JPS58158197A - 発酵法によるイノシンの製造法 - Google Patents
発酵法によるイノシンの製造法Info
- Publication number
- JPS58158197A JPS58158197A JP57041564A JP4156482A JPS58158197A JP S58158197 A JPS58158197 A JP S58158197A JP 57041564 A JP57041564 A JP 57041564A JP 4156482 A JP4156482 A JP 4156482A JP S58158197 A JPS58158197 A JP S58158197A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- inosine
- strain
- resistance
- adenine
- genus bacillus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法によるイノシンの製造法ｔこ関するもの
である。従来、発酵法によるイノシンの生産ｔこ関して
は、アデニン要求性、又はそれに各種のプリンアナログ
耐性を付饗したバチルス属（特公昭３８−２３０９８、
特開昭５６−１６２９９８、特公昭５５−２９６６）、
ブレ仮 ビバクテリウム属（特−昭５ ’Ｉ −５０５７１＠１
Ａｇｒ、Ｂｉａ１．Ｃｈｅｍ、、 ４２． ３９９（１
９７８）等のイノシシ生産菌が知られている。
である。従来、発酵法によるイノシンの生産ｔこ関して
は、アデニン要求性、又はそれに各種のプリンアナログ
耐性を付饗したバチルス属（特公昭３８−２３０９８、
特開昭５６−１６２９９８、特公昭５５−２９６６）、
ブレ仮 ビバクテリウム属（特−昭５ ’Ｉ −５０５７１＠１
Ａｇｒ、Ｂｉａ１．Ｃｈｅｍ、、 ４２． ３９９（１
９７８）等のイノシシ生産菌が知られている。
本発明者らは上述のような従来のイノシンの製造法に対
し、プリンアナログ耐性を有するバチルス属の染色体よ
り得たプリンアナログ耐性に開学する遺伝子領域が組み
込まれているベクターをアデニン要求性のバチルス属の
変異株１こ含有せしめたイノシン生産性バチルス属の微
生物が著量のイノシンを蓄積することを見い出した。
し、プリンアナログ耐性を有するバチルス属の染色体よ
り得たプリンアナログ耐性に開学する遺伝子領域が組み
込まれているベクターをアデニン要求性のバチルス属の
変異株１こ含有せしめたイノシン生産性バチルス属の微
生物が著量のイノシンを蓄積することを見い出した。
本発明はこの知見に基づいて完成されたものである。本
発明でいうプリンアナログとはバチルス属の微生物の増
殖を抑制し、かつその抑制がヒポキサンチン、イノシン
、あるいは５１−イノシン酸等を培地中１こ添加すれば
全体的又は部分的に解除されるようなものである。例え
ば、８−アザグアニン、８−アザヒボキサンチン、８−
アザアデニン、２，６−ジアミツプリン、６−メルカプ
トプリン、６−メルカプトプリンリボシド、８−メルカ
プトグアノシ７等がある。
発明でいうプリンアナログとはバチルス属の微生物の増
殖を抑制し、かつその抑制がヒポキサンチン、イノシン
、あるいは５１−イノシン酸等を培地中１こ添加すれば
全体的又は部分的に解除されるようなものである。例え
ば、８−アザグアニン、８−アザヒボキサンチン、８−
アザアデニン、２，６−ジアミツプリン、６−メルカプ
トプリン、６−メルカプトプリンリボシド、８−メルカ
プトグアノシ７等がある。
プリンアナログ耐性？こ関供する染色体遺伝子の供亭菌
はバチルス属のプリンアナログ耐性を有する変異株なら
どのような菌株でもよいが、耐性のより高いものが望ま
しい。又、アデニン要求性株を親株として、プリンアナ
ログ耐性を有する変異株を誘導すれば、イノシン生産能
を有する変異株を得ることができ、このような変異株を
遺伝子供ケ菌として用いればよりよい結果が得られる。
はバチルス属のプリンアナログ耐性を有する変異株なら
どのような菌株でもよいが、耐性のより高いものが望ま
しい。又、アデニン要求性株を親株として、プリンアナ
ログ耐性を有する変異株を誘導すれば、イノシン生産能
を有する変異株を得ることができ、このような変異株を
遺伝子供ケ菌として用いればよりよい結果が得られる。
又、遺伝子供学菌として、アデニン要求性及びプリンア
ナログ耐性変異株ｔこ、さら１こ従来知られているよう
なイノシン生産能を向上させるような性質、例えばサル
ファ剤耐性、メチオニン耐性等をイ１加した菌株を誘導
して用いれば、イノノンの生産性が高い菌株を得ること
ができ、このような菌株を染色体遺伝子供亭菌として用
いれば、より好ましい結果が得られる。
ナログ耐性変異株ｔこ、さら１こ従来知られているよう
なイノシン生産能を向上させるような性質、例えばサル
ファ剤耐性、メチオニン耐性等をイ１加した菌株を誘導
して用いれば、イノノンの生産性が高い菌株を得ること
ができ、このような菌株を染色体遺伝子供亭菌として用
いれば、より好ましい結果が得られる。
上記サルファ剤とはバチルス属の微生物の増殖を抑制し
、かつその抑制がｐ−アミノ安息香酸又は葉酸等の添加
により全面的又は部分的ｔこ解除されるようなものであ
る。例えば、サルファグアニンン、サルファメトメジン
、スルフイイキサゾーム、スルファニルアミド、サルフ
ァメトメジン、サルファメラジン等がある。
、かつその抑制がｐ−アミノ安息香酸又は葉酸等の添加
により全面的又は部分的ｔこ解除されるようなものであ
る。例えば、サルファグアニンン、サルファメトメジン
、スルフイイキサゾーム、スルファニルアミド、サルフ
ァメトメジン、サルファメラジン等がある。
遺伝子供亭菌より染色体ＤＮＡを抽出する方法は、例え
ばＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 ８９ 、 Ｉ
０６５（１９６５） に記載されているような通常の
方法で行うことができる。
ばＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 ８９ 、 Ｉ
０６５（１９６５） に記載されているような通常の
方法で行うことができる。
ベクターＤＮＡとしては、バチルス属の菌体中で複製す
るプラスミド又はファージならば、どのようなものでも
よい。例えばスタフイルコアカス属微生物由来のｐＴＩ
２７ 、ｐｃＩ９４ 、ｐｃ２２１゜ｐＣ２２３，ｐＵ
Ｂ１１２ （以上、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
るプラスミド又はファージならば、どのようなものでも
よい。例えばスタフイルコアカス属微生物由来のｐＴＩ
２７ 、ｐｃＩ９４ 、ｐｃ２２１゜ｐＣ２２３，ｐＵ
Ｂ１１２ （以上、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ７４． １６８
０（＋９７７）参照）、ｐ Ｕ Ｂ １１０ （Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋１３１、 ３１８（１９７８）
参照）、ｐ Ｔ Ｐ ４ ＋１）ＴＰ５（以上Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ＋ ５ ＋ ５５（１
９７８）参照）、枯草菌由来のｐＬｓ１６＋ｐＬＳ２８
（以上、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋エエエｐ６９９
（１９７７）参照）、ｐ Ｌ Ｓ １３ （Ｊ、 Ｂａ
ｃｔｅｒｊｏｌ、＋Ｌ１９． １４８７（１９７７）参
照）、ｐＰＬｌ 。
０（＋９７７）参照）、ｐ Ｕ Ｂ １１０ （Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋１３１、 ３１８（１９７８）
参照）、ｐ Ｔ Ｐ ４ ＋１）ＴＰ５（以上Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ＋ ５ ＋ ５５（１
９７８）参照）、枯草菌由来のｐＬｓ１６＋ｐＬＳ２８
（以上、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋エエエｐ６９９
（１９７７）参照）、ｐ Ｌ Ｓ １３ （Ｊ、 Ｂａ
ｃｔｅｒｊｏｌ、＋Ｌ１９． １４８７（１９７７）参
照）、ｐＰＬｌ 。
１）ＰＬ２ （以上、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋
工２４゜４８４（＋９７５）参照）、テンペレートフ
ァーン知 としても龜られるｒｈｏ Ｉ １ （Ｇｅｎｅ、＋上ツ
８９（＋９７９））＋ｐｈｉ１０５（Ｇｅｎｅ、、ｓ＋
８７（１９７９））、５ＰＯ２（Ｇｅｎｅ、、７．
５１（１９７９）） 等がある。更會こ上記プラス
ミドをもとｔこして構築した複合プラスミドも当然のこ
となからベクターＤＮＡとして利用できうる。
工２４゜４８４（＋９７５）参照）、テンペレートフ
ァーン知 としても龜られるｒｈｏ Ｉ １ （Ｇｅｎｅ、＋上ツ
８９（＋９７９））＋ｐｈｉ１０５（Ｇｅｎｅ、、ｓ＋
８７（１９７９））、５ＰＯ２（Ｇｅｎｅ、、７．
５１（１９７９）） 等がある。更會こ上記プラス
ミドをもとｔこして構築した複合プラスミドも当然のこ
となからベクターＤＮＡとして利用できうる。
染色体ＤＮＡ及びベクターＤＮＡはそれぞれ制限エンド
ヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれのベクターに
は適した制限エンドヌクレアーゼがあるが、それは上記
ベクターにこりいての記載がある文献等ｔこ示されであ
る。染色体ＤＮＡｔ二ついい−１１１、１石切断が部分
的 ｅこ行なわれるようｔこ反応条件を調節すれば多くの種
類の制限酵素が利用できる。
ヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれのベクターに
は適した制限エンドヌクレアーゼがあるが、それは上記
ベクターにこりいての記載がある文献等ｔこ示されであ
る。染色体ＤＮＡｔ二ついい−１１１、１石切断が部分
的 ｅこ行なわれるようｔこ反応条件を調節すれば多くの種
類の制限酵素が利用できる。
かくして得られた染色体ＤＮＡ断片と、切断されたベク
ターＤＮＡとを連結せしめる方法は、リガーゼを用いる
通常の方法が使用できる。一方、ターミナルトランスフ
ェラーゼを用いて染色体ＤＮＡ断片と開裂したベクター
ＤＮＡとにデオキシシチジル酸とデオキシシチジル酸を
それぞれ付加し、混合した後アニーリングして連結せし
める方法も利用し得る。
ターＤＮＡとを連結せしめる方法は、リガーゼを用いる
通常の方法が使用できる。一方、ターミナルトランスフ
ェラーゼを用いて染色体ＤＮＡ断片と開裂したベクター
ＤＮＡとにデオキシシチジル酸とデオキシシチジル酸を
それぞれ付加し、混合した後アニーリングして連結せし
める方法も利用し得る。
かくして得られた染色体ＤＮＡ断片を組み込んり組換え
ベクターＤＮＡの受容菌はバチルス属のアデニン要求性
を有する変異株ならどのようなものでもよいが、プリン
アナログ耐性を有していない菌株を用いれば、形質転換
株を選択する際１こ好都合である。更に組換え゛ＤＮＡ
受容菌としてブリ／アナログ耐性を有し、より高いイノ
ノン生産能を有する菌株を用いれば、よりイノシン生産
性の高い形質転換株を得ることができる。受容−とじて
は当然イノノン分解能がより低いものを用いなければな
らない。
ベクターＤＮＡの受容菌はバチルス属のアデニン要求性
を有する変異株ならどのようなものでもよいが、プリン
アナログ耐性を有していない菌株を用いれば、形質転換
株を選択する際１こ好都合である。更に組換え゛ＤＮＡ
受容菌としてブリ／アナログ耐性を有し、より高いイノ
ノン生産能を有する菌株を用いれば、よりイノシン生産
性の高い形質転換株を得ることができる。受容−とじて
は当然イノノン分解能がより低いものを用いなければな
らない。
染色体ＤＮＡとベクターの混合物をＤＮＡ受容菌１こ導
入するｔこけ例えばＭａｌｅｃ、 Ｇｅｎｅ、 Ｇｅｎ
ｅｔ、。
入するｔこけ例えばＭａｌｅｃ、 Ｇｅｎｅ、 Ｇｅｎ
ｅｔ、。
二６８． ＩＩ＋（＋９７９）ｔこ記載されているよ
うな通常の形質転換法が利用できる。
うな通常の形質転換法が利用できる。
イノノン生産能を有し、プリンアナログ耐性に開学する
遺伝子領域が組み込まれているベクターを含有する形質
転換株を選択するｔこけ、例えばベクター受容菌として
アデニン要求性変異株を用いて形質転換し、プリンアナ
ログを含有する培地で生育してくる菌株を選択すればよ
い。又、ベクターＤＮＡの抗生物質耐性等の性質を併せ
もつ菌株を選択できるような培地を用いればより選別が
容易である。プリンアナログ耐性及び例えばサルファ剤
耐性、又はメチオニンスルフ゛オオキシド耐性等に閏年
する遺伝子領域が組み込まれている組換えベクターＤ
Ｎ Ａの受容菌を選択する場合、これらの耐性を有する
薬剤を含有している培地で生育してくる菌株を選別すれ
ばよい。
遺伝子領域が組み込まれているベクターを含有する形質
転換株を選択するｔこけ、例えばベクター受容菌として
アデニン要求性変異株を用いて形質転換し、プリンアナ
ログを含有する培地で生育してくる菌株を選択すればよ
い。又、ベクターＤＮＡの抗生物質耐性等の性質を併せ
もつ菌株を選択できるような培地を用いればより選別が
容易である。プリンアナログ耐性及び例えばサルファ剤
耐性、又はメチオニンスルフ゛オオキシド耐性等に閏年
する遺伝子領域が組み込まれている組換えベクターＤ
Ｎ Ａの受容菌を選択する場合、これらの耐性を有する
薬剤を含有している培地で生育してくる菌株を選別すれ
ばよい。
このようｔこして、一旦選別されたプリンアナログ耐性
等に開学する遺伝子領域が組み込まれている組換えベク
ターＤＮＡは、形質転換株より抽出後、他の組換えベク
ターＤＮＡ受容菌、例えばイノシン生産菌を有する菌株
に導入すること１こよりイノノン蓄積量をさら１こ増大
させることができる。
等に開学する遺伝子領域が組み込まれている組換えベク
ターＤＮＡは、形質転換株より抽出後、他の組換えベク
ターＤＮＡ受容菌、例えばイノシン生産菌を有する菌株
に導入すること１こよりイノノン蓄積量をさら１こ増大
させることができる。
この場合、受容菌はイノシン生産能のより高い菌株、例
えばプリンアナログ耐性及びサルファ剤、又はメチオニ
ンスルフォオキシド耐性等を併せもつ菌株を受容菌とす
ればさらに高いのイノシン収率が得られる。
えばプリンアナログ耐性及びサルファ剤、又はメチオニ
ンスルフォオキシド耐性等を併せもつ菌株を受容菌とす
ればさらに高いのイノシン収率が得られる。
かくして得られたイノシン生産菌を用いてイノシンを製
造する方法は従来のイノシン生産菌の培養方法と特ｔこ
変らない。即ち、培地としては炭素源、窒素源、無機イ
オン、および有機微量栄養素を含有する通常の培地であ
る。炭素源としてはグルコース、シュークロース等の炭
水化物が望ましい、窒素源としてはアンモニア水、アン
モニアガス、アンモニウム塩、アミノ酸等が利用できる
。
造する方法は従来のイノシン生産菌の培養方法と特ｔこ
変らない。即ち、培地としては炭素源、窒素源、無機イ
オン、および有機微量栄養素を含有する通常の培地であ
る。炭素源としてはグルコース、シュークロース等の炭
水化物が望ましい、窒素源としてはアンモニア水、アン
モニアガス、アンモニウム塩、アミノ酸等が利用できる
。
無機イオンとしてはリン酸イオンが必要であるほか、カ
リイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイ
オン等が適宜培地中に添加される。有機微量栄養素とし
てアデニン要求性を満足せしめるべき物質、例えばアデ
ニン、アデノシン、又はＲＮＡ加水分解物等を鱒加する
。その他１こビタミン、アミノ酸等が有機微量栄養素と
して適宜使用される。
リイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイ
オン等が適宜培地中に添加される。有機微量栄養素とし
てアデニン要求性を満足せしめるべき物質、例えばアデ
ニン、アデノシン、又はＲＮＡ加水分解物等を鱒加する
。その他１こビタミン、アミノ酸等が有機微量栄養素と
して適宜使用される。
培養は好気的条件下で、望ましくはｐＨ４ないし８に制
御しっつｌないし５日も行なえばよい。
御しっつｌないし５日も行なえばよい。
カくシて得られた培養液中には著量りイノシンが生成蓄
積される。培養液よりイノシンを採取する方法はイオン
交換樹脂等を用いる通常の方法でよい。
積される。培養液よりイノシンを採取する方法はイオン
交換樹脂等を用いる通常の方法でよい。
実施例
バチルス・ズブチリスＡＪＩｌ？ＩＩ（アルギニン、ロ
イシン複要求株）がらＮ−メチル−Ｎ’−二１− ｏ
−Ｎ −＝ ）ロングアニジン変異処理ニよって誘導し
たアデニン要求性変異株ＡＪ１１８３１（ＦＥＲＭ−Ｐ
ら４− ）を得た。さらｔここのアデニン要求性株
から同様の変異処理によって誘導したイノシン生産菌Ａ
Ｊｌ＋８３２（ＦＥＲＭ−Ｐら牛９う ）（アルギニン
要求性、ロイシン要求性、アデニン要求性、８−アザグ
アニン耐性）、Ａｌｌ＋８３３（ＦＥＲＭ−Ｐ ６４
ｒ４ ）（アルギニン要求性、ロイシン要求性、アデ
ニン要求性、８−アザグアニン耐性、サルファグアニジ
ン耐性）を原株とし、これより次のような方法で新規イ
ノシン生産菌を造成した。
イシン複要求株）がらＮ−メチル−Ｎ’−二１− ｏ
−Ｎ −＝ ）ロングアニジン変異処理ニよって誘導し
たアデニン要求性変異株ＡＪ１１８３１（ＦＥＲＭ−Ｐ
ら４− ）を得た。さらｔここのアデニン要求性株
から同様の変異処理によって誘導したイノシン生産菌Ａ
Ｊｌ＋８３２（ＦＥＲＭ−Ｐら牛９う ）（アルギニン
要求性、ロイシン要求性、アデニン要求性、８−アザグ
アニン耐性）、Ａｌｌ＋８３３（ＦＥＲＭ−Ｐ ６４
ｒ４ ）（アルギニン要求性、ロイシン要求性、アデ
ニン要求性、８−アザグアニン耐性、サルファグアニジ
ン耐性）を原株とし、これより次のような方法で新規イ
ノシン生産菌を造成した。
（１） 染色体ＤＮＡの調製
ＡＪ ＋１８３２、Ａｌ＋８３３ を各々１ｔの［Ｂ
ａｃｔｏ −’Ｐｅｎａｓｓａｙ Ｂｒｏｔｈ Ｊ
（商品名、Ｄｉｆｃｏ社製）中でｇｏｃで約２時間振盪
培養を行ない、対数増殖期の菌体を集菌後、通常のＤＮ
Ａ抽出法（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ ＪＩＪ＋
１０６５（１９６５））ｒこより染色体ＤＮＡを抽
出、精製し、Ａｌｌ＋８３２から３．１■、Ａｌｌ＋８
３３から３，７■を得た。
ａｃｔｏ −’Ｐｅｎａｓｓａｙ Ｂｒｏｔｈ Ｊ
（商品名、Ｄｉｆｃｏ社製）中でｇｏｃで約２時間振盪
培養を行ない、対数増殖期の菌体を集菌後、通常のＤＮ
Ａ抽出法（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ ＪＩＪ＋
１０６５（１９６５））ｒこより染色体ＤＮＡを抽
出、精製し、Ａｌｌ＋８３２から３．１■、Ａｌｌ＋８
３３から３，７■を得た。
（２） 染色体ＤＮＡ断片のベクターヘノ挿入ヘクター
トして自律増殖性のプラスミドｐ［ＪＢＩＩＱ （カ
ナマイシン、ネオマイシン耐性を発現する）を用いた。
トして自律増殖性のプラスミドｐ［ＪＢＩＩＱ （カ
ナマイシン、ネオマイシン耐性を発現する）を用いた。
（＋Ｉで得た染色体ＤＮＡを各々５μ２ずっとプラスミ
ドｐＵ８１１０５μｖずつを、それぞれ制限エンドヌク
レアーゼＥｃｏＲＩ を３７ｔ？て６ｏ分間作用させ
てＤＮＡ鎖を切断した。６５ｒで１ｏ分間の熱処理後、
各両反応液を混合し、ＡＴＰ及びジチオスライトール存
在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼｔ：テ］ Ｏ
ｃｌｃ テ２４時間、ＤＮＡ鎖の連結反応を行なった。
ドｐＵ８１１０５μｖずつを、それぞれ制限エンドヌク
レアーゼＥｃｏＲＩ を３７ｔ？て６ｏ分間作用させ
てＤＮＡ鎖を切断した。６５ｒで１ｏ分間の熱処理後、
各両反応液を混合し、ＡＴＰ及びジチオスライトール存
在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼｔ：テ］ Ｏ
ｃｌｃ テ２４時間、ＤＮＡ鎖の連結反応を行なった。
＋３１ 形質転換
バチルス・ズブチリスＡＪ１１８３１（アルギニン、ロ
イシン複要求株、アデニン要求性変異株）をｒ Ｐｅｎ
ａｓｓａｙ Ｂｒｏｔｈ Ｊ （Ｄｉｆｃｏ 社製）＃
こ接種して３０ｒｒこてｌ晩振盪培養を行ない、培養培
地！（グル’：ＩＩ −：Ａ ５ ｆ ／ ｔ ｓ
（ＮＨ４）２５０４２ ？ ／ Ｌ １ＫＨ２ＰＯ４６
ｆ ／ Ｌ ｓ Ｋ２ＨＰＯ４１４ｆ ／ Ｌ、 Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ，ＯＱ、２ ｆ ／ Ｌ、 ９ エン酸ナ
トリウム１９／ｌ、＠母エキス２ｔ／１％Ｌ−アルギニ
７２５０ｍｇ／ＬＳＬ−−イノン５゜叢ｇ ／ ｔ １
アデニン５゛０講ｙ／ｌを含む）に＆挿し、３７Ｃ１
こて４時間振盪培養を行なった後、さらｔコ培養培地Ｉ
ｆ （！ｌ ルコ）−ス５ ｔ ／ Ｌ ｓ （Ｎ８４
％、５Ｏ４２ｔ／１１ＫＨ，ＰＯ４６ｆ／ｌ、 Ｋ、Ｈ
ＰＯ４１４ｔ ／ Ｌ １ＭｇＳＯ４嗜７Ｈ２０１，２
９／ ｔ 、 クエン酸ナトリウム１ｔ／ｌ、酵母−
’−キス０．２ ｆ／ｌ。
イシン複要求株、アデニン要求性変異株）をｒ Ｐｅｎ
ａｓｓａｙ Ｂｒｏｔｈ Ｊ （Ｄｉｆｃｏ 社製）＃
こ接種して３０ｒｒこてｌ晩振盪培養を行ない、培養培
地！（グル’：ＩＩ −：Ａ ５ ｆ ／ ｔ ｓ
（ＮＨ４）２５０４２ ？ ／ Ｌ １ＫＨ２ＰＯ４６
ｆ ／ Ｌ ｓ Ｋ２ＨＰＯ４１４ｆ ／ Ｌ、 Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ，ＯＱ、２ ｆ ／ Ｌ、 ９ エン酸ナ
トリウム１９／ｌ、＠母エキス２ｔ／１％Ｌ−アルギニ
７２５０ｍｇ／ＬＳＬ−−イノン５゜叢ｇ ／ ｔ １
アデニン５゛０講ｙ／ｌを含む）に＆挿し、３７Ｃ１
こて４時間振盪培養を行なった後、さらｔコ培養培地Ｉ
ｆ （！ｌ ルコ）−ス５ ｔ ／ Ｌ ｓ （Ｎ８４
％、５Ｏ４２ｔ／１１ＫＨ，ＰＯ４６ｆ／ｌ、 Ｋ、Ｈ
ＰＯ４１４ｔ ／ Ｌ １ＭｇＳＯ４嗜７Ｈ２０１，２
９／ ｔ 、 クエン酸ナトリウム１ｔ／ｌ、酵母−
’−キス０．２ ｆ／ｌ。
Ｌ−アルギニ７５０ｍｇ／ｌ、Ｌ、−ロインン５ｖｒｇ
／ を及びアデニン６０１１ｙ／ｌを含む）へ接種に
よって、いわゆるコンピテントな（ＤＮＡ取込能を有す
る）細胞を調製した（参考文献、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、＋ ８上、 ７４１（１９６１））。
／ を及びアデニン６０１１ｙ／ｌを含む）へ接種に
よって、いわゆるコンピテントな（ＤＮＡ取込能を有す
る）細胞を調製した（参考文献、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、＋ ８上、 ７４１（１９６１））。
このコンピテント細胞懸濁液ｔこ（２）で得たＤＮＡ溶
液を各々、別々會こ加えて３７ｔｒでさらに振盪培養を
行なって形質転換反応を完了させた。
液を各々、別々會こ加えて３７ｔｒでさらに振盪培養を
行なって形質転換反応を完了させた。
次にＡＪＩ＋８３２のＤＮＡｒこよる形質転換株ヲ含む
懸濁液をカナマイシン５μｆ／ｗｔｌ、ｆ ルコースＳ
ｆ／ｌ、 （ＮＨ４）２Ｓｏ、 ２ ｆ／１％ＫＨ
，ＰＯ４６ｙ／ｌ、’ Ｋ２ＨＰＯ，Ｉ ４ ｔ／ｌ
、 ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，２ｙ／ｚ、 クエン酸ナ
トリウム１ ｆ ／ ｔ％Ｌ−アルギニンｌ ＯＯｍｇ
／Ｌ、Ｌ−ロイシン５ｏｏｔｙ／Ｌ、７デニ７５０１１
９ ／ ｌ ｓ カナマイシン５μｆ／ｌｌ／、８−ア
ザｆ ７ 二：／ Ｉ ＯＯｐｆ／ｙｘｌ及び寒天２０
ｔ／ｌを含みｐＨ７，２に調節した最小培地ｕｌ（プ
レート）に塗沫し、３７ｃで培養した。又、ＡＪ１１８
３３のＤＮＡ１こよ、る形質転換を含む懸濁液を最小培
地■に更ｔこサルファグアニジン＋００ｒ／罰を添加し
た最小培地■（プレート）ｔこ塗沫し、３７ｃで培養し
た。培養３日後には最小培地用土ｔこ５個のコロニー、
最小培地■上１こ４個のコロニーが出現したのでこれを
釣菌し、各クローンをそれぞれ純粋に分離した。
懸濁液をカナマイシン５μｆ／ｗｔｌ、ｆ ルコースＳ
ｆ／ｌ、 （ＮＨ４）２Ｓｏ、 ２ ｆ／１％ＫＨ
，ＰＯ４６ｙ／ｌ、’ Ｋ２ＨＰＯ，Ｉ ４ ｔ／ｌ
、 ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，２ｙ／ｚ、 クエン酸ナ
トリウム１ ｆ ／ ｔ％Ｌ−アルギニンｌ ＯＯｍｇ
／Ｌ、Ｌ−ロイシン５ｏｏｔｙ／Ｌ、７デニ７５０１１
９ ／ ｌ ｓ カナマイシン５μｆ／ｌｌ／、８−ア
ザｆ ７ 二：／ Ｉ ＯＯｐｆ／ｙｘｌ及び寒天２０
ｔ／ｌを含みｐＨ７，２に調節した最小培地ｕｌ（プ
レート）に塗沫し、３７ｃで培養した。又、ＡＪ１１８
３３のＤＮＡ１こよ、る形質転換を含む懸濁液を最小培
地■に更ｔこサルファグアニジン＋００ｒ／罰を添加し
た最小培地■（プレート）ｔこ塗沫し、３７ｃで培養し
た。培養３日後には最小培地用土ｔこ５個のコロニー、
最小培地■上１こ４個のコロニーが出現したのでこれを
釣菌し、各クローンをそれぞれ純粋に分離した。
最小培地ｍから得られた形質転換株の性質は、いずれも
アルギニン要求性、ロイシン要求性、アデニン要求性、
８−７ザグアニンａ求性、カナマイシン耐性を示し、最
小培地■がら得られた形質転換株の性質は、いずれもア
ルギニ／要求性、ロイシン要求性、アデニン要求性、８
−７ザグアニン耐性、サルファグアニジン耐性、カナマ
イシン耐性を示した。
アルギニン要求性、ロイシン要求性、アデニン要求性、
８−７ザグアニンａ求性、カナマイシン耐性を示し、最
小培地■がら得られた形質転換株の性質は、いずれもア
ルギニ／要求性、ロイシン要求性、アデニン要求性、８
−７ザグアニン耐性、サルファグアニジン耐性、カナマ
イシン耐性を示した。
＋４１７Ｊンアナログ等の耐性領域を担うプラスミドｐ
ＵＢ、１１０の抽出 （３）で得られたクローンのうち、最小培地■上のクロ
ーンＡＪ、＋ １８３４（ＦＥＲＭ−Ｐら４嘘 ）、培
地■上のクローンＡＪ１１８３５（ＦＥＲＭ−Ｐも何ら
）を用いて、Ｃ，１，Ｋａ’ｄｏらの方法拳（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 上人５．１３６５（１９
８１））１こ基づいたＤＮＡ抽出法により各々別々に菌
体のＤＮＡを抽出し、アガロース電気泳動によってプラ
スミドＤＮＡと染色体ＤＮＡを分離し、プラスミドＤＮ
Ａ区分を各々分画採取し精製した。
ＵＢ、１１０の抽出 （３）で得られたクローンのうち、最小培地■上のクロ
ーンＡＪ、＋ １８３４（ＦＥＲＭ−Ｐら４嘘 ）、培
地■上のクローンＡＪ１１８３５（ＦＥＲＭ−Ｐも何ら
）を用いて、Ｃ，１，Ｋａ’ｄｏらの方法拳（Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 上人５．１３６５（１９
８１））１こ基づいたＤＮＡ抽出法により各々別々に菌
体のＤＮＡを抽出し、アガロース電気泳動によってプラ
スミドＤＮＡと染色体ＤＮＡを分離し、プラスミドＤＮ
Ａ区分を各々分画採取し精製した。
こうして得られた新規プラスミド、即ち菌株ＡＪ１１８
３４ から得られたプラスミドを（３）で述べたのと
同様の方法によって、原株のイノシフ生産菌ＡＪ１１８
３２ へ形質転換法ｔこより再導入し、カナマイシン
耐性株ＡＪ１１８３６（ＦＥＲＭ−Ｐ ら吠７ ）
を得た。又、ＡＪ１１８３５ から得られたプラスミ
ドをイノシン生産菌ＡＪＩ＋８３３へ形質転換法ｔこよ
り再導入し、カナマイシン耐性株ＡＪ１１８３７（ＦＥ
ＲＭ−Ｐ しは−ビ ）を得た。
３４ から得られたプラスミドを（３）で述べたのと
同様の方法によって、原株のイノシフ生産菌ＡＪ１１８
３２ へ形質転換法ｔこより再導入し、カナマイシン
耐性株ＡＪ１１８３６（ＦＥＲＭ−Ｐ ら吠７ ）
を得た。又、ＡＪ１１８３５ から得られたプラスミ
ドをイノシン生産菌ＡＪＩ＋８３３へ形質転換法ｔこよ
り再導入し、カナマイシン耐性株ＡＪ１１８３７（ＦＥ
ＲＭ−Ｐ しは−ビ ）を得た。
（５） イノシンの生産
第１表電こ示す菌株を各々を培養してイノシン生産能を
調べた。結果を第１表ｒこ示す。培養は５０〇−容肩付
フラスコ中にイノシン生産菌地（グルコース８０１７１
％ＮＨ４Ｃｌ １５ ｆ／ｌ。
調べた。結果を第１表ｒこ示す。培養は５０〇−容肩付
フラスコ中にイノシン生産菌地（グルコース８０１７１
％ＮＨ４Ｃｌ １５ ｆ／ｌ。
ＫＨ２ＰＯ４５ｆ／ｌ、ＭｇＳＯ４−７Ｈ，ＯＯ，４ｔ
／ｌ。
／ｌ。
Ｆｅ５０． ・ ７Ｈ，Ｏｌ Ｏ肩９／ｌ 、
Ｍｎ５Ｏ，−７Ｈ，Ｏｌ ０ＩＩ９／１％Ｃａ
Ｃｌ２−２Ｈ，０２ｆ／ｌ、アデニン２００ｖＩｖ／１
１大豆蛋白加水分解液４０ｍ１／ｌ。
Ｍｎ５Ｏ，−７Ｈ，Ｏｌ ０ＩＩ９／１％Ｃａ
Ｃｌ２−２Ｈ，０２ｆ／ｌ、アデニン２００ｖＩｖ／１
１大豆蛋白加水分解液４０ｍ１／ｌ。
アルギニン１００ｓ＋ｙ／を及びロイ・ノン１００ｗＩ
ｇ ／ ｔを含みｐＨ６，５１こＫＯＨで調製した。）
を２０１ずつ分注し、１１５Ｔ’で１０分間加圧殺菌し
た後、予め斜面培地で培養して得た各種菌体を接種後、
３４Ｃで７２時間振盪培養を行なった。
ｇ ／ ｔを含みｐＨ６，５１こＫＯＨで調製した。）
を２０１ずつ分注し、１１５Ｔ’で１０分間加圧殺菌し
た後、予め斜面培地で培養して得た各種菌体を接種後、
３４Ｃで７２時間振盪培養を行なった。
第 １ 表
ＡＪ１１８３１ ａｒｇ＋Ｉｅｕ＋ａｄｅ Ｏ，’
ｌｆ／ＬＡＪ１ｔ８３２ ａｒｇ＋ｌｅｕ＋ａｄｅ＋８
−ＡＧｒｌ、８ ／／ａｒｇ アルギニン要求性 ｌｅｕ ロイシン要求性 ａｄｅ アデニン要求性 ＫｒｒＩｒ カナマイノン耐性 ＳＧｒ サルファグアニジン耐性 ８−ＡＧｒ８−アザグアニン耐性 特許出願人 味の素株式会社
ｌｆ／ＬＡＪ１ｔ８３２ ａｒｇ＋ｌｅｕ＋ａｄｅ＋８
−ＡＧｒｌ、８ ／／ａｒｇ アルギニン要求性 ｌｅｕ ロイシン要求性 ａｄｅ アデニン要求性 ＫｒｒＩｒ カナマイノン耐性 ＳＧｒ サルファグアニジン耐性 ８−ＡＧｒ８−アザグアニン耐性 特許出願人 味の素株式会社
Claims (1)
- バチルス属のプリンアナログ耐性を有する変異株の染色
体遺伝子より得たプリンアナログ耐性１こ開学する遺伝
子領域が組み込まれているベクターをバチルス属のアデ
ニン要求性変異株−こ含有せしめたイノシン生産性微生
物を培養１１培地中１こ蓄積されたイノシンを採取する
ことを特徴とするイノシンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57041564A JPS58158197A (ja) | 1982-03-16 | 1982-03-16 | 発酵法によるイノシンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57041564A JPS58158197A (ja) | 1982-03-16 | 1982-03-16 | 発酵法によるイノシンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58158197A true JPS58158197A (ja) | 1983-09-20 |
| JPH0333318B2 JPH0333318B2 (ja) | 1991-05-16 |
Family
ID=12611931
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57041564A Granted JPS58158197A (ja) | 1982-03-16 | 1982-03-16 | 発酵法によるイノシンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58158197A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1447442A1 (en) * | 2003-02-17 | 2004-08-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Inosine production by means of Bacillus bacteria able to grow in the presence of 6-ethoxypurine |
| EP1700910A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing Bacillus and a method for producing purine-derived substance therewith |
| WO2007125783A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| WO2007125782A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| US8034767B2 (en) | 2006-12-22 | 2011-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus |
| US9012182B2 (en) | 2004-03-31 | 2015-04-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
-
1982
- 1982-03-16 JP JP57041564A patent/JPS58158197A/ja active Granted
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1447442A1 (en) * | 2003-02-17 | 2004-08-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Inosine production by means of Bacillus bacteria able to grow in the presence of 6-ethoxypurine |
| CN100374549C (zh) * | 2003-02-17 | 2008-03-12 | 味之素株式会社 | 属于芽孢杆菌属的肌苷生产细菌和生产肌苷的方法 |
| US9012182B2 (en) | 2004-03-31 | 2015-04-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
| EP1700910A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing Bacillus and a method for producing purine-derived substance therewith |
| US7326546B2 (en) | 2005-03-10 | 2008-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| US8298791B2 (en) | 2005-03-10 | 2012-10-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| WO2007125783A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| WO2007125782A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-11-08 | Ajinomoto Co., Inc. | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| US8236531B2 (en) | 2006-04-24 | 2012-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing a purine-derived substance |
| US8409563B2 (en) | 2006-04-24 | 2013-04-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing a purine-derived substance |
| US8034767B2 (en) | 2006-12-22 | 2011-10-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0333318B2 (ja) | 1991-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0142676B2 (ja) | ||
| US4407952A (en) | Method for producing L-phenylalanine by fermentation | |
| EP0030727B1 (en) | Method for producing l-valine by fermentation and method for producing a new microorganism of the genus escherichia | |
| FR2480307A1 (fr) | Procede pour la production de l-proline par fermentation | |
| FR2480306A1 (fr) | Procede pour la production de l-methionine par fermentation | |
| JPS63233798A (ja) | ５′−グアニル酸の製造法 | |
| FR2484448A1 (fr) | Procede pour produire de la l-arginine par fermentation | |
| DE3789833T2 (de) | Isoliertes Phenylalanindehydrogenase-Gen und Verfahren zur Herstellung von Phenylalanindeshydrogenase. | |
| JPS58158197A (ja) | 発酵法によるイノシンの製造法 | |
| KR101371954B1 (ko) | 신규 방법 | |
| JPS63273486A (ja) | １−（４−メトキシフェニル）−２−アミノプロパンの製法 | |
| JPS5931691A (ja) | 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 | |
| KR920001378B1 (ko) | Dna 및 그의 이용 | |
| JPS58175493A (ja) | 発酵法によるグアノシンの製造法 | |
| JPH022349A (ja) | ピリミジンアナログ耐性化遺伝子ｄｎａおよびその用途 | |
| JPH0459877B2 (ja) | ||
| DE60035781T2 (de) | Vektoren, zellen und verfahren zur herstellung von pyrimidindeoxyribonucleosiden | |
| JPS58216694A (ja) | 発酵法によるヒポキサンチンの製造法 | |
| JPH0511960B2 (ja) | ||
| ES2728970T3 (es) | Microorganismos que tienen una productividad de L-aminoácidos potenciada y proceso de producción de Laminoácidos en el que se usan los mismos | |
| JPH0638751A (ja) | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 | |
| JPS58134994A (ja) | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 | |
| JPS58158195A (ja) | 発酵法による５′−イノシン酸の製造法 | |
| JPS58175492A (ja) | 発酵法によるグアノシン−５′−モノリン酸の製造法 | |
| KR850001233B1 (ko) | 미생물에 의한 5'-이노신산의 제조방법 |