JP4913929B2 - 核酸系物質の製造法 - Google Patents
核酸系物質の製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4913929B2 JP4913929B2 JP16570498A JP16570498A JP4913929B2 JP 4913929 B2 JP4913929 B2 JP 4913929B2 JP 16570498 A JP16570498 A JP 16570498A JP 16570498 A JP16570498 A JP 16570498A JP 4913929 B2 JP4913929 B2 JP 4913929B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- purr
- nucleic acid
- medium
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵法による核酸系物質の製造法に関する。核酸系物質は、調味料等の原料として産業上有用である。
【0002】
【従来の技術】
従来、発酵法によるイノシン、グアノシン等の核酸及びそれらの塩基(ヒポキサンチン、グアニン等)等の核酸系物質の製造においては、培地中のアデニン系物質の量を制限すると共に、アデニン要求性及び核酸アナログ耐性を付与した変異株(特公昭55−2956号公報、特公昭55−45199号公報)が用いられている。
【0003】
通常の変異処理により得られる変異株は、目的の遺伝子以外にも変異が導入されることが多く、また、核酸系物質の生合成経路には複雑な制御機構が存在するために、核酸系物質を著量生産する微生物を得ることは困難である。したがって、従来の菌株育種法によって得られた変異株は、必ずしも満足できるものではなかった。
【0004】
一方、プリン生合成系に関与する酵素群をコードする遺伝子(プリンオペロン)の発現に関与する配列を改変してプリンオペロンの発現を高めたバチルス属細菌を用いて、イノシンまたはグアノシンを製造する方法が開示されている(特開平3−164185号公報)。この方法は、プリンオペロンのプロモーター又はオペレーターを改変し、該オペロンの発現量を高め、それによってイノシン又はグアノシンの生産量を高めるというものである。
【0005】
バチルス・サチリス(Bacillus subtilis)のプリンオペロン(purEKBC(ORF)QLFMNHD:ORFは機能が未知のオープン・リーディング・フレーム)の発現は、過剰量のアデニンによって抑制され、また、グアニンによるアテニュエーションによっても調節を受けている。さらに、プリンオペロンの5’フランキング領域に結合するリプレッサータンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子(purR)が単離されており、purR遺伝子を破壊されたバチルス・サチリスは、プリンオペロンに組み込まれたpurC−lacZ融合遺伝子の発現のアデニンによる抑制が、約1/10に低減されたことが示されている(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7455-7549 (1995))。
【0006】
バチルス・サチリスでは、前記リプレッサータンパク質は、プリンオペロンの遺伝子群の他に、アデニンの生合成に関与するpurA遺伝子やピリミジン生合成に関与するピリミジンオペロンの遺伝子群の発現を調節することが知られている(1997, J. Bacteriol. 179, 7394-7402, H. Zalkin等)。
【0007】
一方、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)では、プリンオペロンリプレッサーは、プリンオペロンの遺伝子群の他に、5’−IMP(イノシン酸)生合成の基質となるグリシンの生合成に関与するglyA遺伝子の発現(1990, J. Bacteriol. 172, 3799-3803, H. Zalkin等)、及びグリシンから供給されるC1やCO2の生成に関与するgcvオペロン遺伝子群の発現にも影響することが報告されている(1993, J. Bacteriol. 175, 5129-5134, G. V. Stauffer 等)。
【0008】
前述のように、プリンオペロンとイノシン又はグアノシンの生産との関係については一部報告されている。しかし、purR遺伝子が関与する生合成系は多岐にわたっている。また、バチルス・サチリスのプリンオペロンは10個の酵素をコードしており、多くの反応に関与している。このように、核酸系物質の生合成系は非常に複雑であり、purR遺伝子と核酸系物質の蓄積との関係についてはほとんど知られていない。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、核酸系物質の産業上の重要性から、従来の方法よりもさらに有利に核酸系物質を製造する方法を提供することを課題とする。
【0010】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、purR遺伝子の機能について鋭意検討を行い、その結果、purR遺伝子を破壊したバチルス・サチリスが核酸系物質を蓄積することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0011】
すなわち本発明は、
(1)プリンオペロンのリプレッサータンパク質が正常に機能しない微生物を培地で培養し、培地中に核酸系物質を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とする核酸系物質の製造法、
(2)前記微生物が、染色体上の前記リプレッサータンパク質をコードする遺伝子が破壊されたことにより、該リプレッサータンパク質が正常に機能しないことを特徴とする(1)の方法、
(3)前記微生物がバチルス属細菌である(1)の方法、
(4)前記核酸系物質が核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドである(1)の方法、および
(5)前記核酸系物質が、ヒポキサンチン、ウラシル、グアニンまたはアデニンから選ばれる(4)の方法、である。
【0012】
本発明において、プリンオペロンのリプレッサータンパク質が正常に機能しないとは、プリンオペロンの5’フランキング領域にリプレッサータンパク質が結合し、該オペロンの転写を抑制する機能が、通常に比べて低いか又は実質的に消失していることをいう。
【0013】
本発明において核酸系物質とは、ヒポキサンチン、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン等の核酸塩基、イノシン、アデノシン、グアノシン、ウリジン、チミジン、シチジン等のヌクレオシド、イノシン酸、アデニル酸、グアニル酸、ウリジル酸、チミジル酸、シチジル酸等のヌクレオチド、又はこれらのヌクレオシドもしくはヌクレオチドのリボースがデオキシリボースに置換されたものをいう。これらの中では、核酸塩基が好ましい。本発明において、核酸系物質には、プリン系物質及びプリミジン系物質のいずれもが含まれる。プリン系物質には、プリン塩基、及びプリン塩基を有するヌクレオシド並びにヌクレオチドが含まれる。また、ピリミジン系物質には、ピリミジン塩基、及びピリミジン塩基を有するヌクレオシド並びにヌクレオチドが含まれる。本発明において、プリン系物質としてはヒポキサンチン、アデニン及びグアニンが好ましい。また、ピリミジン系物質としてはウラシルが好ましい。
【0014】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法に用いる微生物は、プリンオペロンのリプレッサータンパク質(以下、単に「リプレッサー」ともいう)が正常に機能しない微生物である。該微生物は、プリン系物質の生合成系酵素の遺伝子がオペロンを形成しており、該オペロンの調節に関与するリプレッサーをコードする遺伝子(purR)を有するものであれば特に制限されないが、具体的にはバチルス属等に属する細菌が挙げられる。バチルス属細菌としては、バチルス・サチリス、バチルス・アミロリケファシエンス等が挙げられる。
【0015】
リプレッサーが正常に機能しない微生物は、purR遺伝子が、該遺伝子産物であるリプレッサーの活性が低下又は消失するか、又はpurR遺伝子の転写が低下または消失するように、改変することによって得られる。このような微生物は、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196(1985))により、染色体上のpurR遺伝子を、正常に機能しないpurR遺伝子(以下、「破壊型purR遺伝子」ということがある)で置換することによって行うことができる。
【0016】
相同組換えは、染色体上の配列と相同性を有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体が染色体上に組み込まれる。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により破壊された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることもある。このような菌株を選択することにより、破壊型purR遺伝子が染色体上の正常なpurR遺伝子と置換された菌株を取得することができる。
【0017】
このような相同組換えによる遺伝子破壊技術は既に確立しており、直鎖DNAを用いる方法、温度感受性プラスミドを用いる方法等が利用できる。また、薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたpurR遺伝子を含み、かつ、目的とする微生物細胞内で複製できないプラスミドを用いることによっても、purR遺伝子の破壊を行うことができる。すなわち、前記プラスミドで形質転換され、薬剤耐性を獲得した形質転換体は、染色体DNA中にマーカー遺伝子が組み込まれている。このマーカー遺伝子は、その両端のpurR遺伝子配列と染色体上のpurR遺伝子との相同組換えによって組み込まれる可能性が高いため、効率よく遺伝子破壊株を選択することができる。
【0018】
遺伝子破壊に用いる破壊型purR遺伝子は、具体的には、制限酵素消化及び再結合によるpurR遺伝子の一定領域の欠失、purR遺伝子への他のDNA断片(マーカー遺伝子等)の挿入、または部位特異的変異法(Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987))や次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理(Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978))によって、purR遺伝子のコーディング領域またはプロモーター領域等の塩基配列の中に1つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることにより、コードされるリプレッサーの活性を低下又は消失させるか、又はpurR遺伝子の転写を低下または消失させることにより、取得することができる。これらの態様の中では、制限酵素消化及び再結合によりpurR遺伝子の一定領域を欠失させる方法、又はpurR遺伝子へ他のDNA断片を挿入する方法が、確実性及び安定性の点から好ましい。
【0019】
purR遺伝子は、プリンオペロンを持つ微生物の染色体DNAから、公知のpurR遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR法によって取得することができる。また、プリンオペロンを持つ微生物の染色体DNAライブラリーから、公知のpurR遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、purR遺伝子を取得することができる。バチルス・サチリス168 Marburg株では、purR遺伝子の塩基配列が報告されている(GenBank accession No.D26185(コード領域は塩基番号118041〜118898)、DDBJ Accession No.Z99104(コード領域は塩基番号54439〜55296))。尚、本発明においては、purR遺伝子は破壊型purR遺伝子の作製に用いるため、必ずしも全長を含む必要はなく、遺伝子破壊を起こすのに必要な長さを有していればよい。
【0020】
purR遺伝子の取得に用いる微生物は、該purR遺伝子が、遺伝子破壊株の創製に用いる微生物のpurR遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していれば特に制限されないが、通常これらは同じ微生物を用いることが好ましい。
【0021】
PCRに用いるプライマーとしては、purR遺伝子を増幅することができるものであればよく、具体的には配列番号1及び配列番号2に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【0022】
また、マーカー遺伝子としては、スペクチノマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。スペクチノマイシン耐性遺伝子は、バチルス ジェネチック ストック センター(BGSC)より市販されているエシェリヒア・コリ ECE101株から、プラスミドpDG1726を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。
【0023】
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いる場合は、該遺伝子をプラスミド中のpurR遺伝子の適当な部位に挿入し、得られるプラスミドで微生物を形質転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択すれば、purR遺伝子破壊株が得られる。染色体上のpurR遺伝子が破壊されたことは、サザンブロッティングやPCR法により、染色体上のpurR遺伝子又はマーカー遺伝子を解析することによって、確認することができる。前記スペクチノマイシン耐性遺伝子が染色体DNAに組み込まれたことの確認は、スペクチノマイシン耐性遺伝子を増幅することができるプライマー(例えば配列番号3及び4に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド)を用いたPCRにより、行うことができる。
【0024】
上記のようにして得られるリプレッサーが正常に機能しない微生物を好適な培地で培養することによって、培地中に核酸系物質を生成蓄積せしめることができる。
【0025】
本発明に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可能なものならばよい。
【0026】
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
【0027】
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用される。
【0028】
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
【0029】
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養条件は、用いる微生物の種類によるが、例えばバチルス・サチリスでは、発酵温度20〜50℃、pHを4〜9に制御しつつ通気培養を行う。培養中にpHが低下する場合にはアンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして40時間〜3日間程度培養することにより、培養液中に核酸系物質が蓄積される。
【0030】
培養終了後、培養液中に蓄積された核酸系物質を採取する方法としては公知の方法に従って行えばよい。例えば、沈殿法、またはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。
【0031】
また、本発明に用いる微生物は、さらにヌクレオシダーゼやヌクレオチダーゼをコードする遺伝子を欠損させれば、各々に対応するヌクレオシド又はヌクレオチドを蓄積させることができ、又アデニンやグアニンの要求性を付与すれば、これらの生合成系経路上の前駆体及びその関連物質を蓄積させることができる。
【0032】
さらに、本発明の方法により製造された核酸塩基に、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ又はホスホリボシルトランスフェラーゼを作用させることにより、該塩基に対応するヌクレオシド又はヌクレオチドが得られる。
【0033】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。
【0034】
【実施例1】
<1>purR遺伝子のクローニング
バチルス・サチリス168 Marburg株(ATCC6051)のpurR遺伝子を含むDNA断片を、該細菌の染色体DNAを鋳型としたPCRにより取得した。
【0035】
染色体DNAは、次のようにして調製した。バチルス・サチリスATCC6051株を50mlのLB培地に接種し、37℃で一夜培養した後集菌し、リゾチーム1mg/mlを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりDNAを沈殿させた。生じたDNAの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、PCRに用いた。
【0036】
PCR用のプライマーには、バチルス・サチリス168 Marburg株の既知のpurR遺伝子の塩基配列(GenBank accession No.D26185(コード領域は塩基番号118041〜118898)、DDBJ Accession No.Z99104(コード領域は塩基番号54439〜55296))に基づいて設計した配列番号1及び2に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(日本バイオサービス(株)に委託して合成した)を用いた。これらのプライマーの5’末端付近及び3’末端付近には、それぞれHindIII及びPstIの制限酵素認識配列を有する。
【0037】
前記染色体DNA 6ng/μl及びプライマー各3μMを含む0.1mlのPCR反応液を用いて、変性:94℃、1分、アニーリング:45℃、1分、伸長反応:72℃、1分からなる反応サイクルを、30サイクルの条件でPCRを行なった。
【0038】
上記反応産物及びプラスミドpHSG398(宝酒造(株))を、HindIII及びPstIで消化し、ライゲーション・キット(宝酒造(株))を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリJM109を形質転換した。形質転換株を、クロラムフェニコール(Cm)30μg/ml及びX−Gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド)を含むLB寒天培地で培養し、クロラムフェニコール耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のDNA断片が挿入されたプラスミドを、pHSG398BSPRと命名した(図1)。
【0039】
<2>破壊型purR(ΔpurR)を含むプラスミドの作製
バチルス ジェネチック ストック センター(BGSC)より市販されているエシェリヒア・コリ ECE101株から、プラスミドpDG1726を調製した。該プラスミドは、スペクチノマイシン耐性(Spr)遺伝子をカセットで取り出すことができる。
【0040】
pDG1726及び<1>で得たpHSG398BSPRを、各々HincII及びEcoRVの制限酵素で完全切断(図2)及び部分切断した後、フェノール処理した。各DNAをライゲーション・キットで連結した後、該ライゲーション溶液を用いて、エシェリヒア・コリJM109を形質転換し、クロラムフェニコール50μg/ml及びスペクチノマイシン100μg/mlを含むLB寒天培地で培養した。得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、purR遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子の挿入によって破壊されたプラスミドpHSG398ΔBSPR:Sprを得た(図3)。
【0041】
<3>purR遺伝子破壊株の取得
上記<2>で得たプラスミドpHSG398ΔBSPR:Sprを用いて、バチルス・サチリスSB112(BGSC 1A227)を形質転換した。形質転換は、Ishiwaらの方法(Ishiwa H. et al., 1986, Jpn.J, Genet. 61 515-528)に従って、コンピテントセルを調製して行なった。プラスミドpHSG398ΔBSPR:Sprは、バチルス・サチリスの細胞中ではDNA複製ができない。しかし、該プラスミドはスペクチノマイシン耐性遺伝子の5’側及び3’側に、染色体purRと相同な領域を有するため、染色体purR遺伝子と2重交差組み換えにより、遺伝子置換を行うことができる。
【0042】
上記形質転換株をスペクチノマイシン100μg/mlを含むLB寒天培地で培養し、生育する株を選択することにより、染色体purR遺伝子がΔBSPR:Spr遺伝子により置換された株を取得した。目的どおりの遺伝子置換が生じていることは、候補株の染色体DNAを鋳型とし、前記purR遺伝子用プライマー(配列番号1及び2)、及び、配列番号3及び4に示す塩基配列を有するSpr遺伝子用プライマー(日本バイオサービス(株)に委託合成した。)を用いたPCRを行い、ΔpurR:Spr部分の大きさとスペクチノマイシン耐性遺伝子の挿入により確認した。こうして得られた遺伝子置換株の1つを、バチルス・サチリス SB112Kと名づけた。
【0043】
<4>purR欠損株による核酸の生産
上記<3>で作製したバチルス・サチリスSB112K株、及び親株のバチルス・サチリスSB112を、スペクチノマイシン100μg/mlを含むLB及びLB寒天培地で37℃1晩培養した後、表1に示した生産培地20mlに、各3白金耳を接種し、32℃で72時間培養した。
【0044】
【表1】
【0045】
培養終了後、培養液中のヒポキサンチン、ウラシル、グアノシン、グアニン、アデノシン、アデニンの蓄積量を、高速液体クロマトグラフィーで測定した。その結果を表2に示す。purR欠損株、SB112Kは、約600mg/Lという著量のヒポキサンチンを蓄積し、親株に比べて約20倍の蓄積量の増加を示した。また、ウラシルは親株に比べて5倍以上蓄積量が増加した。さらに、親株では蓄積が認められなかったアデニン及びグアニンも、purR欠損株では蓄積が認められた。
【0046】
【表2】
【0047】
【発明の効果】
本発明により、核酸系物質又はその原料を効率よく製造することができる。
【0048】
【配列表】
【0049】
【0050】
【0051】
【0052】
【0053】
【図面の簡単な説明】
【図1】 プラスミドpHSG398BSPRの構造を示す図。太線はバチルス・サチリスSB112由来のpurR遺伝子を示す。カッコ内の数値はコーディング領域の最初を1としたときの位置を示す。細線はプラスミッドpHSG398である。
【図2】 pHSG398BSPRをHincII及びEcoRVで完全切断して得た断片を示す図。
【図3】 purR遺伝子破壊用プラスミドpHSG398ΔBSPR:Sprの構造を示す図。太線はバチルス・サチリスSB112の破壊型purR遺伝子(ΔpurR)を示す。カッコ内の数値はコーディング領域の最初を1としたときの位置を示す。細線はスペクチノマイシン耐性遺伝子、点線はプラスミドpHSG398である。
Claims (2)
- 染色体上のプリンオペロンリプレッサータンパク質をコードする遺伝子が破壊されたことにより、該リプレッサータンパク質をコードする遺伝子の転写が低下または消失するように改変されたバチルス属細菌を培地で培養し、培地中にヒポキサンチンおよびグアニンから選択される核酸系物質を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするヒポキサンチンおよびグアニンから選択される核酸系物質の製造法。
- 染色体上のプリンオペロンリプレッサータンパク質をコードする遺伝子が破壊されたことにより、該リプレッサータンパク質をコードする遺伝子の転写が低下または消失するように改変され、かつアデニン要求性を付与されたバチルス属細菌を培地で培養し、培地中にイノシンを生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするイノシンの製造法。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16570498A JP4913929B2 (ja) | 1998-06-12 | 1998-06-12 | 核酸系物質の製造法 |
US09/327,681 US6284495B1 (en) | 1998-06-12 | 1999-06-08 | Method for producing nucleic acid substances |
IDP990561A ID22863A (id) | 1998-06-12 | 1999-06-10 | Metoda untuk memproduksi bahan asam nukleat |
KR1019990021717A KR100642971B1 (ko) | 1998-06-12 | 1999-06-11 | 핵산 물질 생산 방법 |
CNB991083792A CN1150333C (zh) | 1998-06-12 | 1999-06-14 | 制备核酸物质的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16570498A JP4913929B2 (ja) | 1998-06-12 | 1998-06-12 | 核酸系物質の製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11346778A JPH11346778A (ja) | 1999-12-21 |
JP4913929B2 true JP4913929B2 (ja) | 2012-04-11 |
Family
ID=15817479
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP16570498A Expired - Lifetime JP4913929B2 (ja) | 1998-06-12 | 1998-06-12 | 核酸系物質の製造法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6284495B1 (ja) |
JP (1) | JP4913929B2 (ja) |
KR (1) | KR100642971B1 (ja) |
CN (1) | CN1150333C (ja) |
ID (1) | ID22863A (ja) |
Families Citing this family (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4352716B2 (ja) * | 2003-02-17 | 2009-10-28 | 味の素株式会社 | バチルス属に属するイノシン生産菌及びイノシンの製造法 |
BRPI0509056A (pt) * | 2004-03-31 | 2007-08-21 | Ajinomoto Kk | bactéria pertencendo ao gênero bacillus ou ao gênero escherichia, e, métodos para produzir um nucleosìdeo de purina, para produzir um nucleotìdeo de purina e para produzir ácido 5'-guanìlico |
US7326546B2 (en) * | 2005-03-10 | 2008-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
WO2007125783A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
KR101250826B1 (ko) * | 2006-04-24 | 2013-04-11 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 퓨린계 물질 생산균 및 퓨린계 물질의 제조법 |
CA2675026A1 (en) * | 2007-01-12 | 2008-07-24 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Compositions and methods for enhancing tolerance for the production of organic chemicals produced by microorganisms |
JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸または核酸の製造方法 |
US8048624B1 (en) | 2007-12-04 | 2011-11-01 | Opx Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for 3-hydroxypropionate bio-production from biomass |
JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
US8809027B1 (en) | 2009-09-27 | 2014-08-19 | Opx Biotechnologies, Inc. | Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase |
AU2010298004B2 (en) | 2009-09-27 | 2016-02-25 | Opx Biotechnologies, Inc. | Method for producing 3-hydroxypropionic acid and other products |
CA2781400A1 (en) * | 2009-11-20 | 2011-05-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Production of an organic acid and/or related chemicals |
US20120264902A1 (en) * | 2011-04-18 | 2012-10-18 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Methods, Systems and Compositions for Increased Microorganism Tolerance to and Production of 3-Hydroxypropionic Acid (3-HP) |
SG11201501013PA (en) | 2012-08-10 | 2015-04-29 | Opx Biotechnologies Inc | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
CA2905602A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sarah M. Hoyt | Flash evaporation for product purification and recovery |
WO2014146026A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Opx Biotechnologies, Inc. | Bioproduction of chemicals |
US11408013B2 (en) | 2013-07-19 | 2022-08-09 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
JP6603658B2 (ja) | 2013-07-19 | 2019-11-06 | カーギル インコーポレイテッド | 脂肪酸及び脂肪酸誘導体の製造のための微生物及び方法 |
EP3053999B1 (en) | 2013-10-02 | 2019-11-20 | Ajinomoto Co., Inc. | Ammonia control apparatus and ammonia control method |
EP3061828A4 (en) | 2013-10-23 | 2017-03-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance |
JP2015142566A (ja) * | 2013-12-26 | 2015-08-06 | 国立大学法人 鹿児島大学 | 養魚用飼料 |
EP2993228B1 (en) | 2014-09-02 | 2019-10-09 | Cargill, Incorporated | Production of fatty acid esters |
JP2020506702A (ja) | 2017-02-02 | 2020-03-05 | カーギル インコーポレイテッド | C6−c10脂肪酸誘導体を生成する遺伝子組み換え細胞 |
WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
US20220354855A1 (en) * | 2019-10-09 | 2022-11-10 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Treatment for gastrointestinal disorders |
CN111471635B (zh) * | 2020-04-13 | 2022-02-15 | 江南大学 | 一种提高枯草芽孢杆菌核酸含量的方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW201793B (ja) | 1989-08-04 | 1993-03-11 | Takeda Pharm Industry Co Ltd | |
JP3164185B2 (ja) | 1994-04-21 | 2001-05-08 | 富士電機株式会社 | 整流ダイオードのサージ保護回路 |
-
1998
- 1998-06-12 JP JP16570498A patent/JP4913929B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-06-08 US US09/327,681 patent/US6284495B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-10 ID IDP990561A patent/ID22863A/id unknown
- 1999-06-11 KR KR1019990021717A patent/KR100642971B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-06-14 CN CNB991083792A patent/CN1150333C/zh not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1150333C (zh) | 2004-05-19 |
KR20000006105A (ko) | 2000-01-25 |
KR100642971B1 (ko) | 2006-11-13 |
US6284495B1 (en) | 2001-09-04 |
CN1239143A (zh) | 1999-12-22 |
ID22863A (id) | 1999-12-16 |
JPH11346778A (ja) | 1999-12-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4913929B2 (ja) | 核酸系物質の製造法 | |
KR101086208B1 (ko) | 푸린계 물질 생산균 및 푸린계 물질의 제조법 | |
JP4760711B2 (ja) | バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を使用した発酵によるプリンヌクレオシド及びヌクレオチドの製造方法 | |
KR101250826B1 (ko) | 퓨린계 물질 생산균 및 퓨린계 물질의 제조법 | |
KR101173533B1 (ko) | 퓨린계 물질 생산균 및 퓨린계 물질의 제조법 | |
JP5488594B2 (ja) | プリンリボヌクレオシド及びリボヌクレオチドの製造方法 | |
US20030129708A1 (en) | Mutant carbamoylphosphate synthetase and method for producing compounds derived from carbamoylphosphate | |
JP4352716B2 (ja) | バチルス属に属するイノシン生産菌及びイノシンの製造法 | |
EP0286303B1 (en) | Dna and its use | |
KR101669474B1 (ko) | 5'-구아닐산의 생산방법 | |
JP2003219876A (ja) | プリンヌクレオシドおよびプリンヌクレオチドの製造方法 | |
EP0412688A1 (en) | Modified DNA and its use | |
EP0465132A2 (en) | DNA and its use | |
JP2007075108A (ja) | プリンヌクレオシド生産菌及びプリンヌクレオシド製造法 | |
EP1844135B1 (en) | Escherichia strain capable of converting xmp to gmp and maintaining the inactivated state of gene(s) associated with gmp degradation and methods of using the same | |
JP5583311B2 (ja) | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 | |
RU2405833C2 (ru) | Способ микробиологического синтеза пуринового нуклеозида 5'-аминоимидазол-4-карбоксамидрибозида (аикар) и штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент аикар | |
RU2244004C2 (ru) | Способ получения инозина и 5'-инозиновой кислоты, штамм escherichia coli - продуцент инозина | |
JPH05192164A (ja) | 組換えdnaおよびその用途 | |
JP2938497B2 (ja) | 発酵法によるシチジンの製造方法 | |
KR20020019938A (ko) | 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드 생산을 위한 벡터, 세포및 피리미딘 데옥시리보뉴클레오시드 생산 방법 | |
CN117417906A (zh) | 重组微生物及其在生产核苷中的应用 | |
CN117587055A (zh) | 一种提高微生物核苷产量的方法 | |
JP2001046097A5 (ja) | ||
JP2003250570A (ja) | 2’−デオキシリボヌクレオシド化合物の製造方法及びこの中間体の製造方法、並びにこれらに使用する2−デオキシリボース5−リン酸アルドラーゼ遺伝子 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040722 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070130 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070330 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070330 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070918 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071119 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20081028 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081127 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20090203 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20090612 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111020 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120120 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150127 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150127 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |