JPH11346778A

JPH11346778A - 核酸系物質の製造法

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Publication number: JPH11346778A
Application number: JP10165704A
Authority: JP
Inventors: Katsuaki Sato; 勝明佐藤; Yoshihiro Usuda; 佳弘臼田
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1998-06-12
Publication date: 1999-12-21
Anticipated expiration: 2018-06-12
Also published as: ID22863A; CN1239143A; US6284495B1; CN1150333C; KR100642971B1; JP4913929B2; KR20000006105A

Abstract

(57)【要約】【課題】効率よく核酸系物質を製造する方法を提供す
る。【解決手段】プリンオペロンのリプレッサータンパク
質が正常に機能しない微生物、好ましくは該タンパク質
をコードする染色体上の遺伝子（ｐｕｒＲ）が破壊され
た株を培地で培養し、培地中に核酸系物質を生成蓄積せ
しめ、これを該培地から採取する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法による核酸
系物質の製造法に関する。核酸系物質は、調味料等の原
料として産業上有用である。

【０００２】

【従来の技術】従来、発酵法によるイノシン、グアノシ
ン等の核酸及びそれらの塩基（ヒポキサンチン、グアニ
ン等）等の核酸系物質の製造においては、培地中のアデ
ニン系物質の量を制限すると共に、アデニン要求性及び
核酸アナログ耐性を付与した変異株（特公昭５５−２９
５６号公報、特公昭５５−４５１９９号公報）が用いら
れている。

【０００３】通常の変異処理により得られる変異株は、
目的の遺伝子以外にも変異が導入されることが多く、ま
た、核酸系物質の生合成経路には複雑な制御機構が存在
するために、核酸系物質を著量生産する微生物を得るこ
とは困難である。したがって、従来の菌株育種法によっ
て得られた変異株は、必ずしも満足できるものではなか
った。

【０００４】一方、プリン生合成系に関与する酵素群を
コードする遺伝子（プリンオペロン）の発現に関与する
配列を改変してプリンオペロンの発現を高めたバチルス
属細菌を用いて、イノシンまたはグアノシンを製造する
方法が開示されている（特開平３−１６４１８５号公
報）。この方法は、プリンオペロンのプロモーター又は
オペレーターを改変し、該オペロンの発現量を高め、そ
れによってイノシン又はグアノシンの生産量を高めると
いうものである。

【０００５】バチルス・サチリス（Bacillus subtili
s）のプリンオペロン（purEKBC(ORF)QLFMNHD：ORFは機
能が未知のオープン・リーディング・フレーム）の発現
は、過剰量のアデニンによって抑制され、また、グアニ
ンによるアテニュエーションによっても調節を受けてい
る。さらに、プリンオペロンの５’フランキング領域に
結合するリプレッサータンパク質及び該タンパク質をコ
ードする遺伝子（ｐｕｒＲ）が単離されており、ｐｕｒ
Ｒ遺伝子を破壊されたバチルス・サチリスは、プリンオ
ペロンに組み込まれたｐｕｒＣ−ｌａｃＺ融合遺伝子の
発現のアデニンによる抑制が、約１／１０に低減された
ことが示されている（Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 92,
7455-7549 (1995)）。

【０００６】バチルス・サチリスでは、前記リプレッサ
ータンパク質は、プリンオペロンの遺伝子群の他に、ア
デニンの生合成に関与するｐｕｒＡ遺伝子やピリミジン
生合成に関与するピリミジンオペロンの遺伝子群の発現
を調節することが知られている（1997, J. Bacteriol.
179, 7394-7402, H. Zalkin等）。

【０００７】一方、エシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）では、プリンオペロンリプレッサーは、プリンオ
ペロンの遺伝子群の他に、５’−ＩＭＰ（イノシン酸）
生合成の基質となるグリシンの生合成に関与するｇｌｙ
Ａ遺伝子の発現（1990, J. Bacteriol. 172, 3799-380
3, H. Zalkin等）、及びグリシンから供給されるＣ₁や
ＣＯ₂の生成に関与するｇｃｖオペロン遺伝子群の発現
にも影響することが報告されている（1993, J. Bacteri
ol. 175, 5129-5134, G. V. Stauffer 等）。

【０００８】前述のように、プリンオペロンとイノシン
又はグアノシンの生産との関係については一部報告され
ている。しかし、ｐｕｒＲ遺伝子が関与する生合成系は
多岐にわたっている。また、バチルス・サチリスのプリ
ンオペロンは１０個の酵素をコードしており、多くの反
応に関与している。このように、核酸系物質の生合成系
は非常に複雑であり、ｐｕｒＲ遺伝子と核酸系物質の蓄
積との関係についてはほとんど知られていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、核酸系物質
の産業上の重要性から、従来の方法よりもさらに有利に
核酸系物質を製造する方法を提供することを課題とす
る。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために、ｐｕｒＲ遺伝子の機能について鋭意
検討を行い、その結果、ｐｕｒＲ遺伝子を破壊したバチ
ルス・サチリスが核酸系物質を蓄積することを見出し、
本発明を完成するに至った。

【００１１】すなわち本発明は、（１）プリンオペロン
のリプレッサータンパク質が正常に機能しない微生物を
培地で培養し、培地中に核酸系物質を生成蓄積せしめ、
これを該培地から採取することを特徴とする核酸系物質
の製造法、（２）前記微生物が、染色体上の前記リプレ
ッサータンパク質をコードする遺伝子が破壊されたこと
により、該リプレッサータンパク質が正常に機能しない
ことを特徴とする（１）の方法、（３）前記微生物がバ
チルス属細菌である（１）の方法、（４）前記核酸系物
質が核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドである
（１）の方法、および（５）前記核酸系物質が、ヒポキ
サンチン、ウラシル、グアニンまたはアデニンから選ば
れる（４）の方法、である。

【００１２】本発明において、プリンオペロンのリプレ
ッサータンパク質が正常に機能しないとは、プリンオペ
ロンの５’フランキング領域にリプレッサータンパク質
が結合し、該オペロンの転写を抑制する機能が、通常に
比べて低いか又は実質的に消失していることをいう。

【００１３】本発明において核酸系物質とは、ヒポキサ
ンチン、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シト
シン等の核酸塩基、イノシン、アデノシン、グアノシ
ン、ウリジン、チミジン、シチジン等のヌクレオシド、
イノシン酸、アデニル酸、グアニル酸、ウリジル酸、チ
ミジル酸、シチジル酸等のヌクレオチド、又はこれらの
ヌクレオシドもしくはヌクレオチドのリボースがデオキ
シリボースに置換されたものをいう。これらの中では、
核酸塩基が好ましい。本発明において、核酸系物質に
は、プリン系物質及びプリミジン系物質のいずれもが含
まれる。プリン系物質には、プリン塩基、及びプリン塩
基を有するヌクレオシド並びにヌクレオチドが含まれ
る。また、ピリミジン系物質には、ピリミジン塩基、及
びピリミジン塩基を有するヌクレオシド並びにヌクレオ
チドが含まれる。本発明において、プリン系物質として
はヒポキサンチン、アデニン及びグアニンが好ましい。
また、ピリミジン系物質としてはウラシルが好ましい。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法に用いる微生物は、プリンオペロンのリプ
レッサータンパク質（以下、単に「リプレッサー」とも
いう）が正常に機能しない微生物である。該微生物は、
プリン系物質の生合成系酵素の遺伝子がオペロンを形成
しており、該オペロンの調節に関与するリプレッサーを
コードする遺伝子（ｐｕｒＲ）を有するものであれば特
に制限されないが、具体的にはバチルス属等に属する細
菌が挙げられる。バチルス属細菌としては、バチルス・
サチリス、バチルス・アミロリケファシエンス等が挙げ
られる。

【００１５】リプレッサーが正常に機能しない微生物
は、ｐｕｒＲ遺伝子が、該遺伝子産物であるリプレッサ
ーの活性が低下又は消失するか、又はｐｕｒＲ遺伝子の
転写が低下または消失するように、改変することによっ
て得られる。このような微生物は、例えば、遺伝子組換
え法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecular
Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (197
2); Matsuyama, S. andMizushima, S., J. Bacteriol.,
162, 1196(1985)）により、染色体上のｐｕｒＲ遺伝子
を、正常に機能しないｐｕｒＲ遺伝子（以下、「破壊型
ｐｕｒＲ遺伝子」ということがある）で置換することに
よって行うことができる。

【００１６】相同組換えは、染色体上の配列と相同性を
有する配列を持つプラスミド等が菌体内に導入される
と、ある頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起
こし、導入されたプラスミド全体が染色体上に組み込ま
れる。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇
所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から
抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により破壊さ
れた遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝
子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることも
ある。このような菌株を選択することにより、破壊型ｐ
ｕｒＲ遺伝子が染色体上の正常なｐｕｒＲ遺伝子と置換
された菌株を取得することができる。

【００１７】このような相同組換えによる遺伝子破壊技
術は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法、温度
感受性プラスミドを用いる方法等が利用できる。また、
薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたｐｕｒ
Ｒ遺伝子を含み、かつ、目的とする微生物細胞内で複製
できないプラスミドを用いることによっても、ｐｕｒＲ
遺伝子の破壊を行うことができる。すなわち、前記プラ
スミドで形質転換され、薬剤耐性を獲得した形質転換体
は、染色体ＤＮＡ中にマーカー遺伝子が組み込まれてい
る。このマーカー遺伝子は、その両端のｐｕｒＲ遺伝子
配列と染色体上のｐｕｒＲ遺伝子との相同組換えによっ
て組み込まれる可能性が高いため、効率よく遺伝子破壊
株を選択することができる。

【００１８】遺伝子破壊に用いる破壊型ｐｕｒＲ遺伝子
は、具体的には、制限酵素消化及び再結合によるｐｕｒ
Ｒ遺伝子の一定領域の欠失、ｐｕｒＲ遺伝子への他のＤ
ＮＡ断片（マーカー遺伝子等）の挿入、または部位特異
的変異法（Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in
Enzymology, 154, 350 (1987)）や次亜硫酸ナトリウ
ム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理（Shor
tle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S.A., 75, 270(1978)）によって、ｐｕｒＲ遺伝子のコ
ーディング領域またはプロモーター領域等の塩基配列の
中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加
または逆位を起こさせることにより、コードされるリプ
レッサーの活性を低下又は消失させるか、又はｐｕｒＲ
遺伝子の転写を低下または消失させることにより、取得
することができる。これらの態様の中では、制限酵素消
化及び再結合によりｐｕｒＲ遺伝子の一定領域を欠失さ
せる方法、又はｐｕｒＲ遺伝子へ他のＤＮＡ断片を挿入
する方法が、確実性及び安定性の点から好ましい。

【００１９】ｐｕｒＲ遺伝子は、プリンオペロンを持つ
微生物の染色体ＤＮＡから、公知のｐｕｒＲ遺伝子の塩
基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライ
マーとするＰＣＲ法によって取得することができる。ま
た、プリンオペロンを持つ微生物の染色体ＤＮＡライブ
ラリーから、公知のｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列に基づい
て作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブ
リダイゼーション法によって、ｐｕｒＲ遺伝子を取得す
ることができる。バチルス・サチリス１６８Ｍａｒｂｕ
ｒｇ株では、ｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列が報告されてい
る（GenBankaccession No.D26185（コード領域は塩基番
号118041〜118898）、DDBJ Accession No.Z99104(コー
ド領域は塩基番号54439〜55296)）。尚、本発明におい
ては、ｐｕｒＲ遺伝子は破壊型ｐｕｒＲ遺伝子の作製に
用いるため、必ずしも全長を含む必要はなく、遺伝子破
壊を起こすのに必要な長さを有していればよい。

【００２０】ｐｕｒＲ遺伝子の取得に用いる微生物は、
該ｐｕｒＲ遺伝子が、遺伝子破壊株の創製に用いる微生
物のｐｕｒＲ遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性
を有していれば特に制限されないが、通常これらは同じ
微生物を用いることが好ましい。

【００２１】ＰＣＲに用いるプライマーとしては、ｐｕ
ｒＲ遺伝子を増幅することができるものであればよく、
具体的には配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。

【００２２】また、マーカー遺伝子としては、スペクチ
ノマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられ
る。スペクチノマイシン耐性遺伝子は、バチルスジェ
ネチックストックセンター（ＢＧＳＣ）より市販さ
れているエシェリヒア・コリＥＣＥ１０１株から、プラ
スミドｐＤＧ１７２６を調製し、該プラスミドからカセ
ットとして取り出すことにより、取得することができ
る。

【００２３】マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用
いる場合は、該遺伝子をプラスミド中のｐｕｒＲ遺伝子
の適当な部位に挿入し、得られるプラスミドで微生物を
形質転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択すれ
ば、ｐｕｒＲ遺伝子破壊株が得られる。染色体上のｐｕ
ｒＲ遺伝子が破壊されたことは、サザンブロッティング
やＰＣＲ法により、染色体上のｐｕｒＲ遺伝子又はマー
カー遺伝子を解析することによって、確認することがで
きる。前記スペクチノマイシン耐性遺伝子が染色体ＤＮ
Ａに組み込まれたことの確認は、スペクチノマイシン耐
性遺伝子を増幅することができるプライマー（例えば配
列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チド）を用いたＰＣＲにより、行うことができる。

【００２４】上記のようにして得られるリプレッサーが
正常に機能しない微生物を好適な培地で培養することに
よって、培地中に核酸系物質を生成蓄積せしめることが
できる。

【００２５】本発明に用いる培地としては、炭素源、窒
素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミ
ン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用い
て常法により行うことができる。合成培地または天然培
地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源
および窒素源は培養する菌株の利用可能なものならばよ
い。

【００２６】炭素源としてはグルコース、グリセロー
ル、フラクトース、シュークロース、マルトース、マン
ノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の
糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等
も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。

【００２７】窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩また
は硝酸塩等が使用される。

【００２８】有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペ
プトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が
使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異
株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が
必要である。

【００２９】無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養条件は、用いる微生物の種類によるが、例えばバチ
ルス・サチリスでは、発酵温度２０〜５０℃、ｐＨを４
〜９に制御しつつ通気培養を行う。培養中にｐＨが低下
する場合にはアンモニアガス等のアルカリで中和する。
かくして４０時間〜３日間程度培養することにより、培
養液中に核酸系物質が蓄積される。

【００３０】培養終了後、培養液中に蓄積された核酸系
物質を採取する方法としては公知の方法に従って行えば
よい。例えば、沈殿法、またはイオン交換クロマトグラ
フィー等によって単離することができる。

【００３１】また、本発明に用いる微生物は、さらにヌ
クレオシダーゼやヌクレオチダーゼをコードする遺伝子
を欠損させれば、各々に対応するヌクレオシド又はヌク
レオチドを蓄積させることができ、又アデニンやグアニ
ンの要求性を付与すれば、これらの生合成系経路上の前
駆体及びその関連物質を蓄積させることができる。

【００３２】さらに、本発明の方法により製造された核
酸塩基に、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ又はホス
ホリボシルトランスフェラーゼを作用させることによ
り、該塩基に対応するヌクレオシド又はヌクレオチドが
得られる。

【００３３】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的
に説明する。

【００３４】

【実施例１】＜１＞ｐｕｒＲ遺伝子のクローニングバチルス・サチリス１６８Ｍａｒｂｕｒｇ株（ＡＴＣ
Ｃ６０５１）のｐｕｒＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、該
細菌の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得し
た。

【００３５】染色体ＤＮＡは、次のようにして調製し
た。バチルス・サチリスＡＴＣＣ６０５１株を５０ｍｌ
のＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜培養した後集菌し、
リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌
液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノー
ル沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿
は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、ＰＣＲ
に用いた。

【００３６】ＰＣＲ用のプライマーには、バチルス・サ
チリス１６８Ｍａｒｂｕｒｇ株の既知のｐｕｒＲ遺伝
子の塩基配列（GenBank accession No.D26185（コード
領域は塩基番号118041〜118898）、DDBJ Accession No.
Z99104(コード領域は塩基番号54439〜55296)）に基づい
て設計した配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチド（日本バイオサービス（株）に委託し
て合成した）を用いた。これらのプライマーの５’末端
付近及び３’末端付近には、それぞれＨｉｎｄIII及び
ＰｓｔＩの制限酵素認識配列を有する。

【００３７】前記染色体ＤＮＡ６ｎｇ／μｌ及びプラ
イマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用い
て、変性：９４℃、１分、アニーリング：４５℃、１
分、伸長反応：７２℃、１分からなる反応サイクルを、
３０サイクルの条件でＰＣＲを行なった。

【００３８】上記反応産物及びプラスミドｐＨＳＧ３９
８（宝酒造（株））を、ＨｉｎｄIII及びＰｓｔＩで消
化し、ライゲーション・キット（宝酒造（株））を用い
て連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エ
シェリヒア・コリＪＭ１０９を形質転換した。形質転換
株を、クロラムフェニコール（Ｃｍ）３０μｇ／ｍｌ及
びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養
し、クロラムフェニコール耐性で且つ白色コロニーとな
った形質転換株を得た。このようにして得られた形質転
換株よりプラスミドを抽出し、目的のＤＮＡ断片が挿入
されたプラスミドを、ｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲと命名し
た（図１）。

【００３９】＜２＞破壊型ｐｕｒＲ（ΔｐｕｒＲ）を含
むプラスミドの作製バチルスジェネチックストックセンター（ＢＧＳ
Ｃ）より市販されているエシェリヒア・コリＥＣＥ１
０１株から、プラスミドｐＤＧ１７２６を調製した。該
プラスミドは、スペクチノマイシン耐性（Ｓｐ^r）遺伝
子をカセットで取り出すことができる。

【００４０】ｐＤＧ１７２６及び＜１＞で得たｐＨＳＧ
３９８ＢＳＰＲを、各々ＨｉｎｃII及びＥｃｏＲＶの制
限酵素で完全切断（図２）及び部分切断した後、フェノ
ール処理した。各ＤＮＡをライゲーション・キットで連
結した後、該ライゲーション溶液を用いて、エシェリヒ
ア・コリＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコー
ル５０μｇ／ｍｌ及びスペクチノマイシン１００μｇ／
ｍｌを含むＬＢ寒天培地で培養した。得られた形質転換
株よりプラスミドを抽出し、ｐｕｒＲ遺伝子がスペクチ
ノマイシン耐性遺伝子の挿入によって破壊されたプラス
ミドｐＨＳＧ３９８ΔＢＳＰＲ：Ｓｐ^rを得た（図
３）。

【００４１】＜３＞ｐｕｒＲ遺伝子破壊株の取得上記＜２＞で得たプラスミドｐＨＳＧ３９８ΔＢＳＰ
Ｒ：Ｓｐ^rを用いて、バチルス・サチリスＳＢ１１２
（ＢＧＳＣ１Ａ２２７）を形質転換した。形質転換
は、Ishiwaらの方法（Ishiwa H. et al., 1986, Jpn.J,
Genet. 61 515-528）に従って、コンピテントセルを調
製して行なった。プラスミドｐＨＳＧ３９８ΔＢＳＰ
Ｒ：Ｓｐ^rは、バチルス・サチリスの細胞中ではＤＮＡ
複製ができない。しかし、該プラスミドはスペクチノマ
イシン耐性遺伝子の５’側及び３’側に、染色体ｐｕｒ
Ｒと相同な領域を有するため、染色体ｐｕｒＲ遺伝子と
２重交差組み換えにより、遺伝子置換を行うことができ
る。

【００４２】上記形質転換株をスペクチノマイシン１０
０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地で培養し、生育する株
を選択することにより、染色体ｐｕｒＲ遺伝子がΔＢＳ
ＰＲ：Ｓｐ^r遺伝子により置換された株を取得した。目
的どおりの遺伝子置換が生じていることは、候補株の染
色体ＤＮＡを鋳型とし、前記ｐｕｒＲ遺伝子用プライマ
ー（配列番号１及び２）、及び、配列番号３及び４に示
す塩基配列を有するＳｐ^r遺伝子用プライマー（日本バ
イオサービス（株）に委託合成した。）を用いたＰＣＲ
を行い、ΔｐｕｒＲ：Ｓｐ^r部分の大きさとスペクチノ
マイシン耐性遺伝子の挿入により確認した。こうして得
られた遺伝子置換株の１つを、バチルス・サチリスＳ
Ｂ１１２Ｋと名づけた。

【００４３】＜４＞ｐｕｒＲ欠損株による核酸の生産上記＜３＞で作製したバチルス・サチリスＳＢ１１２Ｋ
株、及び親株のバチルス・サチリスＳＢ１１２を、スペ
クチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ及びＬＢ寒
天培地で３７℃１晩培養した後、表１に示した生産培地
２０ｍｌに、各３白金耳を接種し、３２℃で７２時間培
養した。

【００４４】

【表１】表１発酵培地組成 ─────────────────────── 培地成分濃度 ─────────────────────── グルコース１００ｇ／ＬＮＨ₄Ｃｌ２０ｇ／ＬＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ／ＬＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．４ｇ／ＬＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２ｐｐｍＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ２ｐｐｍＬ−トリプトファン３００ｍｇ／ＬＬ−フェニルアラニン３００ｍｇ／ＬＬ−グルタミン酸１５．０ｇ／ＬＤＬ−メチオニン０．３ｇ／Ｌ豆濃縮液（Ｔ−Ｎ）１．５ｇ／Ｌ消泡剤（ＧＤ−１１３）０．０５ｍｌ／ＬＰＨ調整（ＫＯＨ）７．２ｇ／Ｌ ───────────────────────

【００４５】培養終了後、培養液中のヒポキサンチン、
ウラシル、グアノシン、グアニン、アデノシン、アデニ
ンの蓄積量を、高速液体クロマトグラフィーで測定し
た。その結果を表２に示す。ｐｕｒＲ欠損株、ＳＢ１１
２Ｋは、約６００ｍｇ／Ｌという著量のヒポキサンチン
を蓄積し、親株に比べて約２０倍の蓄積量の増加を示し
た。また、ウラシルは親株に比べて５倍以上蓄積量が増
加した。さらに、親株では蓄積が認められなかったアデ
ニン及びグアニンも、ｐｕｒＲ欠損株では蓄積が認めら
れた。

【００４６】

【表２】表２発酵成績 ─────────────────────────── 生産物 (mg/L) 菌株 ────────────────── ヒホ゜キサンチンウラシルク゛アニンアテ゛ニン ─────────────────────────── ＳＢ１１２Ｋ 585 166 20 127 ＳＢ１１２(親株) 30 30 0 0 ───────────────────────────

【００４７】

【発明の効果】本発明により、核酸系物質又はその原料
を効率よく製造することができる。

【００４８】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CTCAAGCTTG AAGTTGCGAT GATCAAAA 28

【００４９】配列番号：２配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CTCCTGCAGA CATATTGTTG ACGATAAT 28

【００５０】配列番号：３配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTGAGGAGGA TATATTTGAA T 21

【００５１】配列番号：４配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TTATAATTTT TTTAATCTGT T 21

【００５２】配列番号：５配列の長さ：1200 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：バチルス・サチリス株名： 168 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：259..1116 特徴を決定した方法：配列 ATATGCATCC TGAAGTTGCG ATGATCAAAA ACCAGATGAA ACGCTTTGGT GCAGATGCCG 60 TGTTAATGAG CGGGAGCGGC CCGACAGTGT TTGGACTGGT TCAGTATGAG TCGAAGGTGC 120 AGAGAATTTA TAACGGGTTA AGAGGCTTCT GCGATCAAGT TTATGCGGTG AGAATGATCG 180 GCGAACAGAA CGCTCTTGAT TAAATCCGTA TGTTAAGTTA TATTGATCTT AAAATATTCG 240 GATTTTGGGG GTGAGTTC ATG AAG TTT CGT CGC AGC GGC AGA TTG GTG GAC 291 Met Lys Phe Arg Arg Ser Gly Arg Leu Val Asp 1 5 10 TTA ACA AAT TAT TTG TTA ACC CAT CCG CAC GAG TTA ATA CCG CTA ACC 339 Leu Thr Asn Tyr Leu Leu Thr His Pro His Glu Leu Ile Pro Leu Thr 15 20 25 TTT TTC TCT GAG CGG TAT GAA TCT GCA AAA TCA TCG ATC AGT GAA GAT 387 Phe Phe Ser Glu Arg Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp 30 35 40 TTA ACA ATT ATT AAA CAA ACC TTT GAA CAG CAG GGG ATT GGT ACT TTG 435 Leu Thr Ile Ile Lys Gln Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu 45 50 55 CTT ACT GTT CCC GGA GCT GCC GGA GGC GTT AAA TAT ATT CCG AAA ATG 483 Leu Thr Val Pro Gly Ala Ala Gly Gly Val Lys Tyr Ile Pro Lys Met 60 65 70 75 AAG CAG GCT GAA GCT GAA GAG TTT GTG CAG ACA CTT GGA CAG TCG CTG 531 Lys Gln Ala Glu Ala Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu 80 85 90 GCA AAT CCT GAG CGT ATC CTT CCG GGC GGT TAT GTA TAT TTA ACG GAT 579 Ala Asn Pro Glu Arg Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp 95 100 105 ATC TTA GGA AAG CCA TCT GTA CTC TCC AAG GTA GGG AAG CTG TTT GCT 627 Ile Leu Gly Lys Pro Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala 110 115 120 TCC GTG TTT GCA GAG CGC GAA ATT GAT GTT GTC ATG ACC GTT GCC ACG 675 Ser Val Phe Ala Glu Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr 125 130 135 AAA GGC ATC CCT CTT GCG TAC GCA GCT GCA AGC TAT TTG AAT GTG CCT 723 Lys Gly Ile Pro Leu Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro 140 145 150 155 GTT GTG ATC GTT CGT AAA GAC AAT AAG GTA ACA GAG GGC TCC ACA GTC 771 Val Val Ile Val Arg Lys Asp Asn Lys Val Thr Glu Gly Ser Thr Val 160 165 170 AGC ATT AAT TAC GTT TCA GGC TCC TCA AAC CGC ATT CAA ACA ATG TCA 819 Ser Ile Asn Tyr Val Ser Gly Ser Ser Asn Arg Ile Gln Thr Met Ser 175 180 185 CTT GCG AAA AGA AGC ATG AAA ACG GGT TCA AAC GTA CTC ATT ATT GAT 867 Leu Ala Lys Arg Ser Met Lys Thr Gly Ser Asn Val Leu Ile Ile Asp 190 195 200 GAC TTT ATG AAA GCA GGC GGC ACC ATT AAT GGT ATG ATT AAC CTG TTG 915 Asp Phe Met Lys Ala Gly Gly Thr Ile Asn Gly Met Ile Asn Leu Leu 205 210 215 GAT GAG TTT AAC GCA AAT GTG GCG GGA ATC GGC GTC TTA GTT GAA GCC 963 Asp Glu Phe Asn Ala Asn Val Ala Gly Ile Gly Val Leu Val Glu Ala 220 225 230 235 GAA GGA GTA GAT GAA CGT CTT GTT GAC GAA TAT ATG TCA CTT CTT ACT 1011 Glu Gly Val Asp Glu Arg Leu Val Asp Glu Tyr Met Ser Leu Leu Thr 240 245 250 CTT TCA ACC ATC AAC ATG AAA GAG AAG TCC ATT GAA ATT CAG AAT GGC 1059 Leu Ser Thr Ile Asn Met Lys Glu Lys Ser Ile Glu Ile Gln Asn Gly 255 260 265 AAT TTT CTG CGT TTT TTT AAA GAC AAT CTT TTA AAG AAT GGA GAG ACA 1107 Asn Phe Leu Arg Phe Phe Lys Asp Asn Leu Leu Lys Asn Gly Glu Thr 270 275 280 GAA TCA TGACAAAAGC AGTCCACACA AAACATGCCC CAGCGGCAAT CGGGCCTTAT 1163 Glu Ser 285 TCACAAGGGA TTATCGTCAA CAATATGTTT TACAGCT 1200

【００５３】配列番号：６配列の長さ：285 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Lys Phe Arg Arg Ser Gly Arg Leu Val Asp Leu Thr Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Thr His Pro His Glu Leu Ile Pro Leu Thr Phe Phe Ser Glu Arg 20 25 30 Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp Leu Thr Ile Ile Lys 35 40 45 Gln Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu Leu Thr Val Pro Gly 50 55 60 Ala Ala Gly Gly Val Lys Tyr Ile Pro Lys Met Lys Gln Ala Glu Ala 65 70 75 80 Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu Ala Asn Pro Glu Arg 85 90 95 Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp Ile Leu Gly Lys Pro 100 105 110 Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala Ser Val Phe Ala Glu 115 120 125 Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr Lys Gly Ile Pro Leu 130 135 140 Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro Val Val Ile Val Arg 145 150 155 160 Lys Asp Asn Lys Val Thr Glu Gly Ser Thr Val Ser Ile Asn Tyr Val 165 170 175 Ser Gly Ser Ser Asn Arg Ile Gln Thr Met Ser Leu Ala Lys Arg Ser 180 185 190 Met Lys Thr Gly Ser Asn Val Leu Ile Ile Asp Asp Phe Met Lys Ala 195 200 205 Gly Gly Thr Ile Asn Gly Met Ile Asn Leu Leu Asp Glu Phe Asn Ala 210 215 220 Asn Val Ala Gly Ile Gly Val Leu Val Glu Ala Glu Gly Val Asp Glu 225 230 235 240 Arg Leu Val Asp Glu Tyr Met Ser Leu Leu Thr Leu Ser Thr Ile Asn 245 250 255 Met Lys Glu Lys Ser Ile Glu Ile Gln Asn Gly Asn Phe Leu Arg Phe 260 265 270 Phe Lys Asp Asn Leu Leu Lys Asn Gly Glu Thr Glu Ser 275 280 285

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲの構造を
示す図。太線はバチルス・サチリスＳＢ１１２由来のｐ
ｕｒＲ遺伝子を示す。カッコ内の数値はコーディング領
域の最初を１としたときの位置を示す。細線はプラスミ
ッドｐＨＳＧ３９８である。

【図２】ｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲをＨｉｎｃII及びＥ
ｃｏＲＶで完全切断して得た断片を示す図。

【図３】ｐｕｒＲ遺伝子破壊用プラスミドｐＨＳＧ３
９８ΔＢＳＰＲ：Ｓｐ^rの構造を示す図。太線はバチル
ス・サチリスＳＢ１１２の破壊型ｐｕｒＲ遺伝子（Δｐ
ｕｒＲ）を示す。カッコ内の数値はコーディング領域の
最初を１としたときの位置を示す。細線はスペクチノマ
イシン耐性遺伝子、点線はプラスミドｐＨＳＧ３９８で
ある。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プリンオペロンのリプレッサータンパク
質が正常に機能しない微生物を培地で培養し、培地中に
核酸系物質を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取す
ることを特徴とする核酸系物質の製造法。
【請求項２】前記微生物が、染色体上の前記リプレッ
サータンパク質をコードする遺伝子が破壊されたことに
より、該リプレッサータンパク質が正常に機能しないこ
とを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】前記微生物がバチルス属細菌である請求
項１記載の方法。
【請求項４】前記核酸系物質が核酸塩基、ヌクレオシ
ド又はヌクレオチドである請求項１記載の方法。
【請求項５】前記核酸系物質が、ヒポキサンチン、ウ
ラシル、グアニンまたはアデニンから選ばれる請求項４
記載の方法。