KR920001378B1 - Dna 및 그의 이용 - Google Patents

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Abstract

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Description

DNA 및 그의 이용
제1도, 제2도 및 제3도는 각각 실시예에서 수득된 재조합 플라스미드 pEX117, pEX147 및 pBX121의 제한 효소 절단지도를 나타낸다. 괄호안의 수치는 염기상의 수(킬로 염기쌍)이다.
본 발명은 5′-이노시네이트 탈수소효소 유전자를 갖는 DNA, 상기 DNA가 삽입된 벡타, 상기 벡타로 형질 전환된 바실루스 균주 및 이 형질 전환체를 배양하는 구아노신의 제조방법에 관한 것이다.
구아노신은 조미화학물질인 5′-구아닐산의 합성에 출발물질로써 중요한 물질이며, 이를 저가로 대량 생산하는 것은 공업적 측면에서 매우 중요하다. 지금까지 뉴클레오티드 포스포릴라제 결핍, GMP 리덕타제 결핍 및 아데닌-아데노신 저항과 같은 특성을 갖는 아데딘 요구 변이주가 발효 방법에 의한 구아노신의 제조에 사용되었다.
구아노신의 생산에 박테리아 균주를 성장시키는 합리적인 방법을 발견하기 위한 광범위한 연구의 결과, 본 발명자들은 바실루스속의 이노신- 및/또는 구아노신-생산균주를 구아노신- 및/또는 크산토신-생산 미생물로부터 유도된 5′-이노시네이트 탈수소효소 유전자 부분이 삽입된 벡타 DNA에 의해 형질 전환시키면 구아노신의 축적이 현저히 증가한다는 것을 발견하였다. 이 발견 및 계속적인 연구의 결과, 본 발명자들은 본 발명을 완성하게 되었다.
그러므로, 본 발명은 (1) 5′-이노시네이트 탈수소효소 유전자 및 그로부터 떨어진 Hind Ⅲ 절단부위 2.9킬로 염기쌍을 갖는 DNA ; (2) 바실루스속의 구아노신 및/또는 크산토산 생산 균주의 염색체 DNA로부터 수득된 상기 (1)에서 언급된 DNA ; (3) 상기 (2)에서 언급한 DNA가 삽입된 벡타 ; (4) 상기 (3)에서 언급한 벡타로 형질 전환된 바실루스 균주 ; (5) 상기 (3)에서 언급한 벡타로 형질 전환된 구아노신을 생산할 수 있는 상기 (4)에서 언급한 바실루스 균주 ; 및 (6) 구아노신- 및/또는 크산토신 생산 바실루스 균주의 염색체 DNA로부터 수득된 5′-이노시네이트 탈수소효소 유전자 부분이 삽입된 벡타로 형질 전환된 구아노신 생산 바실루스 균주를 배지에서 배양하고, 배양액에 생산 및 축적된 구아노신을 회수함을 특징으로 하는 구아노신의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 DNA는 5′-이노시네이트 탈수소효소 유전자를 갖는 미생물로부터 수득된다. 이 공여체 미생물로서, 일반적으로 구아노신- 및/또는 크산토신 생산미생물이 사용된다. 상기 물질을 생산할 수 없는 미생물일지라도, 상기 미생물의 5′-이노시네이트 탈수소효소가 퓨린물질에 의한 피드백조절로부터 일부 또는 전체가 격리되어 있다면 본 발명을 실시하는데 DNA 공여체로 사용될 수 있다. 그러므로, 구아노신- 및/또는 크산토신 생산 바실루스 균주는 공여체 미생물의 예로 언급될 수 있으며, 그의 염색체 DNA는 분리원으로 작용할 수 있다.
예를들면, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 푸밀리스(Bacillus pumilis) 또는 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주가 있다. 더 상세하게 이들 바실루스 균주로는 바실루스 서브틸리스 NA-6011(IFO 14189, FERM BR-291, KAIST 830719-10410), 바실루스 서브틸리스 NA-6012(IFO 14190, FERM BP -292, KAIST 830719-10510), 바실루스 서브틸리스 NA-7821(IFO 14368, FERM BP-618, KAIST 841109-14111), 바실루스 서브틸리스 ATCC 19221, 바실루스 푸밀루스 NA-1102(IFO 14185, FERM BP-289, KAIST 830719-10210), 바실루스 푸밀루스 NA-1103(IFO 14186, FERM BP-290, KAIST 83079-10310)가 있다.
염색체 DNA는 공지의 방법, 예를들면 염색체 DNA를 페놀로 추출함으로써 공여체 미생물로부터 제조된다.
공여체로부터 수득된 염색체 DNA를 제한 효소로 절단하여 5′-이노시네이트 탈수소효소 유전자 및 그로부터 떨어진 Hind Ⅲ 절달부위 2.9킬로 염기쌍을 갖는 DNA 단편을 제조한다. 이 DNA 단편의 제조에 있어, 각종 문헌(예. 유전공학 연구를 위한 다까라시약, 다까라 슈조사 발행, 일본)에 기재된 제한 효소중에서 적당한 제한 효소가 선택될 수 있다. 이들 제한 효소의 특정예로는 Pst I, Pvu I 또는 Hind Ⅲ 등이 있다.
이렇게 수득된 5′-이노시네이트 탈수소효소 유전자 부분-함유 염색체 DNA 단편을 벡타 DNA에 삽입시킨다. 벡타 DNA로는 pUB 110[J.Bacterilo., 134, 318(1978)], pT127, pC194, pC221[Proc. Natl. Acad.Sci, U.S.A., 74, 1680(1977)] 및 pLS28[J.Bacteriol., 131, 699(1977)]과 같은 공지의 것, 및 바실루스 균주에 벡타로 사용될 수 있는 것이라면 새로 분리 또는 합성된 것이 사용될 수 있다. 이 벡타 DNA를 상술한 염색체 DNA 단편의 제조에 사용된 제한 효소로 절단한다.
이렇게 수득된 5′-이노시네이트 탈수소효소 유전자 부분 함유 염색체 DNA 단편을 공지의 DNA 리가아제 방법[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 57, 1426(1967)], 말단전이효소 방법[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 69, 2904(1972)] 또는 T4 리가아제를 사용한 플러쉬 말단 결찰 방법[유끼고세이가가꾸, 39, 110(1972)]에 의해 절단된 벡타 DNA와 함께 결찰시킨다.
상기 방법에 의해 5′-이노시네이트 탈수소효소 유전자 부분이 삽입된 벡타 DNA를 바실루스속에 속하는 박테리아 균주의 형질 전환에 사용한다. 수용체 미생물로는 5′-이노시네이트 탈수소효소 결필 크산틴 요구 변이주를 사용하는 것이 필요한 형질 전환체의 선택에 유리하다.
바실루스 서브틸리스 RN-63(IFO 14307, FERM-P 7410, KAIST 841109-13811)은 수용체 미생물의 예이다.
재조합 DNA를 공지의 형질 전환 방법[Mol.Gen.Genet., 168, 111(1973)]에 의해 수용체 미생물에 도입한다.
수용체가 크산틴 요구 변이주일때, 예를들어 5′-이노시네이트 탈수소효소 유전자 부분이 삽입된 벡타 DNA를 운반하는 필요한 형질 전환체는 크산틴이 없는 배지에서 성장할 수 있는 균주를 분리함으로써 선택될 수 있다.
사용된 벡타 DNA가 특정 항생물질에 대한 저항성과 같은 선택마커를 가질때, 상술한 선택적 배지에 항생물질을 가하면 필요한 형질 전환체의 선택이 용이하다.
수득된 5′-이노시네이트 탈수소효소 유전자 부분이 삽입된 재조합 벡타 DNA를 숙주 균주로부터 추출하여 이어서 또다른 구아노신 생산 미생물에 도입하거나, 5′-이노시네이트 탈수소효소 유전자 부분 함유 DNA 단편을 추출된 재조합 DNA로부터 제조하여 또다른 벡터 DNA에 삽입한 다음, 이어서 구아노신 생산 미생물에 도입한다.
또한 숙주-박테리아가 에스케리키아 콜리와 같이 바실루스 속이외의 속에 속하는 숙주-베타계를 사용하여 5′-이노시네이트 탈수소효소 유전자 부분을 클로닝하고, 수득된 재조합 DNA로부터 상기 유전자 부분을 함유한 DNA 단편을 제조한 후, 이 DNA 단편을 바실루스속의 박테리아 균주의 이용에 적당한 벡타 DNA에 삽입하고, 이를 구아노신 생산 미생물에 도입한다.
상술한 바실루스 서브틸리스 NA-6011, 바실루스 서브틸리스 NA-6012, 바실루스 서브틸리스 NA-7821 등은 구아노신 생산 미생물의 예이다.
이렇게 수득된 형질 전환체의 예로는, 균주 NA-6011로부터 유도된 형질 전환체 바실루스 서브틸리스 TF 11(IFO 14312, FREM P-7412, KAIST 841109-14011), 균주 NA-6012로부터 유도된 형질 전환체 바실루스 서브틸리스 TF 21(IFO 14313, FERM P-7413, KAIST 84110-13911) 및 균주 NA-6128(IFO 14373, FERM BP-617, KAIST 841109-14211)로부터 유도된 형질 전환체 NA-6128(pBX121′)가 있다. 도입된 플라스미드의 유전적 특성은 이들 형질 전환체에서 형질 발현되며, 이들 형질 전환체는 형질 전환전의 상응하는 균주들과 비교해 높은 클로람페니콜 저항성, 높은 5′-이노시네이트 탈수소효소 활성 및 큰 구아노신 생산성을 갖는다. 그러나 다른 박테리아 특성은 형질 전환체에 그대로 남아 있다.
상술한 균주 NA-6011, NA-6012 및 NA-7821은 모균주 바실루스 서브틸리스 No.115로부터 유도된 구아노신 생산 균주이며, 이들의 박테리아 특성은 표 1에 기재한다.
[표 1]
Figure kpo00001
버기′즈 매뉴얼 어브 디터미네이티브 박테리오로지(8판, 1974, R.E.Buchanan 및 N.E.Gibbons)에서 알 수 있는 바와 같은 상기의 박테리아 특성을 갖는 미생물은 바실루스 서브틸리스에 속하는 균주이다. 형질 전환체 TF11, TF12, NA-6128(pBX 121′)는 같은 박테리아 특성을 나타낸다.
여기에 사용된 IFO 번호는 일본국 재단법인 발효연구소(IFO : 일본국 오오사까시 요도가와꾸 주소혼마찌 2쪼메 17-85)의 수탁번호이고, FERM P 번호는 일본국 공업기술원 미생물 공업 기술연구소(FRI : 일본국 이바라끼껭 쓰꾸바꾼 야다베마찌 히가시 1쪼메 1-3)의 수탁번호이며, FERM BP 번호는 부타페스트 협약하에 FRI에 기탁된 수탁번호이고, KAIST 번호는 한국과학기술원(KAIST : 서울특별시 성북구 하월곡동 39-1)의 수탁번호이다. 수탁번호 및 기탁일은 하기와 같다.
Figure kpo00002
상기식에서 FERM P 수탁번호로 FRI에 1982년 1월 25일 기탁된 미생물의 계대 배양액은 부타페스트 협약하의 기탁으로 전환되어 다음과 같이 FERM BP 수탁번호로 FRI에 저장되어 있다.
Figure kpo00003
상기 방법으로 수득된 구아노신 생산 형질 전환체는 종래에 구아노신 생산 균주를 배양하는 것과 같은 방법으로 성장될 수 있다. 그러므로, 배지로서, 탄소원, 질소원, 금속이온 및 필요하다면 아미노산, 핵산 및 비타민과 같은 기타 영양분을 함유한 배지가 사용된다. 탄소원으로는 글루코오즈, 슈크로오즈, 말토오즈, 녹말, 당화전분, 몰라세 등이 사용될 수 있다. 질소원으로는 펩톤, 옥수수 침지액, 대두밀, 이스트 및 우레아와 같은 유기질소원 및 암모늄염(예.황산염, 질산염, 염산염, 탄산염), 암모니아기체 및 암모니아수와 같은 무기질소원이 단독으로 또는 배합하여 사용될 수 있다. 미생물 성장에 필요한 기타 양분으로는 필요하다면 각종 무기염, 아미노산, 비타민 등이 단독으로 또는 배합하여 사용될 수 있다.
아데닌 원으로는 아데닌, 아데도신, 아데닐산 및 핵산뿐만 아니라 이들을 함유한 미생물세포 및 그의 추출물이 사용될 수 있다. 또한 필요하다면 배지에 실리콘유 또는 폴리에틸렌글리콜 에테르와 같은 거품방지제 또는 표면활성제를 가할 수 있다.
배양은 일반적으로 호기성 조건하에 수행되며, 예를들면 호기조건 및 교반하에 진탕 또는 침지 배양의 방법으로 수행된다. 일반적으로 배지의 pH는 4~9의 범위가 바람직하다. 배지에서 pH 변화를 관찰하는 경우, pH치를 바람직한 범위로 조절하기 위해 배지에 적당량의 황산, 탄산칼슘, 수산화나트륨, 암모니아기체, 암모니아수 등을 가할 수 있다. 배양 온도는 미생물 성장 및 구아노신 축적을 맞추기 위해 일반적으로 20℃~45℃ 범위내에서 선택한다. 배양은 구아노신의 축적이 최대치에 도달할때까지 계속한다. 이러한 목적은 일반적으로 24시간 ~144시간 동안 배양함으로써 성취될 수 있다.
배양액으로부터 구아노신을 분리 또는 회수하는 것은 침전방법 및 이온교환수지 또는 활성탄을 사용한 크로마토그래피와 같은 공지의 분리 및 정제 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법은 형질 전환전의 균주를 사용하는 경우와 비교해 구아노신의 생산성이 증가될 수 있다. 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
[실시예 1]
i) 염색체 DNA의 제법.
구아노신을 생산할 수 있는 균주 바실루스 서브틸리스 NA-6012(IFO 14190, FERM BP-292, KAIST 830719-10510)를 C배지(5g/ℓ 글루코오즈, 0.5g/ℓ 소듐시트레이트, 5g/ℓ 폴리펩톤(다이고영양화학사, 일본), 5g/ℓ 이스트 추출물, 1g/ℓ(NH4)2SO4, 7g/ℓ K2HPO4, 3g/ℓ KH2PO4, 0.2g/ℓ MgSO4.7H2O, pH 7.0)에 접종시키고, 37℃에서 밤새 배양한다. 배양액 1ℓ에서 수거한 세포로부터 페놀을 사용한 염색체 DNA 추출 방법에 의해 최종량 8.0mg의 염색체 DNA를 수득한다[Biochem.Biophys.Acta, 72, 619(1963)].
ii) 염새체 DNA를 pBR 322에 삽입.
특별히 지시하지 않는한, 하술될 각 제한 효소 절단 단계에 이용된 조건은 문헌에 기재되어 있다.
[T.Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p98~103, 1982].
상기 단계 i)에서 수득된 염색체 DNA 3μg 부분을 제한 효소 Pst I(Nippon Gene 사제. 일본)으로 37℃에서 60분간 분해하여 DNA 사슬을 절단한다.
효소가 불활성화된 후 최종 농도가 2.5M이 되도록 암모늄 아세테이트를 가하고, 2부피의 냉알콜을 더 가한 다음, -70℃로 냉각시킨 후, 침전된 DNA를 원심분리에 의해 수거한다. 멸균수(35μl)를 상기 DNA 침전물에 가하여 이를 용해시킨다. 한편, 1μg의 Ek계 플라스미드 pBR 322를 제한 효소 Pst I으로 절단하고, 상기와 같은 방법으로 원심분리에 의해 DNA를 수거한 후, 35μl의 멸균수에 용해시킨다.
수득된 염색체 DNA 단편 및 pBR 322 DNA 단편을 용액중에서 혼합하고, 6.6mM MgCl2, 10mM 디티오트레이톨 및 660μm ATP를 함유한 66mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)중에서 T4 파아지-유도 DNA 리가아제(Nippon Gene)를 사용하여 결찰을 수행한다.
iii) 크산틴 요구 에스케리키아 콜리 균주를 재조합 플라스미드 DNA로 형질 전환.
영양 요구 변이주를 분리하는 공지의 방법(복제 플레이팅법)에 의해 균주 에스케리키아 콜리 C600으로부터 크산틴 요구 균주 에스케리키아 콜리 X-895(IFO 14308, FERM BP-614, KAIST 841109-13711)를 수득한다. 적격세포 방법[S.N.Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 69, 2100(1972)]에 의해 상기 균주를 재조합 플라스미드로 형질 전환시킨다.
균주 에스케리키아 콜리 X-895를 L배지(10g/ℓ) 박토트립톤(Difco, 미국), 5g/ℓ 이스트 추출물, 5g/ℓ 염화나트륨)에 배양하고, 세포를 수거 및 세척한 후 빙냉염화칼슘 용액을 가하여 적격세포를 제조한다.
이 적격세포 현탁액에 상기 단계 ii)에서 수득된 DNA 용액을 가함으로써 플라스미드 DNA 반응, 즉 형질 전환을 일으킨다.
15μg/ml의 테트라시클린을 함유한 M-9 CM 한천 플레이트(6g/ℓ Na2HPO4, 3g/ℓ KH2PO4, 0.5g/ℓ 염화나트륨, 1g/ℓ 염화암모늄, 1mM 황산마그네슘, 1mM 염화칼슘, 2g/ℓ 글루코오즈, 2g/ℓ 카사미노산, 15g/ℓ 한천, pH 7.2)을 상기 형질 전환체를 함유한 현탁액 0.1ml로 넓게 펴고, 37℃에서 1일간 배양한다. 한천 플레이트 배지에 형성된 군락으로부터 형질 전환체 에스케리키아 콜리 TEX-117(테트라시클린 저항, 크산틴 불필요)을 분리한다.
iv) 형질 전환체로부터 플라스미드 추출.
상기에 인용한 문헌 “분자 클로닝” p 86-93에 기재된 방법에 의해 형질 전환체 TEX-117로부터 재조합 플라스미드를 추울한다. 이 에스케리키아 콜리 TEX-117을 상기 L배지에 접종시키고, 플라스미드 증폭을 위해 클로람페니콜을 가한 후, 밤새 배양하고, 세포를 수거한다. 이 세포를 세척하고, 라이소자임을 가한 다음, 1% 소듐라우릴 설페이트를 함유한 0.2M 수산화나트륨을 가하여 박테리아를 분해시킨다. 5M 포타슘 아세테이트를 가한 후 원심분리하여 플라스미드-함유 상층액을 수득한다. 상층액에 0.6부피의 이소프로필 알콜을 가하여 플라스미드 DNA를 침전시키고, 에탄올로 세척한 후, TE 완충액(10mM 트리스-염산 완충액, 1mM EDTA, pH 8.0)에 용해시킨다.
염화세슘을 가하여 비중 1.60이 되게 하고, 최종 농도가 600μg/ml가 되도록 브롬화에티듐을 가한다. 베크만 울트라 원심분리기(로우터 V65Ti)를 사용하여 20℃ 및 50,000rpm에서 12시간 동안 원심분리하고, 자외선에서 검출된 플라스미드 밴드를 수거한 후, n-부탄올로 추출하여 브롬화 에티듐을 제거하고, TE 완충액에 투석시킨다. 300ml의 배양액으로 상기 공정을 수행하면 pEX117이라 명명된 재조합 플라스미드 약 200μg이 수득된다. pEX117을 각종 제한 효소로 절단하고, 분해물을 아가로즈겔 전기영동한다. 분자량 표준으로 λ-파아지의 Hind Ⅲ 분해물(Nippon Gene 사제)을 사용한다. 전기영동 패턴으로부터 제1도에 나타낸 제한 효소 절단 지도를 수득한다. pEX117은 pBR 322의 Pst I 부위에 삽입된 약 6.4킬로염기 DNA 단편을 갖는 재조합 플라스미드이다.
[실시예 2]
i) 3μg의 pEX117을 제한 효소 Hind Ⅲ으로 부분 분해한다. 한편, pBR 322는 Hind Ⅲ으로 완전 분해한다. 두 분해물을 혼합하고, T4 파아지-유도 DNA 리가아제를 사용하여 실시예 1-ii)에 기재된 방법에 의해 함께 결찰시킨다. 이 DNA 용액을 실시예 1-iii)에 기재된 방법에 의한 에스케리키아 콜리 X-895의 형질 전환에 사용한다. 테트라시클린 저항 균주를 수득하고, 이로부터 더 이상 크산틴을 필요로 하지 않는 형질 전환체, 특 에스케리키아 콜리 TEX-147을 수득한다. 실시예 i-iv)에 기재된 방법에 의해 수행된 플라스미드 추출에 의해 상기 형질 전환체로부터 약 220μg의 재조합 플라스미드를 수득한다. 이 플라스미드를 pEX 147이라 명명한다. pEX 147의 제한 효소 절단지도는 제2도에 나타낸다. pEX 147은 pBR 322의 Hind Ⅲ 부위에 2.9 킬로염기 DNA 단편을 삽입함으로써 유도된 재조합 플라스미드이다.
ii) 약 220μg의 재조합 플라스미드 pEX 147을 제한 효소 Hind Ⅲ으로 부분 분해하고, 저 융점 아가로즈(Bethesda Research Laboratories Incorporation. U.S.A.)를 사용하여 상기 분해물을 겔 전기영동한다. 2.9킬로 염기 DNA의 이동 거리에 해당하는 아가로즈겔의 부분을 절단해 내고, 상기의 인용한 문헌 “분자 클로닝” p 170에 기재된 방법에 의해 상기 아가로즈겔 부분으로부터 DNA를 추출한다. 최종적으로 약 2μg의 DNA를 수득한다. 제한 효소 절단 패턴에 의해, 상기 DNA가 pBR 322의 Hind Ⅲ 부위에 삽입된 2.9킬로 염기 DNA라는 것이 확인된다.
[실시예 3]
i) BS-계 벡타(pC194)에 5′-이노시네이트 탈수소 효소 유전자를 삽입.
3μg의 pEX117을 제한 효소 Hind Ⅲ으로 부분 분해하고, 한편 숙주가 바실루스 서브틸리스 인 플라스미드 pC194를 Hind Ⅲ으로 완전 분해한다. 두 분해물을 혼합하고, T4 파아지-유도 DNA 리가아제를 사용하여 실시예 1-ii)에 기재된 방법에 의해 함께 결찰시킨다.
ii) 크산틴 요구 바실루스 서브틸리스 균주를 재조합 플라스미드 DNA로 형질 전환.
영양 요구 변이주를 분리하는 공지의 방법에 의해 균주 바실루스 서브틸리스 MI-114(유전적 특성 : trpC2, leu8, r-, m-)로부터 크산틴 요구 균주 바실루스 서브틸리스 즉 균주 RN-63(IFO 14307, FERM Bp-613, KAIST 841109-13811)를 수득한다.
이 바실루스 서브틸리스 RN-63을 상기 단계 i)에서 제조된 DNA 용액으로 형질 전환시켜 클로람페니콜 저항 형질 전환체를 수득한다. 형질 전환은 상기 영양 요구변이주의 원형질체에 폴리에틸렌글리콜을 작용시켜 DNA 과업을 일으키는 방법에 의해 수행된다. [s. Chang and S.N.Cohen. Mol.Gen.Genet., 168, 111(1979)].
상기 형질 전환 과정의 결과로, 형질 전환체 바실루스 서브틸리스 TX-121이 다음과 같이 수득된다 : 10μg/ml의 클로람페니콜을 함유한 재생 배지에 형질 전환체를 성장시켜 10μg/ml의 클로람페니콜을 함유한 M-9CMTL 배지(각 50μg/ml의 트립토판 및 류신으로 보퉁된 M-9 배지)의 한천 플레이트에 리플리카-평판 배양한다. 37℃에서 1일 동안 배양한 후, 클로람페니콜에 저항성을 가지며, 동시에 성장을 위해 크산틴이 필요없는 균주 바실루스 서브틸리스 TX-121을 수득한다.
iii) 형질 전환체로부 플라스미드 추출.
균주 바실루스 서브틸리스 TX-121을 300ml의 상술한 L배지에 성장시키고, 생성된 배지로부터 실시예 1-iv)의 방법에 의해 약 100μg의 플라스미드를 수득한다. 이 플라스미드를 pBX121로 명명한다. 재조합 플라스미드 pBX121의 제한 효소 절단지도는 제3도에 나타내며, 삽입 단편의 크기는 약 2.9킬로 염기이다.
[실시예 4]
바실루스 서브틸리스 형질 전환체를 사용한 구아노신의 제법.
바실루스 서브틸리스 NA-6012(IFO 14190, FERM BP-292, KAIST 830719-10510)을 실시예 3-ii)에 기재된 방법에 따라 pBX 121로 형질 전환시키고, 10μg/ml 클로람페니콜을 함유한 재생배지를 형질 전환체를 함유한 현탁액으로 넓게 편다음 37℃에서 5일간 배양한 후, 형성된 군락으로부터 클로람페니콜 저항 형질 전환체 바실루스 서브틸리스 TF21(IFO 14313, FERM BP-616, KAIST 841109-13911)을 수득한다.
200ml 삼각 플라스크에 표 2에 기재된 종배지 200ml를 넣고, 1루우프의 바실루스 서브틸리스 TF 21으로 접종시킨다. 37℃ 18시간 동안 진탕한 후, 1ml의 배지를 표 2에 기재된 발효배지 20ml에 접종시키고, 200ml의 주름 플라스크에 넣은 후, 회전 진탕기에 37℃에서 4일간 배양한다. 발효 브로스에 18.0mg/ml의 구아노신이 축적된다.
약 50플라스크를 사용하여 상기와 같은 배양을 수행하여 같은 질의 배양액 1ℓ를 수득한다. 배양액을 수산화나트륨에 의해 pH 11로 조절함으로써 구아노신 결정을 용해시키고, 박테리아 세포를 원심분리에 의해 제거한 후, 수득된 상층액을 중화 및 냉각하여 구아노신을 침전시킨다. 수득된 조결정을 700ml의 열수에 용해시키고, 용액을 활성탄으로 탈색한 후, 냉각시켜 구아노신을 침전시킨다. 따라서 14.5g의 정제된 구아노신 결정을 수득한다. 상기 정제 결정의 순도는 93%이다. 비교를 위해, 재조합 플라스미스 pBX 121이 없는 균주, 즉 바실루스 서브틸리스 NA-6012를 상기와 같은 조건하에 배양하면, 14mg/ml의 구아노신이 축적된다.
[표 2]
Figure kpo00004
[실시예 5]
바실루스 서브틸리스 NA-6011(IFO 14189, FERM BP-291, KAIST 830719-10410)을 실시예 3-ii)의 방법에 따라 pBX121로 형질 전환시키고, 클로람페니콜 저항 형질 전환체 바실루스 서브틸리스 TF11(IFO 14312, FERM BP-615, KAIST 841109-14011)을 분리해 내고, 실시예 4와 같은 조건하에 배양한다. 구아노신 축적량은 16.0mg/ml이다. 계속해서 실시예 4와 같은 방법으로 1ℓ의 발효 브로스로부터 구아노신을 정제하여 13.1g의 91% 순도 결정상 구아노신을 수득한다. 같은 조건하에 재조합 플라스미드 pBX121 없는 균주, 즉 바실루스 서브틸리스 NA-6011을 배양하면 5.0mg/ml의 구아노신이 축적된다.
[실시예 6]
형질 전환체의 5′-이노시네이트 탈수소효소 활성.
MEA배지(10g/ℓ 폴리펩톤, 5g/ℓ 이스트추출물, 5g/ℓ 염화나트륨, 5g/ℓ 소듐 글루타메니트, 0.5g/ℓ 황산마그네슘, 0.1g/ℓ 염화칼슘, 50g/ℓ 글루코오즈, pH 7.2)를 균주 바실루스 서브틸리스 TX-121로 접종시키고, 37℃에서 밤새 배양한다. 세포를 수거하여 세척하고, 5mM 클루타티온(환원형)을 함유한 1/10 부피의 0.05M 포스페이트 완충액(pH 7.2)에 현탁시켜 음파파쇄한다. 잔류물을 원심분리에 의해 제거하고, 상층액을 상기 포스페이트 완충액에 밤새 투석하여 조 효소 용액을 수득한다. 상기 조 효소 용액을 비.마가사니크의 방법(Methods in Enzymology. Ⅵ, p106-110 아카데미프레스, 뉴욕, 1963)에 의해 5′-이노시네이트 탈수소효소 활성을 분석한다. 확인된 효소 활성은 0.02단위/mg 단백질이다. 재조합 플라스미드가 없는 숙주, 즉 바실루스 서브틸리스 RN-63을 같은 방법으로 5′-이노시네이트 탈수소효소 활성 분석하면, 효소 활성이 매우 부족하다는 것이 밝혀진다.
[실시예 7]
실시예 1에 기재된 방법에 따라, 구아노신을 생산할 수 있는 바실루스 서브틸리스 NA-7821(IFO 14368, FERM BP-618, KAIST 841109-14111)의 염색체 DNA를 제한 효소 Pst I으로 분해하고, 수득된 DNA 단편을 절단된 pBR 322와 결찰시킨 다음, 크산틴 요구 에스케리키아 콜리 X-895에 보충되는 플라스미드 pEX 117′를 수득한다. pEX 117′를 제한 효소 Hind Ⅲ으로 부분 분해하고, 실시예 3에 기재된 방법에 의해 플라스미드 pC194와 결찰시켜, 5′-이노시네이트 탈수소효소 유전자 및 Hind Ⅲ 절단부위 2.9킬로 염기쌍을 갖는 플라스미드 pBX121′를 수득한다.
그리고, 바실루스 서브틸리스 NA-6128(IFO 14373, FERM BP-617, KAIST 841109-14211)를 실시예 4에 기재된 방법에 따라 플라스키드 pBX121′로 형질 전환시킨다. 수득된 형질 전환체 NA-6128(pBX121′)을 10% 글루코오즈 2% 황산 암모늄, 1% 우레아, 1% 소듐 글루타메이트, 2% 옥수수 침지액, 0.2% RNA, 0.5% 염화칼슘, 0.2% 황산 마그네슘, 0.05% 염화칼륨, 2.5mg/ℓ 황산망간 및 3% 탄산칼슘을 함유한 발효 배지에 접종시키고, 횐전진탕기에 37℃에서 3일간 배양한다. 발효 브로스에 20mg/ml의 구아노신이 축적된다. 비교를 위해, 재조합 플라스미드 pBX 121′가 없는 균주, 즉 바실루스 서브틸리스 NA-6128을 상기와 같은 조건하에 배양하면, 7mg/ml의 구아노신이 축적된다.
상기에서, 균주 NA-7821 및 균주 NA-6128은 균주 NA-6012 및 균주 NA-6011을 각각 N-메틸-N′니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 처리함으로써 유도된다.

Claims (3)

  1. 구아노신 생산 바실루스 균주, 또는 크산토신 생산 바실루스 균주, 또는 구아노신 및 크산토신 생산 바실루스 균주의 염색체 DNA로부터 수득된 5′-이노시네이트 탈수소 효소 유전자 부분이 삽입된 벡타에 의해 형질 전환된 구아노신 생산 바실루스 균주를 배지에서 배양하고, 배양액에 생성 및 축적된 구아노신을 수거함을 특징으로 하는 구아노신의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 언급된 DNA가 5′-이노시네이트 탈수소 효소 유전자 및 그로부터 떨어진 Hind Ⅲ 절단부위 2,9킬로 염기쌍을 갖는 DNA인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 바실루스 균주가 바실루스 서브틸리스 NA-6011(IFO 14189, FERM BP-291, KAIST 830719-10410), 바실루스 서브틸리스 NA-6012(IFO 14190, FERM BP-292, KAIST 830719-10510), 바실루스 서브틸리스 NA-7821(IFO 14368, FERM BP-618, KAIST 841109-14111), 바실루스 서브틸리스 ATCC 19221, 바실루스 푸밀루스 NA-1102(IFO 14185, FERM BP-289, KAIST 830719-10210) 또는 바실루스 푸밀루스 NA-1103(IFO 14186, FERM BP-290, KAIST 830719-10310)인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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