JPS58175492A - 発酵法によるグアノシン−５′−モノリン酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるグアノシン−５′−モノリン酸の製造法Info
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- JPS58175492A JPS58175492A JP57058439A JP5843982A JPS58175492A JP S58175492 A JPS58175492 A JP S58175492A JP 57058439 A JP57058439 A JP 57058439A JP 5843982 A JP5843982 A JP 5843982A JP S58175492 A JPS58175492 A JP S58175492A
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- resistance
- guanosine
- strain
- dna
- adenine
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法Ｖこよるグアノシン−５′−モノリン酸
（以下ｉ’ Ｇ Ｍ ’Ｐ ｊと記す）の製造法に関す
る。 ・ 発酵法１こよるＧＭＰの生産ｔこ関しては、アデニン要
求性、又はそれに各種のプリンアナログ配性を付学した
バチルス属の微生物（特公昭４２−６１５８）ブレビバ
クテリウム属の微生物（特公昭４２−６１５８）、エシ
ェリヒア属の微生物（特公昭４３−１１７６０）、アデ
ニン要求性およびデコイニン又はメチオニンスルフオキ
７ド耐性のバチルス属の微生物（特公昭５６−１２４３
８）等がＧＭＰを生産することが知られてし・る。
（以下ｉ’ Ｇ Ｍ ’Ｐ ｊと記す）の製造法に関す
る。 ・ 発酵法１こよるＧＭＰの生産ｔこ関しては、アデニン要
求性、又はそれに各種のプリンアナログ配性を付学した
バチルス属の微生物（特公昭４２−６１５８）ブレビバ
クテリウム属の微生物（特公昭４２−６１５８）、エシ
ェリヒア属の微生物（特公昭４３−１１７６０）、アデ
ニン要求性およびデコイニン又はメチオニンスルフオキ
７ド耐性のバチルス属の微生物（特公昭５６−１２４３
８）等がＧＭＰを生産することが知られてし・る。
本発明者らは上述のような従来のＧＭＰの製造法に対し
、プリンアナログ耐性又はデコイニノ耐性を有するバチ
ルス属の染色体より得たプリンアナログ耐性又はデコイ
ニン耐性１こ関ケする遺伝子領域が組み込まれているベ
クターをアデニン要求性のバチルス属の変異株に含有せ
しめたＧ Ｍ Ｐ ／、１産性バチルス属の微生物が著
量のＧＭＰを蓄積することを見（・出した。。
、プリンアナログ耐性又はデコイニノ耐性を有するバチ
ルス属の染色体より得たプリンアナログ耐性又はデコイ
ニン耐性１こ関ケする遺伝子領域が組み込まれているベ
クターをアデニン要求性のバチルス属の変異株に含有せ
しめたＧ Ｍ Ｐ ／、１産性バチルス属の微生物が著
量のＧＭＰを蓄積することを見（・出した。。
本発明はこの知見に基づいて完成されたものである。本
発明でいうプリンアナログとはバチルス属の微生物の増
殖を抑制し、かつその抑制がヒポキサ／チン、イノシン
、５−イノンン酸、グアニン、グアノシン、５゛−グア
ニル酸等を培地中に添加スれば全体的又は部分的ｔこ解
除されるようなものである。１列えば、８−アザグアニ
ン、８−アザヒボキサンチン、８−アザアデニン、２．
６−ジアミツブリン、６−メルカプトプリン、６−メル
カブトプリンリボンド、８−メルカプトグアノシフ等が
ある。
発明でいうプリンアナログとはバチルス属の微生物の増
殖を抑制し、かつその抑制がヒポキサ／チン、イノシン
、５−イノンン酸、グアニン、グアノシン、５゛−グア
ニル酸等を培地中に添加スれば全体的又は部分的ｔこ解
除されるようなものである。１列えば、８−アザグアニ
ン、８−アザヒボキサンチン、８−アザアデニン、２．
６−ジアミツブリン、６−メルカプトプリン、６−メル
カブトプリンリボンド、８−メルカプトグアノシフ等が
ある。
プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性ｔこ関ケ・する
染色体遺伝子の供学菌はバチルス属のプリンアナログ耐
性又はデコイニン耐性を有する変異株ならどのような菌
株でもよいが、耐性度のより高いものが望ましい。又、
アデニン要求性であってＧ Ｍ Ｐ生産能を有する菌株
を親株として、プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性
を有する変異株を誘導すれば、ＧＭＰ生産能がより高い
変異株を得ることができ、このような変異株を遺伝子供
ケ菌として用いればよりよい結果が得られる。又、知ら
れているようなＧＭＰ生産能を向上させるような性質、
例えばメチオニンスルホキノド耐性、サイコフラニン耐
性、サルファグアニジン耐性等を付加した菌株を誘導し
て用いれば、ＧＭＰの生産能がより高い菌株を得ること
ができ、このような菌株を染色体遺伝子供り一菌として
用いれば、より好ましい結果が得られる。
染色体遺伝子の供学菌はバチルス属のプリンアナログ耐
性又はデコイニン耐性を有する変異株ならどのような菌
株でもよいが、耐性度のより高いものが望ましい。又、
アデニン要求性であってＧ Ｍ Ｐ生産能を有する菌株
を親株として、プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性
を有する変異株を誘導すれば、ＧＭＰ生産能がより高い
変異株を得ることができ、このような変異株を遺伝子供
ケ菌として用いればよりよい結果が得られる。又、知ら
れているようなＧＭＰ生産能を向上させるような性質、
例えばメチオニンスルホキノド耐性、サイコフラニン耐
性、サルファグアニジン耐性等を付加した菌株を誘導し
て用いれば、ＧＭＰの生産能がより高い菌株を得ること
ができ、このような菌株を染色体遺伝子供り一菌として
用いれば、より好ましい結果が得られる。
遺伝子供学菌より染色体ＤＮＡを抽出する方法は、例え
ばＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ ８９ ＋ ｌ
０６５（＋９６５）ｔこ記載されているような通常の方
法？こより行うことができる。
ばＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ ８９ ＋ ｌ
０６５（＋９６５）ｔこ記載されているような通常の方
法？こより行うことができる。
ベクターＤＮＡとしては、バチルス属の菌体中で複製す
るプラスミド又はファージならば、どのようなものでも
よい。例えばスタフィロコッカス属微生物由来のｐＴＩ
２７．ｐ、ｃ１９４ 、ｐＣ２２１゜ｐＣ２２３、ｐＵ
Ｂｌ １２ （以上、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
るプラスミド又はファージならば、どのようなものでも
よい。例えばスタフィロコッカス属微生物由来のｐＴＩ
２７．ｐ、ｃ１９４ 、ｐＣ２２１゜ｐＣ２２３、ｐＵ
Ｂｌ １２ （以上、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、 Ｓ、 Ａ、＋ ユｊ、
１６８（［１９７７）参照）、ｐ ＵＢ １１０（’
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ ＋ ３４ ＋３１８
（＋９７８）参照）１．ｐ”ｒｐ ４ ； ｐＴｐｓ（
以上、Ｍｉｃｒｏｂ’１ｏｌＬｅｔｔｅｒｓ＋ ５．
５５（＋９７８）参照）、枯草菌由来のｐｔ、ｓ
＋ ５ 、 ｐＬＳ２８（以−に、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、＋ ＋ ３１ ＋ ６９９（＋ ９７７
） 参照）、ｐ Ｌ Ｓ １３（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏ１１１２９、１４８７（１９７７）参照）、ｐＰＬ
ｌ。
１６８（［１９７７）参照）、ｐ ＵＢ １１０（’
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋ ＋ ３４ ＋３１８
（＋９７８）参照）１．ｐ”ｒｐ ４ ； ｐＴｐｓ（
以上、Ｍｉｃｒｏｂ’１ｏｌＬｅｔｔｅｒｓ＋ ５．
５５（＋９７８）参照）、枯草菌由来のｐｔ、ｓ
＋ ５ 、 ｐＬＳ２８（以−に、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、＋ ＋ ３１ ＋ ６９９（＋ ９７７
） 参照）、ｐ Ｌ Ｓ １３（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏ１１１２９、１４８７（１９７７）参照）、ｐＰＬ
ｌ。
ｐＰＬ２（以、に、Ｊ、 Ｂａｃ＋ｅｒｉｏｌ＋ ＋
２４ ＋４８４（１９７５）参照）、テンペレートフ
ァージとしても知られるｒｈｏ Ｉ Ｉ （Ｇｅｎｅ、
＋ ５ ＋ ８９（＋９７９））、’ｐｈｉ １０
５（Ｇｅｎｅ、、５．８７（，１９７９）’）、５ＰＯ
２（Ｇｅｎｅ、、７． ５１（１９７，９） ）等があ
る。更［こ上記プラスミドをもとにして構築した複合プ
ラスミドも当然のことながらベクターＤＮＡとして利用
できうる。
２４ ＋４８４（１９７５）参照）、テンペレートフ
ァージとしても知られるｒｈｏ Ｉ Ｉ （Ｇｅｎｅ、
＋ ５ ＋ ８９（＋９７９））、’ｐｈｉ １０
５（Ｇｅｎｅ、、５．８７（，１９７９）’）、５ＰＯ
２（Ｇｅｎｅ、、７． ５１（１９７，９） ）等があ
る。更［こ上記プラスミドをもとにして構築した複合プ
ラスミドも当然のことながらベクターＤＮＡとして利用
できうる。
染色体ＤＮＡ及びベクターＤＮＡはそれぞれ制限エンド
ヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれのベクターｔ
こは適した制限エンドヌクレアーゼがあるが、それは上
記ベクターについての記載がある文献等に示されである
。染色体ＤＮＡｔこりぃては制限エンドヌクレアーゼ１
こよる切断が部分的に行なわれるように反応条件を調節
すれば多くの種類の制限酵素が利用できる。
ヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれのベクターｔ
こは適した制限エンドヌクレアーゼがあるが、それは上
記ベクターについての記載がある文献等に示されである
。染色体ＤＮＡｔこりぃては制限エンドヌクレアーゼ１
こよる切断が部分的に行なわれるように反応条件を調節
すれば多くの種類の制限酵素が利用できる。
かくして得られた染色体ＤＮＡ断片と、切断されたベク
ターＤＮＡとを連結せしめる方法は、リガーゼを用いる
通常の方法が使用できる。一方、ターミナルトランスフ
ェラーゼを用いて染色体ＤＮＡ断片と開裂したベクター
ＤＮＡとにデオキシアゾニール酸とデオキソシチジル酸
をそれぞれ付加し、混合した後アニーリングして連結せ
しめる方法も利用し得る。
ターＤＮＡとを連結せしめる方法は、リガーゼを用いる
通常の方法が使用できる。一方、ターミナルトランスフ
ェラーゼを用いて染色体ＤＮＡ断片と開裂したベクター
ＤＮＡとにデオキシアゾニール酸とデオキソシチジル酸
をそれぞれ付加し、混合した後アニーリングして連結せ
しめる方法も利用し得る。
かくして得られた染色体ＤＮＡ断片を組み込んだ組換え
ベクターＤＮＡの受容菌はバチルス属のアデニン要求性
を有する変異株ならどのようなものでもよいが、プリン
アナログ耐性又はデフィニン耐性を有し−ていない菌株
を用いれば、形質転換株を選択する際ｔこ好都合である
。更に組換えＤＮＡ受容菌としてプリンアナログ耐性又
はデコイニン耐性を有し、より高いＧＭＰ生産能を有す
る菌株を用いれば、よりＧＭＰ生産性の高い形質転換株
ヲ得ルコトカできる。受容菌としては当然Ｇ Ｍ Ｐ分
解能がより低いものを用いなければならない。
ベクターＤＮＡの受容菌はバチルス属のアデニン要求性
を有する変異株ならどのようなものでもよいが、プリン
アナログ耐性又はデフィニン耐性を有し−ていない菌株
を用いれば、形質転換株を選択する際ｔこ好都合である
。更に組換えＤＮＡ受容菌としてプリンアナログ耐性又
はデコイニン耐性を有し、より高いＧＭＰ生産能を有す
る菌株を用いれば、よりＧＭＰ生産性の高い形質転換株
ヲ得ルコトカできる。受容菌としては当然Ｇ Ｍ Ｐ分
解能がより低いものを用いなければならない。
染色体ＤＮＡとベクターの混合物をＤＮＡ受容菌に導入
する１こけ例えばＭａｌｅｃ、 Ｇｅｎｅ、 Ｇｅｎｅ
＋、＋＋ａｓ、 ｚ＋（＋９７９）４こ記載されてい
るような通常の形質転換法が利用できる。
する１こけ例えばＭａｌｅｃ、 Ｇｅｎｅ、 Ｇｅｎｅ
＋、＋＋ａｓ、 ｚ＋（＋９７９）４こ記載されてい
るような通常の形質転換法が利用できる。
ＧＮＰ生産能を有し、プリンアナログ耐性又はデコイニ
ン耐性ｔこ関グ・する遺伝子領域が組み込まれているベ
クターを含有する形質転換株を選択するには、例えばベ
クター受容菌としてアデニン要求性変異株を用いて形質
転換し、プリンアナログ又番ｊデコイニンを含有する培
地で生育してくる菌株を選択すればよい。又、ベクター
ＤＮＡ上の抗生物質耐性等の性質を併せもつ菌株を選択
できるよう入培地を用いればより選別が容易である。
ン耐性ｔこ関グ・する遺伝子領域が組み込まれているベ
クターを含有する形質転換株を選択するには、例えばベ
クター受容菌としてアデニン要求性変異株を用いて形質
転換し、プリンアナログ又番ｊデコイニンを含有する培
地で生育してくる菌株を選択すればよい。又、ベクター
ＤＮＡ上の抗生物質耐性等の性質を併せもつ菌株を選択
できるよう入培地を用いればより選別が容易である。
このよう１こして、一旦選別されたプリンアナログ耐性
等１こ関ケする遺、伝子領域が組み込まれている組換え
ベクターＤＮＡは、形質転換株より抽出かくして得られ
たＧＭＰ生産菌を培養してＧＭＰを製造する方法は従来
知られている方法と特に変らない。
等１こ関ケする遺、伝子領域が組み込まれている組換え
ベクターＤＮＡは、形質転換株より抽出かくして得られ
たＧＭＰ生産菌を培養してＧＭＰを製造する方法は従来
知られている方法と特に変らない。
即ち、このような微生物を培養する培地は、炭素源、窒
素源、無機塩類、アデニンおよび必要ならば更にその他
の微量栄養素を含有する通常の液体培地である。炭素源
としては、グルコース、糖蜜、デンプン加水分解液など
の炭水化物が望ましい。窒素源としては硫安、硝安、塩
安、リン安等のアンモニウム塩、硝安等の硝酸塩、尿素
、アンモニアガス等が使用できる。また栄養要求物質と
してのアデニンはアデニン、アデニン鉱酸塩、アデノシ
ン、アデニル酸等のいずれも使用可能である。また必要
に応じてビタミン類、アミノ酸、アデニン以外の核酸塩
基などの微量栄養素を添加すれば、ＧＭＰ蓄積量を増す
ことができる場合が多い。
素源、無機塩類、アデニンおよび必要ならば更にその他
の微量栄養素を含有する通常の液体培地である。炭素源
としては、グルコース、糖蜜、デンプン加水分解液など
の炭水化物が望ましい。窒素源としては硫安、硝安、塩
安、リン安等のアンモニウム塩、硝安等の硝酸塩、尿素
、アンモニアガス等が使用できる。また栄養要求物質と
してのアデニンはアデニン、アデニン鉱酸塩、アデノシ
ン、アデニル酸等のいずれも使用可能である。また必要
に応じてビタミン類、アミノ酸、アデニン以外の核酸塩
基などの微量栄養素を添加すれば、ＧＭＰ蓄積量を増す
ことができる場合が多い。
培養方法は好気的条件がよく、また、培養温度は２７な
いし３８℃の範囲が好適であて〕。場合によっては培養
途中にて培養温度を変更させてもよい。培養開始時−お
よび培養中に培養液のｐＨを５．０ないし９，０１こ調
節し培養するのが望ましい５゜ｐ Ｉ４の調整ｔこは無
機酸、有機酸あるいはアルカリさらに尿素、炭酸カルシ
ウム、アンモニア水、アンモニアガスなどを使用するこ
とが出来る。かくして２ないし５日間培養すれば著量の
Ｇ〜１Ｐが培地中１こ蓄積される。
いし３８℃の範囲が好適であて〕。場合によっては培養
途中にて培養温度を変更させてもよい。培養開始時−お
よび培養中に培養液のｐＨを５．０ないし９，０１こ調
節し培養するのが望ましい５゜ｐ Ｉ４の調整ｔこは無
機酸、有機酸あるいはアルカリさらに尿素、炭酸カルシ
ウム、アンモニア水、アンモニアガスなどを使用するこ
とが出来る。かくして２ないし５日間培養すれば著量の
Ｇ〜１Ｐが培地中１こ蓄積される。
培養液からＧＭＰを採取する方法は、イオン交換樹脂を
用いる等通常の方法でよい。
用いる等通常の方法でよい。
実施ｉ列
バチルス・ズブチリスＡＪ１．１７１１（アルギニン、
ロイシン要求性＞からＮ−メチル−Ｎ”−二トローニト
ロソグアニン変異処理（ｓ ｏ ｏ ｐｙ／ｍｅのＮ−
メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニシンにＯＣｌ
こて３０分間１０’コ／−の菌体な接触１１８５３ （
Ｆ ＥＲ，Ｍ−Ｐ ＠’Ｆ３４− ’） （アルギニ
ン要求ｔ′１、ロイシン要求性、アデニン要求性）を得
た。
ロイシン要求性＞からＮ−メチル−Ｎ”−二トローニト
ロソグアニン変異処理（ｓ ｏ ｏ ｐｙ／ｍｅのＮ−
メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニシンにＯＣｌ
こて３０分間１０’コ／−の菌体な接触１１８５３ （
Ｆ ＥＲ，Ｍ−Ｐ ＠’Ｆ３４− ’） （アルギニ
ン要求ｔ′１、ロイシン要求性、アデニン要求性）を得
た。
さら１ここのアデニン要求株から同様の変異処理にヨッ
テ誘ｉｊＪ ｌ−タａ Ｍ ｌ） 生産菌ＡＪ−１１８
５４（１・’ Ｉ＞ ＲＭ−Ｐ ら１世 ）（アルギ
ニン要求性、ロイシン要求性、アデニン要求性、８−ア
ザグアニン耐性）、ＡＪＩ！８５５（ＦＥＲＭ−Ｐ
）（アルギニン要求性、ロイシン要求性、アデニ
ン要求性、デコイニン耐性）、ＡＪＩ＋８５６ （ア
ルギニン要求性、ロイシン要求性、アデニン要求性、８
−アザグアニン耐性、デコイニン耐性）を得た。
テ誘ｉｊＪ ｌ−タａ Ｍ ｌ） 生産菌ＡＪ−１１８
５４（１・’ Ｉ＞ ＲＭ−Ｐ ら１世 ）（アルギ
ニン要求性、ロイシン要求性、アデニン要求性、８−ア
ザグアニン耐性）、ＡＪＩ！８５５（ＦＥＲＭ−Ｐ
）（アルギニン要求性、ロイシン要求性、アデニ
ン要求性、デコイニン耐性）、ＡＪＩ＋８５６ （ア
ルギニン要求性、ロイシン要求性、アデニン要求性、８
−アザグアニン耐性、デコイニン耐性）を得た。
（１） 染色体ＤＮＡの調製
ＡＪ１１８５４、ＡＪＩ！８５６ 及びＡＪ＋１８５
６ を各々１ｔの［Ｂａｃ＋ｏ −Ｐｅｎａｓｓａｙ
Ｂｒｏｔｈ ｊ （Ｄｉ ｆｃｏ社製）中で３０Ｃ１約
２時間振盪培養を行い、対数増殖期の菌体を集菌後、通
常のＤＮＡ抽出法（、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋
８９’＋１０６５（＋９６５））により染色体ＤＮＡ
を抽出、精製し、最終ＡＪ］１８５４から３．ＩＩＩｙ
。
６ を各々１ｔの［Ｂａｃ＋ｏ −Ｐｅｎａｓｓａｙ
Ｂｒｏｔｈ ｊ （Ｄｉ ｆｃｏ社製）中で３０Ｃ１約
２時間振盪培養を行い、対数増殖期の菌体を集菌後、通
常のＤＮＡ抽出法（、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋
８９’＋１０６５（＋９６５））により染色体ＤＮＡ
を抽出、精製し、最終ＡＪ］１８５４から３．ＩＩＩｙ
。
八Ｊ１１８５５から２．６■、八Ｊ １１８５６から３
゜６窮ｇを得た。
゜６窮ｇを得た。
１２） 染色体ＤＮＡ断片のベクターへの捜入プリン
アナｐグ耐性又はデコイニン耐性を支配する遺伝子領域
をクローニングするため、そのベクターとして自律増殖
性のプラスミドｐＵＢｌｌｏ （カナマインン耐性、
ネオマイ７）耐性を発現する）を用いた。ｉｌｌで得ら
れた染色体ｒ）ＮＡを各々５７＋ｆずつとプラスミｌ’
ｐ ［、Ｉ Ｂ ］ １０ ５７．＋ ｆずつをそれぞ
れ制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ＋を３７ Ｃ１こて
６０分作用させてＤＮＡ鎖を切断した。６５Ｃで１０分
間熱処理後、各両反応液を混合し、ＡＴＰおよびジチオ
スライトール存在下、Ｔ、ファージ由来の１） ＮΔリ
ガーゼにて１ｏｒｔこて２４時間、ＤＮＡ鎖の連絡反応
を行なった。
アナｐグ耐性又はデコイニン耐性を支配する遺伝子領域
をクローニングするため、そのベクターとして自律増殖
性のプラスミドｐＵＢｌｌｏ （カナマインン耐性、
ネオマイ７）耐性を発現する）を用いた。ｉｌｌで得ら
れた染色体ｒ）ＮＡを各々５７＋ｆずつとプラスミｌ’
ｐ ［、Ｉ Ｂ ］ １０ ５７．＋ ｆずつをそれぞ
れ制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ＋を３７ Ｃ１こて
６０分作用させてＤＮＡ鎖を切断した。６５Ｃで１０分
間熱処理後、各両反応液を混合し、ＡＴＰおよびジチオ
スライトール存在下、Ｔ、ファージ由来の１） ＮΔリ
ガーゼにて１ｏｒｔこて２４時間、ＤＮＡ鎖の連絡反応
を行なった。
（３） 組換えプラスミドＤＮＡｔこよる形質転換バ
チルス・ズブチリスＡ Ｊ ｌ １８５３ ヲｌ Ｐｅ
ｎａｓｓａｙ −Ｉうｒｏｔｈ Ｊ （Ｄｉｆｃｏ社
製）ｔこ接種して３０ｒで１晩振とう培養を行ない、第
■培ｊ１．を培地（グルコース５ ｔｌｌ、 （ＮＨ
４）、５ｏ４２タ ／ｌ、 ＫＨ２ＰＯ４６？／ｌ
、 Ｋ、ＨＰＯ４１４Ｖ 、／ ｔ 、 ＭｇＳＯ
４・７Ｈ，Ｏ’ ０．２ ｔｌｌ、 クエン酸すトリ
ウム１ｙ／１１酵母エキス２１／ｌ、Ｌ。
チルス・ズブチリスＡ Ｊ ｌ １８５３ ヲｌ Ｐｅ
ｎａｓｓａｙ −Ｉうｒｏｔｈ Ｊ （Ｄｉｆｃｏ社
製）ｔこ接種して３０ｒで１晩振とう培養を行ない、第
■培ｊ１．を培地（グルコース５ ｔｌｌ、 （ＮＨ
４）、５ｏ４２タ ／ｌ、 ＫＨ２ＰＯ４６？／ｌ
、 Ｋ、ＨＰＯ４１４Ｖ 、／ ｔ 、 ＭｇＳＯ
４・７Ｈ，Ｏ’ ０．２ ｔｌｌ、 クエン酸すトリ
ウム１ｙ／１１酵母エキス２１／ｌ、Ｌ。
−アルギニン２５０扉ｇ／１１Ｌ−ロイ／ン５０ｍｑ
／ ｌｓアデニン５０Ｉｇ／ｌを含む）１こ接種し、３
７Ｃにて４時間振盪培養を？Ｊなった後、さらｔこ第１
培養培地（グルコース５ｙ／ｌ。
／ ｌｓアデニン５０Ｉｇ／ｌを含む）１こ接種し、３
７Ｃにて４時間振盪培養を？Ｊなった後、さらｔこ第１
培養培地（グルコース５ｙ／ｌ。
（ＮＨ，）、Ｓｏ、 ２ ｒ／ｚＳＫＨ２Ｐ０． ６
ｓ＋／ｚ。
ｓ＋／ｚ。
Ｋ２ＨＰＯ４１４９／ ｔｌＭｇＳＯ，・７Ｈ，ＩＯ＋
、２ ｙ ／１１クエン酸ナトリウム１ｙ７ｔ、 酵母
エキスｏ、２ｙ／ｌ、Ｌ−アルダ−’−’／ ！’ｌ
０１１９／ Ｚ ｓ ｌ−一ロインン５ ｆＩＩ（／
／ ｌ 、アゾ＝ンｓｏｍｇ／／−を含む）へ接種し、
３７Ｃにて１．．５時間振盪培養を行なうこと１こよっ
て、いわゆるコンピテントな（ＤＮＡ取込能を有する）
細胞を調製した（参与文献 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
＋ ８上＋ ７４１（＋９６１））。 このフンピ
テント細胞懸濁液に（２）で得たＤＮＡ溶液を各々、別
々ｅこ加えて３７ｒでさらに２時間振盪培養を行なって
形質転換反応を完了させた。
、２ ｙ ／１１クエン酸ナトリウム１ｙ７ｔ、 酵母
エキスｏ、２ｙ／ｌ、Ｌ−アルダ−’−’／ ！’ｌ
０１１９／ Ｚ ｓ ｌ−一ロインン５ ｆＩＩ（／
／ ｌ 、アゾ＝ンｓｏｍｇ／／−を含む）へ接種し、
３７Ｃにて１．．５時間振盪培養を行なうこと１こよっ
て、いわゆるコンピテントな（ＤＮＡ取込能を有する）
細胞を調製した（参与文献 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
＋ ８上＋ ７４１（＋９６１））。 このフンピ
テント細胞懸濁液に（２）で得たＤＮＡ溶液を各々、別
々ｅこ加えて３７ｒでさらに２時間振盪培養を行なって
形質転換反応を完了させた。
次に菌株ΔＪ１１８５３のＤＮＡ形質転換株を含む懸濁
液をカナマイシン５１ｔ９／ｒｙｅ１８−アザグアニン
ｌ ＯＯ１ｔｔ／−を含有する最小培地（最小培地Ｉｌ
ｌ、カナマイシン５１ｔｔ／ｍｅ及びデコイ二ン＋００
０／ｊｆ／−を含有する最小培地（最小ｔｉ’７地ＩＶ
）、カナマイジン５μｖフ／イ及び８−ラ′ザグ７ ＝
ｖ ｌ Ｏ０１ｔ？／ｒｓｅ及びデコイ＝７１ＯＯＯ
ｐ？／ｗｅを含有する最小培地（最小培地Ｖ）のプレー
１− 、、Ｉｘ ｔこ塗抹し３７ｒで培養した。（最小
項Ｊｕｌはグルコース５ ｆ ７１１（ＮＨ４）、、
５ｏ４２ ？、／１１＋ｏ＋２ｐｏ、 ６ ｔｌｌ
、 Ｋ、ＨＰＯ４１４ｔｌｌ。
液をカナマイシン５１ｔ９／ｒｙｅ１８−アザグアニン
ｌ ＯＯ１ｔｔ／−を含有する最小培地（最小培地Ｉｌ
ｌ、カナマイシン５１ｔｔ／ｍｅ及びデコイ二ン＋００
０／ｊｆ／−を含有する最小培地（最小ｔｉ’７地ＩＶ
）、カナマイジン５μｖフ／イ及び８−ラ′ザグ７ ＝
ｖ ｌ Ｏ０１ｔ？／ｒｓｅ及びデコイ＝７１ＯＯＯ
ｐ？／ｗｅを含有する最小培地（最小培地Ｖ）のプレー
１− 、、Ｉｘ ｔこ塗抹し３７ｒで培養した。（最小
項Ｊｕｌはグルコース５ ｆ ７１１（ＮＨ４）、、
５ｏ４２ ？、／１１＋ｏ＋２ｐｏ、 ６ ｔｌｌ
、 Ｋ、ＨＰＯ４１４ｔｌｌ。
Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，２ｒ ／ ｔ 、 クエン
酸ナトリウＡ Ｉ ？／１１Ｌ−フルギ＝ンｌｏ ｏ＊
ｇ−／ｌ、 ■−−ロイ７ンｌ ＯＯ＊Ｓｌ／ Ｌ、ア
デニ１５０＃１ｇ／′を及び寒天２ Ｏｆ？ ／ ｔ、
ｐ’Ｈ７，２）の組成な有するものである。）培養３
日後には１−記最小培地Ｉｌｌ ｌ ＋コロ 個のコロ
ニーが、最小培地〜ヒに５個のコロ＝ −が、！小培地
ｙ上に３個のコロニーそれぞれ出現したので、これらを
釣菌し各クローンをそれぞれ純粋に分離した。
酸ナトリウＡ Ｉ ？／１１Ｌ−フルギ＝ンｌｏ ｏ＊
ｇ−／ｌ、 ■−−ロイ７ンｌ ＯＯ＊Ｓｌ／ Ｌ、ア
デニ１５０＃１ｇ／′を及び寒天２ Ｏｆ？ ／ ｔ、
ｐ’Ｈ７，２）の組成な有するものである。）培養３
日後には１−記最小培地Ｉｌｌ ｌ ＋コロ 個のコロ
ニーが、最小培地〜ヒに５個のコロ＝ −が、！小培地
ｙ上に３個のコロニーそれぞれ出現したので、これらを
釣菌し各クローンをそれぞれ純粋に分離した。
ｔｌｌられた形質転換株の性質はいずれもアルギニン要
求性、ロインン要求性、アデニン要求性、カナマインン
耐性を有し、かつ最小培地ｍからｆＩＩらねた形質転換
株は８−アザグアニン耐性、最小培地■から得られた形
質転換株はデフィニン耐性、最小培地■から得られた形
質転換株は８−７ ｆ グアニン耐性及びデコイニン耐
性の７１τｊをそわぞれ１）１せもつ菌株で１１ちった
。
求性、ロインン要求性、アデニン要求性、カナマインン
耐性を有し、かつ最小培地ｍからｆＩＩらねた形質転換
株は８−アザグアニン耐性、最小培地■から得られた形
質転換株はデフィニン耐性、最小培地■から得られた形
質転換株は８−７ ｆ グアニン耐性及びデコイニン耐
性の７１τｊをそわぞれ１）１せもつ菌株で１１ちった
。
（４） 組換えプラスミドＤＮＡの抽出１．３）で得
られたクローンのうｔ）、最小培地■１−のクローンＡ
Ｊ１１８５７（ＦＦＲＭ−Ｐら４？？）及び鮫小１’ｉ
’＜地■」二のクロ］ンＡＪＩ＋８５８（ＦＥＲＭ−Ｐ
ら４計９ ）、培地■ｊＺのクローンＡＪＩ＋８５
９を用いてＣ，１，ｋａｄｏ らの方法（Ｊ、 Ｂａ
’ｃ！ｅｒｉｏ１．＋ ユ４５ 、 ＋ ３６ｓ（＋
９ｓ＋ｌ）に尽づいたＴ）ＮＡ抽出法１こより各々別々
１こ菌体ＤＮＡを抽出し、アガロース電気泳動１こよっ
てブラスミｌ’ Ｄ Ｎ Ａと染色体ＤＮＡを分離し、
プラスミドＤＮＡ区分を各々分画、採取し、精製ＡＪ＋
１８５５、ＡＪ１１８５６へ形質転換ａ：ｆこより再導
入し、各々の菌株に対応するカナマイ／ン耐性株ＡＪ＋
１８６０、ＡＪｌ＋８６１（ＦＥＲＭ−Ｐ いりＯ）及
びＡＪ ＋ １８７０（ＦＥＲＭ−Ｐ６ｒｏｌ ）を
得た。
られたクローンのうｔ）、最小培地■１−のクローンＡ
Ｊ１１８５７（ＦＦＲＭ−Ｐら４？？）及び鮫小１’ｉ
’＜地■」二のクロ］ンＡＪＩ＋８５８（ＦＥＲＭ−Ｐ
ら４計９ ）、培地■ｊＺのクローンＡＪＩ＋８５
９を用いてＣ，１，ｋａｄｏ らの方法（Ｊ、 Ｂａ
’ｃ！ｅｒｉｏ１．＋ ユ４５ 、 ＋ ３６ｓ（＋
９ｓ＋ｌ）に尽づいたＴ）ＮＡ抽出法１こより各々別々
１こ菌体ＤＮＡを抽出し、アガロース電気泳動１こよっ
てブラスミｌ’ Ｄ Ｎ Ａと染色体ＤＮＡを分離し、
プラスミドＤＮＡ区分を各々分画、採取し、精製ＡＪ＋
１８５５、ＡＪ１１８５６へ形質転換ａ：ｆこより再導
入し、各々の菌株に対応するカナマイ／ン耐性株ＡＪ＋
１８６０、ＡＪｌ＋８６１（ＦＥＲＭ−Ｐ いりＯ）及
びＡＪ ＋ １８７０（ＦＥＲＭ−Ｐ６ｒｏｌ ）を
得た。
＋５１０ＭＰの生ｐｉ’、ｊ：Ａ Ｊ Ｉ １８５３、
Ａ Ｊ Ｉ ＋ ８５４、ＡＪ＋１８５５ 、 ＡＪ１
１８５６、 ＡＪ１１８５７ 、Ａ 、Ｉ ｌ ｌ Ｂ
５８ 、八Ｊ１１８５９、ＡＪ１１８６０、ＡＪＩ］
８６１、ＡＪ１１８７０ を培養した結果を第１表ｔ
こ示す。培養方法は５００ｍＪ容肩（−１フラスコ？こ
Ｇ Ｍ Ｐ生産培地（グルコース８０２／ｌ、 Ｎｉ１
４ＣＩ ＋ ５ ？／ｌ、 Ｋ１．、ＰＯ４１０ｆ／
Ｌ。
Ａ Ｊ Ｉ ＋ ８５４、ＡＪ＋１８５５ 、 ＡＪ１
１８５６、 ＡＪ１１８５７ 、Ａ 、Ｉ ｌ ｌ Ｂ
５８ 、八Ｊ１１８５９、ＡＪ１１８６０、ＡＪＩ］
８６１、ＡＪ１１８７０ を培養した結果を第１表ｔ
こ示す。培養方法は５００ｍＪ容肩（−１フラスコ？こ
Ｇ Ｍ Ｐ生産培地（グルコース８０２／ｌ、 Ｎｉ１
４ＣＩ ＋ ５ ？／ｌ、 Ｋ１．、ＰＯ４１０ｆ／
Ｌ。
Ｋ２Ｏ［”Ｏ，、＋ ４ ？ ／ ｔ 、 〜１ｇ５Ｏ
４−７Ｈ２０５９／ ｌ 。
４−７Ｈ２０５９／ ｌ 。
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１０ｍｙ／ｌ、 ＭｎＳＯ４・７
１１２０１０ ｍｇ／ ｌ 、 ＣａＣｌ２・２Ｈ２０
２？ ／′ｌ、アデニノ２００嘘、／１１大豆蛋白加水
分解液、ｉｏ＊ｇ７１１アルギニン１００■／１．ロイ
シン＋００ｍｑ／を及びＩ、−グルタミン酸１ｏｙ７ｔ
を含みｐＨ６，５にＫＯ！（で調製した。）を２０肩ｌ
ずつ分注し、１１５Ｃで１０分間加圧殺菌した後、ｒ・
め斜面培地で培養して得た各種菌体を接種後、３４ｒで
３０間振盪培養を行った。
１１２０１０ ｍｇ／ ｌ 、 ＣａＣｌ２・２Ｈ２０
２？ ／′ｌ、アデニノ２００嘘、／１１大豆蛋白加水
分解液、ｉｏ＊ｇ７１１アルギニン１００■／１．ロイ
シン＋００ｍｑ／を及びＩ、−グルタミン酸１ｏｙ７ｔ
を含みｐＨ６，５にＫＯ！（で調製した。）を２０肩ｌ
ずつ分注し、１１５Ｃで１０分間加圧殺菌した後、ｒ・
め斜面培地で培養して得た各種菌体を接種後、３４ｒで
３０間振盪培養を行った。
第 １ 表
Claims (1)
- バチルス属のプリンアナログ耐性又はデコイニン耐性を
有する変異株の染色体遺伝子より得たプリンアナログ耐
性又はデコイニン耐性ｔこ関り、する遺伝子領域が組み
込まれているベクターな／バチルス属のアデニン要求性
変異株を二含有せジメタグアノシン−５１−モノリン酸
生産性微生物を培養し、培地中に蓄積されたグアノ・ノ
ン−５°−モノリン酸を採取することを特徴とするグア
ノシン−５′−モノリン酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57058439A JPS58175492A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 発酵法によるグアノシン−５′−モノリン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57058439A JPS58175492A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 発酵法によるグアノシン−５′−モノリン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58175492A true JPS58175492A (ja) | 1983-10-14 |
| JPH0422557B2 JPH0422557B2 (ja) | 1992-04-17 |
Family
ID=13084425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57058439A Granted JPS58175492A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 発酵法によるグアノシン−５′−モノリン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58175492A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0185092A1 (en) * | 1984-03-12 | 1986-06-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for preparing 5'-guanylic acid |
-
1982
- 1982-04-08 JP JP57058439A patent/JPS58175492A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0185092A1 (en) * | 1984-03-12 | 1986-06-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for preparing 5'-guanylic acid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0422557B2 (ja) | 1992-04-17 |
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