BRPI0710752B1 - métodos para produzir uma substância derivada de purina e um nucleotídeo de purina - Google Patents

Abstract

bactéria pertencendo ao gênero bacillus, e, métodos para produzir uma substância derivada de purina e um nucleotídeo de purina. uma substância de purina pode ser produzida cultivando uma bactéria bacilius que é capaz de produzir a substância de purina e tem uma atividade enzimática reduzida de frutose bifosfatase em um meio de cultura para produzir e acumular a substância de purina no meio de cultura ou uma célula da bactéria, e coletar a substância de purina do meio de cultura ou da célula.

Description

“MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA DERIVADA DE PURINA E UM NUCLEOTÍDEO DE PURINA” CAMPO TÉCNICO A presente invenção se refere a um método para produzir substâncias derivadas de purina tal como nucleotídeos de purina tipicamente incluindo 5'-ácido inosínico e 5'-ácido guanüico, e nucleosídeos de purina tal como inosina e guanosina, que são substâncias importantes como matérias-primas para síntese dos nucleotídeos de purina, e assim por diante, e uma bactéria pertencendo ao gênero Bacillus usado para o método. Substâncias derivadas de purina são úteis como condimentos, drogas, matérias-primas destes, e assim por diante.

TÉCNICA ANTERIOR Métodos para produzir inosina e guanosina por fermentação usando cepas auxotróficas de adenina de bactérias Bacillus e derivados destas que são adicionalmente concedidos com resistência a várias drogas tal como análogos de purina (Documentos de patente 1 a 8), e tais microorganismos do gênero Brevibacterium (Documentos de patente 9 e 10, Documento de não patente 1), e assim por diante foram conhecidos.

Tais cepas mutantes são tipicamente obtidas tratando um microorganismo com radiação ultravioleta ou nitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina), e selecionando um mutante alvo usando um meio de seleção adequado.

Além disso, cepas que produzem substâncias derivadas de purina também foram criadas usando técnicas de engenharia genética em bactérias Bacillus (Documentos de patente 11a 20), bactérias Brevibacterium (Documento de patente 21), e bactérias Escherichia (Documento de patente 22). Especificamente, por exemplo, um método para produzir eficientemente um composto derivado de ácido nucléico tal como hipoxantina, uracila, guanina e adenina com uma bactéria Bacillus na qual um gene (purR) codificando o repressor de operon de purina é rompido é descrito (Documento de patente 23).

Em Bacillus subtilis, o repressor de operon de purina como descrito acima é conhecido por regular, além dos genes de operon de purina, o gene purA que está envolvido em biossíntese de AMP (Documento de não patente 2), o gene glyA que está envolvido em biossíntese de ácido formiltetrahidrofólico (Documento de não patente 3), o gene pbuG que codifica o transportador de hipoxantina/guanina (Documento de não patente 4), e assim por diante.

Além disso, um microorganismo que produz eficientemente derivado de inosina por fornecimento de auxotrofia de adenina por rompimento do gene de succinil-AMP sintase (purA) em adição a rompimento do gene purR, e supressão de decomposição de inosina em hipoxantina por rompimento do gene de nucleosídeo de purina fosforilase (deoD), e um método para produzir inosina usando o microorganismo foram descritos (Documento de patente 8).

Frutose bifosfatase é uma das enzimas gliconeogênicas, que catalisa a reação de gerar ffutose-6-fosfato a partir de frutose-1,6-bifosfato. Existe apenas pouco conhecimento sobre a relação entre esta enzima e a via biossintética de substâncias derivadas de purina, e não foi tentado criar uma bactéria produtora de substância derivada de purina reduzindo a atividade desta enzima.

Documento de patente 1: Publicação Patente Japonesa (KOKOKU) No. 38-23099 Documento de patente 2: Publicação Patente Japonesa No. 5417033 Documento de patente 3: Publicação Patente Japonesa No. 552956 Documento de patente 4: Publicação Patente Japonesa No. 5545199 Documento de patente 5: Publicação Patente Japonesa No. 5714160 Documento de patente 6: Publicação Patente Japonesa No. 5741915 Documento de patente 7: Patente Japonesa Não-examinada (KOKAI) No. 59-42895 Documento de patente 8: Patente Japonesa Não-examinada No. 2004-242610 Documento de patente 9: Publicação Patente Japonesa No. 515075 Documento de patente 10: Publicação Patente Japonesa No. 58-17592 Documento de patente 11: Patente Japonesa Não-examinada No. 58-158197 Documento de patente 12: Patente Japonesa Não-examinada No. 58-175493 Documento de patente 13: Patente Japonesa Não-examinada No. 59-28470 Documento de patente 14: Patente Japonesa Não-examinada No. 60-156388 Documento de patente 15: Patente Japonesa Não-examinada No. 1-27477 Documento de patente 16: Patente Japonesa Não-examinada No. 1-174385 Documento de patente 17: Patente Japonesa Não-examinada No. 3-58787 Documento de patente 18: Patente Japonesa Não-examinada No. 3-164185 Documento de patente 19: Patente Japonesa Não-examinada No. 5-84067 Documento de patente 20: Patente Japonesa Não-examinada No. 5-192164 Documento de patente 21: Patente Japonesa Não-examinada No. 63-248394 Documento de patente 22: Publicação de Patente Internacional WO99/03988 Documento de patente 23: Patente Norte-Americana No. 6.284.495 Documento de não patente 1: Agric. Biol. Chem., 1978, 42, 399-405 Documento de não patente 2: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1995, 92, 7455-7459 Documento de não patente 3: J. Bacteriol., 2001, 183, 61756183 Documento de não patente 4: J. Bacteriol., 2003, 185, 52005209 DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO Objetivo a ser atingido pela invenção Um objetivo da presente invenção é construir uma bactéria Bacillus adequada para produção por fermentação de substâncias derivadas de purina tal como nucleosídeos de purina e/ou nucleotídeos de purina, e fornecer um método para produzir uma substância derivada de purina usando uma tal bactéria.

Meios para atingir o objetivo Foram conduzidas várias pesquisas a fim de atingir o objetivo mencionado acima. Como um resultado, foi encontrado que se a atividade enzimática de frutose bifosfatase da via de gliconeogênese foi diminuída em uma bactéria Bacillus, uma capacidade da bactéria de produzir um nucleosídeo de purina ou um nucleotídeo de purina é melhorada, e consumada a presente invenção.

Apresente invenção assim fornece os seguintes. (1) Uma bactéria pertencendo ao gênero Bacillus tendo uma capacidade de produzir substância derivada de purina, caracterizada pelo fato de que a bactéria foi modificada de forma que atividade enzimática de frutose bifosfatase é diminuída. (2) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descrito acima, caracterizada pelo fato de que a substância derivada de purina é um nucleosídeo de purina selecionado a partir do grupo consistindo de inosina, xantosina, guanosina e adenosina. (3) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descrito acima, caracterizada pelo fato de que a substância derivada de purina é um nucleotídeo de purina selecionado a partir do grupo consistindo de ácido inosínico, ácido xantílico, ácido guanílico e ácido adenílico. (4) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descrito acima, caracterizada pelo fato de que a atividade de frutose bifosfatase é diminuída por ruptura de um gene codificando frutose bifosfatase. (5) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descrito acima, caracterizada pelo fato de que o gene codificando frutose bifosfatase é um gene codificando uma proteína das seguintes (A) ou (B): (A) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQIDNO: 1, (B) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o que inclui substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um ou diversos resíduos de aminoácidos e tem atividade de frutose bifosfatase. (6) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descrito acima, que foi adicionalmente modificada de forma que atividade de fosforribosil pirofosfato sintetase é aumentada. (7) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descrito acima, que foi adicionalmente modificada de forma que quantidade de expressão do operon de purina é aumentada. (8) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descrito acima, caracterizada pelo fato de que quantidade de expressão do operon de purina é aumentada por ruptura do gene purR, que é um gene codificando um repressor do operon de purina. (9) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descrito acima, que foi adicionalmente modificada de forma que atividade de fosforilase de nucleosídeo de purina é diminuída. (10) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descrito acima, que foi adicionalmente modificada de forma que atividade de IMP desidrogenase é diminuída. (11) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descrito acima, que é Bacillus subtilis. (12) Um método para produzir uma substância derivada de purina, que compreende cultivar a bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descrito acima em um meio para causar acúmulo de uma substância derivada de purina em células da bactéria ou no meio, e coletar a substância derivada de purina das células ou meio. (13) O método como descrito acima, caracterizado pelo fato de que a substância derivada de purina é um nucleosídeo de purina ou um nucleotídeo de purina. (14) O método como descrito acima, caracterizado pelo fato de que a substância derivada de purina é um nucleosídeo de purina selecionado a partir do grupo consistindo de inosina, xantosina, guanosina e adenosina. (15) O método como descrito acima, caracterizado pelo fato de que a substância derivada de purina é um nucleotídeo de purina selecionado a partir do grupo consistindo de ácido inosínico, ácido xantílico, ácido guanílico e ácido adenílico. (16) Um método para produzir um nucleotídeo de purina, que compreende produzir um nucleosídeo de purina pelo método como descrito acima, reagir o nucleosídeo de purina com um doador de fosfato selecionado a partir do grupo consistindo de ácido polifosfórico, fenil fosfato e carbamil fosfato, e um microorganismo tendo uma capacidade de produzir um éster de 5'-ácido fosfórico de nucleosídeo ou fosfatase ácida para produzir um nucleotídeo de purina, e coletar o nucleotídeo de purina.

Melhor modo para realizar a invenção <1> Bactéria Bacillus da presente invenção (I) Fornecer a capacidade de produzir uma substância derivada de purina Na presente invenção, a frase "atividade é diminuída" abrange um estado de que a atividade é menor do que a atividade em uma cepa não modificada tal como uma bactéria Bacillus tipo selvagem, um estado de que a atividade foi substancialmente eliminada. A bactéria Bacillus da presente invenção é uma bactéria Bacillus que tem a capacidade de produzir uma substância derivada de purina e foi modificada de forma que atividade enzimática de frutose bifosfatase é diminuída. O termo "substância derivada de purina" significa uma substância tendo um esqueleto de purina, e exemplos destas incluem nucleosídeos de purina, nucleotídeos de purina, e assim por diante. Os nucleosídeos de purina incluem inosina, xantosina, guanosina, adenosina, e assim por diante, e os nucleotídeos de purina incluem ésteres de 5'-ácido fosfórico de nucleosídeos de purina, por exemplo, ácido inosínico (inosina -5'-fosfato, de agora em diante também referido como "IMP"), ácido xantílico (xantosina-5'-fosfato, de agora em diante também referido como "XMP"), ácido guanílico (guanosina-5'-monofosfato, de agora em diante também referido como "GMP"), ácido adenílico (adenosina-5'-monofosfato, de agora em diante também referido como "AMP"), e assim por diante. A frase "capacidade de produzir uma substância derivada de purina" significa uma capacidade da bactéria Bacillus da presente invenção de produzir, secretar ou causar acúmulo de uma substância derivada de purina nas células bacterianas ou em um meio quando a bactéria é cultivada no meio até um ponto em que a substância derivada de purina pode ser coletada das células ou meio. A bactéria Bacillus da presente invenção pode ter uma capacidade de produzir dois ou mais tipos das substâncias derivadas de purina mencionadas acima. A bactéria Bacillus tendo a capacidade de produzir uma substância derivada de purina pode ser uma bactéria tendo inerentemente a capacidade de produzir uma substância derivada de purina, ou uma bactéria viável modificando tais bactérias Bacillus como descrito abaixo usando uma técnica de mutagênese ou DNA recombinante de forma que elas tenham a capacidade de produzir uma substância derivada de purina. Além disso, ela pode ser uma bactéria Bacillus à qual a capacidade de produzir uma substância derivada de purina é concedida ou de qual a capacidade de produzir uma substância derivada de purina é melhorada modificando a bactéria de forma que atividade enzimática de frutose bifosfatase seja diminuída, de uma maneira tal como descrito posteriormente.

Na presente invenção, a frase "atividade enzimática é diminuída" abrange um estado que atividade enzimática de frutose bifosfatase descrita acima, ou uma enzima de decompõe uma substância derivada de purina descrita posteriormente tal como inosina monofosfato (IMP) desidrogenase, ou os semelhantes é menor do que aquela em uma cepa não modificada, por exemplo, uma cepas tipo selvagem da bactéria Bacillus, e um estado em que a atividade foi substancialmente eliminada. O mesmo deve se aplicar à atividade do repressor de operon de purina descrito posteriormente.

Exemplos da bactéria Bacillus usada para obter a bactéria Bacillus da presente invenção incluem Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus, e assim por diante.

Exemplos de Bacillus subtilis incluem Bacillus subtilis 168 Marburg (ATCC 6051), Bacillus subtilis PY79 (Plasmid, 1984, 12, 1-9) e assim por diante, e exemplos de Bacillus amyloliquefaciens incluem Bacillus amyloliquefaciens T (ATCC 23842), Bacillus amyloliquefaciens N (ATCC 23845), e assim por diante. Exemplos de Bacillus pumilus incluem Bacillus pumilus Gottheil No. 3218 (ATCC No. 21005, Patente Norte-Americana No. 3.616.206), e assim por diante. Estas cepas podem ser obtidas a partir da American Type Culture Collection (Endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América).

Uma bactéria Bacillus tendo a capacidade de produzir uma substância derivada de purina pode ser obtida fornecendo, por exemplo, auxotrofia de nucleosídeo de purina ou resistência a uma droga tal como análogo de purina para tais bactérias Bacillus como descrito acima (Publicação Patente Japonesa Nos. 38-23099, 54-17033, 55-45199, 57-14160, 57-41915 e 59-42895). Uma bactéria Bacillus tendo auxotrofia ou resistência a droga pode ser obtida tratando a bactéria com agente mutagênico que é usado para mutagênese usual tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou EMS (etil metanossulfonato).

Exemplos de bactérias Bacillus que produzem um nucleosídeo de purina incluem os seguintes.

Como um exemplo específico de cepa produtora de inosina pertencendo ao gênero Bacillus, a cepa KMBS16 de Bacillus subtilis pode ser usada. Esta cepas é derivada da cepas trpC2 conhecida de Bacillus subtilis (168 Marburg), caracterizada pelo fato de que um gene purR codificando o repressor de operon de purina (purR::spc), um gene purA codificando succinil-AMP sintase (purA::erm), e um gene deoD codificando fosforilase de nucleosídeo de purina (deoD::kan) são rompidos (Patente Japonesa Não-examinada No. 2004-242610, US2004166575A1). Cepas AJ3772 de Bacillus subtilis (FERM P-2555, Patente Japonesa Não-examinada No. 62-014794) e assim por diante também pode ser usado.

Exemplos de bactérias Bacillus que tem uma capacidade de produzir guanosina incluem uma bactéria Bacillus que tem atividade aumentada de IMP desidrogenase (Patente Japonesa Não-examinada No. 358787), uma bactéria Bacillus que é obtida introduzindo um vetor compreendendo um gene conferindo resistência a análogo de purina ou decoinina em um mutante auxotrófico de adenina (Publicação Patente Japonesa No. 4-28357), e assim por diante.

Exemplos de bactérias Bacillus que produzem um nucleotídeo de purina incluem os seguintes.

Como uma bactéria Bacillus produtora de ácido inosínico, cepas produtoras de inosina de Bacillus subtilis que têm atividade de fosfatase atenuada foram relatadas (Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804805; Fujimoto, M., Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259). Exemplos de bactérias Bacillus produtoras de ácido guanílico incluem mutantes de bactérias Bacillus que têm auxotrofia de adenina, resistência a decoinina ou sulfóxido de metionina, e uma capacidade de produzir 5'-ácido guanílico (guanosina-5'-monofosfato, de agora em diante referido como "GMP") (Publicação Patente Japonesa No. 56-12438).

Além disso, uma bactéria produtora de ácido xantílico pode ser construída pelo método usado para melhoramento de bactérias corineformes tipicamente incluindo Corynebacterium ammoniagenes. Por exemplo, obtendo uma cepas melhorada de PRPP amidotransferase (Patente Japonesa Não-examinada No. 8-168383), uma cepas resistente a aminoácido alifático (Patente Japonesa Não-examinada No. 4-262790), ou uma cepas resistente a dihidroprolina (Publicação Não Examinada de Patente Sul Coreana No. 200356490), uma bactéria produtora de ácido xantílico pode ser construída.

Além disso, exemplo de um método para melhorar bactérias Bacillus que têm a capacidade de produzir uma substância derivada de purina também inclui melhorar as atividades de enzimas envolvidas em biossíntese de purina que são comuns à biossíntese de nucleosídeos de purina e nucleotídeos de purina, i.e., enzimas de biossíntese de purina, em células bacterianas. A atividade da enzima nas células é preferivelmente aumentada para um nível maior do que aquele de uma cepas não modificada de bactéria Bacillus, por exemplo, uma bactéria Bacillus tipo selvagem. A frase "atividade é aumentada" abrange, por exemplo, quando número de moléculas de enzima por célula é aumentado, e quando a atividade específica por molécula de enzima é aumentada, e assim por diante. Por exemplo, a atividade pode ser aumentada aumentando a quantidade de expressão do gene da enzima.

Exemplos de uma enzima envolvida na biossíntese de purina incluem, por exemplo, fosforribosil pirofosfato amidotransferase, fosforribosil pirofosfato sintetase (PRPP sintetase [EC: 2.7.6.1]), e assim por diante.

Alguns dos catabólitos produzidos por metabolismo de fontes de açúcar tal como glicose que circula na via de pentose fosfato são convertidos em ribose-5-fosfato via ribulose-5-fosfato. A partir da ribose-5-fosfato biossintetizada, PRPP é produzido, o qual é um precursor indispensável para biossíntese de nucleosídeo de purina, histidina e triptofano. Especificamente, ribose-5-fosfato é convertido em PRPP por fosforribosil pirofosfato sintetase. Portanto, uma capacidade de produzir substância derivada de purina pode ser concedida a uma bactéria Bacillus modificando de forma que a atividade de PRPP sintetase desta seja aumentada. A frase "atividade de fosforribosil pirofosfato sintetase é aumentada" significa que a atividade de fosforribosil pirofosfato sintetase aumenta se comparada com aquela de uma cepas não modificada tal como uma cepas tipo selvagem ou uma cepas parental. A atividade da fosforribosil pirofosfato sintetase pode ser medida, por exemplo, pelo método de Switzer et al. (Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11) ou Roth et al. (Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17). Uma bactéria Bacillus na qual a atividade de fosforribosil pirofosfato sintetase é aumentada pode ser produzida, por exemplo, aumentando expressão de um gene codificando a fosforribosil pirofosfato sintetase em uma bactéria Bacillus de acordo com um método de usar um plasmídeo contendo o gene ou integrando o gene em um cromossomo, o que pode ser realizado da mesma maneira que aquela do método descrito em Patente Japonesa Não-examinada No. 2004-242610. Embora o gene prs de SEQ ID NO: 3 derivado de uma bactéria Bacillus (No. de Acesso de GenBank XI6518) possa ser mencionado como o gene codificando fosforribosil pirofosfato sintetase utilizável para a presente invenção, qualquer dos genes derivados de outras bactérias, animais ou plantas codificando uma proteína tendo a atividade de fosforribosil pirofosfato sintetase pode ser usado.

Além disso, quando PRPP que é um precursor indispensável para biossíntese de nucleosídeo de purina, histidina e triptofano é produzido uma vez, uma parte é convertida em nucleotídeos de purina e nucleosídeos de purina pelas enzimas envolvidas na biossíntese de purina. Exemplos de genes codificando tais enzimas incluem os genes do operon de purina de Bacillus subtilis, especificamente, genes do operon de purD purEKB-purC(orf) QLF-purMNH(J) (Ebbole D.J. and Zalkin EL, J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 827487) (no momento, também chamado purEKBCSQLFMNHD, Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002, No. de Acesso de GenBank NC_000964), e os genes do regulon pur de Escherichia coli (Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Por conseguinte, melhorar expressão destes genes concede ou melhora a capacidade de produzir uma substância derivada de purina. Em adição, genes do operon de purina que podem ser usados para a presente invenção não são limitados a estes, e genes derivados de outros microorganismos, animais e plantas também podem ser usados.

Exemplos do método para aumentar quantidade de expressão do operon de purina incluem aumentar expressão de genes do operon de purina em uma bactéria Bacillus por um método de usar um plasmídeo contendo os genes ou integrando os genes em um cromossomo ou os semelhantes. O segundo método para aumentar quantidade de expressão do operon de purina inclui substituir um promotor do operon de purina por um mais forte, e substituir a região -35 ou -10 do promotor nativo por uma seqüência consenso.

Por exemplo, em Bacillus subtilis (B. subtilis cepas 168 Marburg, ATCC 6051), a seqüência de -35 do operon de purina é uma seqüência consenso (TTGACA), mas a seqüência de -10 é TAAGAT, que difere da seqüência consenso TATAAT (Ebbole, DJ. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287). Portanto, mudando a seqüência de -10 (TAAGAT) para a seqüência consenso similar TATAAT, TATGAT ou TAAAAT, a atividade transcricional do operon de purina pode ser aumentada. Uma seqüência de promotor pode ser substituída pelo mesmo método que aquele da substituição gênica, que é descrito abaixo. O terceiro método para aumentar quantidade de expressão do operon de purina inclui reduzir quantidade de expressão do repressor de operon de purina (Patente Norte-Americana No. 6.284.495). A frase "expressão de um repressor de operon de purina" inclui tanto transcrição de um gene de operon como tradução de um produto de transcrição. Além disso, "quantidade de expressão é diminuída" inclui quando a quantidade de expressão é menor do que aquela em uma cepas não modificada tal como uma bactéria Bacillus tipo selvagem, e quando a expressão foi substancialmente eliminada.

Quantidade de expressão do repressor de operon de purina (repressor de purina) pode ser diminuída, por exemplo, tratando uma bactéria Bacillus com radiação de raios ultravioleta ou agente mutagênico usado em um tratamento de mutagênese usual tal como NTG ou EMS e selecionando um mutante mostrando quantidade de expressão diminuída do repressor de purina pode ser empregado.

Além disso, uma bactéria Bacillus exibindo uma quantidade de expressão diminuída do repressor de purina também pode ser obtida por, por exemplo, além de um tratamento de mutagênese, substituindo um gene codificando o repressor de purina em um cromossomo (purR, Acesso de GenBank NC_000964, região de codificação corresponde aos números 54439 a 55293 de nucleotídeos, SEQ ID NO: 5) com um gene correspondente que não funciona normalmente (daqui para frente, também referido como “gene tipo rompido”) por recombinação homóloga utilizando uma técnica de recombinação gênica (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202).

Por exemplo, um gene tipo rompido para um gene normal pode ser substituído por um gene tipo rompido no cromossomo hospedeiro de uma maneira como descrito abaixo. A seguir, a ruptura do gene purR é explicada. Outros genes tal como os genes purA, deoD, guaB e fbp podem ser similarmente rompidos.

Quando um plasmídeo ou o semelhante que tem uma seqüência homóloga a uma seqüência no cromossomo e que não é capaz de se replicar em células de bactérias Bacillus é introduzido na célula, resultando em recombinação no sítio da seqüência tendo homologia em uma certa freqüência. O plasmídeo inteiro é então recombinado no cromossomo. Posteriormente, se recombinação é adicionalmente causada no sítio da seqüência tendo homologia no cromossomo, o plasmídeo é removido do cromossomo. Neste momento, dependendo do sítio onde a recombinação ocorre, o gene tipo rompido pode ser mantido no cromossomo, e o gene normal original pode ser removido do cromossomo com o plasmídeo. Selecionando uma tal cepas, é possível obter uma cepas na qual o gene purR normal no cromossomo foi substituído pelo gene purR tipo rompido.

Tais técnicas de ruptura gênica baseadas em recombinação homóloga já foram estabelecidas e incluem um método de utilizar um DNA linear, um método de utilizar um plasmídeo sensível a temperatura e assim por diante. Além disso, o gene purR também pode ser rompido usando um plasmídeo que contém o gene purR no qual um gene marcador tal como um gene de resistência a droga foi inserido e que não é capaz de replicar na célula bacteriana alvo. Isto é, em um transformante que foi transformado com um plasmídeo tal como descrito acima, o gene marcador é incorporado no DNA cromossômico e concede resistência a droga. Uma vez que o gene marcador é incorporado no cromossomo em uma alta taxa por recombinação homóloga das seqüências de gene purR que coloca o gene marcador no plasmídeo entre o gene purR no cromossomo, uma cepas com gene purR rompido pode ser eficientemente selecionada.

O gene purR tipo rompido usado para a ruptura gênica pode ser obtido, especificamente, deletando uma certa região do gene purR por digestão com uma enzima de restrição e re-ligação, inserindo outro fragmento de DNA (gene marcador etc.) no gene purR, ou causando substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou mais nucleotídeos in a seqüência de nucleotídeos da região de codificação, região promotora ou os semelhantes do gene purR por uma mutagênese específica de sítio (Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 1987, 154, 350-367) ou por PCR recombinante (PCR Technology, Stockton Press (1989)) ou por tratamento com um agente químico tal como hipossulfito de sódio ou hidroxilamina (Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1978, 75, 21702174), seguido por seleção de uma cepas na qual a atividade do repressor codificado pelo gene purR é diminuída ou transcrição do gene é diminuída. Entre estes métodos, deletar uma certa região do gene purR por digestão com uma enzima de restrição e re-ligação ou inserir outro fragmento de DNA no gene purR é preferível em vista de confiabilidade e estabilidade. A região certa do gene purR a ser deletada pode ser uma seqüência de extremidade 5', seqüência interna ou seqüência de extremidade 3' do gene purR. Entretanto, se a região responde por 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, particularmente 97% ou mais, do comprimento completo de gene purR, certeza de redução da atividade de repressor é aumentada. Além disso, quando uma mutação de mudança de quadro é causada por deleção ou inserção de nucleotídeos na região de codificação do gene purR, é preferível causar deleção ou inserção de nucleotídeos em múltiplos sítios e causar deleção ou inserção de nucleotídeos no lado de extremidade 3', em vista de reduzir seguramente a atividade de repressor.

Redução da atividade de repressor de purina também pode ser atingida, além da ruptura gênica mencionada acima, introdução de uma mutação que reduz a atividade intracelular de repressor de purina no gene purR no cromossomo baseado em um método de mutagênese convencional. Por exemplo, ela pode ser atingida introduzindo uma substituição de aminoácido (mutação de sentido incorreto), um códon de parada (mutação sem sentido), ou uma mutação de mudança de quadro que adiciona ou deleta um ou dois nucleotídeos, ou deletando o gene parcialmente ou inteiramente. Além disso, a atividade do repressor também pode ser diminuída inserindo um transposon no gene purR no cromossomo.

Redução da atividade do repressor de purina também pode ser atingida substituindo uma seqüência de controle de expressão do gene purR tal como promotor no DNA cromossômico por um mais fraco. A força de um promotor é definida pela freqüência de atos de iniciação de síntese de RNA. Exemplos de método para avaliar a força de promotores e promotores fortes são descritos no artigo de Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128), e assim por diante. Além disso, também é possível introduzir substituição de nucleotídeo para diversos nucleotídeos em uma região promotora de um gene alvo e com isso modificar o promotor a ser enfraquecido como descrito em Publicação de Patente Internacional W000/18935. Além disso, sabe-se que substituição de diversos nucleotídeos no espaçador entre o sítio de ligação de ribossomo (RBS) e o códon de início, em particular, uma seqüência imediatamente antes do códon de início, afeta fortemente eficiência de tradução de mRNA. Esta modificação de RBS pode ser combinada com transcrição decrescente de um gene alvo.

Além disso, um DNA recombinante no qual uma mutação que desestabiliza RNA mensageiro transcrito a partir do gene purR é introduzido pode ser preparado e transformado em uma bactéria Bacillus hospedeira.

Atividades de enzimas codificadas pelos genes purA, deoD, guaB, e flyp descritos posteriormente também podem ser diminuídas da mesma maneira como descrito acima. O gene purR pode ser obtido a partir de um DNA cromossômico de um microorganismo tendo o operon de purina por PCR usando oligonucleotídeos preparados baseado na seqüência de nucleotídeos conhecida do gene purR como iniciadores. O gene purR também pode ser obtido a partir de uma biblioteca de DNA cromossômico de um microorganismo tendo o operon de purina por hibridização usando um oligonucleotídeo preparado com base na seqüência conhecida de nucleotídeos do gene purR como uma sonda. A seqüência de nucleotídeos do gene purR da cepas 168 Marburg de Bacillus subtilis foi relatada (No. de Acesso de GenBank D26185 (a região de codificação corresponde aos números de nucleotídeos 118041 a 118898), ou NC_000964 (a região de codificação corresponde aos números de nucleotídeos 54439 a 55296)). A seqüência de nucleotídeos do gene purR e a seqüência de aminoácidos codificada pelo gene são mostradas em SEQ ID NOS: 5 e 6 de Listagem de Seqüências (Patente Japonesa Não-examinada No. 2004-242610).

Iniciadores usados para PCR para obter o gene purR podem ser quaisquer daqueles possibilitando amplificação de uma parte ou comprimento completo do gene purR, e exemplos específicos incluem oligonucleotídeos tendo as seqüências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NO: 15 (GAAGTTGATGATCAAAA) e SEQ ID NO: 16 (ACATATTGTTGACGATAAT).

Exemplos do gene marcador descrito acima incluem genes de resistência a droga tal como um gene de resistência a espectinomicina e gene de resistência a canamicina. O gene de resistência a espectinomicina de Enterococcus faecalis pode ser obtido preparando o plasmídeo pDG1726 da cepas ECE101 de Escherichia coli comercialmente disponível a partir do Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) e removendo o gene de resistência como uma gaveta do plasmídeo. O gene de resistência a eritromicina de Staphylococcus aureus pode ser obtido preparando o plasmídeo pDG646 da cepas ECE91 de Escherichia coli comercialmente disponível a partir do Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) e removendo o gene de resistência como uma gaveta do plasmídeo. O gene de resistência a canamicina derivado de Streptococcus faecalis pode ser obtido preparando o plasmídeo pDG783 da cepas ECE94 de Escherichia coli comercialmente disponível a partir do Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) e removendo o gene de resistência como uma gaveta do plasmídeo. Além disso, o gene de resistência a cloranfenicol de Staphylococcus aureus pode ser obtido preparando o plasmídeo pC194 da cepas 1E17 de Bacillus subtilis comercialmente disponível a partir do Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) e realizando PCR usando tal plasmídeo como um modelo para amplificar o plasmídeo.

Quando um gene de resistência a droga é usado como o gene marcador, uma cepas com gene purR rompido pode ser obtida inserindo o gene de resistência a droga no gene purR em um plasmídeo em um sítio apropriado, transformando um microorganismo com o plasmídeo obtido e selecionando um transformante que se tomou resistente a droga. Ruptura do gene purR no cromossomo pode ser confirmada analisando o gene purR ou o gene marcador no cromossomo usando Southern blotting ou PCR. Incorporação do gene de resistência a espectinomicina, gene de resistência a eritromicina ou gene de resistência a canamicina mencionados acima em um DNA cromossômico pode ser confirmada por PCR usando iniciadores que podem amplificar estes genes.

Também se sabe que expressão do operon de purina é regulada pela seqüência de terminador-antiterminador localizada depois do promotor (de agora em diante referido como seqüência atenuadora) (Ebbole, D.J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287; Ebbole D.J. and Zalkin H., J. Biol. Chem., 1988, 263, 10894-10902; Ebbole, D.J. and Zalkin, H., J. Bacteriol., 1989, 171, 2136-2141). Portanto, quantidade de expressão do operon de purina pode ser aumentada deletando a seqüência atenuadora. Deleção da seqüência atenuadora pode ser atingida pelo mesmo método que aquele para ruptura de purR. A fim de adicionalmente aumentar transcrição do operon de purina, os métodos descritos acima podem ser combinados. Por exemplo, o gene purR pode ser rompido, e depois, o operon de purina do qual a seqüência atenuadora é deletada pode ser amplificado usando um plasmídeo ou múltiplas cópias de um tal operon de purina podem ser introduzidas em um cromossomo.

As atividades de uma enzima envolvida em biossíntese de purina também podem ser melhoradas dessensibilizando a enzima envolvida em biossíntese de purina para regulação desta, por exemplo, de acordo com o método mencionado acima para dessensibilizar uma enzima para inibição por retroalimentação (Patente Internacional 99/03988).

Além disso, a capacidade de produzir substância derivada de purina também pode ser melhorada atenuando absorção de substâncias derivadas de purina pelas células. Por exemplo, a absorção de nucleosídeos de purina pelas células pode ser atenuada bloqueando uma reação envolvida na absorção de nucleosídeos de purina pelas células. Um exemplo da reação envolvida na absorção de os nucleosídeos de purina pelas células inclui reações catalisadas por nucleosídeo permeases.

Além disso, quando um nucleosídeo de purina é produzido, atividade de uma enzima de decompõe o nucleosídeo de purina pode ser diminuída a fim de melhorar a capacidade de produzir um nucleosídeo de purina. Um exemplo de uma tal enzima inclui nucleosídeo de purina fosforilase.

Nucleotídeos de purina biossintetizados a partir de PRPP por enzimas envolvidas em biossíntese de purina são desfosforilados e com isso convertidos em um nucleosídeo de purina. Para causar eficientemente acúmulo de um nucleosídeo de purina, é preferível reduzir uma atividade de nucleosídeo de purina fosforilases, o que adicionalmente degrada nucleosídeos de purina em hipoxantina ou os semelhantes. Isto é, é preferível atenuar ou eliminar uma atividade de um nucleosídeo de purina fosforilase que emprega nucleosídeos de purina, tal como inosina, como um substrato.

Especificamente, a atividade de nucleosídeo de purina fosforilase pode ser diminuída rompendo os genes deoD e pupG codificando nucleosídeo de purina fosforilase em bactérias Bacillus. A bactéria Bacillus da presente invenção pode ser modificada rompendo um ou ambos os genes deoD e pupG. Como os genes deoD e pupG, por exemplo, aqueles genes derivados de bactérias Bacillus (deoD: No. de Acesso de GenBank NC 000964 (SEQ ID NO: 7% pupG: No. de Acesso de GenBank NC 000964 (SEQ ID NO: 9)) podem ser usados, e uma cepas com gene rompido pode ser obtida da mesma maneira que aquela usada para a ruptura mencionada acima do gene purR. A capacidade de produzir uma substância derivada de purina também pode ser melhorada diminuindo a atividade de succinil-AMP sintase. Um exemplo do gene codificando succinil-AMP sintase inclui o gene purA. Um exemplo do gene purA inclui, por exemplo, aqueles tendo a seqüência de nucleotídeos registrada como No. de Acesso de GenBank NC_000964 (região de codificação corresponde aos números de nucleotídeos 4153460 a 4155749 da fita complementar, SEQ ID NO: 11). A capacidade de produzir uma substância derivada de purina também pode ser melhorada diminuindo uma atividade de inosina monofosfato (IMP) desidrogenase. Um exemplo do gene codificando IMP desidrogenase inclui o gene guaB. Um exemplo do gene guaB inclui, por exemplo, aqueles tendo a seqüência de nucleotídeos registrada como No. de Acesso de GenBank NC_000964 (região de codificação corresponde aos números de nucleotídeos 15913 a 17376, SEQ ID NO: 13).

Além disso, como um método para melhorar uma capacidade de produzir substância derivada de purina, amplificação de um gene codificando uma proteína tendo uma atividade de secretar uma substância derivada de purina pode ser contemplada. Um exemplo de uma bactéria na qual um tal gene foi amplificado inclui, uma bactéria Bacillus na qual o gene rhtA é amplificado (Patente Japonesa Não-examinada No. 2003-219876).

Os genes purR, deoD, pupG, purA e guaB a serem rompidos como descrito acima, e o gene prs cuja expressão deve ser melhorada podem ser variantes conservativas, por exemplo, DNAs codificando proteínas tendo seqüências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 4 o que inclui substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um ou diversos resíduos de aminoácidos, respectivamente, e tendo atividade do repressor de purina, nucleosídeo de purina fosforilase, succinil-AMP sintase, IMP desidrogenase ou fosforribosil pirofosfato sintetase, respectivamente. Número pretendido pelo termo mencionado acima "diversos" é, por exemplo, 2 a 50, preferivelmente 2 a 30, mais preferivelmente 2 a 10.

Tal mudança de seqüências de aminoácidos como descrito acima normalmente é mudança conservativa que mantém atividades de proteínas. Exemplos de substituição conservativa de aminoácidos incluem: substituição de Ser ou Thr por Ala; substituição de Gin, His ou Lys por Arg; substituição de Glu, Gin, Lys, His ou Asp por Asn; substituição de Asn, Glu ou Gin por Asp; substituição de Ser ou Ala por Cys; substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gin; substituição de Asn, Gin, Lys ou Asp por Glu; substituição de Pro por Gly; substituição de Asn, Lys, Gin, Arg ou Tyr por His; substituição de Leu, Met, Vai ou Phe por Ile; substituição de Ile, Met, Vai ou Phe por Leu; substituição de Asn, Glu, Gin, His ou Arg por Lys; substituição de Ile, Leu, Vai ou Phe por Met; substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu por Phe; substituição de Thr ou Ala por Ser; substituição de Ser ou Ala por Thr; substituição de Phe ou Tyr por Trp; substituição de His, Phe ou Trp por Tyr; e substituição de Met, Ile ou Leu por Vai.

Exemplos específicos de variantes conservativas dos genes purR, deoD, pupG, purA, guaB e fbp e do gene prs descrito acima incluem DNAs mostrando uma homologia de, por exemplo, 70% ou mais, preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, particularmente preferivelmente 95% ou mais, com DNAs tendo as seqüências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11, 13, 15 e 3, respectivamente. Mais especificamente, os exemplos das variantes conservativas incluem DNAs que são capazes de hibridizar com DNAs tendo seqüências de nucleotídeos complementares às seqüências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11, 13, 15 e 3 em condições estringentes. Um exemplo das condições estringentes inclui condições de lavagem a 60°C e concentrações salinas de 1 xSSC, 0,1% de SDS, preferivelmente 0,1><SSC, 0,1% de SDS, uma vez ou mais vezes, preferivelmente duas vezes ou três vezes.

Homologia de DNAs pode ser avaliada por busca BLAST, busca FASTA, o método de cálculo de Crustal W, e assim por diante. BLAST (ferramenta básica de busca de alinhamento local) é um algoritmo de busca heurística usado pelos programas blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn e tblastx, e os resultados obtidos por estes programas são considerados significantes com base em uso do método estatístico de Karlin, Samuel, and Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications and statisties for multiple high-scoring segments in molecular sequences", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, 90:5873-7). O método de busca FASTA foi descrito por W.R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183:63-98). O método de Clustal W é descrito por Thompson J.D., Higgins D.G., and Gibson TJ. ("CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680).

Além disso, DNA usado para preparação de um gene tipo rompido também pode ser uma variante conservativa de gene purR, deoD, pupG, purA ou guaB. A incorporação de um gene alvo no DNA cromossômico de bactéria Bacillus pode ser realizada da mesma maneira que aquela para o gene codificando transaldolase descrito posteriormente. (II) Modificação para diminuir atividade enzimática de fratose bifosfatase A bactéria Bacillus da presente invenção pode ser obtida modificando uma cepas tendo a capacidade de produzir uma substância derivada de purina tal como aquelas descritas acima de forma que a atividade enzimática de frutose bifosfatase é diminuída. A ordem da modificação não é limitada, e depois de modificar uma bactéria de forma que a atividade enzimática de frutose bifosfatase desta seja diminuída, capacidade produtora de nucleotídeo de purina pode ser concedida à bactéria.

Frutose bifosfatase é uma enzima que catalisa uma reação gerando frutose-6-fosfato a partir de frutose-1,6-bifosfato, e esta reação é uma das reações da via de gliconeogênese. A "via de gliconeogênese" significa uma via na qual ácido oxaloacético intracelular é convertido em ácido fosfoenolpirúvico por descarboxilação catalisada por fosfoenolpiruvato carboxiquinase (EC: 4.1.1.49) e fosforilação, ácido fosfoenolpirúvico é convertido em frutose-1,6-bifosfato pelas reações reversas de enzimas glicolíticas, frutose-1,6-bifosfato é adicionalmente convertido em frutose-6-fosfato por frutose bifosfatase (EC: 3.1.3.11), e glicose é biossintetizada a partir de frutose-6-fosfato por glicose-6-fosfato isomerase e glicose-6-fosfatase (EC: 3.1.3.9). A atividade enzimática de frutose bifosfatase pode ser medida pelo método seguinte. Por exemplo, ela pode ser medida convertendo frutose-6-fosfato gerada em NADPH por fosfoglucoisomerase e glicose-6-fosfato desidrogenase, e medindo NADPH.

Tal modificação que a atividade enzimática de frutose bifosfatase é diminuída pode ser atingida por, por exemplo, como explicado acima para ruptura do gene purR, substituindo um gene correspondente que não funciona normalmente (e.g., gene tipo rompido obtido inserindo um gene marcador tal como gene de resistência a droga no gene de frutose bifosfatase) para o gene de frutose bifosfatase no cromossomo por recombinação homóloga. Além disso, como descrito para o gene purR, uma mutação para reduzir atividade enzimática de frutose bifosfatase intracelular pode ser introduzida no gene de frutose bifosfatase no cromossomo por métodos convencionais de mutagênese.

Um exemplo de frutose bifosfatase de Bacillus subtilis inclui uma proteína consistindo de 671 aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 2, e um gene codificando a proteína, preferivelmente um gene tendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 (gene fòp, números de nucleotídeos 4127053 a 4129065 de No. de Acesso de GenBank NC_000964), pode ser usado para a modificação. O gene fòp se localiza a cerca de 323° no cromossomo de Bacillus subtilis.

Exemplos de DNA codificando uma proteína substancialmente idêntica a frutose bifosfatase incluem, especificamente, um DNA codificando uma proteína mostrando uma homologia de 50% ou mais, preferivelmente 70% ou mais, mais preferivelmente 80% mais, particularmente preferivelmente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, com a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, e tendo a atividade enzimática de frutose bifosfatase. O gene codificando frutose bifosfatase também pode ser uma variante conservativa do gene fbp como os genes mencionados acima. Especificamente, exemplos incluem um DNA codificando uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 incluindo substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um ou diversos resíduos de aminoácidos e tendo atividade de frutose bifosfatase. Exemplos incluem adicionalmente um DNA codificando uma proteína mostrando uma homologia de 50% ou mais, preferivelmente 70% ou mais, mais preferivelmente 80% mais, particularmente preferivelmente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, com a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, e tendo a atividade enzimática de frutose bifosfatase. Mais especificamente, exemplos incluem um DNA que é capaz de hibridizar com um DNA tendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 em condições estringentes. As condições estringentes incluem condições de lavagem a 60°C e concentrações salinas de lxSSC, 0,1% de SDS, preferivelmente 60°C, 0,1*SSC, 0,1% de SDS, uma vez ou mais vezes, preferivelmente duas vezes ou três vezes.

Um tal DNA codificando uma proteína substancialmente idêntica a frutose bifosfatase como descrito acima pode ser obtido, por exemplo, modificando uma seqüência de nucleotídeos codificando uma tal enzima de forma que o resíduo de aminoácido de uma parte específica é substituído, deletado, inserido, adicionado ou invertido pela mutagênese específica de sítio. Um tal DNA modificado como descrito acima também pode ser obtido por um tratamento de mutagênese convencionalmente conhecido. Exemplos do tratamento de mutagênese incluem um tratamento in vitro de DNA antes de tratamento de mutagênese com hidroxilamina, e um tratamento de um microorganismo tal como bactéria Escherichia contendo DNA antes de tratamento de mutagênese com radiação ultravioleta ou um agente mutagênico usado para tratamento de mutagênese convencional tal como N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou ácido nitroso. O gene alvo pode ser obtido, por exemplo, por método de PCR (reação em cadeia da polimerase, White, T.J. et al., Trends Genet., 1989, 5, 185-189) usando um DNA cromossômico de uma bactéria Bacillus como um modelo e oligonucleotídeos preparados baseado em seqüência de nucleotídeos de gene alvo como iniciadores. O DNA cromossômico pode ser preparado a partir de uma bactéria servindo como uma doadora de DNA, por exemplo, pelo método de Saito e Miura (H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 1963, 72, 619-629; Text for Bioengineering Experiments, Editado pela Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp.97-98, Baifukan, 1992) ou os semelhantes. Os iniciadores para PCR pode ser preparado baseado em uma seqüência gênica conhecida de uma bactéria Bacillus, ou baseado em informação em uma região conservada entre genes de outras bactérias cujas seqüências são conhecidas.

Exemplos do vetor para incorporar um gene alvo em um DNA cromossômico de bactéria Bacillus incluem um vetor tendo uma origem de replicação sensível a temperatura, tal como pHV1248 (Prtit, M.-A., et. al., J. Bacteriol., 1990, 172, 6736-6740), vetores para E. coli tal como pHSG398 (Takara Shuzo) e pBluescript SK- (Stratagene), e assim por diante. A fim de ligar um gene objetivo e um vetor carregando um marcador que funciona em bactérias Bacillus para preparar um DNA recombinante, o vetor é digerido com uma enzima de restrição se combinando com a extremidade do gene objetivo. A ligação normalmente é realizada usando uma ligase tal como T4 DNA ligase.

Para introduzir um DNA recombinante preparado como descrito acima em uma bactéria Bacillus, qualquer dos métodos de transformação conhecidos que foram até agora relatados pode ser empregado. Exemplos incluem, por exemplo, um método de preparar células competentes a partir de células que estão na fase de crescimento seguido por introduzir o DNA nestas, (Dubunau D. and Davidoff-Abelson, R., J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221) e um método de fazer células hospedeiras em protoplastos ou esferoplastos, que podem facilmente adquirir DNA recombinante, seguido por introduzir o DNA recombinante nas células aceptoras de DNA (Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 1979, 168, 111-115). <2> Método para produzir uma substância derivada de purina A bactéria Bacillus da presente invenção produz eficientemente uma substância derivada de purina. Portanto, cultivando a bactéria Bacillus da presente invenção em um meio apropriado, uma substância derivada de purina, tal como nucleosídeo de purina e nucleotídeo de purina pode ser produzida e acumulada em células da bactéria ou no meio.

Como para o meio usado para a presente invenção, cultura pode ser realizada de uma maneira convencional usando um meio convencional contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio e sais minerais assim como nutrientes traço orgânicos tal como aminoácidos e vitaminas, como requerido. Ou um meio sintético ou um meio natural pode ser usado. Quaisquer tipos de fonte de carbono e fonte de nitrogênio podem ser usados contanto que eles possam ser utilizados por uma cepas a ser cultivada.

Como a fonte de carbono, açúcares tal como glicose, frutose, sacarose, maltose, manose, galactose, arabinose, xilose, trealose, ribose, hidrolisados de amido e melaço, e álcoois tal como glicerol e manitol são usados, e ácidos orgânicos tal como ácido glucônico, ácido acético, ácido cítrico, ácido maleico, ácido fumárico e ácido succínico também podem ser usados independentemente ou em combinação com outras fontes de carbono.

Como a fonte de nitrogênio, amônia, sais de amônio tal como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio e acetato de amônio, sais de ácido nítrico, nitrogênio orgânico tal como hidrolisado de soja, e assim por diante são usados.

Como os nutrientes traço orgânicos, aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucléicos, aqueles contendo estas substâncias tal como peptona, ácido casamino, extrato de levedura e produto de decomposição de proteína de soja e assim por diante são usados. Quando uma cepas mutante auxotrófica que requer um aminoácido ou os semelhantes para crescimento é usada, é necessário suplementar o nutriente requerido.

Como os sais minerais, sais de ácido fosfórico, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês e assim por diante são usados.

Embora as condições de cultura possam variar dependendo do tipo de bactéria Bacillus a ser usado, Bacíllus subtilis, por exemplo, é cultivada como cultura sob aeração, enquanto que a temperatura de fermentação é controlada para ser de 20 a 50°C, e pH para ser de 4 a 9. Quando pH cai durante a cultura, o meio é neutralizado com uma base alcalina tal como gás amônia. Um nucleosídeo de purina é acumulado no meio depois de cerca de 40 horas a 3 dias de cultura de uma maneira tal como descrito acima.

Depois de término da cultura, inosina acumulada no meio pode ser coletada de uma maneira convencional. Por exemplo, ela pode ser isolada por precipitação, cromatografia de troca iônica e assim por diante.

Além disso, se o microorganismo usado para a presente invenção carece de um gene codificando uma nucleosidase ou nucleotidase, um nucleosídeo ou nucleotídeo correspondente pode ser acumulado. Além disso, se auxotrofia de inosina é concedida, um precursor ou substâncias relevantes envolvidas na via de biossíntese desta podem ser acumulados.

Além disso, reagindo inosina ou guanosina preparada pelo método da presente invenção com nucleosídeo de purina fosforilase ou fosforribosiltransferase, 5’-ácido inosínico ou 5'-ácido guanílico podem ser obtidos.

Além disso, também é possível fosforilar o nucleosídeo de purina produzido usando o microorganismo da presente invenção reagindo fosfotransferase no nucleosídeo de purina para produzir um nucleotídeo de purina (éster de 5'-ácido fosfórico de nucleosídeo) (Patente Japonesa Não-examinada No. 2000-295996). Por exemplo, o método para produzir um nucleotídeo de purina usando uma bactéria Escherichia na qual um gene codificando inosina guanosina quinase de Escherichia coli é introduzido (Patente Internacional 91/08286), e o método para produzir um nucleotídeo de purina usando Corynebacterium ammoniagenes na qual um gene codificando inosina guanosina quinase de Exiguobacterium acetylicum é introduzido (Patente Internacional 96/30501) pode ser usado.

Além disso, também é possível produzir um nucleotídeo de purina (éster de 5'-ácido fosfórico de nucleosídeo) reagindo o nucleosídeo de purina produzido usando o microorganismo da presente invenção com um doador de fosfato selecionado a partir do grupo consistindo de ácido polifosfórico, fenil fosfato e carbamil fosfato, e um microorganismo tendo uma capacidade de produzir um éster de 5'-ácido fosfórico de nucleosídeo ou fosfatase ácida (EC 3.1.3.2). Embora o microorganismo tendo uma capacidade de produzir um éster de 5'-ácido fosfórico de nucleosídeo não seja particularmente limitado contanto que um microorganismo tendo uma capacidade de converter um nucleosídeo de purina em um nucleotídeo de purina seja escolhido, exemplos incluem, por exemplo, o microorganismo descrito em Publicação de Patente Internacional WO96/37603.

Além disso, Escherichia blattae JCM 1650, Serratia ficaria ATCC 33105, Klebsiella planticola IFO 14939 (ATCC 33531), Klebsiella pneumoniae IFO 3318 (ATCC 8724), Klebsiella terrigena IFO 14941 (ATCC 33257), Morganella morganii IFO 3168, Enterobacter aerogenes IFO 12010, Enterobacter aerogenes IFO 13534 (ATCC 13048), Chromobacterium fluviatile IAM 13652, Chromobacterium violaceum IFO 12614, Cedecea lapagei JCM 1684, Cedecea davisiae JCM 1685, Cedecea neteri JCM 5909, e assim por diante descritas em Patente Japonesa Não-examinada No. 07231793 também podem ser usadas.

Como a fosfatase ácida, por exemplo, a fosfatase ácida descrita em Patente Japonesa Não-examinada No. 2002-000289 pode ser usada, e uma fosfatase ácida cuja afinidade com um nucleosídeo é aumentada (Patente Japonesa Não-examinada No. 10-201481), uma fosfatase ácida mutante cuja atividade de nucleotidase é diminuída (Patente Internacional 96/37603), uma fosfatase ácida mutante cuja atividade de hidrólise de éster de ácido fosfórico é diminuída (Patente Japonesa Não-examinada No. 2001-245676) e assim por diante podem ser mais preferivelmente usadas.

Também é possível obter um nucleotídeo de purina fosforilando quimicamente um nucleosídeo de purina produzido usando o microorganismo da presente invenção (Bulletin of the Chemical Society of Japan, 42, 3505). Além disso, um método de obter GMP acoplando o microorganismo tendo uma capacidade de produzir XMP da presente invenção e atividade de XMP aminase usando o sistema regenerante de ATP de um microorganismo, e um método de obter IMP acoplando inosina quinase (Biosci. Biotech. Biochem., 51, 840 (1997); Patente Japonesa Não-examinada No. 63-230094) também podem ser usados.

Nucleosídeo de inosina, guanosina ou purina preparado pelo método da presente invenção usado para a preparação mencionada acima de nucleotídeo de purina pode ser um produto purificado, ou caldo de fermentação de nucleosídeo de purina, ou um produto bruto contendo um nucleosídeo de purina.

EXEMPLOS

Daqui para frente, a presente invenção será mais especificamente explicada com referência a exemplos.

Exemplo 1 <Construção de cepa bacteriana deficiente nos genes pupG e deoD codificando nucleosídeo de purina fosforilases>

Uma cepa deficiente no gene de nucleosídeo de purina fosforilase (deoD) foi construída a partir da cepa recombinante KMBS310 como descrito abaixo. A cepa KMBS310 (Pedido de Patente Japonesa No. 2005-280186), que é derivada de Bacillus subtilis (cepa 168 Marburg de B. subtilis, ATCC 6051), é deficiente no gene de repressor de operon de purina (purR), gene de succinil-AMP sintase (purA) e gene de nucleosídeo de purina fosforilase (pupG), e tem gene de IMP desidrogenase (guaB) atenuado, caracterizado pelo fato de que a região promotora de operon de purina e seqüência SD do gene de PRPP sintetase(£>rs) foram modificadas. Expressão do operon de purina e do gene de PRPP sintetase foram melhoradas pelas modificações da região promotora e da seqüência SD, respectivamente.

Um DNA genômico preparado a partir da cepa KMBS16 (purR::spc purA::erm deoD::kan, Patente Japonesa Não-examinada No. 2004242610) pelo método de Fouet e Sonenshein (J. Bacteriol., 1990, 172, 835844) foi usado para transformar células competentes da cepas 168 Marburg de B. subtilis preparada pelo método de Dubnau e DavidofF-Abelson (J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221), e colônias cultivadas em uma placa de ágar LB contendo 5 pg/ml de canamicina foram obtidas. Colônias que não se tomaram resistentes a espectinomicina nem resistentes a eritromicina foram selecionadas a partir das colônias obtidas, e uma cepa entre estas foi designada KMBS5 (deoD::kan).

Um DNA genômico preparado a partir de KMBS5 pelo método de Fouet e Sonenshein (J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844) foi usado para transformar células competentes da cepa KMBS310 preparada pelo método de Dubnau e Davidoff-Abelson (J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221), e colônias cultivadas em uma placa de ágar LB contendo 5 pg/ml de canamicina e 20 pg/ml de guanina foram obtidas. Diversas colônias foram selecionadas a partir das colônias obtidas como descrito acima, e um dos transformantes para o qual pode ser confirmado que deoD::kan substituiu o gene deoD tipo selvagem, e todas as mutações derivadas de KMBS310 não foram substituídas pelas seqüências tipo selvagem foi designado KMBS321. Exemplo 2 <Constmção de cepa bacteriana deficiente em gene fbp codificando frutose bifosfatase, cultura e avaliação desta> (1) Preparação de cepa deficiente de gene ft>p Uma cepa deficiente no gene de frutose bifosfatase {fbp) foi construída a partir da cepa recombinante KMBS321 mencionada acima como descrito abaixo. A cepa KMBS321, que é derivada de Bacillus subtilis (cepas 168 Marburg de B. subtilis, ATCC 6051), é deficiente no gene de repressor de operon de purina (purR), gene de succinil-AMP sintase (purA) e gene de nucleosídeo de purina fosforilase (pupG), e tem gene de IMP desidrogenase (guaB) atenuado, caracterizado pelo fato de que região promotora de operon de purina e seqüência SD do gene de PRPP sintetase (prs) é modificada.

(i) Amplificação de região antes de fbp por PCR

Iniciadores de PCR 28-mer e 50-mer tendo as seguintes seqüências de nucleotídeos foram preparados baseados na informação de um banco de dados de genes (Nos. de Acesso de GenBank NC_000964 e VO 1277). TTCCCTTAGGGTTATTTTCGTTTCAAAA (SEQID NO: 17) cgtttgttgaactaatgggtgctTTTATGAGCATGTGCATGATAAGGTGA (SEQ ID NO: 18, os nucleotídeos indicados com letras minúsculas correspondem à região antes de promotor do gene de resistência a cloranfenicol (cat) clonado em pC194) PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 1,5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer) foi realizado usando o DNA cromossômico da cepas 168 Marburg de B. subtilis como um modelo e os iniciadores mencionados acima para obter um fragmento de amplificação contendo uma região de extremidade 5’ de gene flp e cerca de 1350 bp antes de região.

(ii) Amplificação de região depois de fl>p por PCR

Iniciadores de PCR 50-mer e 27-mer tendo as seguintes seqüências de nucleotídeos foram preparados baseados na informação de um banco de dados de genes (Nos. de Acesso de GenBank NC_000964 e V01277). acagctccagatccatatccttcttTTTTAGAGAGTTTGCGGGAGTAT CG (SEQ ID NO: 19, os nucleotídeos indicados com letras minúsculas correspondem a uma região posterior de gene estrutural do gene de resistência a cloranfenicol {cai) clonado em pC194) TAAAGGTTTTTCGGGATAAGATTGAAA (SEQ ID NO: 20) PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 1.5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer) foi realizado usando o DNA cromossômico da cepas 168 Marburg de B. subtilis como um modelo e os iniciadores mencionados acima para obter um fragmento de amplificação contendo uma região de extremidade 3’ de gene fòp e cerca de 1770 bp depois de região.

(iii) Amplificação de gene cat por PCR

Iniciadores de PCR 50-mer tendo as seguintes seqüências de nucleotídeos foram preparados baseados na informação de um banco de dados de genes (Nos. de Acesso de GenBank V01277 e NC_000964). tcaccttatcatgcacatgctcataaaAGCACCCATTAGTTCAACAAACG (SEQ ID NO: 21, os nucleotídeos indicados com letras minúsculas correspondem à seqüência de região de extremidade 5’ do gene fbp, e eles foram designados como sendo complementares à região de extremidade 3’ de SEQ ID NO: 18) cgatactcccgcaaactctctaaaaAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT (SEQ ID NO: 22, os nucleotídeos indicados com letras minúsculas correspondem à seqüência de região de extremidade 3’ do gene fòp, e eles foram designados como sendo complementares à região de extremidade 3’ de SEQ ID NO: 19) PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 1.5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer) foi realizado usando o plasmídeo pC194 carregando o gene de resistência a cloranfenicol {cat) como um modelo e os iniciadores mencionados acima para obter um fragmento de amplificação de cerca de 980 bp contendo o gene cat. (iv) Amplificação de fragmento compreendendo região de fòp inserida com gene cat por PCR recombinante Os fragmentos de DNA amplificados em (i) a (iii) descritos acima foram purificados usando Coluna MicroSpin S-400 (Amersham Pharmacia Biotech), e então uma mistura destes em quantidades apropriadas foi usada como um modelo junto com as seqüências de SEQ ID NOS: 17 e 20 para realizar PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 4,5 minuto, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer) e com isso obter um fragmento compreendendo a região de fbp inserida com o gene cat. (v) Preparação de cepa produtora de inosina com flψ rompido O fragmento de DNA compreendendo a região de fbp na qual o gene cat (fbp::caí) obtido em(iv) foi inserido foi sujeito a eletroforese em gel de agarose, e o fragmento alvo foi extraído do gel. O fragmento de DNA purificado como descrito acima foi usado para transformar células competentes da cepa KMBS321 de B. subtilis preparada pelo método de Dubnau e Davidoff-Abelson (J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221), e colônias cultivadas em uma placa de ágar LB contendo 2,5 pg/ml de cloranfenicol e 20 pg/ml de guanina foram obtidas. DNAs cromossômicos foram preparados a partir destas colônias, cepas nas quais região de fbp em um cromossomo foi substituída pela região de fbp cuja seqüência interna foi substituída pelo gene de resistência a cloranfenicol (fbp::caí) por dupla recombinação foram identificadas pelo método de PCR descrito em (iv), e uma destas cepas foi designada TAB S13 3. (2) Produção de nucleosídeo de purina por cepa produtora de inosina deficiente em gene fbp. A cepa TABS133 deficiente em gene fbp e uma cepa de controle KMBS321 foram cada uniformemente aplicadas em uma placa de meio LB contendo 20 mg/1 de guanina, e cultivadas durante a noite a 34°C. As células correspondendo a 1/8 da placa foram inoculadas em 20 ml de meio de fermentação contido em um frasco Sakaguchi com volume de 500-ml, então 50 g/1 de carbonato de cálcio foi adicionado ao meio, e as células foram cultivadas a 34°C com agitação. Setenta e duas horas depois do início da cultura, o meio foi amostrado, e quantidades de inosina e hipoxantina contidas no meio foram medidas por métodos conhecidos. A quantidade de inosina acumulada observada com a cepa TABS133 deficiente de gene fl>p foi maior do que aquela observada com a cepa KMBS321 como uma cepa de controle. [Composição de meio de fermentação] Glicose 30 g/1 KH2P04 1 g/1 NH4CI 32 g/1 Mameno (T-N)* 1,35 g/1 DL-Metionina 0,4 g/1 L-Triptofano 0,02 g/1 Adenina 0,1 g/1 Guanosina 0,075 g/1 MgS04 0,4 g/1 FeS04 0,01 g/1 MnS04 0,01 g/1 Adecanol (antiespuma) 0,5 ml/1 (ajustado para pH 7,0 com KOH) Carbonato de Cálcio 50 g/1 *: Hidrolisado de proteína de soja Tabela 1 [Explicação de Listagem de Seqüências] SEQID NO: 1: Seqüência de nucleotídeos de gene fbp SEQ ID NO: 2: Seqüência de aminoácidos de ffutose bifosfatase SEQ ID NO: 3: Seqüência de nucleotídeos de geneprs SEQ ID NO: 4: Seqüência de aminoácidos de fosforribosil pirofosfato sintetase SEQ ID NO: 5: Seqüência de nucleotídeos de gene purR SEQ ID NO: 6: Seqüência de aminoácidos de repressor de purina SEQ ID NO: 7: Seqüência de nucleotídeos de gene deoD

SEQ ID NO: 8: Seqüência de aminoácidos de produto de gene deoD (nucleosídeo de purina fosforilase) SEQ ID NO: 9: Seqüência de nucleotídeos de genepupG

SEQ ID NO: 10: Seqüência de aminoácidos de produto de gene pupG (nucleosídeo de purina fosforilase) SEQ ID NO: 11: Seqüência de nucleotídeos de gene purA SEQ ID NO: 12: Seqüência de aminoácidos de succinil-AMP sintase SEQ ID NO: 13: Seqüência de nucleotídeos de gene guaB SEQ ID NO: 14: Seqüência de aminoácidos de IMP desidrogenase SEQ ID NO: 15: Iniciador para amplificação de gene purR

SEQ ID NO: 16: Iniciador para amplificação de gene purR SEQ ID NO: 17: Iniciador para amplificação de região antes de gene fbp SEQ ID NO: 18: Iniciador para amplificação de região antes de genefbp SEQ ID NO: 19: Iniciador para amplificação de região depois de gene fbp SEQ ID NO: 20: Iniciador para amplificação de região depois de gene fbp SEQ ID NO: 21: Iniciador para amplificação de gene cat SEQ ID NO: 22: Iniciador para amplificação de gene cat APLICABILIDADE INDUSTRIAL

Usando a bactéria Bacillus da presente invenção, eficiência de produção de um nucleosídeo de purina e/ou um nucleotídeo de purina pode ser melhorada.

REIVINDICAÇÕES

Claims (10)

1. Método para produzir uma substância derivada de purina, caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar em um meio uma bactéria pertencente ao gênero Bacillus que tem uma capacidade de produzir uma substância derivada de purina, para causar acúmulo de uma substância derivada de purina nas células da bactéria ou no meio, e coletar a substância derivada de purina das células ou do meio, em que a bactéria foi modificada de forma que atividade enzimática de frutose bifosfatase é diminuída pela ruptura de um gene que codifica a frutose bisfosfatase, ou redução da quantidade de expressão do gene que codifica a frutose bisfosfatase, e em que a substância derivada de purina é um nucleosídeo de purina selecionado a partir do grupo consistindo em inosina, xantosina, guanosina e adcnosina.

2. Método de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o gene codificando frutose bifosfatase é um gene codificando uma proteína das seguintes (A) ou (B): (A) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQIDNO: 1, (B) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que inclui substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um ou diversos resíduos de aminoácidos e tem atividade de frutose bifosfatase.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado pelo fato de que a bactéria foi adicionalmente modificada de forma que atividade de fosforribosil pirofosfato sintetase é aumentada.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3. caracterizado pelo fato de que a bactéria foi adicionalmcnte modificada de forma que quantidade de expressão do operon de purina é aumentada.

5. Método de acordo com reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que quantidade de expressão do operon de purina é aumentada por ruptura do gene purR, que é um gene codificando um repressor do operon de purina.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a bactéria foi adicionalmente modificada de forma que a atividade de fosforilase de nucleosídeo de purina é diminuída.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela bactéria ter sido adicionalmente modificada de forma que atividade de IMP desidrogenase é diminuída.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Bacillus subtilis.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a substância derivada de purina é inosina.

10. Método para produzir um nucleotídeo de purina, caracterizado pelo fato de compreender: produzir um nucleosídeo de purina pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, reagir o nucleosídeo de purina com um doador de fosfato selecionado a partir do grupo consistindo em ácido polifosfórico, fenil fosfato e carbamil fosfato, e um microorganismo tendo uma capacidade de produzir um éster de 5'-ácido fosfórico de nucleosídeo ou fosfatase ácida para produzir um nucleotídeo de purina, e coletar o nucleotídeo de purina.