JPS5928470A - バチルス・ズブチリス - Google Patents
バチルス・ズブチリスInfo
- Publication number
- JPS5928470A JPS5928470A JP13930382A JP13930382A JPS5928470A JP S5928470 A JPS5928470 A JP S5928470A JP 13930382 A JP13930382 A JP 13930382A JP 13930382 A JP13930382 A JP 13930382A JP S5928470 A JPS5928470 A JP S5928470A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bacillus subtilis
- amidotransferase
- dna
- adenine
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明はバチルス・ズブチリス、特にホスホリボ／ル
ービーホスフェート・アミドトランスフェラーゼ） （ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｂｏｓｙ １ｐｙｒｏｐｈｏｓｐ
ｈａ ｔｅａｍｉｄｏｉｒａｎｓｒｅｒａｓｅ ；以下
ｒｐ ＲＰ Ｐアミドトラノスフエラ−ゼ」と記ス）の
遺伝子が組み込まれているプラスミドを有するバチルス
・ズブチリスに関する。
ービーホスフェート・アミドトランスフェラーゼ） （ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｂｏｓｙ １ｐｙｒｏｐｈｏｓｐ
ｈａ ｔｅａｍｉｄｏｉｒａｎｓｒｅｒａｓｅ ；以下
ｒｐ ＲＰ Ｐアミドトラノスフエラ−ゼ」と記ス）の
遺伝子が組み込まれているプラスミドを有するバチルス
・ズブチリスに関する。
バチルス属の微生物には、ヒボキサンチン、アデニン等
のプリン塩基、イノゾン、グアノゾン、アデノシン等の
プリンヌクレオシド、イノシン酸キサンチル酸、グアニ
ル酸等のプリンヌクレオチドを生産する変異株が知られ
ている。又、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼは、プ
リンヌクレオチド合成系における重要な酵素であり、プ
リンヌクレオチドのみならず、プリン塩基及びプリンヌ
クレオシドの生成散もＰＲＰＰアミドトラ／スフエラー
ゼの活性に大きく依存している。
のプリン塩基、イノゾン、グアノゾン、アデノシン等の
プリンヌクレオシド、イノシン酸キサンチル酸、グアニ
ル酸等のプリンヌクレオチドを生産する変異株が知られ
ている。又、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼは、プ
リンヌクレオチド合成系における重要な酵素であり、プ
リンヌクレオチドのみならず、プリン塩基及びプリンヌ
クレオシドの生成散もＰＲＰＰアミドトラ／スフエラー
ゼの活性に大きく依存している。
従って、上記のようなバチルス属の微生物につい−Ｃ’
、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ活：生の高い株を
得れば、プリン塩基プリンヌクレオシド又はプリンヌク
レオチドをより高い収率でｉられることか期待できる。
、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ活：生の高い株を
得れば、プリン塩基プリンヌクレオシド又はプリンヌク
レオチドをより高い収率でｉられることか期待できる。
ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ活性の高い菌株を得
るには従来、バチルス属の微生物に８−アザグアニン等
のプリンアナログに対する耐性を人工変異により（＝１
与する方法が知られている。
るには従来、バチルス属の微生物に８−アザグアニン等
のプリンアナログに対する耐性を人工変異により（＝１
与する方法が知られている。
叙上のような従来の技術に対し、本発明者らは、遺伝子
組換え技術により、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ
の遺伝子が組み込まれているプラスミドを有するバチル
ス・ズブチリスを得ることに成功し、これによって従来
の人工変異法では得られなかったＰＲＰＰアミドトラン
スフェラーゼ活性の極めて高い菌株を得ることに成功し
た。
組換え技術により、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ
の遺伝子が組み込まれているプラスミドを有するバチル
ス・ズブチリスを得ることに成功し、これによって従来
の人工変異法では得られなかったＰＲＰＰアミドトラン
スフェラーゼ活性の極めて高い菌株を得ることに成功し
た。
即ちこの発明は、ＰＲ，ＰＰ・アミドトランスフェラー
ゼの遺伝子が組み込まれているプラスミドを有するバチ
ルス・ズブチリスである。
ゼの遺伝子が組み込まれているプラスミドを有するバチ
ルス・ズブチリスである。
ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼが導入されるバチル
ス・ズブチリスはどのような菌株であってもよい。具体
的に例示すれば、以下のものがある。
ス・ズブチリスはどのような菌株であってもよい。具体
的に例示すれば、以下のものがある。
ヒボキサンチノ生産菌であるバチルス・ズブチリ二ノ要
求性） 、イノシン生産菌であるバチルス・ズブチリス
ＡＪＩ＋９１３（アルギニノ、ロインγ ン、アデニン要求性、８−アザ−アニン耐性）、イノシ
ン酸生産菌であるバチルス・ズブチリスＡＪＩ＋９１４
（アルギニン、ロイシン、アデニン要求性、８−７ザグ
アニン耐性）、グアノノン生産菌であるバチルス・ズブ
チリスＡＪ、ｌｌ９１５（アルギニン、ロイシン、アデ
ニン要求性）、およびグアニル酸生産菌であるバチルス
・ズブチリスＡＪ１１９１６（アルギニン、ロイシン、
アデニン要求性）等である。
求性） 、イノシン生産菌であるバチルス・ズブチリス
ＡＪＩ＋９１３（アルギニノ、ロインγ ン、アデニン要求性、８−アザ−アニン耐性）、イノシ
ン酸生産菌であるバチルス・ズブチリスＡＪＩ＋９１４
（アルギニン、ロイシン、アデニン要求性、８−７ザグ
アニン耐性）、グアノノン生産菌であるバチルス・ズブ
チリスＡＪ、ｌｌ９１５（アルギニン、ロイシン、アデ
ニン要求性）、およびグアニル酸生産菌であるバチルス
・ズブチリスＡＪ１１９１６（アルギニン、ロイシン、
アデニン要求性）等である。
ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼが組み込まれている
台、） （−１’； ｙ、−；ドを得るには、次のような通常の
方法が用いられる。
台、） （−１’； ｙ、−；ドを得るには、次のような通常の
方法が用いられる。
染色体ＤＮＡ及びプラスミドベクターを各々制限エンド
ヌクレアーゼを用いて切断する。次にリガーゼにより染
色体ＤＮＡ断片と切断されたベクターＤＮＡとを連結せ
しめる。かくして得られた染色体１） Ｎ Ａ断片とベ
クターの結合物の受容菌は遺伝子が増幅・発現するよう
な微生物ならばどのようなものでもよいが、ＰＲＦＰア
ミドトランスフェラーゼ欠損株を用いれば形質転換株を
選択する際に好都合である。このとき受容菌として、ヒ
ボキサンチン要求性変異株や、８−アザグアニン等のプ
リン系核酸アナログ感受性菌を用いることもできる。
ヌクレアーゼを用いて切断する。次にリガーゼにより染
色体ＤＮＡ断片と切断されたベクターＤＮＡとを連結せ
しめる。かくして得られた染色体１） Ｎ Ａ断片とベ
クターの結合物の受容菌は遺伝子が増幅・発現するよう
な微生物ならばどのようなものでもよいが、ＰＲＦＰア
ミドトランスフェラーゼ欠損株を用いれば形質転換株を
選択する際に好都合である。このとき受容菌として、ヒ
ボキサンチン要求性変異株や、８−アザグアニン等のプ
リン系核酸アナログ感受性菌を用いることもできる。
組換えＤＮＡを上記のようなりＮＡ受容菌に４八するに
は、例えばＭｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、 １６Ｌ
ｌ１１（１９７９）に記載されているような通常の形
質転換法が使用できる。
は、例えばＭｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、 １６Ｌ
ｌ１１（１９７９）に記載されているような通常の形
質転換法が使用できる。
形質転換株のうちより、ＰＲＰＰアミドトランスフェラ
ーゼが組込まれているようなプラスミドを得るには、受
容菌としてヒボキサンチン要求菌（ＰＲＰＰアミドトラ
ンスフェラーゼ欠損株など）を用い、ヒポキサンチンを
含有しない培地に生育し得るような菌株を選択すればよ
い。また、ベクターＤＮＡのマーカーの性質を併せもつ
菌株を選択できるような培地を用いれば、より選択が容
易である。このようにして一旦選別されたＰＲＰＰアッ
トトランスフェラーゼ遺伝子領域カ組ミ込マれている組
換えベクターは形質転換株より抽出後池のＤＮＡ受容菌
、例えば各種の核酸、アミノ酸生産菌等に導入する事が
できる。
ーゼが組込まれているようなプラスミドを得るには、受
容菌としてヒボキサンチン要求菌（ＰＲＰＰアミドトラ
ンスフェラーゼ欠損株など）を用い、ヒポキサンチンを
含有しない培地に生育し得るような菌株を選択すればよ
い。また、ベクターＤＮＡのマーカーの性質を併せもつ
菌株を選択できるような培地を用いれば、より選択が容
易である。このようにして一旦選別されたＰＲＰＰアッ
トトランスフェラーゼ遺伝子領域カ組ミ込マれている組
換えベクターは形質転換株より抽出後池のＤＮＡ受容菌
、例えば各種の核酸、アミノ酸生産菌等に導入する事が
できる。
バチルス・ズブチリスを宿主としうるプラスミドベクタ
ーは、例えば、スタフィロコッカス属微生物由来のｐＴ
１２７． ｐｃＩ９４． ｐｃ２２１． ｐｃ２２３ｐ
ＵＢＩ＋２ （以上Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ 、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ 、Ｕ、Ｓ、Ａ、 、 ７４．１６８０（＋
９７７）参照）、ＰＵＢｌｌｏ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、、１３４，３１８（１９７８）参照）、ｐＴＰ４．
ｐＴＰ５（以上、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅ
ｒＳ、＋＠、５５（＋９７８）参照）、枯草菌由来のｐ
ＬＳ竺ｐＬＳ２８（以上、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、
１３１，６９９（＋９７７） 参照）、３ ｐＬｓ＠＠（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１２９．１４
８７（＋９７７）参照）、ｐｐｔ、 菖 ［）ＰＬ２
（以」二、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ｌｊし１
，４８４（＋ｃ＋７ｓ）参照）、等がある。更にこれら
プラスミドをもとにして構築した複合プラスミドも当然
のことながらベクターＤＮＡとして利用できうる。
ーは、例えば、スタフィロコッカス属微生物由来のｐＴ
１２７． ｐｃＩ９４． ｐｃ２２１． ｐｃ２２３ｐ
ＵＢＩ＋２ （以上Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ 、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ 、Ｕ、Ｓ、Ａ、 、 ７４．１６８０（＋
９７７）参照）、ＰＵＢｌｌｏ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、、１３４，３１８（１９７８）参照）、ｐＴＰ４．
ｐＴＰ５（以上、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅ
ｒＳ、＋＠、５５（＋９７８）参照）、枯草菌由来のｐ
ＬＳ竺ｐＬＳ２８（以上、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、
１３１，６９９（＋９７７） 参照）、３ ｐＬｓ＠＠（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１２９．１４
８７（＋９７７）参照）、ｐｐｔ、 菖 ［）ＰＬ２
（以」二、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ｌｊし１
，４８４（＋ｃ＋７ｓ）参照）、等がある。更にこれら
プラスミドをもとにして構築した複合プラスミドも当然
のことながらベクターＤＮＡとして利用できうる。
ブチリスは、使用した宿主菌が、アデニン要求性でヒボ
キサンチンの分解能が低下している一合にはヒボキサン
チンを、アデニン要求性でイノシンの分解１止が低下し
ている場合にはイノシンを、アデニン要求性で５′−イ
ノシン酸の分解能が低下している場合には５１−イノシ
ン酸を、アデニン要求性で５ ’−Ａ−サンチル酸の分
解能が低下している場合には５１−キサンチル酸を、ア
デニン要求性でグアニンの分解能が低下している場合に
はグアニンを、アデニン要求性でグアノノンの分解能が
低下している場合にはグアノシフを、アデニン要求性で
５＋−グアニル酸の分１ＪＩ１．詣が低下している場合
には５′−グアニル酸を、アデニン分解能が低下してい
る場合にはアデニンを、アゾ、ノンン分解能が低下して
いる場合にはアデノノンを、５′−アデニル酸分解能が
低下している場合には５′−アデニル酸を、２−チアゾ
ールアラニン耐性を有している場合にはし一ヒスチジン
を、それぞれ大溝に生産する。
キサンチンの分解能が低下している一合にはヒボキサン
チンを、アデニン要求性でイノシンの分解１止が低下し
ている場合にはイノシンを、アデニン要求性で５′−イ
ノシン酸の分解能が低下している場合には５１−イノシ
ン酸を、アデニン要求性で５ ’−Ａ−サンチル酸の分
解能が低下している場合には５１−キサンチル酸を、ア
デニン要求性でグアニンの分解能が低下している場合に
はグアニンを、アデニン要求性でグアノノンの分解能が
低下している場合にはグアノシフを、アデニン要求性で
５＋−グアニル酸の分１ＪＩ１．詣が低下している場合
には５′−グアニル酸を、アデニン分解能が低下してい
る場合にはアデニンを、アゾ、ノンン分解能が低下して
いる場合にはアデノノンを、５′−アデニル酸分解能が
低下している場合には５′−アデニル酸を、２−チアゾ
ールアラニン耐性を有している場合にはし一ヒスチジン
を、それぞれ大溝に生産する。
これらの物質を生産せしめるために本発明の微生物を培
養する方法は、通常の方法と持に窒わる点はない。
養する方法は、通常の方法と持に窒わる点はない。
即ち、培地は、炭素源、窒素源、無機イオン更に必要に
よりアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する
通常のものが使用できる。炭素源としてはグルコース、
ンユクロース、及びフラクトース並びにこれらの炭水化
物を含有する澱粉解氷分解物、モラセス及び果汁等が使
用できる。
よりアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する
通常のものが使用できる。炭素源としてはグルコース、
ンユクロース、及びフラクトース並びにこれらの炭水化
物を含有する澱粉解氷分解物、モラセス及び果汁等が使
用できる。
窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水アンモ
ニウム塩、硝酸塩等が好ましい。無機イオンとして、燐
酸イオン、カリイオン、マグネンウムイオン、秩イオン
、マンガンイオン等が必要により適宜培地に添加される
。
ニウム塩、硝酸塩等が好ましい。無機イオンとして、燐
酸イオン、カリイオン、マグネンウムイオン、秩イオン
、マンガンイオン等が必要により適宜培地に添加される
。
有機微量栄養素として、アデニン要求性等の栄養要求性
を有するバチルス・ズブチリスを培−ｉする場合には、
栄養要求性を満足せしめるべぎ物質が培地に添加される
。
を有するバチルス・ズブチリスを培−ｉする場合には、
栄養要求性を満足せしめるべぎ物質が培地に添加される
。
培養は好気的条件下で行うのが望ましく、ｐＨ４から８
の範囲の１閥当なｐＨ，２８℃から４２℃の範囲の適当
な温度に調節しつつ培養を行えばより好ましい結果が得
られる。
の範囲の１閥当なｐＨ，２８℃から４２℃の範囲の適当
な温度に調節しつつ培養を行えばより好ましい結果が得
られる。
実施例
＋１１ バチルス・ズブチリス ＡＪ１１７１１（ア
／ｌ／ ｄｒ’ ＝ ７、＋：＋イシン複要求株）をＮ
’−メチル−Ｎ’ニトロ−Ｎ−二トロングアニジン１０
００と ・／ ｍｌを含む燐酸緩衝液に懸濁し、３１，５℃３゜
ランスフェラーゼ欠損株Ａ Ｊ Ｉ １９２３ （ＦＥ
ＲＭＰ−θｌ、、ｂＬ ）（本菌株はヒボキサンチン要
求株の中より選択した）を誘導した。Ａ Ｊ ＋１８９
１はヒボキサンチンを蓄積したので以後、ヒポキサ７チ
ン生産菌として用いる。次、？同様の変異操作によって
、イノノン分解能の低下したイノノン生産菌ＡＪＩ＋９
１３（ＮＲＲＬＢ−７ｋｌｏｑ ）、イノシン酸分解能
の低下したイノノン酸生産菌ＡＪ ＋ １９１４（ＮＲ
ＲＬＢ ／ｆ１０ξ ）、グアノシン分解能の低下した
グアノシン生産菌Ａ、）ｚｇ＋５（ＮＲＲｔ。
／ｌ／ ｄｒ’ ＝ ７、＋：＋イシン複要求株）をＮ
’−メチル−Ｎ’ニトロ−Ｎ−二トロングアニジン１０
００と ・／ ｍｌを含む燐酸緩衝液に懸濁し、３１，５℃３゜
ランスフェラーゼ欠損株Ａ Ｊ Ｉ １９２３ （ＦＥ
ＲＭＰ−θｌ、、ｂＬ ）（本菌株はヒボキサンチン要
求株の中より選択した）を誘導した。Ａ Ｊ ＋１８９
１はヒボキサンチンを蓄積したので以後、ヒポキサ７チ
ン生産菌として用いる。次、？同様の変異操作によって
、イノノン分解能の低下したイノノン生産菌ＡＪＩ＋９
１３（ＮＲＲＬＢ−７ｋｌｏｑ ）、イノシン酸分解能
の低下したイノノン酸生産菌ＡＪ ＋ １９１４（ＮＲ
ＲＬＢ ／ｆ１０ξ ）、グアノシン分解能の低下した
グアノシン生産菌Ａ、）ｚｇ＋５（ＮＲＲｔ。
Ｂ−／１１０６）、ファニル酸分解能の低下したグアニ
ル酸生産菌ＡＪ１１９１６（ＮＲＲＬＰｅｎａｓｓａｙ
ＢｒｏｔｈＪ （商品名、Ｄｉ ｒｃｏ社製）中で３
０℃で約２時間振盪培養を行い、ヌーｊ数増殖期の菌体
を得て集菌後、通常のＤＮＡ抽出法（Ｊ。
ル酸生産菌ＡＪ１１９１６（ＮＲＲＬＰｅｎａｓｓａｙ
ＢｒｏｔｈＪ （商品名、Ｄｉ ｒｃｏ社製）中で３
０℃で約２時間振盪培養を行い、ヌーｊ数増殖期の菌体
を得て集菌後、通常のＤＮＡ抽出法（Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、８９．１０６５（＋９６５））
により、染色体を抽出、精製し、最終３．３１１１ｇを
得た。
により、染色体を抽出、精製し、最終３．３１１１ｇを
得た。
ｆ３１ＰＲＰＰ−アミドトランスフェラーゼの遺伝子領
域をフローニングするため、そのベクターとして自律増
殖性のプラスミドｐｕＢＩＩＯ（カナマイシン、ネオマ
インノ耐性を発現する）を用いた。（２）で得た染色体
ＤＮＡを各々５μ２ずつとプラスミドｐＵＢＩＩ０ ５
μ２ずつをそれぞれ制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ Ｒ
１で３７℃、６０分作用させてＤＮＡ鎖を切断した。
域をフローニングするため、そのベクターとして自律増
殖性のプラスミドｐｕＢＩＩＯ（カナマイシン、ネオマ
インノ耐性を発現する）を用いた。（２）で得た染色体
ＤＮＡを各々５μ２ずつとプラスミドｐＵＢＩＩ０ ５
μ２ずつをそれぞれ制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ Ｒ
１で３７℃、６０分作用させてＤＮＡ鎖を切断した。
６５℃で１０分間の熱処理後、各両反応液を混合し、Ａ
ＴＰ及びジチオスライトール存在下、Ｔ４ファージ由来
のＤＮＡリガーゼにて１０℃２４時間、ｏ Ｎ Ａ 鎖
の連結反応を行った。
ＴＰ及びジチオスライトール存在下、Ｔ４ファージ由来
のＤＮＡリガーゼにて１０℃２４時間、ｏ Ｎ Ａ 鎖
の連結反応を行った。
（４） バチルス・ズブチリスＡＪ＋１９２３（アル
ギニン、ロインンー■−一、ヒポササンチン要求性変異
株）をｒＰｅｎａｓｓｙ−ＢｒｏｔｈＪ （Ｄｉ ｆｃ
。
ギニン、ロインンー■−一、ヒポササンチン要求性変異
株）をｒＰｅｎａｓｓｙ−ＢｒｏｔｈＪ （Ｄｉ ｆｃ
。
社製）に接種して３０℃にて１晩振盪培養を行い、倒・
Ｉ培養培地（グルコース ５ｆ／１１（ＮＨ＜）ｓｓＯ
４２Ｙ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４６ｆ／４に２ＨＰＯ４１４Ｙ
／ｌ 、 ＭｆＳＯ４・７Ｈ，００，２μ、クエン酸ナ
トリウム＋ ９／ｌ、酵母エキス２ ｆ／ｌ。
Ｉ培養培地（グルコース ５ｆ／１１（ＮＨ＜）ｓｓＯ
４２Ｙ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４６ｆ／４に２ＨＰＯ４１４Ｙ
／ｌ 、 ＭｆＳＯ４・７Ｈ，００，２μ、クエン酸ナ
トリウム＋ ９／ｌ、酵母エキス２ ｆ／ｌ。
し−アルギニン２５０Ｔｎ９／ｌ 、 Ｌ−Ｏインン５
ｏｍｇ／ｌ、ヒボキサンチｖ ｓｏｍｑ／ｌｌｌを含
む）に接種し、３７℃にて４時間振盪培養を行った後、
さらにオ■培養培地（グルコース５ ？ ／ ＩＪ 、
（ＮＨ４）２ Ｓ０４ ２１ｉＩ／ＣＫＨ２ＰＯ４６Ｇ
１／ｌ。
ｏｍｇ／ｌ、ヒボキサンチｖ ｓｏｍｑ／ｌｌｌを含
む）に接種し、３７℃にて４時間振盪培養を行った後、
さらにオ■培養培地（グルコース５ ？ ／ ＩＪ 、
（ＮＨ４）２ Ｓ０４ ２１ｉＩ／ＣＫＨ２ＰＯ４６Ｇ
１／ｌ。
Ｋ２ＨＰＯ４１４ｆｔ／１． ＭｙＳＯ，１，２？／１
１ クエン酸ナトリウム Ｉ？／ｌ、酵母エキス０．
２ Ｙ／ｌ 。
１ クエン酸ナトリウム Ｉ？／ｌ、酵母エキス０．
２ Ｙ／ｌ 。
Ｌ−アルダ＝ ７ ｓｏ ｍ！９／／１． Ｌ −ｏイ
：／ ７５ ｍ９／ ｌ 。
：／ ７５ ｍ９／ ｌ 。
ヒボキサンチン５０ｍｇ／ｌを含む）へ接種し、３７℃
にて１．５時間振盪培養を行うことによって、いわゆる
コンピテントな（ＤＮＡ取込能を有する）細胞を調製し
た（参考文献、ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ、＋８１＋’７４
１（＋９６１））。このコンピテント細胞懸濁液に（３
）で得たＤＮＡ溶液を各々別々に加えて３７℃でさらに
振盪培養を行って形質転換反応を完了させた。次にこの
形質転換株を含む懸濁液を、（グルコース５ ｙ／１１
（ＮＨ４）２Ｓｏ４２９／’１１ＫＨ，Ｐｏ、 ６ｆ
ｌ／ｌ、 Ｋ２ＨＰＯ４１４ｆｌ／ｌ、ＭｊＳＯ４７
Ｈ２００，２ｆ／ｌ 、 クエン酸ナトリウムＩｆ！
／１ＳＬ−アルギニ７１００ｍ９／１１Ｌ−ロイシン１
００＋Ｉ＋ｇ／１１カナマイノン５ｒＡｇ／１１寒天２
０ Ｌｉ！／ｌ、（［） Ｈ７，２）を含む培地１１１
に冷凍し、３７℃て培養した。
にて１．５時間振盪培養を行うことによって、いわゆる
コンピテントな（ＤＮＡ取込能を有する）細胞を調製し
た（参考文献、ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ、＋８１＋’７４
１（＋９６１））。このコンピテント細胞懸濁液に（３
）で得たＤＮＡ溶液を各々別々に加えて３７℃でさらに
振盪培養を行って形質転換反応を完了させた。次にこの
形質転換株を含む懸濁液を、（グルコース５ ｙ／１１
（ＮＨ４）２Ｓｏ４２９／’１１ＫＨ，Ｐｏ、 ６ｆ
ｌ／ｌ、 Ｋ２ＨＰＯ４１４ｆｌ／ｌ、ＭｊＳＯ４７
Ｈ２００，２ｆ／ｌ 、 クエン酸ナトリウムＩｆ！
／１ＳＬ−アルギニ７１００ｍ９／１１Ｌ−ロイシン１
００＋Ｉ＋ｇ／１１カナマイノン５ｒＡｇ／１１寒天２
０ Ｌｉ！／ｌ、（［） Ｈ７，２）を含む培地１１１
に冷凍し、３７℃て培養した。
培養３日後には、上記培地１１１上に１０個のコロニー
が出現したので、これを釣菌し、各クローンを各々純粋
に分離した。
が出現したので、これを釣菌し、各クローンを各々純粋
に分離した。
培地１１１から得られた形質転換株の性質は、いずれも
アルギニン、ロインン複要求性、カナマイノン耐性ヒボ
キサンチン非要求性を示した。
アルギニン、ロインン複要求性、カナマイノン耐性ヒボ
キサンチン非要求性を示した。
＋４１ＰＲＦＰ−アミドトランスフェラーゼの遺伝子領
域を含むプラスミドの確認および、各種核酸生産菌への
導入。
域を含むプラスミドの確認および、各種核酸生産菌への
導入。
１５１ １４１で得られたクローンのうち、ＡＪＩＩ９
２４（ＦＥＲＭ−Ｐ ららち３ ）を用いてＣ，１，
Ｋａｄ。
２４（ＦＥＲＭ−Ｐ ららち３ ）を用いてＣ，１，
Ｋａｄ。
らの方法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、＋４５．１３６
５．（＋９８１））に基づいたｌ） Ｎ Ａ抽出法によ
り、ＤＮＡを抽出しアカロースゲル電気泳動により、プ
ラスミドｐＨＥ１７ （８，２メガダルトン）を確認し
、次に分画採取し精製した。
５．（＋９８１））に基づいたｌ） Ｎ Ａ抽出法によ
り、ＤＮＡを抽出しアカロースゲル電気泳動により、プ
ラスミドｐＨＥ１７ （８，２メガダルトン）を確認し
、次に分画採取し精製した。
Ａ 、ｌ Ｉ １９２３を精製したプラスミドｐＨＥ１
７を用いて形質転換すると、カナマイ７ノ耐性とヒボキ
ザノチン非要求性の性質が同時に導入されることから、
ＰＲＰＰ−アミドトランスフェラーゼの遺伝子領域が少
なくとも含まれているものと考えられる。そこてＰＲＰ
Ｐ−アミドトランスフェラーゼの活性測定を椎尾らの変
法（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、６６、１７５（＋９６９）
）を用いて行った。
７を用いて形質転換すると、カナマイ７ノ耐性とヒボキ
ザノチン非要求性の性質が同時に導入されることから、
ＰＲＰＰ−アミドトランスフェラーゼの遺伝子領域が少
なくとも含まれているものと考えられる。そこてＰＲＰ
Ｐ−アミドトランスフェラーゼの活性測定を椎尾らの変
法（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、６６、１７５（＋９６９）
）を用いて行った。
その結果を牙−表に示す。
第１表
ＡＪ１１７１１ ａｒｇ−、１ｅｕ−なし
０．２ＡＪ１１９２３ ａｒｇ、Ｉｅｉｉ、Ｈｉ
なし ０ｔ ／７ この結果から、プラスミドｐＨＥ１１１によるＰＲＰＰ
−アミドトランスフェラーゼの遺伝子増幅が明らかであ
る。
０．２ＡＪ１１９２３ ａｒｇ、Ｉｅｉｉ、Ｈｉ
なし ０ｔ ／７ この結果から、プラスミドｐＨＥ１１１によるＰＲＰＰ
−アミドトランスフェラーゼの遺伝子増幅が明らかであ
る。
次に（４）と同様な方法により、ヒポキサンチン９１
生産４ＡＪ Ｉ ＩＭ−一、イノノン生産菌ＡＪ＋１９
１３、イノノン酸生産菌ＡＪＩ＋９１４、グアノノン生
産＋ＷＡＪ Ｉ １９１５、グアニル酸生産菌ＡＪＩ＋
９１６へプラスミドｐＨＥＩ７を導入した結果、各々形
質転換株Ａ Ｊ １１９１７（ＮＲＲＬＢ−／ξｌＯど
）、ＡＪＩ＋９１８（ＮＲＲＬ Ｂ−人ｍ／、）ｃ
／）、ＡＪ１１９１９（ＮＲＲＬ Ｂ −／、ｆ／１
０ ）、Ａ Ｊ ＋ １ ’９２０（ＮＲＲＬ
Ｂ−Ａ！、〜ｌ／／）、ＡＪ］１９２１（Ｎ ＲＲＬ
Ｂ −／ｒ／／ユ ）を得た。
１３、イノノン酸生産菌ＡＪＩ＋９１４、グアノノン生
産＋ＷＡＪ Ｉ １９１５、グアニル酸生産菌ＡＪＩ＋
９１６へプラスミドｐＨＥＩ７を導入した結果、各々形
質転換株Ａ Ｊ １１９１７（ＮＲＲＬＢ−／ξｌＯど
）、ＡＪＩ＋９１８（ＮＲＲＬ Ｂ−人ｍ／、）ｃ
／）、ＡＪ１１９１９（ＮＲＲＬ Ｂ −／、ｆ／１
０ ）、Ａ Ｊ ＋ １ ’９２０（ＮＲＲＬ
Ｂ−Ａ！、〜ｌ／／）、ＡＪ］１９２１（Ｎ ＲＲＬ
Ｂ −／ｒ／／ユ ）を得た。
（６） 以上のようにして得られた各種核酸生産菌株
を下記培養培地にて、３４℃にて７２時間培養した結果
を牙２表に示す。
を下記培養培地にて、３４℃にて７２時間培養した結果
を牙２表に示す。
※ 発酵培地組成はグルコースｓｏｙ／１１ＮＨ，ＣＩ
！ ５９／１１ ＫＨ２ＰＯ４５９７’ｌ、
Ｍｆｉ’ＳＯ４・７Ｈ，，００，４ｆｌ／１ＸＦｅＳＯ
４・７Ｈ，ＯＩＯｍＬｊ／ｌ、 ＭｎＳＯ４・７Ｈ２０
１０ｍ９／１１ＣａＣ４−２Ｈ２０２ｆ／／ｌ）、味邑
（登録商標）４０ｍｌ／ｌ、 ７ ルギ：７］００ｍ
１４＋ｒ（ラフ１００ｒｒｖ’ｌ１１アゾ＝ ７２００
ｍｑ／ （、、ｐ Ｈ６，５（ＫＯＨ）てあり、２０
ｍＡを坂ロフラスコに分注し、１１５℃、ｌＯ分オート
クレプして殺菌した。
！ ５９／１１ ＫＨ２ＰＯ４５９７’ｌ、
Ｍｆｉ’ＳＯ４・７Ｈ，，００，４ｆｌ／１ＸＦｅＳＯ
４・７Ｈ，ＯＩＯｍＬｊ／ｌ、 ＭｎＳＯ４・７Ｈ２０
１０ｍ９／１１ＣａＣ４−２Ｈ２０２ｆ／／ｌ）、味邑
（登録商標）４０ｍｌ／ｌ、 ７ ルギ：７］００ｍ
１４＋ｒ（ラフ１００ｒｒｖ’ｌ１１アゾ＝ ７２００
ｍｑ／ （、、ｐ Ｈ６，５（ＫＯＨ）てあり、２０
ｍＡを坂ロフラスコに分注し、１１５℃、ｌＯ分オート
クレプして殺菌した。
Claims (1)
- ポスホリボ／ルビロホスフエート・アミドトランスフェ
ラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｂｏｓｙｌｐｙｒｏｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅａｍｉｄｏｌｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の遺
伝子が組み込まれているプラスミドを有スるバチルス・
ズブチリス
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13930382A JPS5928470A (ja) | 1982-08-11 | 1982-08-11 | バチルス・ズブチリス |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13930382A JPS5928470A (ja) | 1982-08-11 | 1982-08-11 | バチルス・ズブチリス |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5928470A true JPS5928470A (ja) | 1984-02-15 |
| JPH0459877B2 JPH0459877B2 (ja) | 1992-09-24 |
Family
ID=15242142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13930382A Granted JPS5928470A (ja) | 1982-08-11 | 1982-08-11 | バチルス・ズブチリス |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5928470A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1700910A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing Bacillus and a method for producing purine-derived substance therewith |
| WO2007125783A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| WO2007125782A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| US8034767B2 (en) | 2006-12-22 | 2011-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus |
| US9012182B2 (en) | 2004-03-31 | 2015-04-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
-
1982
- 1982-08-11 JP JP13930382A patent/JPS5928470A/ja active Granted
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9012182B2 (en) | 2004-03-31 | 2015-04-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
| EP1700910A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing Bacillus and a method for producing purine-derived substance therewith |
| EP1700910A3 (en) * | 2005-03-10 | 2007-03-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing Bacillus and a method for producing purine-derived substance therewith |
| US7326546B2 (en) | 2005-03-10 | 2008-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| US8298791B2 (en) | 2005-03-10 | 2012-10-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| WO2007125783A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| WO2007125782A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| US8236531B2 (en) | 2006-04-24 | 2012-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing a purine-derived substance |
| US8409563B2 (en) | 2006-04-24 | 2013-04-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing a purine-derived substance |
| US8034767B2 (en) | 2006-12-22 | 2011-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0459877B2 (ja) | 1992-09-24 |
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