglIIサイトでフレームシフトが生じることになり、コード
される酵素は機能を持たなくなると予測される（図２）。
される酵素は機能を持たなくなると予測される（図２）。
次に、pCRTMIIpurF'#14をEcoRＩ消化し、purFを含む約1.6Kbの断片を調製した。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（図１に示されるように、pMAN031(J.Bacteriol., 162, 1196(1985))とpUC19（宝酒造社製）のそれぞれVspＩ-HindIII断片を繋ぎ換えたもの）のEcoRＩサイトに挿入し、プラスミドpMAN997purF'#14を得た。プラスミドpMAN997purF'#14でE.coli W3110株（野生株）を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクローンの中から最小培地(1L当たりNa2HPO4 6.8g, KH2PO4 3g, NaCl 0.5g, NH4Cl 1g, MgSO4・7H2O 0.5g, CaCl2・2H2O 15mg, チアミンHCl 2mg, グルコース 0.2g)に生育せず、ヒポキサンチン 50mg/L添加最小培地には生育するクローンを選択した。さらにはこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRによりpurFを含む約1.5kb断片を増幅させ、BglIIで切断されないことを確認した。以上を満足するクローンをpurF欠失株とし、ここではF-2-51株およびF-1-72株とした。
2)サクシニル−ＡＭＰシンターゼ遺伝子(purA)欠失株の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（GenBank Accession No.J04199）の情報に基づき作製された、CTCGAGCTCATGGGTAACAACGTCGTCGTAC（配列番号３）とCTCGTCGACTTACGCGTCGAACGGGTCGCGC（配列番号４）の塩基配列を有する31merと31merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするpurA構造遺伝子領域の約1300bpの増幅断片をpUC18ベクター（宝酒造社製）のSacＩサイトとSalＩサイトの間にクローン化した。なお、PCR用プライマーにはSacIサイトとSalIサイトがそれぞれデザインされている。クローン化されたpurA断片の約1300bpの5'側から約520bpと710bpの位置にそれぞれHpaＩおよびSnaBＩサイトが１ヶ所あるのでプラスミドをHpaＩおよびSnaBＩで消化し、約190bp断片を除去したものを得る目的でT4 DNA リガーゼで連結した。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。18クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からFspＩでは切断せず、SacＩおよびSalＩでの切断で約1100bpの断片が得られるプラスミドDNA(pUC18purA'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するpurAはHpaＩおよびSnaBＩサイトの間で欠失が生じることになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図２）。
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（GenBank Accession No.J04199）の情報に基づき作製された、CTCGAGCTCATGGGTAACAACGTCGTCGTAC（配列番号３）とCTCGTCGACTTACGCGTCGAACGGGTCGCGC（配列番号４）の塩基配列を有する31merと31merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするpurA構造遺伝子領域の約1300bpの増幅断片をpUC18ベクター（宝酒造社製）のSacＩサイトとSalＩサイトの間にクローン化した。なお、PCR用プライマーにはSacIサイトとSalIサイトがそれぞれデザインされている。クローン化されたpurA断片の約1300bpの5'側から約520bpと710bpの位置にそれぞれHpaＩおよびSnaBＩサイトが１ヶ所あるのでプラスミドをHpaＩおよびSnaBＩで消化し、約190bp断片を除去したものを得る目的でT4 DNA リガーゼで連結した。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。18クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からFspＩでは切断せず、SacＩおよびSalＩでの切断で約1100bpの断片が得られるプラスミドDNA(pUC18purA'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するpurAはHpaＩおよびSnaBＩサイトの間で欠失が生じることになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図２）。
次に、pUC18purA'#1をSacＩとSalＩ消化し、purAを含む約1.1Kbの断片を調製した。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）のSacＩサイトとSalＩサイトの間に挿入し、プラスミドpMAN997purA'#1を得た。プラスミドpMAN997purA'#1でF-2-51株（purF-）を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天
プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクローンの中からヒポキサンチン 50mg/L添加最小培地に生育せず、アデニン 50mg/L添加最小培地には生育するクローンを選択した。さらにはこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRによりpurA約1.1kb断片を増幅させ、野生型(約1.3kb)よりサイズが小さいこと、およびFspＩで切断されないことを確認した。以上を満足するクローンをpurA欠失株とし、ここではFA-31株とした。
プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクローンの中からヒポキサンチン 50mg/L添加最小培地に生育せず、アデニン 50mg/L添加最小培地には生育するクローンを選択した。さらにはこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRによりpurA約1.1kb断片を増幅させ、野生型(約1.3kb)よりサイズが小さいこと、およびFspＩで切断されないことを確認した。以上を満足するクローンをpurA欠失株とし、ここではFA-31株とした。
3)プリンヌクレオシド・フォスフォリラーゼ遺伝子(deoD)欠失株の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）において「deoD」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTCGACGCGGGTCTGGAACTGTTCGAC（配列番号５）とCTCGCATGCCCGTGCTTTACCAAAGCGAATC（配列番号６）の塩基配列を有する30merと31merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと翻訳終止コドンをカバーするdeoD構造遺伝子領域を含む約1350bpの増幅断片をpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にクローン化した。本ベクターにはクローニングサイトの両近傍に制限酵素サイトとしてEcoRIサイトが存在する。またPCR用プライマーにはSalＩサイトとSphＩサイトがそれぞれデザインされている。クローン化されたdeoD断片の約1350bpの5'側から約680bpの位置にHpaＩサイトが１ヶ所あるのでプラスミドをHpaＩで消化し、消化されたプラスミドと10merのClaＩリンカーとを混合してT4 DNA リガーゼ反応を行った。この結果、HpaIサイトにClaIサイトが挿入された。このライゲイション液でE.coli HB101のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。16クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からHpaＩでは切断せず、ClaＩで切断されるプラスミドDNA(pCRTMIIdeoD'#16)を選択した。本プラスミドDNAが有するdeoDはHpaＩサイトでフレームシフトが生じることになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図２）。
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）において「deoD」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTCGACGCGGGTCTGGAACTGTTCGAC（配列番号５）とCTCGCATGCCCGTGCTTTACCAAAGCGAATC（配列番号６）の塩基配列を有する30merと31merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと翻訳終止コドンをカバーするdeoD構造遺伝子領域を含む約1350bpの増幅断片をpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にクローン化した。本ベクターにはクローニングサイトの両近傍に制限酵素サイトとしてEcoRIサイトが存在する。またPCR用プライマーにはSalＩサイトとSphＩサイトがそれぞれデザインされている。クローン化されたdeoD断片の約1350bpの5'側から約680bpの位置にHpaＩサイトが１ヶ所あるのでプラスミドをHpaＩで消化し、消化されたプラスミドと10merのClaＩリンカーとを混合してT4 DNA リガーゼ反応を行った。この結果、HpaIサイトにClaIサイトが挿入された。このライゲイション液でE.coli HB101のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。16クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からHpaＩでは切断せず、ClaＩで切断されるプラスミドDNA(pCRTMIIdeoD'#16)を選択した。本プラスミドDNAが有するdeoDはHpaＩサイトでフレームシフトが生じることになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図２）。
次に、pCRTMIIdeoD'#16をEcoRＩ消化し、deoDを含む約1.35Kbの断片を調製した。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）のEcoRＩサイトに挿入し、プラスミドpMAN997deoD'#16を得た。プラスミドpMAN997deoD'#16でF-1-72株（purF-）およびFA-31株(purF-,purA-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクローンをイノシン 1g/L添加LB培地に生育させ
、これらの培養液を薄層クロマトグラムにより分析して、イノシンがヒポキサンチンに分解していないクローンを選択した。さらにはこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRによりdeoDを含む約1.35kb断片を増幅させ、ClaＩで切断されるがHpaＩで切断されないことを確認した。以上を満足するクローンをdeoD欠失株とし、F-1-72株（purF-）およびFA-31株(purF-,purA-)由来のものをそれぞれFD-6株およびFAD-25株とした。
、これらの培養液を薄層クロマトグラムにより分析して、イノシンがヒポキサンチンに分解していないクローンを選択した。さらにはこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRによりdeoDを含む約1.35kb断片を増幅させ、ClaＩで切断されるがHpaＩで切断されないことを確認した。以上を満足するクローンをdeoD欠失株とし、F-1-72株（purF-）およびFA-31株(purF-,purA-)由来のものをそれぞれFD-6株およびFAD-25株とした。
4)プリン・リプレッサー遺伝子(purR)欠失株の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）において「purR」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTCGACGAAAGTAGAAGCGTCATCAG（配列番号７）とCTCGCATGCTTAACGACGATAGTCGCGG（配列番号８）の塩基配列を有する29merと28merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするpurR構造遺伝子領域およびATGの5'上流域約800bpを含む約1.8kbの増幅断片をpUC19ベクター（宝酒造社製）のSalＩサイトおよびSphＩサイトの間にクローン化した。PCR用プライマーにはSalＩサイトとSphＩサイトがそれぞれデザインされており、このサイトがクローニングに利用された。クローン化されたpurR断片の約1.8kbの5'側から約810bpの位置にPmaCＩサイト（purR構造遺伝子領域でのＮ末端近傍）が１ヶ所あるのでプラスミドをPmaCＩで消化した。消化されたプラスミドと8merのBglIIリンカーを混合してT4 DNA リガーゼ反応を行った。この結果、PmaCIサイトにBglIIサイトが挿入された。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からPmaCＩでは切断せず、BglIIで切断されるプラスミドDNA(pUC19purR'#2)を選択した。本プラスミドDNAが有するpurRはPmaCＩサイトでフレームシフトが生じることになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図２）。
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）において「purR」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTCGACGAAAGTAGAAGCGTCATCAG（配列番号７）とCTCGCATGCTTAACGACGATAGTCGCGG（配列番号８）の塩基配列を有する29merと28merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするpurR構造遺伝子領域およびATGの5'上流域約800bpを含む約1.8kbの増幅断片をpUC19ベクター（宝酒造社製）のSalＩサイトおよびSphＩサイトの間にクローン化した。PCR用プライマーにはSalＩサイトとSphＩサイトがそれぞれデザインされており、このサイトがクローニングに利用された。クローン化されたpurR断片の約1.8kbの5'側から約810bpの位置にPmaCＩサイト（purR構造遺伝子領域でのＮ末端近傍）が１ヶ所あるのでプラスミドをPmaCＩで消化した。消化されたプラスミドと8merのBglIIリンカーを混合してT4 DNA リガーゼ反応を行った。この結果、PmaCIサイトにBglIIサイトが挿入された。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からPmaCＩでは切断せず、BglIIで切断されるプラスミドDNA(pUC19purR'#2)を選択した。本プラスミドDNAが有するpurRはPmaCＩサイトでフレームシフトが生じることになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図２）。
次に、pUC19purR'#2をSacＩとSphＩで消化し、purRを含む約1.8Kbの断片を調製した。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）のSacＩサイトとSphＩサイトの間に挿入し、プラスミドpMAN997purR'#2を得た。プラスミドpMAN997purR'#2でFD-6株（purF-,deoD-）およびFAD-25株(purF-,purA-,deoD-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクローンの中から10クローンを無作為に選び、これらの染色体DNAからPCRによりpurRを含む約1.8kb断片を増幅させ、BglIIで切断されるがPmaCＩで切断されないクローンを選択した。これらのクローンをpurR欠失株とし、FD-6株（purF-,deoD-）およびFAD-25株(purF-,purA-,deoD-)由来のものをそれぞれFDR-18株およびFADR-8株とした。なお、purRが破壊された株では、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ活性がpurR非破壊株に比べて増大していることが、deoDおよびpurRが欠失したpurF+株や、purA、deoDおよびpurRが欠失したpurF+株を用いて確認された。ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ活性の測定はL.J.Messengerら(J.Biol.Chem., 254, 3382(1979))の方法に従って行った。
5)脱感作型ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ遺伝子(purF)の作製
1)でpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にクローン化した約1530bpのpurFを搭載したプラスミドよりPstＩとHindIIIでの消化によりpurF断片を切り出し、変異導入用プラスミドpKF18（宝酒造社製）のマルチクローニングサイトのPstＩサイトとHindIIIサイトの間に挿入し直し、目的のクローンを得た(pKFpurF)。G.Zhouら(J.Biol.Chem., 269, 6784(1994))により、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ(PurF)の326位のLys(K)がGln(Q)に変異したもの、さらに410位のPro(P)がTrp(W)に変異したものがいずれもGMPおよびAMPのフィードバック阻害に対して脱感作されていることが示されている。そこで、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ(PurF)の326位のLys(K)をGln(Q)に、410位のPro(P)をTrp(W)に変異できるような遺伝子置換を行うために以下の合成DNAプライマーを作製し、Site-directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km（宝酒造社製）のプロトコールに従って、pKFpurFに部位特異的変異を導入した。
1)でpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にクローン化した約1530bpのpurFを搭載したプラスミドよりPstＩとHindIIIでの消化によりpurF断片を切り出し、変異導入用プラスミドpKF18（宝酒造社製）のマルチクローニングサイトのPstＩサイトとHindIIIサイトの間に挿入し直し、目的のクローンを得た(pKFpurF)。G.Zhouら(J.Biol.Chem., 269, 6784(1994))により、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ(PurF)の326位のLys(K)がGln(Q)に変異したもの、さらに410位のPro(P)がTrp(W)に変異したものがいずれもGMPおよびAMPのフィードバック阻害に対して脱感作されていることが示されている。そこで、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ(PurF)の326位のLys(K)をGln(Q)に、410位のPro(P)をTrp(W)に変異できるような遺伝子置換を行うために以下の合成DNAプライマーを作製し、Site-directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km（宝酒造社製）のプロトコールに従って、pKFpurFに部位特異的変異を導入した。
K326Q変異用プライマー：5'-GGGCTTCGTT CAG AACCGCTATGTTGG-3'（配列番号９）
P410W変異用プライマー：5'-TATGGTATTGATATG TGG AGCGCCACGGAAC-3'（配列番号１０）
P410W変異用プライマー：5'-TATGGTATTGATATG TGG AGCGCCACGGAAC-3'（配列番号１０）
変異導入操作後、得られた形質転換体のそれぞれ6クローンずつをランダムにピックアップし、プラスミドを調製し、変異導入個所周辺の塩基配列を解析した結果、目的のものが得られたことが確認された。得られたプラスミドはそれぞれpKFpurFKQおよびpKFpurFPWとした。さらにpKFpurFKQにP410W(410Pro→Trp)の変異を同じ方法で導入し、二つの変異を同時に持つ変異型プラスミドpKFpurFKQPWも作製した。また本pKFpurFKQ、pKFpurFPW、およびpKFpurFKQPWはpKF18由来のlacp/o（ラクトースオペロンのプロモーター）の下流に変異型（脱感作型）のpurFが挿入されており、本プロモーターの支配下にpurFが発現する。
またこれらのプラスミドでE.coli JM109を形質転換した組換え体をLB液体培地で8時間培養した後に菌体を集め、粗酵素抽出液を調製した。これらのＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ活性およびAMPやGMPによる阻害度の測定をL.J.Messengerら(J.Biol.Chem., 254,
3382(1979))の方法に従って行った。その結果を表１に示す。
3382(1979))の方法に従って行った。その結果を表１に示す。
6)変異型purFプラスミド導入株のプリンヌクレオシド生産能評価
4)で作製したFDR-18株(purF-,deoD-,purR-)およびFADR-8株(purF-,purA-,deoD-,purR-)にpKFpurFKQおよびpKFpurFKQPWを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。
4)で作製したFDR-18株(purF-,deoD-,purR-)およびFADR-8株(purF-,purA-,deoD-,purR-)にpKFpurFKQおよびpKFpurFKQPWを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。
以下に、プリンヌクレオシド生産能の評価のための、プリンヌクレオシド生産用の基本
培地および培養方法ならびに分析方法を示す。
培地および培養方法ならびに分析方法を示す。
1.基本培地：ＭＳ培地
最終濃度
グルコース 40 g/L（別殺菌）
(NH4)2SO4 16 g/L
KH2PO4 1 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
FeSO4・7H2O 0.01 g/L
MnSO4・4H2O 0.01 g/L
イーストエキストラクト 2 g/L
CaCO3 30 g/L（別殺菌）
最終濃度
グルコース 40 g/L（別殺菌）
(NH4)2SO4 16 g/L
KH2PO4 1 g/L
MgSO4・7H2O 1 g/L
FeSO4・7H2O 0.01 g/L
MnSO4・4H2O 0.01 g/L
イーストエキストラクト 2 g/L
CaCO3 30 g/L（別殺菌）
２．培養方法
リフレッシュ(refresh)培養；保存状態の菌を接種
LB寒天培地（必要に応じて薬剤添加）
37℃、一晩
種(seed)培養；リフレッシュ培養した菌を接種
LB液体培地（必要に応じて薬剤添加）、37℃、一晩
主(main)培養；種培養液体培地から2％接種
MS培地（必要に応じてアデニン、薬剤添加)
37℃、20ml/500ml容坂口フラスコ
リフレッシュ(refresh)培養；保存状態の菌を接種
LB寒天培地（必要に応じて薬剤添加）
37℃、一晩
種(seed)培養；リフレッシュ培養した菌を接種
LB液体培地（必要に応じて薬剤添加）、37℃、一晩
主(main)培養；種培養液体培地から2％接種
MS培地（必要に応じてアデニン、薬剤添加)
37℃、20ml/500ml容坂口フラスコ
３．分析方法
培養液500μlを経時的にサンプリングし、15,000rpmで、5分間遠心し、その上清液をH2Oにて4倍希釈後、HPLC分析する。特記しない限り３日間培養後の培地当たりのプリンヌクレオシド蓄積量として評価する。
分析条件：
カラム : Asahipak GS-220 (7.6mmID×500mmL)
緩衝液 : 0.2M NaH2PO4(pH3.98) リン酸にてpH調整
温度 : 55℃
流速 : 1.5ml/min
検出 : UV254nm
保持時間 (min)
イノシン 16.40
ヒポキサンチン 19.27
グアノシン 20.94
グアニン 23.55
アデニン 24.92
アデノシン 26.75
培養液500μlを経時的にサンプリングし、15,000rpmで、5分間遠心し、その上清液をH2Oにて4倍希釈後、HPLC分析する。特記しない限り３日間培養後の培地当たりのプリンヌクレオシド蓄積量として評価する。
分析条件：
カラム : Asahipak GS-220 (7.6mmID×500mmL)
緩衝液 : 0.2M NaH2PO4(pH3.98) リン酸にてpH調整
温度 : 55℃
流速 : 1.5ml/min
検出 : UV254nm
保持時間 (min)
イノシン 16.40
ヒポキサンチン 19.27
グアノシン 20.94
グアニン 23.55
アデニン 24.92
アデノシン 26.75
なお、purA-(アデニン要求性）の菌株についてはMS培地にアデニン 5mg/Lが添加される。
プリンヌクレオシド生産能の評価結果を表２に示す。変異型purFプラスミド導入株では、痕跡量(trace)の生産しか認められないW3110株（野生株）に比べ、優位なイノシンの生産が認められた。
[実施例２]
1)アデノシン・デアミナーゼ遺伝子(add)欠失株の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）において「add」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTCGACGGCTGGATGCCTTACGCATC（配列番号１１）とCTCGCATGCAGTCAGCACGGTATATCGTG（配列番号１２）の塩基配列を有する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするadd構造遺伝子領域およびATGの5'上流域約420bpおよび翻訳終止コドンの下流域約370bpを含む約1.8kbの増幅断片をpUC19ベクター（宝酒造社製）のSalＩサイトとSphＩサイトの間にクローン化した。PCR用プライマーにはSalＩサイトとSphＩサイトがそれぞれデザインされており、このサイトをクローニングに利用した。クローン化されたadd断片の約1.8kbの5'側から約880bpの位置にStuＩサイトが１ヶ所あるのでプラスミドをStuＩで消化した。消化されたプラスミドと8merのBglIIリンカーとを混合し、T4 DNAリガーゼ反応を行った。この結果、StuIサイトにBglIIサイトが挿入された。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からStuＩでは切断されず、BglIIで切断されるプラスミドDNA(pUC19add'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するaddはStuＩサイトでフレームシフトが生じることになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図２）。
1)アデノシン・デアミナーゼ遺伝子(add)欠失株の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）において「add」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTCGACGGCTGGATGCCTTACGCATC（配列番号１１）とCTCGCATGCAGTCAGCACGGTATATCGTG（配列番号１２）の塩基配列を有する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするadd構造遺伝子領域およびATGの5'上流域約420bpおよび翻訳終止コドンの下流域約370bpを含む約1.8kbの増幅断片をpUC19ベクター（宝酒造社製）のSalＩサイトとSphＩサイトの間にクローン化した。PCR用プライマーにはSalＩサイトとSphＩサイトがそれぞれデザインされており、このサイトをクローニングに利用した。クローン化されたadd断片の約1.8kbの5'側から約880bpの位置にStuＩサイトが１ヶ所あるのでプラスミドをStuＩで消化した。消化されたプラスミドと8merのBglIIリンカーとを混合し、T4 DNAリガーゼ反応を行った。この結果、StuIサイトにBglIIサイトが挿入された。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からStuＩでは切断されず、BglIIで切断されるプラスミドDNA(pUC19add'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するaddはStuＩサイトでフレームシフトが生じることになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図２）。
次に、pUC19add'#1をSacＩとSphＩで消化し、addを含む約1.8Kbの断片を調製した。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（図１）のSacＩとSphＩサイトの間に挿入し、プラスミドpMAN997add'#１を得た。プラスミドpMAN997add'#１でFDR-18株（purF-,deoD-,purR-）およびFADR-8株(purF-,purA-,deoD-,purR-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクローンを
アデノシン1.5g/L添加LB培地に生育させ、これらの培養液を薄層クロマトグラムにより分析して、アデノシンがイノシンに転換していないクローンを選択した。さらにこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRによりadd約1.8kb断片を増幅させ、BglIIで切断されるがStuＩで切断されないことを確認した。これらのクローンをadd欠失株とし、FDR-18株（purF-,deoD-,purR-）およびFADR-8株(purF-,purA-,deoD-,purR-)由来のものをそれぞれFDRadd-18-1株およびFADRadd-8-3株とした。
アデノシン1.5g/L添加LB培地に生育させ、これらの培養液を薄層クロマトグラムにより分析して、アデノシンがイノシンに転換していないクローンを選択した。さらにこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRによりadd約1.8kb断片を増幅させ、BglIIで切断されるがStuＩで切断されないことを確認した。これらのクローンをadd欠失株とし、FDR-18株（purF-,deoD-,purR-）およびFADR-8株(purF-,purA-,deoD-,purR-)由来のものをそれぞれFDRadd-18-1株およびFADRadd-8-3株とした。
2)脱感作型purFプラスミド導入株のプリンヌクレオシド生産能評価
1)で作製したFDRadd-18-1株（purF-,deoD-,purR-,add-）およびFADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)にpKFpurFKQおよびpKFpurFKQPWを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。なお、FADRadd-8-3株については野生型purFプラスミド(pKFpurF)による形質転換体も作製し、pKFpurFKQによる形質転換体およびpKFpurFKQPWによる形質転換体と比較評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じである。purA-(アデニン要求性）の菌株についてはMS培地にアデニン5mg/Lが添加されている。
1)で作製したFDRadd-18-1株（purF-,deoD-,purR-,add-）およびFADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)にpKFpurFKQおよびpKFpurFKQPWを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。なお、FADRadd-8-3株については野生型purFプラスミド(pKFpurF)による形質転換体も作製し、pKFpurFKQによる形質転換体およびpKFpurFKQPWによる形質転換体と比較評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じである。purA-(アデニン要求性）の菌株についてはMS培地にアデニン5mg/Lが添加されている。
プリンヌクレオシド生産能の評価結果を表３に示す。W3110株（野生株）に比べ、優位なイノシンの生産が認められた。また、野生型purFに比べ、脱感作型purFKQおよびpurFKQPWの効果が認められた。
[実施例３]
1)脱感作型purF相同組換えプラスミドの作製
実施例１の1)で作製したpurF-株を利用して脱感作型purFを染色体置換するために、先に取得したpurF断片（約1.6kb）よりもさらに3'側に約0.5kb長いpurF断片を取得した。W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）の情報に基づき、CTCCTGCAGAACGAGGAAAAAGACGTATG（配列番号１）とCTCAAGCTTGTCTGATTTATCACATCATC（配列番号１３）の塩基配列を有する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと翻訳終止コドンをカバーするpurF構造遺伝子領域を含む約2.1kbの増幅断片をpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にクローン化した。このクローンの保持するプラスミドをpCRTMIIpurFLとする。pCRTMIIpurFLにはクローニングサイトの両近傍に制限酵素サイトとしてEcoRIサイトが存在する。またPCR用プライマーにはPstIサイトとHindIIIサイトがそれぞれデザインされている。
1)脱感作型purF相同組換えプラスミドの作製
実施例１の1)で作製したpurF-株を利用して脱感作型purFを染色体置換するために、先に取得したpurF断片（約1.6kb）よりもさらに3'側に約0.5kb長いpurF断片を取得した。W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）の情報に基づき、CTCCTGCAGAACGAGGAAAAAGACGTATG（配列番号１）とCTCAAGCTTGTCTGATTTATCACATCATC（配列番号１３）の塩基配列を有する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと翻訳終止コドンをカバーするpurF構造遺伝子領域を含む約2.1kbの増幅断片をpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にクローン化した。このクローンの保持するプラスミドをpCRTMIIpurFLとする。pCRTMIIpurFLにはクローニングサイトの両近傍に制限酵素サイトとしてEcoRIサイトが存在する。またPCR用プライマーにはPstIサイトとHindIIIサイトがそれぞれデザインされている。
次にpCRTMIIpurFLをSnaBＩとHindIIIで消化し、purFのコーデイング領域のＣ末端より下流の約0.65kbの断片を得た。この断片を実施例１の5)で得たpKFpurFKQおよびpKFpurFKQ
PWのSnaBＩサイトとHindIIIサイトとの間に挿入し、pKFpurFLKQおよびpKFpurFLKQPWを作製した。
PWのSnaBＩサイトとHindIIIサイトとの間に挿入し、pKFpurFLKQおよびpKFpurFLKQPWを作製した。
次に、pKFpurFLKQおよびpKFpurFLKQPWをEcoRＩとHindIIIで消化し、purFLKQおよびpurFLKQPWを含む約2.1Kbの断片を調製した。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）のEcoRＩサイトとHindIIIサイトとの間に挿入し、それぞれプラスミドpMAN997purFLKQおよびpMAN997purFLKQPWを得た。
2)脱感作型purF染色体組込み株の作製
プラスミドpMAN997purFLKQおよびpMAN997purFLKQPWでそれぞれFDRadd-18-1株（purF-,deoD-,purR-,add-）およびFADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクローンの中から、FDRadd-18-1株（purF-,deoD-,purR-,add-）の場合には最小培地に生育し、FADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)の場合にはL-ヒスチジン 100mg/Lおよびアデニン 50mg/L添加最小培地に生育するクローンを選択した。
プラスミドpMAN997purFLKQおよびpMAN997purFLKQPWでそれぞれFDRadd-18-1株（purF-,deoD-,purR-,add-）およびFADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクローンの中から、FDRadd-18-1株（purF-,deoD-,purR-,add-）の場合には最小培地に生育し、FADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)の場合にはL-ヒスチジン 100mg/Lおよびアデニン 50mg/L添加最小培地に生育するクローンを選択した。
さらにはこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRによりpurFを含む約1.5kb断片を増幅させ、相同組換え置換による変異導入個所周辺の塩基配列を解析した結果、K326Q(326Lys→Gln)の変異、およびK326Q(326Lys→Gln)＋P410W(410Pro→Trp)の変異をそれぞれが持つことが確認された。
FDRadd-18-1株（purF-,deoD-,purR-,add-）由来のものをFDRadd-18-1::KQ株（purFKQ,deoD-,purR-,add-）およびFDRadd-18-1::KQPW株（purFKQPW,deoD-,purR-,add-）とし、FADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)由来のものをFADRadd-8-3::KQ株(purFKQ,purA-,deoD-,purR-,add-)およびFADRadd-8-3::KQPW株(purFKQPW,purA-,deoD-,purR-,add-)と命名した。
3)脱感作型purF染色体組込み株のプリンヌクレオシド生産能評価
2)で作製したFDRadd-18-1::KQ株（purFKQ,deoD-,purR-,add-）、FDRadd-18-1::KQPW株（purFKQPW,deoD-,purR-,add-）、FADRadd-8-3::KQ株(purFKQ,purA-,deoD-,purR-,add-)およびFADRadd-8-3::KQPW株(purFKQPW,purA-,deoD-,purR-,add-)のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じである。purA-(アデニン要求性）の菌株についてはMS培地にアデニン 5mg/Lが添加されている。
2)で作製したFDRadd-18-1::KQ株（purFKQ,deoD-,purR-,add-）、FDRadd-18-1::KQPW株（purFKQPW,deoD-,purR-,add-）、FADRadd-8-3::KQ株(purFKQ,purA-,deoD-,purR-,add-)およびFADRadd-8-3::KQPW株(purFKQPW,purA-,deoD-,purR-,add-)のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じである。purA-(アデニン要求性）の菌株についてはMS培地にアデニン 5mg/Lが添加されている。
プリンヌクレオシド生産能の評価結果を表４に示す。W3110株（野生株）に比べ、優位なイノシン生産が認められた。
[実施例４]
1)イノシン−グアノシン・キナーゼ遺伝子(gsk)欠失株の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（GenBank Accession No.D00798）の情報に基づき、CTCGAGCTCATGAAATTTCCCGG（配列番号14）とCTCGGATCCGGTACCATGCTG（配列番号15）の塩基配列を有する23merと21merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするgsk構造遺伝子領域を含む約1.5kbの増幅断片をpUC18ベクター（宝酒造社製）のSacＩサイトとBamHＩサイトの間にクローン化した。PCR用プライマーにはSacＩサイトとBamHＩサイトがそれぞれデザインされている。
1)イノシン−グアノシン・キナーゼ遺伝子(gsk)欠失株の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（GenBank Accession No.D00798）の情報に基づき、CTCGAGCTCATGAAATTTCCCGG（配列番号14）とCTCGGATCCGGTACCATGCTG（配列番号15）の塩基配列を有する23merと21merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするgsk構造遺伝子領域を含む約1.5kbの増幅断片をpUC18ベクター（宝酒造社製）のSacＩサイトとBamHＩサイトの間にクローン化した。PCR用プライマーにはSacＩサイトとBamHＩサイトがそれぞれデザインされている。
クローン化されたgsk断片の約1.5kbの5'側から約830bpの位置にBglIIサイトが１ヶ所あるのでプラスミドをBglIIで消化し、そこにカナマイシン耐性（Kmr)遺伝子GenBlock（BamHＩ消化物、ファルマシアハ゛イオテク社製）を挿入する目的でT4 DNA リガーゼ反応を行った。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。4クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からBglIIでは切断されず、EcoRＩとSalＩでの消化で約2.8kbの断片が切り出されるプラスミドDNA(pUC18gsk'#2)を選択した。本プラスミドDNAが有するgskはBglIIサイトで異種遺伝子が挿入されることになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図２）。
次に、pUC18gsk'#2をSacＩ、SphＩおよびDraＩで消化し、gskとKmr遺伝子を含む約2.8Kbの断片を調製した。DraI消化の目的は、SacI-SphI断片の取得を容易にすることである。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）のSacＩサイトとSphＩサイトとの間に挿入し、プラスミドpMAN997gsk'#2を得た。プラスミドpMAN997gsk'#2でFDR-18株（purF-,deoD-,purR-）およびFADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレート、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートおよびカナマイ
シン20μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートには生育しないがカナマイシン20μg/mlを含むLB寒天プレートには生育するクローンを選んだ。さらにこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRによりgsk遺伝子を含む断片を増幅させ、本来の約1.5kb断片ではなくKmr遺伝子を含む約2.8kb断片が増幅されていることを確認した。またこれらのクローンでは、イノシン−グアノシン・キナーゼ活性が検出されないことを確認した。イノシン−グアノシン・キナーゼ活性は臼田ら(Biochim. Biophys. Acta., 1341, 200-206(1997))の方法に従って行った。これらのクローンをgsk欠失株とし、FDR-18株（purF-,deoD-,purR-）およびFADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)由来のものをそれぞれFDRG-18-13株およびFADRaddG-8-3株とした。
シン20μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートには生育しないがカナマイシン20μg/mlを含むLB寒天プレートには生育するクローンを選んだ。さらにこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRによりgsk遺伝子を含む断片を増幅させ、本来の約1.5kb断片ではなくKmr遺伝子を含む約2.8kb断片が増幅されていることを確認した。またこれらのクローンでは、イノシン−グアノシン・キナーゼ活性が検出されないことを確認した。イノシン−グアノシン・キナーゼ活性は臼田ら(Biochim. Biophys. Acta., 1341, 200-206(1997))の方法に従って行った。これらのクローンをgsk欠失株とし、FDR-18株（purF-,deoD-,purR-）およびFADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)由来のものをそれぞれFDRG-18-13株およびFADRaddG-8-3株とした。
2)脱感作型purFプラスミド導入株のプリンヌクレオシド生産能評価
1)で作製したFDRG-18-13株（purF-,deoD-,purR-,gsk-）およびFADRaddG-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-)にpKFpurFKQおよびpKFpurFKQPWを導入し、プリンヌクレオシド生産能を評価するにあたり、プラスミドpKFpurFKQおよびpKFpurFKQPWは薬剤選択マーカー遺伝子がKmr遺伝子であり、宿主FDRG-18-13株およびFADRaddG-8-3株もまたカナマイシン耐性となっているので、形質転換体を得るのが困難である。そこでプラスミドpKFpurFKQおよびpKFpurFKQPWの薬剤選択マーカー遺伝子の交換をアンピシリン耐性遺伝子を持つpUC18ベクター（宝酒造社製）を用いて行った。pKF18とpUC18とはlacプロモーターとマルチクローニングサイトの位置関係が全く同じなので、pKFpurFKQおよびpKFpurFKQPWからPstＩとHindIIIでpurFKQおよびpurFKQPW断片を切り出し、これらをpUC18のPstＩサイトとHindIIIサイトの間に挿入し、pUCpurFKQおよびpUCpurFKQPWを作製した。これらで宿主FDRG-18-13株およびFADRaddG-8-3株を形質転換し、組換え体のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じである。purA-(アデニン要求性）の菌株についてはMS培地にアデニン 5mg/Lが添加されている。
1)で作製したFDRG-18-13株（purF-,deoD-,purR-,gsk-）およびFADRaddG-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-)にpKFpurFKQおよびpKFpurFKQPWを導入し、プリンヌクレオシド生産能を評価するにあたり、プラスミドpKFpurFKQおよびpKFpurFKQPWは薬剤選択マーカー遺伝子がKmr遺伝子であり、宿主FDRG-18-13株およびFADRaddG-8-3株もまたカナマイシン耐性となっているので、形質転換体を得るのが困難である。そこでプラスミドpKFpurFKQおよびpKFpurFKQPWの薬剤選択マーカー遺伝子の交換をアンピシリン耐性遺伝子を持つpUC18ベクター（宝酒造社製）を用いて行った。pKF18とpUC18とはlacプロモーターとマルチクローニングサイトの位置関係が全く同じなので、pKFpurFKQおよびpKFpurFKQPWからPstＩとHindIIIでpurFKQおよびpurFKQPW断片を切り出し、これらをpUC18のPstＩサイトとHindIIIサイトの間に挿入し、pUCpurFKQおよびpUCpurFKQPWを作製した。これらで宿主FDRG-18-13株およびFADRaddG-8-3株を形質転換し、組換え体のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じである。purA-(アデニン要求性）の菌株についてはMS培地にアデニン 5mg/Lが添加されている。
プリンヌクレオシド生産能の評価結果を表５に示す。この結果よりgsk欠失を付与した場合にはイノシンと共にグアノシンも蓄積することが認められた。
3)脱感作型purF染色体組込み株の作製とプリンヌクレオシド生産能評価
プラスミドpMAN997purFLKQおよびpMAN997purFLKQPWでそれぞれFDRG-18-3株（purF-,deoD-,purR-,gsk-）およびFADRaddG-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えに
よりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクローンの中から、FDRG-18-13株（purF-,deoD-,purR-,gsk-）の場合には最小培地に生育し、FADRaddG-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-)の場合にはL-ヒスチジン 100mg/Lおよびアデニン 50mg/L添加最小培地に生育するクローンを選択した。
プラスミドpMAN997purFLKQおよびpMAN997purFLKQPWでそれぞれFDRG-18-3株（purF-,deoD-,purR-,gsk-）およびFADRaddG-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えに
よりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクローンの中から、FDRG-18-13株（purF-,deoD-,purR-,gsk-）の場合には最小培地に生育し、FADRaddG-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-)の場合にはL-ヒスチジン 100mg/Lおよびアデニン 50mg/L添加最小培地に生育するクローンを選択した。
さらにはこれらの目的クローンの染色体DNAを調製し、PCRによりpurFを含む約1.5kb断片を増幅させ、相同組換え置換による変異導入個所周辺の塩基配列を解析した結果、K326Q(326Lys→Gln)の変異、およびK326Q(326Lys→Gln)＋P410W(410Pro→Trp)の変異をそれぞれが持つことが確認された。
FDRG-18-13株（purF-,deoD-,purR-,gsk-）由来のものをFDRG-18-13::KQ株（purFKQ,deoD-,purR-,gsk-）およびFDRG-18-13::KQPW株（purFKQPW,deoD-,purR-,gsk-）とし、FADRaddG-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-)由来のものをFADRaddG-8-3::KQ株(purFKQ,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-)およびFADRaddG-8-3::KQPW株(purFKQPW,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-)と命名した。
FADRaddG-8-3::KQ株(purFKQ,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-)には、プライベート・ナンバーAJ13334が付与された。同株は、1997年6月24日付けで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-0046 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、ブタペスト条約に基づいて国際寄託され、受託番号として、FERM BP-5993が付与された。
これらの４種の脱感作型purF染色体組込み株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じである。purA-(アデニン要求性）の菌株についてはMS培地にアデニン 5mg/Lが添加されている。
プリンヌクレオシド生産能の評価結果を表６に示す。この結果よりgsk欠失を付与した場合にはイノシンと共にグアノシンも蓄積することが認められた。
[実施例５]
1)野生型purR相同組換えプラスミドの作製とpurR+復帰染色体組込み株の作製
実施例１の4)でpUC19ベクター（宝酒造社製）のSalＩサイトとSphＩサイトの間に約1.8kbのpurR断片が搭載されているプラスミド(pUCpurR)を得た。このpUCpurRをSacＩとSphＩで消化し、野生型purRを含む約1.8Kbの断片を調製した。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）のSacＩサイトとSphＩサイトの間に挿入し、プラスミドpMAN997purRを得た。プラスミドpMAN997purRでFADRadd-8-3株（purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体を、シングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして,それぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクローンの中から10クローンを無作為に選び、これらの染色体DNAからPCRによりpurR約1.8kb断片を増幅させ、PmaCＩで切断されるがBglIIで切断されないクローンを選択した。これらのクローンをpurR+復帰株とし、FADadd-8-3-2株(purF-,purA-,deoD-,add-)とした。
1)野生型purR相同組換えプラスミドの作製とpurR+復帰染色体組込み株の作製
実施例１の4)でpUC19ベクター（宝酒造社製）のSalＩサイトとSphＩサイトの間に約1.8kbのpurR断片が搭載されているプラスミド(pUCpurR)を得た。このpUCpurRをSacＩとSphＩで消化し、野生型purRを含む約1.8Kbの断片を調製した。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）のSacＩサイトとSphＩサイトの間に挿入し、プラスミドpMAN997purRを得た。プラスミドpMAN997purRでFADRadd-8-3株（purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体を、シングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして,それぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクローンの中から10クローンを無作為に選び、これらの染色体DNAからPCRによりpurR約1.8kb断片を増幅させ、PmaCＩで切断されるがBglIIで切断されないクローンを選択した。これらのクローンをpurR+復帰株とし、FADadd-8-3-2株(purF-,purA-,deoD-,add-)とした。
2)脱感作型purFプラスミド導入株のプリンヌクレオシド生産能評価
1)で作製したFADadd-8-3-2株(purF-,purA-,deoD-,add-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。なお、FADRadd-8-3株についてもpKFpurKQによる形質転換体を作製し、purR欠失の効果を比較評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じである。MS培地にアデニン5mg/Lが添加されている。
1)で作製したFADadd-8-3-2株(purF-,purA-,deoD-,add-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。なお、FADRadd-8-3株についてもpKFpurKQによる形質転換体を作製し、purR欠失の効果を比較評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じである。MS培地にアデニン5mg/Lが添加されている。
プリンヌクレオシド生産能の評価結果を表７に示す。FADadd（purR野生型）に比べ、FADRadd(purR-型)の方が優位なイノシンの生産を示し、purR欠失の効果が確認された。
[実施例６]
1)イノシン−グアノシン・キナーゼ遺伝子(gsk)欠失株の再取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（GenBank Accession No.D00798）の情報に基づき、CTCGGTACCCTGTTGCGTTAAGCCATCCCAGA（配列番号16）とCTCGCATGC
CAACGTACGGCATTAACCTA（配列番号17）の塩基配列を有する32merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするgsk構造遺伝子領域（約800bp）を含む約3.0kbの増幅断片をpUC19ベクター（宝酒造社製）のKpnＩサイトとSphＩサイトの間にクローン化した。PCR用プライマーにはKpnＩサイトとSphＩサイトがそれぞれデザインされている。
1)イノシン−グアノシン・キナーゼ遺伝子(gsk)欠失株の再取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（GenBank Accession No.D00798）の情報に基づき、CTCGGTACCCTGTTGCGTTAAGCCATCCCAGA（配列番号16）とCTCGCATGC
CAACGTACGGCATTAACCTA（配列番号17）の塩基配列を有する32merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするgsk構造遺伝子領域（約800bp）を含む約3.0kbの増幅断片をpUC19ベクター（宝酒造社製）のKpnＩサイトとSphＩサイトの間にクローン化した。PCR用プライマーにはKpnＩサイトとSphＩサイトがそれぞれデザインされている。
クローン化されたgsk断片の約3.0kbの5'側から約900bpと1030bpの位置にAro51HIサイトが２ヶ所、1640bpの位置にBglIIサイトがそれぞれ１ヶ所あるのでプラスミドをAro51HIとBglIIで消化し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化した後、Aro51HI-BglII断片を除去して、T4 DNA リガーゼでベクター側のDNAのセルフライゲイションを行った。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からAro51HIあるいはBglIIでは切断されず、KpnＩとSphＩでの消化で約2.3kbの断片が切り出されるプラスミドDNA(pUC19gsk'#10)を選択した。本プラスミドDNAが有するgskはAro51HIサイトとBglIIサイトの間で構造遺伝子が欠失することになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図３）。
次に、pUC19gsk'#10をKpnＩおよびSphＩで消化し、gsk遺伝子を含む約2.3Kbの断片を調製した。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）のKpnＩサイトとSphＩサイトの間に挿入し、プラスミドpMAN997gsk'#10を得た。プラスミドpMAN997gsk'#10でFADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして、それぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。さらにアンピシリン感受性のクローンの中から10クローンを無作為に選び、これらの染色体DNAから先のPCRプライマーを用いてPCRによりgsk遺伝子を含む断片を増幅させ、本来の約3.0kb断片ではなく約2.3kb断片が増幅されているクローンを選択した。またこれらのクローンでは、イノシン−グアノシン・キナーゼ活性が検出されないことを確認した。イノシン−グアノシン・キナーゼ活性は臼田ら(Biochim. Biophys. Acta., 1341, 200-206(1997))の方法に従って行った。これらのクローンを新たなgsk欠失株とし、FADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)由来のものをFADRaddgsk株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-)とした。
2)ＧＭＰリダクターゼ遺伝子(guaC)欠失株の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）の情報に基づき、CTCAAGCTTACGGCTCTGGTCCACGCCAG（配列番号18）とCTCCTGCAGCAGCGTTGGGAGATTACAGG（配列番号19）の塩基配列を有する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと翻訳終止コドンをカバーするguaC構造遺伝子領域の約2.2kbの増幅断片をpUC18ベクター（宝酒造社製）のHindIIIサイトとPstＩサイトの間にクローン化した。PCR用プライマーにはHindIIIサイトとPstIサイトがそれぞれデザ
インされている。
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）の情報に基づき、CTCAAGCTTACGGCTCTGGTCCACGCCAG（配列番号18）とCTCCTGCAGCAGCGTTGGGAGATTACAGG（配列番号19）の塩基配列を有する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと翻訳終止コドンをカバーするguaC構造遺伝子領域の約2.2kbの増幅断片をpUC18ベクター（宝酒造社製）のHindIIIサイトとPstＩサイトの間にクローン化した。PCR用プライマーにはHindIIIサイトとPstIサイトがそれぞれデザ
インされている。
クローン化された2.2kbのguaC断片の5'側から約1.1kbの位置にBglIIサイトが１ヶ所あるので、BglIIで切断後、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化した後に、T4 DNA リガーゼで連結した。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。18クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からHindIIIとPstIで約2.2kbの断片が得られ、かつBglIIで本断片が切断されないプラスミドDNA(pUC18guaC'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するguaCはBglIIサイトでフレームシフトが生じることになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図３）。
次に、pUC18guaC'#1をHindIIIとPstIで消化し、guaCを含む約2.2Kbの断片を調製した。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）のHindIIIサイトとPstIサイトの間に挿入し、プラスミドpMAN997guaC'#1を得た。プラスミドpMAN997guaC'#1でFADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)およびFADRaddgsk株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-)を30℃で形質転換し、それぞれ得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。これらのクローンの染色体DNAからPCRによりguaCを含む約2.2kb断片を増幅させ、BglIIで切断されないことを確認した。以上を満足するクローンをguaC欠失株とし、FADRadd-8-3およびFADRaddgsk由来のものをそれぞれFADRaddguaC株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,guaC-)およびFADRaddgskguaC株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-,guaC-)とした。またこれらのクローンでＧＭＰリダクターゼ活性が検出されないことを確認した。ＧＭＰリダクターゼ活性の測定は、B.B.Garberら(J. Bacteriol., 43, 105(1980))の方法に従って行った。
3)脱感作型purFプラスミド導入株のプリンヌクレオシド生産能評価
2)で作製したFADRaddguaC株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,guaC-)およびFADRaddgskguaC株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-,guaC-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じである。MS培地（基本培地）にアデニンが5mg/L添加してある。
2)で作製したFADRaddguaC株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,guaC-)およびFADRaddgskguaC株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,gsk-,guaC-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じである。MS培地（基本培地）にアデニンが5mg/L添加してある。
プリンヌクレオシド生産能の評価結果を表８に示す。guaCを欠失することにより、若干のグアノシン増産効果が認められた。
[実施例７]
1)６−フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ遺伝子(edd)欠失株の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）において「edd」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGAATTCGGATATCTGGAAGAAGAGGG（配列番号20）とCTCAAGCTTGGAATAGTCCCTTCGGTAGC（配列番号21）の塩基配列を有する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするedd構造遺伝子領域およびATGの5'上流域約810bpおよび翻訳終止コドンの下流域約360bpを含む約3.0kbの増幅断片をそのままpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にクローン化した。本ベクターにはPCR産物増幅断片をそのままクローニングすることができ、またクローニングサイトの両近傍に制限酵素サイトとしてEcoRIサイトが存在する。またPCR用プライマーにはBamHＩサイトとHindIIIサイトがそれぞれデザインされている。クローン化されたedd断片の約3.0kbの5'側から約660bpと1900bpの位置にStuＩサイトが２ヶ所あるのでプラスミドをStuＩで消化した。約1.25kbのStuI断片を除去したベクター側のセルフライゲイションをT4 DNA リガーゼで行った。このライゲイション液でE.coli HB101のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からStuＩでは1.25kbの断片が切りだされないプラスミドDNA(pCRTMIIedd'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するeddはプロモーター領域を含むタンパク質コード領域が除去されており、酵素が生成しなくなると予測される（図３）。
1)６−フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ遺伝子(edd)欠失株の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）において「edd」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGAATTCGGATATCTGGAAGAAGAGGG（配列番号20）とCTCAAGCTTGGAATAGTCCCTTCGGTAGC（配列番号21）の塩基配列を有する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするedd構造遺伝子領域およびATGの5'上流域約810bpおよび翻訳終止コドンの下流域約360bpを含む約3.0kbの増幅断片をそのままpCRTMIIベクター（Invitrogen社製）にクローン化した。本ベクターにはPCR産物増幅断片をそのままクローニングすることができ、またクローニングサイトの両近傍に制限酵素サイトとしてEcoRIサイトが存在する。またPCR用プライマーにはBamHＩサイトとHindIIIサイトがそれぞれデザインされている。クローン化されたedd断片の約3.0kbの5'側から約660bpと1900bpの位置にStuＩサイトが２ヶ所あるのでプラスミドをStuＩで消化した。約1.25kbのStuI断片を除去したベクター側のセルフライゲイションをT4 DNA リガーゼで行った。このライゲイション液でE.coli HB101のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からStuＩでは1.25kbの断片が切りだされないプラスミドDNA(pCRTMIIedd'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するeddはプロモーター領域を含むタンパク質コード領域が除去されており、酵素が生成しなくなると予測される（図３）。
次に、pCRTMIIedd'#1をEcoRIで消化し、eddの一部とその近傍を含む約1.75Kbの断片を調製した。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）のEcoRIサイトに挿入し、プラスミドpMAN997edd'#１を得た。プラスミドpMAN997edd'#１でFADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。これらの目的クローンの染色体DNAから、先に示したPCRプライマー
でPCRによりedd領域を増幅させ、増幅断片サイズが野生型の約3.0kbではなく、欠失型の約1.75kbであるクローンを選択した。これらのクローンをedd欠失株とし、FADRaddedd株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-)とした。
でPCRによりedd領域を増幅させ、増幅断片サイズが野生型の約3.0kbではなく、欠失型の約1.75kbであるクローンを選択した。これらのクローンをedd欠失株とし、FADRaddedd株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-)とした。
2)脱感作型purFプラスミド導入株のプリンヌクレオシド生産能評価
1)で作製したFADRaddedd株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じである。MS培地にアデニン5mg/Lが添加されている。eddがコードする６−フォスフォグルコン酸デヒドラーゼはグルコン酸で誘導され、グルコン酸(gluconate)をエントナー・ドゥドルフ(Entner-Doudoroff)経路でピルビン酸へと代謝する第１段階の酵素である。この酵素が欠失することにより、グルコン酸がペントースリン酸経路へのみ流入すると考えられるので、ここではMS培地中のＣ源としてグルコース以外にグルコン酸(48g/L添加)も使用し、評価した。
1)で作製したFADRaddedd株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じである。MS培地にアデニン5mg/Lが添加されている。eddがコードする６−フォスフォグルコン酸デヒドラーゼはグルコン酸で誘導され、グルコン酸(gluconate)をエントナー・ドゥドルフ(Entner-Doudoroff)経路でピルビン酸へと代謝する第１段階の酵素である。この酵素が欠失することにより、グルコン酸がペントースリン酸経路へのみ流入すると考えられるので、ここではMS培地中のＣ源としてグルコース以外にグルコン酸(48g/L添加)も使用し、評価した。
プリンヌクレオシド生産能の評価結果を表９に示す。eddを欠失することにより、グルコン酸をＣ源とする時に顕著なイノシン生産増大効果が認められた。また、Ｃ源をグルコースとした場合にも効果が認められた。
[実施例８]
1)フォスフォグルコース・イソメラーゼ遺伝子(pgi)欠失株の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）において「pgi」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTCGACTCCATTTTCAGCCTTGGCAC（配列番号22）とCTCGCATGCGTCGCATCAGGCATCGGTTG（配列番号23）の塩基配列を有する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするpgi構造遺伝子領域を含む約2.2kbの増幅断片をpUC18ベクター（宝酒造社製）のSalＩサイトとSphＩサイトの間にクローン化した。PCR用プライマーにはSalＩサイトとSphＩサイトがそれぞれデザインされている。クローン化されたpgi断片の約2.2kbの5'側から約1170bpと1660bpの位置にBssHIIサイトとMluIサイトがそれぞれ１ヶ所あるのでプラスミドをBssHIIとMluIで消化した後、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化した。BssHIIサイトとMluIサイトの間の約500bpの断片を除去したベクター側のセルフライゲイションをT4 DNA リガーゼで行った。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からSalIとSphIでの処理で約1.7kbの断片が切りだされるプラスミドDNA(pUC18pgi'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するpgiはBssHIIサイトとMluIサイトの間で欠失が生じる
ことになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図３）。
1)フォスフォグルコース・イソメラーゼ遺伝子(pgi)欠失株の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）において「pgi」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製された、CTCGTCGACTCCATTTTCAGCCTTGGCAC（配列番号22）とCTCGCATGCGTCGCATCAGGCATCGGTTG（配列番号23）の塩基配列を有する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするpgi構造遺伝子領域を含む約2.2kbの増幅断片をpUC18ベクター（宝酒造社製）のSalＩサイトとSphＩサイトの間にクローン化した。PCR用プライマーにはSalＩサイトとSphＩサイトがそれぞれデザインされている。クローン化されたpgi断片の約2.2kbの5'側から約1170bpと1660bpの位置にBssHIIサイトとMluIサイトがそれぞれ１ヶ所あるのでプラスミドをBssHIIとMluIで消化した後、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化した。BssHIIサイトとMluIサイトの間の約500bpの断片を除去したベクター側のセルフライゲイションをT4 DNA リガーゼで行った。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からSalIとSphIでの処理で約1.7kbの断片が切りだされるプラスミドDNA(pUC18pgi'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するpgiはBssHIIサイトとMluIサイトの間で欠失が生じる
ことになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図３）。
次に、pUC18pgi'#1をSalIとSphIで消化し、pgiを含む約1.7Kbの断片を調製した。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）のSalIサイトとSphIサイトの間に挿入し、プラスミドpMAN997pgi'#１を得た。プラスミドpMAN997pgi'#１でFADRadd-8-3株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-)およびFADRaddedd(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-)を30℃で形質転換し、それぞれ得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。これらの目的クローンの染色体DNAから先に示したPCRプライマーでPCRによりpgi領域を増幅させ、増幅断片サイズが野生型の約2.2kbではなく、欠失型の約1.7kbであるクローンを選択した。これらのクローンをpgi欠失株とし、FADRadd-8-3およびFADRaddedd由来のものをそれぞれFADRaddpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,pgi-)およびFADRaddeddpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,pgi-)とした。
2)脱感作型purFプラスミド導入株のプリンヌクレオシド生産能評価
1)で作製したFADRaddpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,pgi-)およびFADRaddeddpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,pgi-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じであるが、生産評価用に使用した培地はMS培地（基本培地）中のイーストエキストラクトを0.8%に増量している。
1)で作製したFADRaddpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,pgi-)およびFADRaddeddpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,pgi-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じであるが、生産評価用に使用した培地はMS培地（基本培地）中のイーストエキストラクトを0.8%に増量している。
プリンヌクレオシド生産能の評価結果を表１０に示す。pgiを欠失することにより、これまでのMS培地にアデニンを5mg/L添加した培地では生育が極度に悪くなったので、イーストエキストラクトを0.8%に増量した培地を用いたが、pgi+の親株では本培地では生育速度の増進とイノシン生産の低下および著量のヒポキサンチンの副生が見られた。一方、pgi欠失株では顕著なイノシン生産増大効果が認められた。
[実施例９]
1)アデニン・デアミナーゼ遺伝子(yicP)欠失株の取得
遺伝子データバンク（E.coli Gene Bank）において、Bacillus subtilis由来のアデニン・デアミナーゼと相同性の高いORF(open reading frame,構造遺伝子）として、yicPが登録されている。そこで、W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、「yicP」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製された、CTCCTGCAGCGACGTTTTCTTTTATGACA（配列番号24）とCTCAAGCTTCGTAACTGGTGACTTTTGCC（配列番号25）の塩基配列を有する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene
Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするyicP構造遺伝子領域およびATGの5'上流域約50bpおよび翻訳終止コドンの下流域約40bpを含む約1.9kb断片を増幅した。PCR用プライマーにはPstＩサイトとHindIIIサイトがそれぞれデザインされている。このPCR産物をPstIとHindIIIで切断後、pUC18ベクター（宝酒造社製）のPstＩサイトとHindIIIサイトの間にクローン化した。クローン化されたyicP断片の約1.9kbの5'側から約540bpと約590bpの位置にHapIサイトとEcoRＶサイトがそれぞれ１ヶ所あるのでプラスミドをHapIとEcoRＶで消化した後、HapI-EcoRＶの47bpを除去したDNAのセルフライゲイションをT4 DNA リガーゼで行った。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からHapIあるいはEcoRＶ消化で切断されないプラスミドDNA(pUC18yicP'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するyicPはHapI-EcoRＶサイトの47bpを欠失させることでフレームシフトが生じることになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図３）。
1)アデニン・デアミナーゼ遺伝子(yicP)欠失株の取得
遺伝子データバンク（E.coli Gene Bank）において、Bacillus subtilis由来のアデニン・デアミナーゼと相同性の高いORF(open reading frame,構造遺伝子）として、yicPが登録されている。そこで、W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、「yicP」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製された、CTCCTGCAGCGACGTTTTCTTTTATGACA（配列番号24）とCTCAAGCTTCGTAACTGGTGACTTTTGCC（配列番号25）の塩基配列を有する29merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene
Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、ATGと翻訳終止コドンをカバーするyicP構造遺伝子領域およびATGの5'上流域約50bpおよび翻訳終止コドンの下流域約40bpを含む約1.9kb断片を増幅した。PCR用プライマーにはPstＩサイトとHindIIIサイトがそれぞれデザインされている。このPCR産物をPstIとHindIIIで切断後、pUC18ベクター（宝酒造社製）のPstＩサイトとHindIIIサイトの間にクローン化した。クローン化されたyicP断片の約1.9kbの5'側から約540bpと約590bpの位置にHapIサイトとEcoRＶサイトがそれぞれ１ヶ所あるのでプラスミドをHapIとEcoRＶで消化した後、HapI-EcoRＶの47bpを除去したDNAのセルフライゲイションをT4 DNA リガーゼで行った。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からHapIあるいはEcoRＶ消化で切断されないプラスミドDNA(pUC18yicP'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するyicPはHapI-EcoRＶサイトの47bpを欠失させることでフレームシフトが生じることになり、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図３）。
次に、pUC18yicP'#1をPstIとHindIIIで消化し、yicP構造遺伝子を含む約1.9Kbの断片を調製した。この断片を温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）のPstIサイトとHindIIIサイトの間に挿入し、プラスミドpMAN997yicP'#１を得た。プラスミドpMAN997yicP'#１でFADRaddedd(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。これらの目的クローンの染色体DNAから先に示したPCRプライマーでPCRによりyicP領域を増幅させ、増幅断片サイズがHapIあるいはEcoRＶで切断されないクローンを選択した。またこれらのクローンではアデニン・デアミナーゼ活性が検出されないことを確認した。アデニン・デアミナーゼ活性はPer Nygaardら(J. Bacteriol., 178, 846-853(1996))の方法に従って行った。これらのクローンをyicP欠失株とし、FADRaddeddyicP株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-)とした。
2)アデニン・デアミナーゼ遺伝子(yicP)欠失株よりフォスフォグルコース・イソメラーゼ遺伝子(pgi)欠失株の取得
さらにFADRaddeddyicP株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-)にpgi欠失を付与した。実施例８で作製したpMAN997pgi'#1を用いて、実施例８に示したと同様の方法で、FADRaddeddyicPpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-)を得た。
さらにFADRaddeddyicP株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-)にpgi欠失を付与した。実施例８で作製したpMAN997pgi'#1を用いて、実施例８に示したと同様の方法で、FADRaddeddyicPpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-)を得た。
3)脱感作型purFプラスミド導入株のプリンヌクレオシド生産能評価
1)および2)で作製したFADRaddeddyicP株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-)およびFADRaddeddyicPpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株の生育におけるアデニン量に対するリスポンスならびにプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じであるが、MS培地にアデニンを0〜50mg/Lの範囲で添加した培地を使用した。
1)および2)で作製したFADRaddeddyicP株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-)およびFADRaddeddyicPpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株の生育におけるアデニン量に対するリスポンスならびにプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じであるが、MS培地にアデニンを0〜50mg/Lの範囲で添加した培地を使用した。
アデニンに対する生育リスポンスおよびプリンヌクレオシド生産能の評価結果を表１１に示す。yicPを欠失することにより、アデニン量に対する生育度が改善されるとともに、アデニン50mg/Lおよび20mg/L添加区でイノシン生産におけるyicP欠失の効果が認められた。
[実施例１０]
1)ＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子(prs)の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）の情報に基づき、CTCGTCGACTGCCTAAGGATCTTCTCATGCCTGATATG（配列番号26）とCTCGCATGCGCCGGGTTCGATTAGTGTTC（配列番号27）の塩基配列を有する38merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと翻訳終止コドンをカバーするprs構造遺伝子領域の約1Kbの増幅断片をpUC18ベクター（宝酒造社製）にクローン化した。PCR用プライマーにはSalＩサイトとSphIサイトがそれぞれデザインされている。このPCR産物をSalIとSphIで切断後、pUC18ベクターのSalＩサイトとSphIサイトの間にクローン化した(pUCprs)。
1)ＰＲＰＰシンセターゼ遺伝子(prs)の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）の情報に基づき、CTCGTCGACTGCCTAAGGATCTTCTCATGCCTGATATG（配列番号26）とCTCGCATGCGCCGGGTTCGATTAGTGTTC（配列番号27）の塩基配列を有する38merと29merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと翻訳終止コドンをカバーするprs構造遺伝子領域の約1Kbの増幅断片をpUC18ベクター（宝酒造社製）にクローン化した。PCR用プライマーにはSalＩサイトとSphIサイトがそれぞれデザインされている。このPCR産物をSalIとSphIで切断後、pUC18ベクターのSalＩサイトとSphIサイトの間にクローン化した(pUCprs)。
2)脱感作型prsの作製
1)でクローン化した約1kbのprsを搭載したプラスミドpUCprsよりSalＩとSphIでの消化によりprs断片を切り出し、変異導入用プラスミドpKF19k（宝酒造社製）のマルチクローニングサイトのSalＩサイトとSphIサイトの間に挿入し直し、目的のクローンを得た(pKFprs)。S.G.Bowerら(J.Biol.Chem., 264, 10287(1989))により、ＰＲＰＰシンセターゼ(Prs)はAMPやADPによりフィードバック阻害を受けることが示唆されている。またその128位のAsp(D)をAla(A)に変異したものが部分的脱感作されていると述べている。そこで、ＰＲＰＰシンセターゼ(Prs)の128位のAsp(D)をAla(A)に変異できるような遺伝子置換を行うため
に以下の合成DNAプライマーを作製し、Site-directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km（宝酒造社製）のプロトコールに従って、pKFprsに部位特異的変異を導入した。
D128A変異用プライマー：5'-GCGTGCAGAGCCACTATCAGC-3'（配列番号28）
1)でクローン化した約1kbのprsを搭載したプラスミドpUCprsよりSalＩとSphIでの消化によりprs断片を切り出し、変異導入用プラスミドpKF19k（宝酒造社製）のマルチクローニングサイトのSalＩサイトとSphIサイトの間に挿入し直し、目的のクローンを得た(pKFprs)。S.G.Bowerら(J.Biol.Chem., 264, 10287(1989))により、ＰＲＰＰシンセターゼ(Prs)はAMPやADPによりフィードバック阻害を受けることが示唆されている。またその128位のAsp(D)をAla(A)に変異したものが部分的脱感作されていると述べている。そこで、ＰＲＰＰシンセターゼ(Prs)の128位のAsp(D)をAla(A)に変異できるような遺伝子置換を行うため
に以下の合成DNAプライマーを作製し、Site-directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km（宝酒造社製）のプロトコールに従って、pKFprsに部位特異的変異を導入した。
D128A変異用プライマー：5'-GCGTGCAGAGCCACTATCAGC-3'（配列番号28）
変異導入操作後、得られた形質転換体の12クローンを無作為にピックアップし、プラスミドを調製し、変異導入個所周辺の塩基配列を解析した結果、目的のものが９クローン得られたことが確認された。この変異型prsを持つpKFprsDAからSalIとSphIでprs断片を切り出し、pUC18とpSTV18（宝酒造社製）のSalIサイトとSphIサイトの間に乗せ換えた。また野生型prsをコントロールとして用いるために、先に作製したpUCprsからSalIとSphIでprs断片を切り出し、pSTV18（宝酒造社製）のSalIサイトとSphIサイトの間に乗せ換えた。これらのpUCprsDAとpSTVprsDAおよびpUCprsとpSTVprsはそれぞれpUC18およびpSTV18由来のlacp/o（ラクトースオペロンのプロモーター）の下流に変異型および野生型のprsが挿入されており、本プロモーターの支配下にprsが発現する。
以上の４つのプラスミドでE.coli JM109を形質転換した組換え体をLB液体培地で8時間培養した後に菌体を集め、粗酵素抽出液を調製した。これらのＰＲＰＰシンセターゼ活性およびADPによる阻害度の測定をK.F.Jensenら(Analytical Biochemistry, 98, 254-263(1979))の方法を一部改変して行った。すなわち基質として[α-32P]ATPを使用し、反応で生成する[32P]AMPを測定した。その結果を表１２に示した。
3)脱感作型prsプラスミド導入株のプリンヌクレオシド生産能評価
実施例９の3)で作製したFADRaddeddyicPpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体をさらにprsやprsDA遺伝子を搭載したpSTVprsとpSTVprsDAでそれぞれ形質転換し、２プラスミド共存型の菌株を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じであるが、MS培地中のイーストエキストラクト量を0.4%にした培地を使用した。
実施例９の3)で作製したFADRaddeddyicPpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体をさらにprsやprsDA遺伝子を搭載したpSTVprsとpSTVprsDAでそれぞれ形質転換し、２プラスミド共存型の菌株を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じであるが、MS培地中のイーストエキストラクト量を0.4%にした培地を使用した。
プリンヌクレオシド生産能の評価結果を表１３に示す。変異型prsDAをプラスミドとして導入することにより、イノシン生産増大効果が認められた。
[実施例１１]
1)キサントシン・フォスフォリラーゼ遺伝子(xapA)欠失株の取得
遺伝子データバンク（E.coli Gene Bank）において「xapA」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製された、４種類のプライマーによるCross-over PCR法により、一段階操作にて変異不活化遺伝子を構築した。使用したプライマーを以下に示す。
1)キサントシン・フォスフォリラーゼ遺伝子(xapA)欠失株の取得
遺伝子データバンク（E.coli Gene Bank）において「xapA」をキーワードにして検索される情報に基づいて作製された、４種類のプライマーによるCross-over PCR法により、一段階操作にて変異不活化遺伝子を構築した。使用したプライマーを以下に示す。
N-out:5'-CGCGGATCCGCGACATAGCCGTTGTCGCC-3'（配列番号29）
N-in: 5'-CCCATCCACTAAACTTAAACATCGTGGCGTGAAATCAGG-3'（配列番号30）
C-in: 5'-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCATCAACCTTATTTGTGG-3'（配列番号31）
C-out:5'-CGCAAGCTTCAAACTCCGGGTTACGGGCG-3'（配列番号32）
N-in: 5'-CCCATCCACTAAACTTAAACATCGTGGCGTGAAATCAGG-3'（配列番号30）
C-in: 5'-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCATCAACCTTATTTGTGG-3'（配列番号31）
C-out:5'-CGCAAGCTTCAAACTCCGGGTTACGGGCG-3'（配列番号32）
まず、N-out(29mer)とN-in(39mer)およびC-in(39mer)とC-out(29mer)の両端プライマーにより、W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、それぞれPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、２つのPCR産物（ともに約850bp断片）を得、次に２つのPCR産物を混合して、再度N-outとC-outを両端プライマーとしてPCRを行い、xapA構造遺伝子領域を含む遺伝子領域が約2.4kb断片（野生型のサイズ）から約1.7kb断片に短縮した遺伝子断片を増幅した。またN-outとC-outのPCR用プライマーにはBamHＩサイトとHindIIIサイトがそれぞれデザインされている。このPCR産物をBamHIとHindIIIで切断後、この断片と温度感受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）をBamHIとHindIIIで切断したプラスミドとのライゲイションをT4 DNA リガーゼで行った。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からBamHIとHindIIIでの消化で約1.7kbの切断断片が生じるプラスミドDNA(pMAN997xapA'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するxapAは構造遺伝子の約700bpが欠失することで、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図３）。
このプラスミドpMAN997xapA'#１でFADRaddeddyicPpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-)を30℃で形質転換し、それぞれ得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体をシングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培
養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。これらの目的クローンの染色体DNAから先に示したN-outとC-outのPCRプライマーでPCRによりxapA領域を増幅させ、増幅断片サイズが約1.7kbのクローンを選択した。これらのクローンをxapA欠失株とし、FADRaddeddyicPpgixapA株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,xapA-)とした。このxapA欠失株では、キサントシンの添加培養によって、培地中にキサンチンの生成が認められず、またキサントシン・フォスフォリラーゼが誘導されていないことも確認できた。キサントシン・フォスフォリラーゼ活性の測定はK. Hammer Jespersenら(Molec. Gen. Genet., 179, 341-348(1980))の方法に従って行った。
養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。これらの目的クローンの染色体DNAから先に示したN-outとC-outのPCRプライマーでPCRによりxapA領域を増幅させ、増幅断片サイズが約1.7kbのクローンを選択した。これらのクローンをxapA欠失株とし、FADRaddeddyicPpgixapA株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,xapA-)とした。このxapA欠失株では、キサントシンの添加培養によって、培地中にキサンチンの生成が認められず、またキサントシン・フォスフォリラーゼが誘導されていないことも確認できた。キサントシン・フォスフォリラーゼ活性の測定はK. Hammer Jespersenら(Molec. Gen. Genet., 179, 341-348(1980))の方法に従って行った。
2)脱感作型purFプラスミド導入株のプリンヌクレオシド生産能評価
1)で作製したFADRaddeddyicPpgixapA株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,xapA-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じであるが、MS培地中のイーストエキストラクトを0.8%に増量した培地を使用した。
1)で作製したFADRaddeddyicPpgixapA株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,xapA-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じであるが、MS培地中のイーストエキストラクトを0.8%に増量した培地を使用した。
プリンヌクレオシド生産能の評価結果を表１４に示す。MS培地中のイーストエキストラクトを増量した場合に、培養後半の糖消費後に顕著に生じるヒポキサンチンの副生が、xapAを欠失することにより減少するとともに、イノシン生産増大効果が認められた。
[実施例１２]
1)ヌクレオシドパーミアーゼ遺伝子(nupG)欠失株の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）の情報に基づき、CTCGAATTCATGGTGCCGAACCACCTTGATAAACG（配列番号33）とCTCGTCGACATGCCGAAACCGGCGAATATAGCGAC（配列番号34）の塩基配列を有する35merと35merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと翻訳終止コドンをカバーするnupG構造遺伝子領域の約2.7Kb断片を増幅した。PCR用プライマーにはEcoRＩサイトとSalIサイトがそれぞれデザインされている。この増幅断片をEcoRI、SalIおよびAflIIで処理した。AflIIサイトはPCR増幅断片中に２ヶ所あり、約750bp、820bpおよび1130bpの３断片が生成する。その中でAflII切断断片の約820bpを除く約720bpと1130bpの２断片を回収し、pUC18ベクター（宝酒造社製）をEcoRIおよびSalI切断したDNAとT4 DNA リガーゼでライゲーションした。このライゲイション液でE.coli HB101を形質転換し、出現したコロニーの16個よりプラスミドを調製し、EcoRIとSalIでの切断断片が約1.9kbのクローン(pUC18nupG'#1)を選択した。さらにpUC18nupG'#1をEcoRIとSalIで処理し、生じる約1.9kbの断片と温度感
受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）をEcoRIとSalIで切断したプラスミドとのライゲイションをT4 DNA リガーゼで行った。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からEcoRIとSalIでの処理で約1.9kbの切断断片が生じるプラスミドDNA(pMAN997nupG'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するnupGは構造遺伝子の約820bpを欠失させることで、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図３）。
1)ヌクレオシドパーミアーゼ遺伝子(nupG)欠失株の取得
W3110株の染色体DNAを鋳型として用い、遺伝子データバンク（E. coli Gene Bank）の情報に基づき、CTCGAATTCATGGTGCCGAACCACCTTGATAAACG（配列番号33）とCTCGTCGACATGCCGAAACCGGCGAATATAGCGAC（配列番号34）の塩基配列を有する35merと35merの両端プライマーによるPCR法（94℃,30sec; 55℃,1min; 72℃,2min; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model9600(ハ゜ーキンエルマー社製)）を行い、SD-ATGと翻訳終止コドンをカバーするnupG構造遺伝子領域の約2.7Kb断片を増幅した。PCR用プライマーにはEcoRＩサイトとSalIサイトがそれぞれデザインされている。この増幅断片をEcoRI、SalIおよびAflIIで処理した。AflIIサイトはPCR増幅断片中に２ヶ所あり、約750bp、820bpおよび1130bpの３断片が生成する。その中でAflII切断断片の約820bpを除く約720bpと1130bpの２断片を回収し、pUC18ベクター（宝酒造社製）をEcoRIおよびSalI切断したDNAとT4 DNA リガーゼでライゲーションした。このライゲイション液でE.coli HB101を形質転換し、出現したコロニーの16個よりプラスミドを調製し、EcoRIとSalIでの切断断片が約1.9kbのクローン(pUC18nupG'#1)を選択した。さらにpUC18nupG'#1をEcoRIとSalIで処理し、生じる約1.9kbの断片と温度感
受性複製起点(tsori)を有する相同組換え用ベクターであるpMAN997（上述）をEcoRIとSalIで切断したプラスミドとのライゲイションをT4 DNA リガーゼで行った。このライゲイション液でE.coli JM109のコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。10クローンの形質転換体からプラスミドDNAを調製し、この中からEcoRIとSalIでの処理で約1.9kbの切断断片が生じるプラスミドDNA(pMAN997nupG'#1)を選択した。本プラスミドDNAが有するnupGは構造遺伝子の約820bpを欠失させることで、コードされる酵素は機能を持たなくなると予測される（図３）。
このプラスミドpMAN997nupG'#１でFADRaddeddyicPpgi株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-)を30℃で形質転換し、得られたコロニーの複数個をアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した。次にこれらの培養菌体を、シングルコロニーが得られるようにアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。さらにもう一度、42℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返し、相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択した。本クローンがプラスミドを細胞質液中に持たないことを確認した。次にこのクローンの複数個をLB寒天プレートに塗布し、30℃で一晩培養した後に、LB液体培地（3ml／試験管）に接種し、42℃で3〜4時間、振とう培養した。これをシングルコロニーが得られるように適当に希釈(10-5〜10-6程度)し、LB寒天プレートに塗布し、42℃で一晩培養し、コロニーを得た。出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれをLB寒天プレートとアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、LB寒天プレートにのみ生育するアンピシリン感受性のクローンを選んだ。これらの目的クローンの染色体DNAから先に示したPCRプライマーでPCRによりnupG領域を増幅させ、増幅断片サイズが約1.9kbのクローンを選択した。これらのクローンをnupG欠失株とし、それぞれFADRaddeddyicPpginupG株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,nupG-)とした。
2)脱感作型purFプラスミド導入株のプリンヌクレオシド生産能評価
1)で作製したFADRaddeddyicPpginupG株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,nupG-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じであるが、MS培地中のイーストエキストラクトを1.2%に増量した培地を使用した。
1)で作製したFADRaddeddyicPpginupG株(purF-,purA-,deoD-,purR-,add-,edd-,yicP-,pgi-,nupG-)にpKFpurFKQを導入した形質転換体を作製し、これらの株のプリンヌクレオシド生産能を評価した。プリンヌクレオシド生産用の基本培地および培養方法ならびに分析方法は実施例１と同じであるが、MS培地中のイーストエキストラクトを1.2%に増量した培地を使用した。
プリンヌクレオシド生産能の評価結果を表１５に示す。MS培地中のイーストエキストラクトを増量した場合に、nupGの欠失により、培養後半の糖消費後に顕著に生じるヒポキサンチンの副生が減少するとともに、イノシン生産増大効果が認められた。
本発明によれば、プリンヌクレオシド生合成系で制御を受ける酵素を脱抑制および脱感作し、さらには分解系や転換系をブロックすることにより、プリンヌクレオシド生産菌が創製される。創製されたプリンヌクレオチド生産菌は、プリンヌクレオシドを発酵法により生産するために好適に使用できる。
Claims (7)
- プリンヌクレオシド生産能を有するエシェリヒア属細菌を培地に培養し、プリンヌクレオシドを生成蓄積せしめ、プリンヌクレオシドを回収することを特徴とする発酵法によるプリンヌクレオシドの製造方法であって、前記細菌は、ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼのフィードバック阻害が解除され、プリン・リプレッサーが不活化され、かつアデノシン・デアミナーゼ、サクシニル−アデノシンモノリン酸シンターゼ、及び、プリンヌクレオシド・フォスフォリラーゼにより触媒される反応が遮断されるように改変された細菌である前記方法。
- 前記ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼのアミノ酸配列の326位のリジンがグルタミンに置換、及び／又は、410位のプロリンがトリプトファンに置換することによって、前記フィードバック阻害が解除される請求項１記載の方法。
- 前記ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼのアミノ酸配列の128位のアスパラギン酸がアラニンに置換することによって、前記フィードバック阻害が解除される請求項１又は２記載の方法。
- 前記細菌が、さらに、プリンヌクレオシド生合成から分岐して他の代謝産物にいたる反応が遮断されるように改変され、当該反応が、イノシン−グアノシン・キナーゼ、グアノシンモノリン酸リダクターゼ、６−フォスフォグルコン酸デヒドラーゼ、フォスフォグルコース・イソメラーゼ、アデニン・デアミナーゼ、キサントシン・フォスフォリラーゼから選ばれる酵素により触媒される反応である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細菌が、さらに、プリンヌクレオシド生合成から分岐して他の代謝産物にいたる反応が遮断されるように改変され、当該反応が、フォスフォグルコース・イソメラーゼにより触媒される反応である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細菌が、さらに、ヌクレオシドパーミアーゼの弱化によりプリンヌクレオシドの細胞内への取り込みが弱化された細菌である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記プリンヌクレオシドが、イノシン、グアノシン、及び、アデノシンから選択される一種以上のプリンヌクレオシドである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
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