JPH0630583B2 - Ｄνａおよびその用途 - Google Patents
Ｄνａおよびその用途Info
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- JPH0630583B2 JPH0630583B2 JP59013968A JP1396884A JPH0630583B2 JP H0630583 B2 JPH0630583 B2 JP H0630583B2 JP 59013968 A JP59013968 A JP 59013968A JP 1396884 A JP1396884 A JP 1396884A JP H0630583 B2 JPH0630583 B2 JP H0630583B2
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- JP
- Japan
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- hind iii
- dna
- guanosine
- strain
- bacillus
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- Expired - Lifetime
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子を有する
ＤＮＡ、それが組み込まれたベクター、そのベクターで
形質転換せしめたバチルス属菌、およびその形質転換株
を培養するグアノシンの製造法に関する。
ＤＮＡ、それが組み込まれたベクター、そのベクターで
形質転換せしめたバチルス属菌、およびその形質転換株
を培養するグアノシンの製造法に関する。
グアノシンは呈味性を有する５′−グアニル酸の合成原
料として重要な物質であり、これを安価かつ大量に製造
することは、工業上きわめて意義深いことである。従
来、発酵法によるグアノシンの製造法に関しては、アデ
ニン要求性変異株に、ヌクレオチドホスホリラーゼ欠損
性、ＧＭＰレダクターゼ欠損性、アデニン・アデノシン
耐性などの性質の付与された変異株が用いられてきた。
料として重要な物質であり、これを安価かつ大量に製造
することは、工業上きわめて意義深いことである。従
来、発酵法によるグアノシンの製造法に関しては、アデ
ニン要求性変異株に、ヌクレオチドホスホリラーゼ欠損
性、ＧＭＰレダクターゼ欠損性、アデニン・アデノシン
耐性などの性質の付与された変異株が用いられてきた。
本発明者らはこのようなグアノシンの製造法において、
菌株の合理的な育成法を見出すべく鋭意研究を重ねた結
果、バチルス属に属するイノシンおよび（または）グア
ノシン生産菌を、グアノシンまたは（および）キサント
シン生産能を有する微生物の５′−イノシン酸脱水素酵
素遺伝子領域の組み込まれたベクターＤＮＡで形質転換
せしめることによって、グアノシンの蓄積量が著しく増
大することを認め、この知見にもとずいてさらに研究を
進めて本発明を完成した。
菌株の合理的な育成法を見出すべく鋭意研究を重ねた結
果、バチルス属に属するイノシンおよび（または）グア
ノシン生産菌を、グアノシンまたは（および）キサント
シン生産能を有する微生物の５′−イノシン酸脱水素酵
素遺伝子領域の組み込まれたベクターＤＮＡで形質転換
せしめることによって、グアノシンの蓄積量が著しく増
大することを認め、この知見にもとずいてさらに研究を
進めて本発明を完成した。
すなわち、本発明は、(1)バチルス属菌由来の５′−イ
ノシン酸脱水素酵素遺伝子を有し、次の制限酵素切断地
図， Hind III (0) Bgl II (0.5) Sac II (0.7) Hind III (0.75) Pvu II (1.0) Cla I (1.1) Hind III (1.15) ＊Hind III (1.4) ＊Hind III (2.65) Hind III (2.9) ［ただし、＊Hind III (1.4)、＊Hind III (2.65)はど
ちらか一方にHind IIIの切断点が存在しているが、決定
されていないことを示す。］で表わされるＤＮＡ、(2)
グアノシンまたは（および）キサントシン生産能を有す
るバチルス属菌の染色体ＤＮＡから得られた上記第(1)
項のＤＮＡ、(3)上記第(2)項のＤＮＡが組み込まれたベ
クター、(4)上記第(3)項のベクターで形質転換されたバ
チルス属菌、(5)上記第(3)項のベクターで形質転換され
たグアノシン生産能を有する上記第(4)のバチルス属菌
に関するものであり、さらにグアノシンまたは（およ
び）キサントシン生産能を有するパチルス属菌の染色体
ＤＮＡから得られた５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子
領域が組み込まれたベクターで形質転換されたグアノシ
ン生産能を有するバチルス属菌を培地に培養し、培養物
中にグアノシンを生成蓄積せしめ、これを採取すること
を特徴とするグアノシンの製造法についても述べる。
ノシン酸脱水素酵素遺伝子を有し、次の制限酵素切断地
図， Hind III (0) Bgl II (0.5) Sac II (0.7) Hind III (0.75) Pvu II (1.0) Cla I (1.1) Hind III (1.15) ＊Hind III (1.4) ＊Hind III (2.65) Hind III (2.9) ［ただし、＊Hind III (1.4)、＊Hind III (2.65)はど
ちらか一方にHind IIIの切断点が存在しているが、決定
されていないことを示す。］で表わされるＤＮＡ、(2)
グアノシンまたは（および）キサントシン生産能を有す
るバチルス属菌の染色体ＤＮＡから得られた上記第(1)
項のＤＮＡ、(3)上記第(2)項のＤＮＡが組み込まれたベ
クター、(4)上記第(3)項のベクターで形質転換されたバ
チルス属菌、(5)上記第(3)項のベクターで形質転換され
たグアノシン生産能を有する上記第(4)のバチルス属菌
に関するものであり、さらにグアノシンまたは（およ
び）キサントシン生産能を有するパチルス属菌の染色体
ＤＮＡから得られた５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子
領域が組み込まれたベクターで形質転換されたグアノシ
ン生産能を有するバチルス属菌を培地に培養し、培養物
中にグアノシンを生成蓄積せしめ、これを採取すること
を特徴とするグアノシンの製造法についても述べる。
本発明のＤＮＡは、５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子
を有する微生物から得られる。この供与菌としては、通
常、グアノシンまたは（および）キサントシン生産能を
有する微生物が用いられるが、該物質の生産能を有さな
い微生物であっても、当該微生物の５′−イノシン酸脱
水素酵素が、プリン系物質によるフィードバック制御か
ら全面または部分的に解除されている場合には、本発明
のＤＮＡの供与菌として用いることができる。たとえ
ば、供与菌の例としては、グアノシンまたは（および）
キサントシン生産能を有するバチルス属菌が挙げられ、
その染色体ＤＮＡから単離することができる。このよう
なバチルス属菌の具体例としては、バチルス・ズブチリ
ス（Bacillus subtilis)NA−６０１１（ＩＦＯ １４１
８９，ＦＥＲＭ ＢＰ−２９１）、バチルス・ズブチリ
スＮＡ−６０１２（ＩＦＯ １４１９０，ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２９２）が挙げられる。
を有する微生物から得られる。この供与菌としては、通
常、グアノシンまたは（および）キサントシン生産能を
有する微生物が用いられるが、該物質の生産能を有さな
い微生物であっても、当該微生物の５′−イノシン酸脱
水素酵素が、プリン系物質によるフィードバック制御か
ら全面または部分的に解除されている場合には、本発明
のＤＮＡの供与菌として用いることができる。たとえ
ば、供与菌の例としては、グアノシンまたは（および）
キサントシン生産能を有するバチルス属菌が挙げられ、
その染色体ＤＮＡから単離することができる。このよう
なバチルス属菌の具体例としては、バチルス・ズブチリ
ス（Bacillus subtilis)NA−６０１１（ＩＦＯ １４１
８９，ＦＥＲＭ ＢＰ−２９１）、バチルス・ズブチリ
スＮＡ−６０１２（ＩＦＯ １４１９０，ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２９２）が挙げられる。
供与菌からの染色体ＤＮＡの調製法としては、公知の方
法、たとえばフェノールを用いて染色体ＤＮＡを抽出す
る方法が用いられる。
法、たとえばフェノールを用いて染色体ＤＮＡを抽出す
る方法が用いられる。
供与菌から得られた染色体ＤＮＡは、制限酵素を用いて
切断し、５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子を有し、
２．９キロベースベア離れたHind IIIの切断点を有する
ＤＮＡ断片を調製する。このようなＤＮＡ断片の調製に
は、各種文献類（例えば、TAKARA REAGENTS FOR GENETI
C ENGINEERING RESEARCH、宝酒造株式会社発行）等に記
載されているものの中から適宜選択された制限酵素を使
用することが出来る。
切断し、５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子を有し、
２．９キロベースベア離れたHind IIIの切断点を有する
ＤＮＡ断片を調製する。このようなＤＮＡ断片の調製に
は、各種文献類（例えば、TAKARA REAGENTS FOR GENETI
C ENGINEERING RESEARCH、宝酒造株式会社発行）等に記
載されているものの中から適宜選択された制限酵素を使
用することが出来る。
次に、このようにして得られた５′−イノシン酸脱水素
酵素遺伝子領域を含む染色体ＤＮＡ断片はベクターＤＮ
Ａに挿入される。ベクターＤＮＡとしては、ｐＵＢ１１
０〔J.Bacteriol.,134,318(1978)〕、ｐＴ１２７、ｐＣ
１９４、ｐＣ２２１（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,1
680(1977)〕、pLS２８（J.Bacteriol.,131,699(1977)〕
など既知のものは無論のこと、その他の新たに分離され
たり合成されたものであっても、バチルス属細菌のベク
ターＤＮＡとして使用することが可能なものであれば、
いずれも用いることができる。ベクターＤＮＡは、前述
の染色体ＤＮＡ断片を調製したときと同様な制限酵素を
用いて切断される。
酵素遺伝子領域を含む染色体ＤＮＡ断片はベクターＤＮ
Ａに挿入される。ベクターＤＮＡとしては、ｐＵＢ１１
０〔J.Bacteriol.,134,318(1978)〕、ｐＴ１２７、ｐＣ
１９４、ｐＣ２２１（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,1
680(1977)〕、pLS２８（J.Bacteriol.,131,699(1977)〕
など既知のものは無論のこと、その他の新たに分離され
たり合成されたものであっても、バチルス属細菌のベク
ターＤＮＡとして使用することが可能なものであれば、
いずれも用いることができる。ベクターＤＮＡは、前述
の染色体ＤＮＡ断片を調製したときと同様な制限酵素を
用いて切断される。
このようにして得られた５′−イノシン酸脱水素酵素遺
伝子領域を含む染色体ＤＮＡ断片と、切断されたベクタ
ーＤＮＡとを連結させる方法は、通常のＤＮＡリガーゼ
を用いる方法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,57,1426(19
67)〕、ターミナルトランスフェラーゼ法〔Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A.,69,2904(1972)〕、T4リガーゼを用いる
フラッシュエンドの連結による方法〔有機合成化学，3
9,110(1972)〕などが用いられる。
伝子領域を含む染色体ＤＮＡ断片と、切断されたベクタ
ーＤＮＡとを連結させる方法は、通常のＤＮＡリガーゼ
を用いる方法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,57,1426(19
67)〕、ターミナルトランスフェラーゼ法〔Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A.,69,2904(1972)〕、T4リガーゼを用いる
フラッシュエンドの連結による方法〔有機合成化学，3
9,110(1972)〕などが用いられる。
上記の方法により、５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子
領域を組み込まれたベクターＤＮＡが、バチルス属に属
する細菌の形質転換に用いられる。このような受容菌に
は、５′−イノシン酸脱水素酵素の欠失したキサンチン
要求性変異株を用いれば、目的とする形質転換株を選択
する際に好都合である。この受容菌の例としては、バチ
ルス・ズブチリスＲＮ−６３株（ＩＦＯ １４３０７，
FERM−Ｐ７４１０）が挙げられる。
領域を組み込まれたベクターＤＮＡが、バチルス属に属
する細菌の形質転換に用いられる。このような受容菌に
は、５′−イノシン酸脱水素酵素の欠失したキサンチン
要求性変異株を用いれば、目的とする形質転換株を選択
する際に好都合である。この受容菌の例としては、バチ
ルス・ズブチリスＲＮ−６３株（ＩＦＯ １４３０７，
FERM−Ｐ７４１０）が挙げられる。
組み換えＤＮＡを受容菌に導入するには、例えば、Mol.
Gen.Genet.168,111(1979)に記載されているような通常
の形質転換法が用いられる。
Gen.Genet.168,111(1979)に記載されているような通常
の形質転換法が用いられる。
５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子領域の組み込まれた
ベクターＤＮＡを保有する形質転換株の選択には、例え
ば、受容菌として、キサンチン要求性変異株を用いて、
キサンチンを含有しない培地に生育しうるような菌株を
選別すればよい。また、供試するベクターＤＮＡが抗生
物質耐性などの選択マーカーを有する場合には、上記の
選別用培地に当該抗生物質を添加する等の方法を用いれ
ば、目的とする形質転換株の選択がより一層容易とな
る。
ベクターＤＮＡを保有する形質転換株の選択には、例え
ば、受容菌として、キサンチン要求性変異株を用いて、
キサンチンを含有しない培地に生育しうるような菌株を
選別すればよい。また、供試するベクターＤＮＡが抗生
物質耐性などの選択マーカーを有する場合には、上記の
選別用培地に当該抗生物質を添加する等の方法を用いれ
ば、目的とする形質転換株の選択がより一層容易とな
る。
このようにして得られた５′−イノシン酸脱水素酵素遺
伝子領域の組み込まれたベクターＤＮＡは、その保有株
から、該組み換えＤＮＡを抽出して、他のグアノシン生
産菌に導入したり、あるいは、抽出された組み換えＤＮ
Ａから５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子領域を含むＤ
ＮＡ断片を調製後、これを他のベクターＤＮＡに連結し
て、グアノシン生産菌に導入して用いることができる。
また、当然のことながら、大腸菌などバチルス属に属す
る細菌以外の宿主−ベクター系を用いて５′−イノシン
酸脱水素酵素遺伝子領域をクローニングした後、得られ
た組み換えＤＮＡから当該遺伝子領域を含むＤＮＡ断片
を調製し、これをバチルス属に属する細菌用のベクター
ＤＮＡに連結して、グアノシン生産菌に導入することも
可能である。
伝子領域の組み込まれたベクターＤＮＡは、その保有株
から、該組み換えＤＮＡを抽出して、他のグアノシン生
産菌に導入したり、あるいは、抽出された組み換えＤＮ
Ａから５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子領域を含むＤ
ＮＡ断片を調製後、これを他のベクターＤＮＡに連結し
て、グアノシン生産菌に導入して用いることができる。
また、当然のことながら、大腸菌などバチルス属に属す
る細菌以外の宿主−ベクター系を用いて５′−イノシン
酸脱水素酵素遺伝子領域をクローニングした後、得られ
た組み換えＤＮＡから当該遺伝子領域を含むＤＮＡ断片
を調製し、これをバチルス属に属する細菌用のベクター
ＤＮＡに連結して、グアノシン生産菌に導入することも
可能である。
このようなグアノシン生産菌の例としては、前述したバ
チルス・ズブチリスＮＡ−６０１１株、バチルス・ズブ
チリスＮＡ−６０１２株が挙げられる。
チルス・ズブチリスＮＡ−６０１１株、バチルス・ズブ
チリスＮＡ−６０１２株が挙げられる。
かくして得られる形質転換株の例としては、ＮＡ−６０
１１株を形質転換して得られるバチルス・ズブチリスＴ
Ｆ１１（ＩＦＯ１４３１２，ＦＥＲＭ Ｐ−７４１
２）、ＮＡ−６０１２株を形成転換して得られるバチル
ス・ズブチリスＴＦ２１（ＩＦＯ１４３１３，ＦＥＲＭ
Ｐ−７４１３）が挙げられる。これら形質転換株は、
導入されたプラスミドの遺伝的特性が発現されるため
に、形質転換前にくらべて、クロラムフェニコールに対
する耐性度が高く、５′−イノシン酸脱水素酵素活性が
高く、グアノシン生産能が増大されるが、その他の菌学
的性質は変らない。
１１株を形質転換して得られるバチルス・ズブチリスＴ
Ｆ１１（ＩＦＯ１４３１２，ＦＥＲＭ Ｐ−７４１
２）、ＮＡ−６０１２株を形成転換して得られるバチル
ス・ズブチリスＴＦ２１（ＩＦＯ１４３１３，ＦＥＲＭ
Ｐ−７４１３）が挙げられる。これら形質転換株は、
導入されたプラスミドの遺伝的特性が発現されるため
に、形質転換前にくらべて、クロラムフェニコールに対
する耐性度が高く、５′−イノシン酸脱水素酵素活性が
高く、グアノシン生産能が増大されるが、その他の菌学
的性質は変らない。
上記のＮＡ−６０１１およびＮＡ−６０１２株は、バチ
ルス・ズブチリスNo.１１５（ＩＦＯ１４１８７）を親
株として誘導されたグアノシン生産菌であり、第１表の
菌学的性質を有する。
ルス・ズブチリスNo.１１５（ＩＦＯ１４１８７）を親
株として誘導されたグアノシン生産菌であり、第１表の
菌学的性質を有する。
上記の菌学的性質をR.E.BuchananおよびN.E.Gibbons編
の「バージス・マニュアル・オブ・デターミナテイブ・
バクテリアオロジー(Bergy′s Manual of Determinativ
e Bacteriology)第８版，１９７４年」にしたがって検
索の結果、バチルス・ズブチリスに属する微生物である
と同定され、形質転換株であるＴＦ１１株およびＴＦ２
１株も同様の菌学的性質を示す。
の「バージス・マニュアル・オブ・デターミナテイブ・
バクテリアオロジー(Bergy′s Manual of Determinativ
e Bacteriology)第８版，１９７４年」にしたがって検
索の結果、バチルス・ズブチリスに属する微生物である
と同定され、形質転換株であるＴＦ１１株およびＴＦ２
１株も同様の菌学的性質を示す。
なお、本明細書において、ＩＦＯ番号は財団法人発酵研
究所（ＩＦＯ，大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７
番８５号）への受託番号を、ＦＥＲＭ Ｐ番号は工業技
術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ，茨城県筑波郡谷田
部町東１丁目１番３号）への受託番号を、またＦＥＲＭ
ＢＰ番号はブタベスト条約に基づくＦＲＩへの受託番
号をそれぞれ示す。
究所（ＩＦＯ，大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７
番８５号）への受託番号を、ＦＥＲＭ Ｐ番号は工業技
術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ，茨城県筑波郡谷田
部町東１丁目１番３号）への受託番号を、またＦＥＲＭ
ＢＰ番号はブタベスト条約に基づくＦＲＩへの受託番
号をそれぞれ示す。
なお、バチルス ズブチリスＲＮ−６３（ＦＥＲＭ Ｐ
−７４１０）、エシエリヒア コリ Ｘ−８９５（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−７４１１）、バチルス ズブチリスＴＦ−１
１（ＦＥＲＭ Ｐ−７４１２）およびバチルス ズブチ
リスＴＦ−２１（ＦＥＲＭ Ｐ−７４１３）について
は、該寄託がブタペスト条約に基づく寄託に切り換えら
れて、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−７４１０はＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６１３として、ＦＥＲＭ Ｐ−７４１１はＦＥＲＭ
ＢＰ−６１４として、ＦＥＲＭ Ｐ−７４１２はＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６１５として、またＦＥＲＭ Ｐ−７４１
３はＦＥＲＭ ＢＰ−６１６としてそれぞれＦＲＩに保
管されている。
−７４１０）、エシエリヒア コリ Ｘ−８９５（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−７４１１）、バチルス ズブチリスＴＦ−１
１（ＦＥＲＭ Ｐ−７４１２）およびバチルス ズブチ
リスＴＦ−２１（ＦＥＲＭ Ｐ−７４１３）について
は、該寄託がブタペスト条約に基づく寄託に切り換えら
れて、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−７４１０はＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６１３として、ＦＥＲＭ Ｐ−７４１１はＦＥＲＭ
ＢＰ−６１４として、ＦＥＲＭ Ｐ−７４１２はＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６１５として、またＦＥＲＭ Ｐ−７４１
３はＦＥＲＭ ＢＰ−６１６としてそれぞれＦＲＩに保
管されている。
このように形質転換して得られたグアノシン生産菌の培
養には、従来のグアノシン生産菌の培養方法と同様の方
法が用いられる。すなわち、培地としては、炭素源、窒
素源、金属イオン類のほかに、必要に応じて、アミノ
酸、核酸、ビタミン類などの栄養源を含有する培地が用
いられる。例えば、炭素源としては、グルコース、シュ
ークロース、マルトース、澱粉、澱粉糖化液、糖蜜など
が用いられる。窒素源としては、ペプトン、コーン、ス
ティーブ、リカー、大豆粉、酵母、尿素などの有機窒素
源のほかに、硫酸、硝酸、塩酸、炭酸などのアンモニウ
ム塩や、アンモニアガス、アンモニア水などの無機窒素
源が、それぞれ単独もしくは混合して用いられる。その
他の栄養源としては、菌の生育に必要な各種の無機塩
類、アミノ酸類、ビタミン類などが適宜選択の上、それ
ぞれ単独もしくは混合して用いられる。アデニン源とし
ては、アデニン、アデノシン、アデニル酸、核酸はもと
より、それらを含有する微生物菌体やそれらの抽出物な
どが用いられる。さらに、培地には、必要に応じて、シ
リコンオイル、ポリアルキレングリコールエーテルなど
の消泡剤や界面活性剤などを添加することができる。
養には、従来のグアノシン生産菌の培養方法と同様の方
法が用いられる。すなわち、培地としては、炭素源、窒
素源、金属イオン類のほかに、必要に応じて、アミノ
酸、核酸、ビタミン類などの栄養源を含有する培地が用
いられる。例えば、炭素源としては、グルコース、シュ
ークロース、マルトース、澱粉、澱粉糖化液、糖蜜など
が用いられる。窒素源としては、ペプトン、コーン、ス
ティーブ、リカー、大豆粉、酵母、尿素などの有機窒素
源のほかに、硫酸、硝酸、塩酸、炭酸などのアンモニウ
ム塩や、アンモニアガス、アンモニア水などの無機窒素
源が、それぞれ単独もしくは混合して用いられる。その
他の栄養源としては、菌の生育に必要な各種の無機塩
類、アミノ酸類、ビタミン類などが適宜選択の上、それ
ぞれ単独もしくは混合して用いられる。アデニン源とし
ては、アデニン、アデノシン、アデニル酸、核酸はもと
より、それらを含有する微生物菌体やそれらの抽出物な
どが用いられる。さらに、培地には、必要に応じて、シ
リコンオイル、ポリアルキレングリコールエーテルなど
の消泡剤や界面活性剤などを添加することができる。
培養は、通常、振盪あるいは通気攪拌深部培養などの好
気的条件下に行われる。培地のpHは、通常、４ないし９
の範囲が好ましい。培養中にpHの変動が観察される場合
は、これを好ましい範囲に修正するために、硫酸、炭酸
カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニアガス、アン
モニア水などを適宜添加してもよい。培養温度は、通
常、２０℃ないし４５℃の範囲から、使用される微生物
の生育およびグアノシンの蓄積に好適な温度が選択され
る。培養は実質的にグアノシンの蓄積量が最大になるま
で行われるが、通常２４時間ないし１４４時間の培養で
目的を達することができる。
気的条件下に行われる。培地のpHは、通常、４ないし９
の範囲が好ましい。培養中にpHの変動が観察される場合
は、これを好ましい範囲に修正するために、硫酸、炭酸
カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニアガス、アン
モニア水などを適宜添加してもよい。培養温度は、通
常、２０℃ないし４５℃の範囲から、使用される微生物
の生育およびグアノシンの蓄積に好適な温度が選択され
る。培養は実質的にグアノシンの蓄積量が最大になるま
で行われるが、通常２４時間ないし１４４時間の培養で
目的を達することができる。
培養物からグアノシンを分離・採取するには、すでに公
知にされている通常の精製手段、例えば沈殿法、イオン
交換樹脂や活性炭によるクロマトグラフィー法などの分
離精製法が用いられる。
知にされている通常の精製手段、例えば沈殿法、イオン
交換樹脂や活性炭によるクロマトグラフィー法などの分
離精製法が用いられる。
本発明の製造法によると、形質転換される前の菌株を用
いる場合に比較し、グアノシンの生産性を高めることが
できる。
いる場合に比較し、グアノシンの生産性を高めることが
できる。
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１ ｉ）染色体ＤＮＡの調製 グアノシンを生産する能力を有するバチルス・ズブチリ
ス（Bacillus subtilis)NA-6012（ＩＦＯ １４１９
０，ＦＥＲＭ ＢＰ−２９２）をＣ培地（グリコース５
ｇ／，クエン酸ナトリウム０．５ｇ／，ポリペプト
ン５ｇ／，酵母エキス５ｇ／，(NH4)2SO4１ｇ／
，K2HPO4７ｇ／，KH2PO4３ｇ／，MgSO4・7H2O０．
２ｇ／，pH７．０）に接種して、３７℃で一夜培養
し、培養液１の菌体から、フェノールを用いる染色体
ＤＮＡ抽出法（Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963))に
よって、最終８．０mgの染色体ＤＮＡを得た。
ス（Bacillus subtilis)NA-6012（ＩＦＯ １４１９
０，ＦＥＲＭ ＢＰ−２９２）をＣ培地（グリコース５
ｇ／，クエン酸ナトリウム０．５ｇ／，ポリペプト
ン５ｇ／，酵母エキス５ｇ／，(NH4)2SO4１ｇ／
，K2HPO4７ｇ／，KH2PO4３ｇ／，MgSO4・7H2O０．
２ｇ／，pH７．０）に接種して、３７℃で一夜培養
し、培養液１の菌体から、フェノールを用いる染色体
ＤＮＡ抽出法（Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963))に
よって、最終８．０mgの染色体ＤＮＡを得た。
ii)染色体ＤＮＡのｐＢＲ３２２への導入 以後の実験に於ける制限酵素の切断条件は、特に断りの
ない限り、「モレキュラー・クローニング」（書名，T.
Maniatis et al,Molecular Cloning A Laboratory Manu
al,Cold Spring Harbor Laboratory,東大出版会発行，
１９８２年，９８頁〜１０３頁）に記載の方法に従って
行った。
ない限り、「モレキュラー・クローニング」（書名，T.
Maniatis et al,Molecular Cloning A Laboratory Manu
al,Cold Spring Harbor Laboratory,東大出版会発行，
１９８２年，９８頁〜１０３頁）に記載の方法に従って
行った。
上記ｉ）項で得た染色体ＤＮＡ３μｇに制限酵素PstＩ
（ニッポンジーン製）を３７℃，６０分間作用させＤＮ
Ａ鎖を切断した。酵素を失活させた後、酢酸アンモニウ
ムを終濃度が２．５Ｍとなるように加え、更に２倍容の
冷アルコールを加えて、−７０℃に冷却後、ＤＮＡの沈
殿を遠心分離した後、該ＤＮＡ沈殿に３５μｌの減菌水
を加え溶解させた。一方、これとは別に、ＥＫ系のプラ
スミドｐＢＲ３２２の１μｇを制限酵素Pst Ｉで切断
し、上述と同様の操作によってＤＮＡを遠心分離し、３
５μｌの減菌水に溶解した。このようにして得られた染
色体ＤＮＡの切断片とｐＢＲ３２２ＤＮＡの切断片を混
合し、６６ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．５），６．６
ｍＭ ＭｇＣｌ２，10mMジチオスライトール，６６０μ
Ｍ ATPを含む緩衝液中で、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡ
リガーゼ（ニッポンジーン製）を用いて連結反応を行っ
た。
（ニッポンジーン製）を３７℃，６０分間作用させＤＮ
Ａ鎖を切断した。酵素を失活させた後、酢酸アンモニウ
ムを終濃度が２．５Ｍとなるように加え、更に２倍容の
冷アルコールを加えて、−７０℃に冷却後、ＤＮＡの沈
殿を遠心分離した後、該ＤＮＡ沈殿に３５μｌの減菌水
を加え溶解させた。一方、これとは別に、ＥＫ系のプラ
スミドｐＢＲ３２２の１μｇを制限酵素Pst Ｉで切断
し、上述と同様の操作によってＤＮＡを遠心分離し、３
５μｌの減菌水に溶解した。このようにして得られた染
色体ＤＮＡの切断片とｐＢＲ３２２ＤＮＡの切断片を混
合し、６６ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．５），６．６
ｍＭ ＭｇＣｌ２，10mMジチオスライトール，６６０μ
Ｍ ATPを含む緩衝液中で、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡ
リガーゼ（ニッポンジーン製）を用いて連結反応を行っ
た。
iii)組み換えプラスミドＤＮＡによるエシェリヒア・コ
リ（Escherichia coli）のキサンチン要求性株の形質転
換 栄養要求性株の取得の際に用いられる通常の方法（レプ
リカ・プレート法）によって、エシェリヒア・コリＣ６
００株より、キサンチン要求性株エシェリヒア・コリＸ
−８９５（ＩＦＯ 14308,ＦＥＲＭ ＢＰ−６１４）を
取得した。
リ（Escherichia coli）のキサンチン要求性株の形質転
換 栄養要求性株の取得の際に用いられる通常の方法（レプ
リカ・プレート法）によって、エシェリヒア・コリＣ６
００株より、キサンチン要求性株エシェリヒア・コリＸ
−８９５（ＩＦＯ 14308,ＦＥＲＭ ＢＰ−６１４）を
取得した。
組み換えプラスミドによる該菌株の形質転換はコンピテ
ントセルを用いる方法（S.N.Cohenet al,Proc.Natl.Aca
d.Sci.,U.S.A,69,2110(1972))によった。
ントセルを用いる方法（S.N.Cohenet al,Proc.Natl.Aca
d.Sci.,U.S.A,69,2110(1972))によった。
すなわち、エシェリヒア・コリＸ−８９５株をＬ培地
（バクトトリプトン１０ｇ／，酵母エキス５ｇ／，
塩化ナトリウム５ｇ／）に培養し、集菌洗浄後、氷冷
した塩化カルシウム溶液を加えコンピテントなセルを調
製した。このコンピテント・セルの懸濁液に上述（ii）
項で作製したＤＮＡ溶液を加えてプラスミドＤＮＡを取
り込ませ、形質転換を行った。
（バクトトリプトン１０ｇ／，酵母エキス５ｇ／，
塩化ナトリウム５ｇ／）に培養し、集菌洗浄後、氷冷
した塩化カルシウム溶液を加えコンピテントなセルを調
製した。このコンピテント・セルの懸濁液に上述（ii）
項で作製したＤＮＡ溶液を加えてプラスミドＤＮＡを取
り込ませ、形質転換を行った。
次に、この形質転換株を含む懸濁液の０．１mlをテトラ
サイクリン１５μg/mlを含むＭ−９ＣＭ寒天培地（Na2H
PO4６ｇ／，KH2PO4３ｇ／，塩化ナトリウム０．５
ｇ／，塩化アンモニウム１ｇ／，硫酸マグネシウム
１ｍＭ，塩化カルシウム１ｍＭ，グルコース２ｇ／，
カザミノ酸２ｇ／，寒天１５ｇ／，pH７．２）の平
板上に塗洙して３７℃で１日培養した。寒天平板培地上
に生じたコロニーから、形質転換株エシェリヒア・コリ
ＴＥＸ−１１７株（テトラサイクリン耐性を獲得し、か
つ、キサンチン要求性を消失している。）を取得した。
サイクリン１５μg/mlを含むＭ−９ＣＭ寒天培地（Na2H
PO4６ｇ／，KH2PO4３ｇ／，塩化ナトリウム０．５
ｇ／，塩化アンモニウム１ｇ／，硫酸マグネシウム
１ｍＭ，塩化カルシウム１ｍＭ，グルコース２ｇ／，
カザミノ酸２ｇ／，寒天１５ｇ／，pH７．２）の平
板上に塗洙して３７℃で１日培養した。寒天平板培地上
に生じたコロニーから、形質転換株エシェリヒア・コリ
ＴＥＸ−１１７株（テトラサイクリン耐性を獲得し、か
つ、キサンチン要求性を消失している。）を取得した。
iv)形質転換株からのプラスミドの抽出 形質転換株ＴＥＸ−１１７からの組み換えプラスミドの
抽出は、前記の「モレキュラー・クローニング」第８６
〜９３頁に記載の方法に従った。すなわち、エシェリヒ
ア・コリＴＥＸ−１１７を前記のＬ培地に接種しプラス
ミドを増幅させるためにクロラムフェニコールを添加し
て、一夜培養後集菌洗浄した。洗浄菌体にリゾチームを
加え、更に１％ラウリル硫酸ナトリウムを含む０．２Ｎ
水酸化ナトリウム溶液を加えて溶菌し、５Ｍ酢酸カリウ
ムを加えた後遠心分離によりプラスミドを含む上澄液を
得た。上澄液に０．６容のイソプロパノールを加えプラ
スミドＤＮＡを沈澱させ、エタノールで洗浄した後ＴＥ
緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液，１ｍＭ ＥＤＴＡ
，pH８．０）に溶解した。これに比重が１．６０とな
るように塩化セシウムを加え、終濃度が６００μg/mlと
なるようにエチジウムブロマイドを加えた。ベックマン
超遠心機（ロータV65Ti）を用いて、２０℃で５０００
０rpm,１２時間遠心分離し、紫外線によって検出される
プラスミドのバンドを取り、ｎ−ブタノールを用いてエ
チジウムブロマイドを抽出除去した後、ＴＥ緩衝液に透
析して３００mlの培養液から約２００μｇ相当の組み換
えプラスミドを得、これをｐＥＸ１１７と命名した。
抽出は、前記の「モレキュラー・クローニング」第８６
〜９３頁に記載の方法に従った。すなわち、エシェリヒ
ア・コリＴＥＸ−１１７を前記のＬ培地に接種しプラス
ミドを増幅させるためにクロラムフェニコールを添加し
て、一夜培養後集菌洗浄した。洗浄菌体にリゾチームを
加え、更に１％ラウリル硫酸ナトリウムを含む０．２Ｎ
水酸化ナトリウム溶液を加えて溶菌し、５Ｍ酢酸カリウ
ムを加えた後遠心分離によりプラスミドを含む上澄液を
得た。上澄液に０．６容のイソプロパノールを加えプラ
スミドＤＮＡを沈澱させ、エタノールで洗浄した後ＴＥ
緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液，１ｍＭ ＥＤＴＡ
，pH８．０）に溶解した。これに比重が１．６０とな
るように塩化セシウムを加え、終濃度が６００μg/mlと
なるようにエチジウムブロマイドを加えた。ベックマン
超遠心機（ロータV65Ti）を用いて、２０℃で５０００
０rpm,１２時間遠心分離し、紫外線によって検出される
プラスミドのバンドを取り、ｎ−ブタノールを用いてエ
チジウムブロマイドを抽出除去した後、ＴＥ緩衝液に透
析して３００mlの培養液から約２００μｇ相当の組み換
えプラスミドを得、これをｐＥＸ１１７と命名した。
ｐＥＸ１１７を種々の制限酵素で切断し、λ−ファージ
のHind III分解物（ニッポンジーン製）の分子量を基準
にしてアガロースゲル電気泳動のパターンから、第１図
に示すような制限酵素切断地図を得た。ｐＥＸ１１７
は、ｐＢＲ３２２のＰｓｔ Ｉサイトに約６．４キロベ
ースのＤＮＡ断片が挿入された組み換えプラスミドであ
る。
のHind III分解物（ニッポンジーン製）の分子量を基準
にしてアガロースゲル電気泳動のパターンから、第１図
に示すような制限酵素切断地図を得た。ｐＥＸ１１７
は、ｐＢＲ３２２のＰｓｔ Ｉサイトに約６．４キロベ
ースのＤＮＡ断片が挿入された組み換えプラスミドであ
る。
実施例２ ｉ）３μｇのｐＥＸ１１７を制限酵素Hind IIIで部分分
解し、一方ｐＢＲ３２２をHind IIIで完全分解して、実
施例１−ii)項に記載した方法に従って両者を混合し、
Ｔ４由来のＤＮＡリガーゼで連結反応を行った。次に、
このＤＮＡ溶液を用いて実施例１−iii)項に記載した方
法でエシェリヒア・コリＸ−８９５株を形質転換して、
テトラサイクリン耐性を獲得し、かつキサンチン要求性
の消失している形質転換株エシェリヒア・コリＴＥＸ−
１４７株を得た。該形質転換株から、実施例１−iv)項
に示した方法でプラスミドを抽出し、約２２０μｇの組
換えプラスミドを得、これをｐＥＸ１４７と命名した。
ｐＥＸ１４７の制限酵素切断地図を第２図に示した。ｐ
ＥＸ１４７はｐＢＲ３２２のHind IIIサイトに２．９キ
ロベースのＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドで
ある。
解し、一方ｐＢＲ３２２をHind IIIで完全分解して、実
施例１−ii)項に記載した方法に従って両者を混合し、
Ｔ４由来のＤＮＡリガーゼで連結反応を行った。次に、
このＤＮＡ溶液を用いて実施例１−iii)項に記載した方
法でエシェリヒア・コリＸ−８９５株を形質転換して、
テトラサイクリン耐性を獲得し、かつキサンチン要求性
の消失している形質転換株エシェリヒア・コリＴＥＸ−
１４７株を得た。該形質転換株から、実施例１−iv)項
に示した方法でプラスミドを抽出し、約２２０μｇの組
換えプラスミドを得、これをｐＥＸ１４７と命名した。
ｐＥＸ１４７の制限酵素切断地図を第２図に示した。ｐ
ＥＸ１４７はｐＢＲ３２２のHind IIIサイトに２．９キ
ロベースのＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミドで
ある。
ii)約２００μｇの組換えプラスミドｐＥＸ１４７を制
限酵素Hind IIIで部分分解し、ロウ・メルティング・ポ
イント・アガロース（Bethesda Research Laboratories
社製）を用いてゲル電気泳動を行い、２．９キロベース
のＤＮＡの電気泳動距離に相当する部分のアガロース・
ゲルを切り取った。次いで前記の「モレキュラー・クロ
ーニング」１７０頁に記載された方法に従って、該アガ
ロース・ゲル切片からＤＮＡの抽出を行い、最後約２μ
ｇのＤＮＡを得た。制限酵素の切断パターンから、該Ｄ
ＮＡはｐＢＲ３２２のHind IIIサイトに挿入された２．
９キロベースのＤＮＡであることを確認した。
限酵素Hind IIIで部分分解し、ロウ・メルティング・ポ
イント・アガロース（Bethesda Research Laboratories
社製）を用いてゲル電気泳動を行い、２．９キロベース
のＤＮＡの電気泳動距離に相当する部分のアガロース・
ゲルを切り取った。次いで前記の「モレキュラー・クロ
ーニング」１７０頁に記載された方法に従って、該アガ
ロース・ゲル切片からＤＮＡの抽出を行い、最後約２μ
ｇのＤＮＡを得た。制限酵素の切断パターンから、該Ｄ
ＮＡはｐＢＲ３２２のHind IIIサイトに挿入された２．
９キロベースのＤＮＡであることを確認した。
実施例３ ｉ）５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子のＢＳ系ベクタ
ー（ｐＣ１９４）への挿入 ３μｇのｐＥＸ１１７を制限酵素Hind IIIで部分分解
し、一方、これとは別に枯草菌を宿主とするプラスミド
ｐＣ１９４の１μｇをHind IIIで完全分解して、実施例
１−ii)に記載した方法に従って両者を混合してＴ４由
来のＤＮＡリガーゼを用いて連結反応を行った。
ー（ｐＣ１９４）への挿入 ３μｇのｐＥＸ１１７を制限酵素Hind IIIで部分分解
し、一方、これとは別に枯草菌を宿主とするプラスミド
ｐＣ１９４の１μｇをHind IIIで完全分解して、実施例
１−ii)に記載した方法に従って両者を混合してＴ４由
来のＤＮＡリガーゼを用いて連結反応を行った。
ii)組み換えプラスミドＤＮＡによるバチルス・ズブチ
リス・キサンチン要求株の形質転換 通常の栄養要求性株の取得法を用いて、バチルス・ズブ
チリスＭＩ−１１４株（遺伝的特性はtrpC2,leu8,r-,
m-）からキサンチン要求性株バチルス・ズブチリスＲＮ
−６３株(IFO１４３０７，ＦＥＲＭ ＢＰ−６１３）を
取得した。
リス・キサンチン要求株の形質転換 通常の栄養要求性株の取得法を用いて、バチルス・ズブ
チリスＭＩ−１１４株（遺伝的特性はtrpC2,leu8,r-,
m-）からキサンチン要求性株バチルス・ズブチリスＲＮ
−６３株(IFO１４３０７，ＦＥＲＭ ＢＰ−６１３）を
取得した。
次に、上記ｉ）項で調製したＤＮＡ溶液を用いてバチル
ス・ズブチリスＲＮ−６３を形質転換し、クロラムフェ
ニコールに耐性な形質転換株を得た。形質転換は該要求
株のプロトプラストにポリエチレングリコールを作用さ
せてＤＮＡを取り込ませる方法（Ｓ．Chang and S.N.Co
hen，Mol.Gen.Genet.,168,111(1979))によった。
ス・ズブチリスＲＮ−６３を形質転換し、クロラムフェ
ニコールに耐性な形質転換株を得た。形質転換は該要求
株のプロトプラストにポリエチレングリコールを作用さ
せてＤＮＡを取り込ませる方法（Ｓ．Chang and S.N.Co
hen，Mol.Gen.Genet.,168,111(1979))によった。
上述の形質転換操作の結果、１０μg/mlのクロラムフェ
ニコールを含む再生用培地に生育した形質転換株を、１
０μg/mlのクロラムフェニコールを含むＭ−９CMTL培地
（Ｍ−９ ＣＭ培地に各々５０μg/mlトリプトファンお
よびロイシンを補足した培地）の寒天平板にレプリカ
し、３７℃で１日培養後に生じたコロニーから、形質転
換株バチルス・ズブチリスＴＸ−１２１を得た。バチル
ス・ズブチリスＴＸ−１２１株は、クロラムフェニコー
ルに耐性でかつキサンチン要求性が相補された形質転換
株である。
ニコールを含む再生用培地に生育した形質転換株を、１
０μg/mlのクロラムフェニコールを含むＭ−９CMTL培地
（Ｍ−９ ＣＭ培地に各々５０μg/mlトリプトファンお
よびロイシンを補足した培地）の寒天平板にレプリカ
し、３７℃で１日培養後に生じたコロニーから、形質転
換株バチルス・ズブチリスＴＸ−１２１を得た。バチル
ス・ズブチリスＴＸ−１２１株は、クロラムフェニコー
ルに耐性でかつキサンチン要求性が相補された形質転換
株である。
iii)形質転換株からのプラスミドの抽出 バチルス・ズブチリスＴＸ−１２１株を前記のＬ培地３
００mlを用いて培養し、得られた培養物から、実施例１
−iv)項に記載した方法により、約１００μｇ相当のプ
ラスミドを得た。このプラスミドをｐＢＸ１２１と命名
した。組み換えプラスミドｐＢＸ１２１の制限酵素切断
地図は第３図に示した通りであって、挿入断片の大きさ
は約２．９キロベースである。
００mlを用いて培養し、得られた培養物から、実施例１
−iv)項に記載した方法により、約１００μｇ相当のプ
ラスミドを得た。このプラスミドをｐＢＸ１２１と命名
した。組み換えプラスミドｐＢＸ１２１の制限酵素切断
地図は第３図に示した通りであって、挿入断片の大きさ
は約２．９キロベースである。
実施例４ バチルス・ズブチリスの形質転換株を用いてのグアノシ
ンの生産 バチルス・ズブチリスＮＡ−６０１２（ＩＦＯ１４１９
０，ＦＥＲＭ ＢＦ−２９２）を実施例３−ii)項に記
載した方法に従って、ｐＢＸ１２１を用いて形質転換
し、形質転換株を含む懸濁液を１０μg/mlのクロラムフ
ェニコールを含む再生用培地に塗洙して３７℃で５日間
培養し、生じたコロニーからクロラムフェニコールに耐
性な形質転換株バチルス・ズブチリスＴＦ２１株（ＩＦ
Ｏ１４３１３，ＦＥＲＭ ＢＰ−６１６）を取得した。
ンの生産 バチルス・ズブチリスＮＡ−６０１２（ＩＦＯ１４１９
０，ＦＥＲＭ ＢＦ−２９２）を実施例３−ii)項に記
載した方法に従って、ｐＢＸ１２１を用いて形質転換
し、形質転換株を含む懸濁液を１０μg/mlのクロラムフ
ェニコールを含む再生用培地に塗洙して３７℃で５日間
培養し、生じたコロニーからクロラムフェニコールに耐
性な形質転換株バチルス・ズブチリスＴＦ２１株（ＩＦ
Ｏ１４３１３，ＦＥＲＭ ＢＰ−６１６）を取得した。
次に第２表に示す種培地２０mlを含む２００ml容三角フ
ラスコに、バチルス・ズブチリスＴＦ−２１株の一白金
耳を接種し、３７℃で１８時間振盪しその１mlを第２表
の主発酵培地２０mlを含む２００ml容ヒダ付フラスコに
接種し、回転式振盪機上で３７℃４日間培養したとこ
ろ、培養液中にグアノシンが１８．０mg/mlの割合で蓄
積されていた。
ラスコに、バチルス・ズブチリスＴＦ−２１株の一白金
耳を接種し、３７℃で１８時間振盪しその１mlを第２表
の主発酵培地２０mlを含む２００ml容ヒダ付フラスコに
接種し、回転式振盪機上で３７℃４日間培養したとこ
ろ、培養液中にグアノシンが１８．０mg/mlの割合で蓄
積されていた。
約５０個のフラスコを用いて同様の培養を行い同質の培
養液１を得た。これを水酸化ナトリウムでpH１１にし
てグアノシン結晶を溶解させた後、遠心分離によって菌
体を除去し、得られた上清液を中和，冷却してグアノシ
ンを析出せしめ、粗結晶を得た。次いで、これを７００
mlの熱水に溶解し、活性炭を用いて脱色し、冷所にてグ
アノシンを析出せしめ、グアノシンの精結晶１４．５ｇ
を得た。該精結晶のグアノシンの純度は９３％であっ
た。なお、組み換えプラスミドｐＢＸ１２１を保持して
いないバチルス・ズブチリスＮＡ−６０１２を上記と同
一の条件で培養したところ、１４mg/mlの割合でグアノ
シンが蓄積されていた。
養液１を得た。これを水酸化ナトリウムでpH１１にし
てグアノシン結晶を溶解させた後、遠心分離によって菌
体を除去し、得られた上清液を中和，冷却してグアノシ
ンを析出せしめ、粗結晶を得た。次いで、これを７００
mlの熱水に溶解し、活性炭を用いて脱色し、冷所にてグ
アノシンを析出せしめ、グアノシンの精結晶１４．５ｇ
を得た。該精結晶のグアノシンの純度は９３％であっ
た。なお、組み換えプラスミドｐＢＸ１２１を保持して
いないバチルス・ズブチリスＮＡ−６０１２を上記と同
一の条件で培養したところ、１４mg/mlの割合でグアノ
シンが蓄積されていた。
実施例５ バチルス・ズブチリスＮＡ−６０１１（ＩＦＯ１４１８
９，ＦＥＲＭ ＢＰ−２９１）を実施例３−ii)項に記
載した方法に従って、ｐＢＸ１２１を用いて形質転換
し、クロラムフェニコール耐性を獲得した形質転換株バ
チルス・ズブチリスＴＦ−１１株（ＩＦＯ１４３１２，
ＦＥＲＭ ＢＰ−６１５）を取得した。これを実施例４
と同様の条件で培養したところ、１６．０mg/mlの割合
でグアノシンが蓄積されていた。次いで、実施例４に記
載した方法に従ってグアノシンの精製を行い、１の培
養液から、純度９１％のグアノシンの精結晶を１３．１
ｇ得た。なお、組み換えプラスミドｐＢＸ１２１を保持
していないバチルス・ズブチリスＮＡ−６０１１を上記
と同一の条件で培養したところ、グアノシンの蓄積量は
５．０mg/mlであった。
９，ＦＥＲＭ ＢＰ−２９１）を実施例３−ii)項に記
載した方法に従って、ｐＢＸ１２１を用いて形質転換
し、クロラムフェニコール耐性を獲得した形質転換株バ
チルス・ズブチリスＴＦ−１１株（ＩＦＯ１４３１２，
ＦＥＲＭ ＢＰ−６１５）を取得した。これを実施例４
と同様の条件で培養したところ、１６．０mg/mlの割合
でグアノシンが蓄積されていた。次いで、実施例４に記
載した方法に従ってグアノシンの精製を行い、１の培
養液から、純度９１％のグアノシンの精結晶を１３．１
ｇ得た。なお、組み換えプラスミドｐＢＸ１２１を保持
していないバチルス・ズブチリスＮＡ−６０１１を上記
と同一の条件で培養したところ、グアノシンの蓄積量は
５．０mg/mlであった。
実施例６ 形質転換株の５′−イノシン酸脱水素酵素活性 バチルス・ズブチリスＴＸ−１２１株をＭＥＡ培地（ポ
リペプトン１０ｇ／，酵母エキス５ｇ／，塩化ナト
リウム５ｇ／，グルタミン酸ソーダ５ｇ／，硫酸マ
グネシウム０．５ｇ／，塩化カルシウム０．１ｇ／
，グルコース５０ｇ／，pH７．２）に接種して、３
７℃で一夜培養後、集菌，洗浄し、1/10容量の５ｍＭグ
ルタチオン（還元型）を含む０．０５Ｍ燐酸緩衝液（pH
７．２）に懸濁し、菌体を超音波破砕した。残渣を遠心
分離によって除去した後、上述の燐酸緩衝液に対して一
夜透析して粗酵素液を調製した。該粗酵素液を用いて、
B.Magasanikの方法（Methods in Enzymology VI,P.１０
６〜１１０，Academic Press,New York(1963))に従っ
て、５′−イノシン酸脱水素酵素活性を測定したとこ
ろ、０．０２ユニット／mg蛋白質の酵素活性が得られ
た。同様にして、組み換えプラスミドを保持していない
宿主菌バチルス・ズブチリスＲＮ−６３の５′−イノシ
ン酸脱水素酵素活性を測定したところ、該菌は全く酵素
活性を示さなかった。
リペプトン１０ｇ／，酵母エキス５ｇ／，塩化ナト
リウム５ｇ／，グルタミン酸ソーダ５ｇ／，硫酸マ
グネシウム０．５ｇ／，塩化カルシウム０．１ｇ／
，グルコース５０ｇ／，pH７．２）に接種して、３
７℃で一夜培養後、集菌，洗浄し、1/10容量の５ｍＭグ
ルタチオン（還元型）を含む０．０５Ｍ燐酸緩衝液（pH
７．２）に懸濁し、菌体を超音波破砕した。残渣を遠心
分離によって除去した後、上述の燐酸緩衝液に対して一
夜透析して粗酵素液を調製した。該粗酵素液を用いて、
B.Magasanikの方法（Methods in Enzymology VI,P.１０
６〜１１０，Academic Press,New York(1963))に従っ
て、５′−イノシン酸脱水素酵素活性を測定したとこ
ろ、０．０２ユニット／mg蛋白質の酵素活性が得られ
た。同様にして、組み換えプラスミドを保持していない
宿主菌バチルス・ズブチリスＲＮ−６３の５′−イノシ
ン酸脱水素酵素活性を測定したところ、該菌は全く酵素
活性を示さなかった。
第１図は実施例で得られた組み換えプラスミドｐＥＸ１
１７、第２図は同じく組み換えプラスミドｐＥＸ１４
７、第３図は同じくプラスミドｐＢＸの制限酵素切断地
図を示す。図中、括弧内の数字は塩基対数（キロベース
ペア）を示し、第１図の※Hind III（３．９），※Hind
III（５．１５），また第２図および第３図の※Hind I
II（１．４），※Hind III（２．６５）は各々どちらか
一方にHind IIIの切断点が存在しているが、決定されて
いないことを示す。
１７、第２図は同じく組み換えプラスミドｐＥＸ１４
７、第３図は同じくプラスミドｐＢＸの制限酵素切断地
図を示す。図中、括弧内の数字は塩基対数（キロベース
ペア）を示し、第１図の※Hind III（３．９），※Hind
III（５．１５），また第２図および第３図の※Hind I
II（１．４），※Hind III（２．６５）は各々どちらか
一方にHind IIIの切断点が存在しているが、決定されて
いないことを示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (5)
- 【請求項１】バチルス属菌由来の５′−イノシン酸脱水
素酵素遺伝子を有し、次の制限酵素切断地図， Hind III (0) Bgl II (0.5) Sac II (0.7) Hind III (0.75) Pvu II (1.0) Cla I (1.1) Hind III (1.15) ＊Hind III (1.4) ＊Hind III (2.65) Hind III (2.9) ［ただし、＊Hind III (1.4)、＊Hind III (2.65)はど
ちらか一方にHind IIIの切断点が存在しているが、決定
されていないことを示す。］で表わされるＤＮＡ。 - 【請求項２】グアノシンまたは（および）キサントシン
生産能を有するバチルス属菌の染色体ＤＮＡから得られ
た特許請求の範囲第（１）項記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】グアノシンまたは（および）キサントシン
生産能を有するバチルス属菌の染色体ＤＮＡから得ら
れ、５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子を有し、次の制
限酵素切断地図， Hind III (0) Bgl II (0.5) Sac II (0.7) Hind III (0.75) Pvu II (1.0) Cla I (1.1) Hind III (1.15) ＊Hind III (1.4) ＊Hind III (2.65) Hind III (2.9) ［ただし、＊Hind III (1.4)、＊Hind III (2.65)はど
ちらか一方にHind IIIの切断点が存在しているが、決定
されていないことを示す。］で表わされるＤＮＡが組み
込まれたベクター。 - 【請求項４】グアノシンまたは（および）キサントシン
生産能を有するバチルス属菌の染色体ＤＮＡから得ら
れ、５′−イノシン酸脱水素酵素遺伝子を有し、次の制
限酵素切断地図， Hind III (0) Bgl II (0.5) Sac II (0.7) Hind III (0.75) Pvu II (1.0) Cla I (1.1) ＊Hind III (1.15) ＊Hind III (1.4) Hind III (2.65) Hind III (2.9) ［ただし、＊Hind III (1.4)、＊Hind III (2.65)はど
ちらか一方にHind IIIの切断点が存在している、決定さ
れていないことを示す。］で表わされるＤＮＡが組み込
まれたベクターで形質転換されたバチルス属菌。 - 【請求項５】特許請求の範囲第（３）項記載のベクター
で形質転換されたグアノシン生産能を有する特許請求の
範囲第（４）項記載のバチルス属菌。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59013968A JPH0630583B2 (ja) | 1984-01-27 | 1984-01-27 | Ｄνａおよびその用途 |
| ES537637A ES537637A0 (es) | 1984-01-27 | 1984-11-14 | Un metodo de producir guanosina |
| US06/671,482 US4749650A (en) | 1984-01-27 | 1984-11-14 | Bacillus containing a 5'inosinate dehydrocenase gene |
| EP84308264A EP0151341B1 (en) | 1984-01-27 | 1984-11-28 | Dna and its use |
| DE8484308264T DE3476422D1 (en) | 1984-01-27 | 1984-11-28 | Dna and its use |
| AT84308264T ATE40405T1 (de) | 1984-01-27 | 1984-11-28 | Dns und ihre verwendung. |
| KR1019840007786A KR920001378B1 (ko) | 1984-01-27 | 1984-12-08 | Dna 및 그의 이용 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59013968A JPH0630583B2 (ja) | 1984-01-27 | 1984-01-27 | Ｄνａおよびその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60156388A JPS60156388A (ja) | 1985-08-16 |
| JPH0630583B2 true JPH0630583B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=11848013
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59013968A Expired - Lifetime JPH0630583B2 (ja) | 1984-01-27 | 1984-01-27 | Ｄνａおよびその用途 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0151341B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0630583B2 (ja) |
| KR (1) | KR920001378B1 (ja) |
| AT (1) | ATE40405T1 (ja) |
| DE (1) | DE3476422D1 (ja) |
| ES (1) | ES537637A0 (ja) |
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| JPS6427477A (en) * | 1987-04-01 | 1989-01-30 | Takeda Chemical Industries Ltd | Dna and use thereof |
| JP4760711B2 (ja) | 2004-03-31 | 2011-08-31 | 味の素株式会社 | バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を使用した発酵によるプリンヌクレオシド及びヌクレオチドの製造方法 |
| US7326546B2 (en) | 2005-03-10 | 2008-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
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| KR101250826B1 (ko) | 2006-04-24 | 2013-04-11 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 퓨린계 물질 생산균 및 퓨린계 물질의 제조법 |
| RU2365622C2 (ru) | 2006-12-22 | 2009-08-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПРОДУКЦИИ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОЗИДОВ И НУКЛЕОТИДОВ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К РОДУ Escherichia ИЛИ Bacillus |
Family Cites Families (2)
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|---|---|---|---|---|
| JPS57181099A (en) * | 1981-04-29 | 1982-11-08 | Biogen Nv | Bacillus cloning vector, recombinant dna molecule, bacillus host transformed thereby and manufacture of polypeptide expressing dna order and being coded thereby |
| JPS58175493A (ja) * | 1982-04-08 | 1983-10-14 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるグアノシンの製造法 |
-
1984
- 1984-01-27 JP JP59013968A patent/JPH0630583B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-14 US US06/671,482 patent/US4749650A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-14 ES ES537637A patent/ES537637A0/es active Granted
- 1984-11-28 DE DE8484308264T patent/DE3476422D1/de not_active Expired
- 1984-11-28 EP EP84308264A patent/EP0151341B1/en not_active Expired
- 1984-11-28 AT AT84308264T patent/ATE40405T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-12-08 KR KR1019840007786A patent/KR920001378B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES8602134A1 (es) | 1985-11-16 |
| EP0151341A1 (en) | 1985-08-14 |
| ATE40405T1 (de) | 1989-02-15 |
| US4749650A (en) | 1988-06-07 |
| ES537637A0 (es) | 1985-11-16 |
| DE3476422D1 (en) | 1989-03-02 |
| EP0151341B1 (en) | 1989-01-25 |
| JPS60156388A (ja) | 1985-08-16 |
| KR850005496A (ko) | 1985-08-26 |
| KR920001378B1 (ko) | 1992-02-11 |
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