JPS6368091A - アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はエシェリシア属菌種のアセチルグルタミン酸キ
ナーゼ（以下ＡＧＫと略す二大腸菌に１２株のａｒｇＢ
遺伝子に対応）、Ｎ−アセチル−γ−グルタミルリン酸
レダクターゼ（以下ＡＧＰＲと略す：ａｒｇＣ遺伝子に
対応）、アルギニノスクシナーゼ（以下Ａｓと略す：ａ
ｒｇＨ遺伝子に対応）の合成に関与する遺伝情報を担う
ＤＮＡ断片を含有する組換え体ＤＮＡ、または該ＤＮＡ
断片とアルギニノコハク酸シンテターゼ（以下ＡＳＳと
略す：ａｒｇＧ遺伝子に対応）の合成に関与する遺伝情
報を担うＤＮＡ断片とを含有する組換え体ＤＮＡを保有
するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する微生物を培地に培養し、培養物中に生成蓄積し
たし一アルギニン。

Ｌ−シトルリン、またはＬ−オルニチンを採取すること
を特徴とするＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、または
Ｌ−オルニチンの製造法に関する。

従って本発明はバイオインダストリーの産業分野に関し
、特に医薬９食品において有用なし一アルギニン、Ｌ−
シトルリンまたはＬ−オルニチンの製造分野に関する。

従来の技術 ］リネバクテリウム属やブレビバクテリウム属などのコ
リネ型グルタミン酸生産菌を用いる発酵法によるし一ア
ルギニンの生産法については、該菌株の野生株から誘導
されたし一アルギニン生産能を有する突然変異株を用い
る方法が知られている。

Ｌ−アルギニン生産性変異株としては、例えばアグリカ
ルチュラル・バイオロジカル・ケミストリイ（八ｇｒ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、　　３６．　１６７５　
（１９７２）　　。

特公昭５４−３７２３５．特開昭５７−１５０：３８１
などに記載されているように、アミノ酸のアナログや核
酸のアナログに対する耐性変異あるいはそれらに核酸塩
基の要求性を付与した菌株などが知られている。また、
組換えＤＮＡ技術により育種された菌株を用いるし一ア
ルギニンの製造法も知られている。例えば、大腸菌のア
ルギニン生合成に関与する遺伝子、なかでもＡＧＫ、Ａ
ＣＰＲ。

アセチルオルニチンデアセチラーゼ（以下Δ○Ｄと略す
）、およびＡＳの合成に関与する遺伝子（ａｒｇＢ、　
ａｒｇＣ，ａｒｇＥ、　ａｒｇＨ＞を担うＤＮＡ断片を
含む組換え体プラスミドＤＮＡ（ｐＥａｒｇｌ）をコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種に保
有させ、該菌株を用いてＬ−アルギニンを発酵生産する
方法などが知られている（特開昭６Ｏ−６６９８９）。

また、コリネバクテリウム属やブレビバクテリウム属な
どのコリネ型グルタミン酸生産菌を用いる発酵法により
、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンを生産する方法
については、該菌種の野生株から誘導された栄養要求性
突然変異株を用いる方法が知られている。Ｌ−オルニチ
ン生産性変異株としては、例えばジャーナル・オブ・ジ
ェネラル・アンド・アプライド・ミクロバイオロジイ（
Ｊ、Ｇｅｎ、Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　　
４　、２７２　（１９５８）に示されているように、シ
トルリンまたはアルギニンの要求性を付与した菌株が知
られている。Ｌ−シトルリン生産性変異株としては、例
えばアミノ　アシッド・ヌクレイツク　アシッド（Ａｍ
ｉｎ。

八ｃｉｄ　　・Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ）　１４．
６　（１９６６）など１こ記載されているように、Ｌ−
アルギニンの要求性を付与した菌株が知られている。

発明が解決しようとする問題点 近年、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、およびＬ−シ
トルリンの需要が増大するにつれ、これらのアミノ酸の
製造法の改善がますます望まれている。

問題点を解決するための手段 本発明者は、組換えＤＮＡ技術によりコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属菌種のし一アルギニン
、Ｌ−シトルリン、およびＬ−オルニチンの生産能力が
向上した菌株を得るため、鋭意研究を重ねた。その結果
、大腸菌のＡＧＫ。

ＡＣＰＲ，ＡＯＤ、ＡＳに対応する各々の遺伝子（ａｒ
ｇＢ、ａｒｇＣ，ａｒｇ’Ｅ、ａｒｇＨ）を含む組換え
体プラスミドｐＥａｒｇｌよりＡＯＤに対応する遺伝子
を欠損させた新たな組換え体プラスミド（ｐＥａｒｇ２
）を保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌株を用いれば、ｐＥａｒｇｌを保有する菌株
に比べてＬ−アルギニンの生産性が高まること、ｐＥａ
ｒｇ２を保有する菌株は保有しない菌株に比べ、Ｌ−オ
ルニチンまたはＬ−シトルリンの生産性が高まること、
またｐＥａｒｇ２に大腸菌のＡＳＳに対応する遺伝子（
ａｒｇＧ）を含むＤＮＡ断片を組み込んだ組換え体ＤＮ
Ａ（ｐＥａｒｇ、４）を保有するコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属菌株を用いれば、ｐＥａｒ
ｇ２を保有する菌株に比べ、Ｌ−アルギニン生産性がさ
らに高まることを見出し、本発明を完成するに至った。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明は、エシェリシア属に属する微生物のＮ−アセチ
ルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチル−γ−グルタミ
ルリン酸レダクターゼおよびアルギニノスクシナーゼの
合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片、またはＮ−
アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチル−γ−グ
ルタミルリン酸しダククーゼ、アルギニノスクシナーゼ
およびアルギニノコハク酸シンテクーゼの合成に関与す
る遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換
え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、培養
物中にＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンまたはＬ−オル
ニチンを生成蓄積させ、該培養物から該アミノ酸を採取
することを特徴とするアミノ酸の製造法を提供する。

本発明の宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属する微生物としては、
いわゆるコリネ型グルタミン酸生産菌として知られてい
る微生物は全て用いることができるが、好適には下記の
菌株が用いられる。

コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ３１８３３ コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣＩ
　３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８ コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣＩ　５９９０ ブレビバクテリウム・ディバリカラム ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム・イマリオフィラムＡＴＣＣ１４０
６８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲンタリス ＡＴＣＣＩ　９２４０ Ｌ−アルギニンを製造する場合、宿主微生物としてＬ−
アルギニン生産性を有しない菌株を用いることもできる
が、すでにＬ−アルギニン生産性を有する菌株を用いる
こともできる。アルギニン生産性を有する菌株としては
、アミノ酸アナログ耐性変異株など公知の菌株が使用で
きる。Ｌ−オルニチンあるいはＬ−シトルリンを製造す
る場合には、宿主微生物としてアルギニン要求性が付与
され、すでにＬ−オルニチンあるいはＬ−シトルリン生
産性を有する菌株を用いる。

本発明においてＡＧＫ、ＡＣＰＲ，Ａｓ、およびＡＳＳ
に対応する遺伝子の供給源となる微生物としてはエシェ
リシア属に属し、ＡＧＫ、ＡＣＰＲ。

ＡＳ、およびＡＳＳの活性を有するものであればいかな
る微生物でもよい。具体的に好適な一例としては、大腸
菌に１２株の遺伝子を用いることができる。大腸菌に１
２株では八〇に、ＡＣＰＲ。

ＡＳ、ＡＳＳは、各々ａｒｇＢ、ａｒｇＣ，ａｒｇＨ。

ａｒｇＧと称する遺伝子にコードされている〔ジェネテ
ィクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　５￥、　１６７　（１９
６５））。

これらの遺伝子の供給源となる染色体ＤＮＡは、これら
酵素の活性を有する微生物の培養菌体をリゾチームおよ
び界面活性剤で処理して溶菌した後除蛋白し、ついでエ
タノールで沈殿させる常法〔バイオキミカ・工・バイオ
フィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　Ａｃｔａ）　７２．６１９　（１９６３））により
単離できる。

アルギニン生合成に係わる酵素の遺伝子を含むＤＮＡ断
片を組み込むためのベクターとしては、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属菌種中で複製できる
ものであれば特に限定されないが、例えばｐｃＧｌ（特
開昭５７−１．３４５００）ｐＣＧ２（特開昭５８−３
５１９７）、ｐＣＧ４゜ｐｃＧｌｌ（いずれも特開昭５
７１８３７９９）。

ｐＣＥ５１．ｐＣＥ５２．ｐＣＥ５３　（いずれもモレ
キユラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクｘ　（Ｍ
ｏｌ、　Ｇａｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）、　　１９６．１７
５　（１９８４）　）ｐＣＥ５４．ｐｃＢｌ　０１　（
いずれも特開昭５８−１０５９９９）あるいはそれらか
ら誘導されたプラスミドを使用することができる。ベク
タープラスミドＤＮＡは、特開昭５７ｉ３４５００ある
いは特開昭５７−１８６４８９に開示された方法で、そ
れらを保有する菌株の培養菌体から単離精製することが
できる。

ＡＧＫ、ＡＧＰＲ，ＡＳ、およびＡｓｓに対応する各遺
伝子を含む供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換え体
ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを制限酵素で切断した後
、Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼで連結反応させ、この結合反
応物を用いて八〇に、ＡＣＰＲ。

ＡＳ、またはＡＳＳが欠損したコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属の変異株を形質転換し、欠損
形質が相補された形質転換株を選択することによって得
ることができる。この組換えＤＮＡ技法は、特開昭５７
１８６４９２および特開昭５７−１８６４８９に記載の
方法に従って、行うことができる。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株
で直接組換え体ＤＮＡを選択する代わりに、例えば大腸
菌のようにすでに遺伝子組換え技法が確立している宿主
−ベクター系を用いることもできる。すなわち、ＡＧＫ
、ＡＣＰＲ，ＡＳ。

ＡＳＳに対応する各遺伝子を含む供与体ＤＮＡと大腸菌
ベクターＤＮＡの試験管内で切断、再結合した反応物を
用い、ＡＧＫ、ＡＣＰＲ，ΔＳ、またはＡＳＳが欠損し
た大腸菌の変異株を形質転換し、欠損形質が相補された
形質転換株を選択することによって目的遺伝子をクロー
ン化することができる。このクローン化したＤＮＡとコ
リネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種の
ベクターＤＮＡを試験管内で制限酵素で切断した後、Ｄ
　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼで再結合反応させ、この結合反応
物を用いて再度、前述のアルギニン生合成酵素が欠損し
た大腸菌変異株を形質転換し、コリネバクテリウム属あ
るいはブレビバクテリウム属菌種のベクターＤＮＡの選
択マーカーを有し、しかも欠損形質が相補された形質転
換株を選択することによっても同様な組換え体ＤＮ’Ａ
が取得できる。宿主大腸菌でクローン化したＤＮＡとコ
リネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム属菌種
のベクターＤＮＡとの組換え体の選択は大腸菌を用いず
、アルギニン生合成に関与する酵素が欠損したコリネバ
クテリウム属あるいはブレビバクテリウム属菌種の変異
株を形質転換し、欠損形質が相補された形質転換株を選
択することによっても目的の組換え体ＤＮＡを取得する
ことができる。

ＡＧＫ、／！ＧＰＲ，Ａｓの遺伝子（ａｒｇＢ。

ａｒｇＣ，ａｒｇＨ）を含むＤＮＡの具体的に好適な例
として、特開昭６０−６６９８９に記載されているｐＥ
ａｒｇｌがあげられる。ｐＥａｒｇｌは大腸菌に１２株
のシーンバンク中のプラスミドｐＬｃ２０−１０　　（
セル（Ｃｅｌｌ）　９　、９１．　　（１９７６））と
プラスミドｐｃＥ５３［モレキユラー・アンド・ジェネ
ラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ
、）１９６、１７５　（１９８４）　）との組換え体と
して取得したプラスミドで、大腸菌のＡＧＫ、Ａ、ＧＰ
Ｒ，ＡＳの遺伝子（ａｒｇＢ、ａｒｇＣ，ａｒｇＨ）に
加えてＡＯＤの遺伝子（ａｒｇＥ）を含有するものであ
る。ｐＥａｒｇｌよりａｒｇＢ、ａｒｇＣ。

ａｒｇＨのみを含むプラスミドを作製するには、例えば
実施例１に示されるようにａｒｇＥの構造遺伝子に対応
するＤＮＡ断片の一部を削除すればよい。

ａｒｇＧ遺伝子のクローン化はＡＳＳ活性を有する大腸
菌に１２株亜株、例えばＷＡ８０２株（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ’−７１８）の染色体ＤＮＡを供与体として、前記の
方法により実施できる。

また、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ，ａｒｇＨおよびａｒｇＧ各
遺伝子を全て含む組換え体ＤＮＡは、たとえばａｒｇＧ
遺伝子を含むＤＮＡ断片と、前記のａｒｇＢ、ａｒｇＣ
，ａｒｇＨ各遺伝子を含むプラスミドとを連結すること
により取得することができる。

以上のように取得したａｒｇＢ、ａｒｇＣ。

ａｒｇＨを含む組換え体ＤＮＡＳａｒｇＧを含む組換え
体ＤＮＡ、あるいはａｒｇＢ、ａｒｇＣ。

ａｒｇＨ，ａｒｇＧを全て含む組換え体ＤＮＡは、特開
昭５７ｉ８６４９２および゛特開昭５７−１８６４８９
に示したプロトプラストを使用する方法により、コリネ
バクテリウム属あるいはブレビバクテリウム属菌種に導
入することができる。

これらの組換え体ＤＮＡ保有株によるＬ−アルギニン、
Ｌ−シトルリン、するいはＬ−オルニチンの生産は、従
来の発酵法によるこれらアミノ酸の製造に用いられる方
法により行うことができる。

すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無機物、ア
ミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中、好気的
条件下、温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行えば、培
養物中にＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、あるいはＬ
−オルニチンが生成蓄積するので、これを採取する。

炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シニークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコール
、ピルビン酸、フマール酸。

乳酸、酢酸などの各種有機酸が使用できる。さらに菌の
資化性によって、炭化水素、アルコール類なども用いう
る。とくに廃糖蜜は好適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム。

酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウ
ム塩類あるいは尿素および他の窒素含有物質ならびにペ
プトン、ＮＺ−アミン、肉エキス。

酵母エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水
分解物、フィツシュミールあるいはその油化物、脱脂大
豆粕あるいはその消化物、踊加水分解物などの窒素含有
有機物など種々のものが使用可能である。

さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム。

燐酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する
。微生物の生育に必要とするビタミン、アミノ酸源など
は、前記したような他の培地成分に従って培地に供給さ
れれば特に加えなくてもよい。

培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である
。培養中の培地のｐＨは中性付近に維持することが望ま
しい。培養期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−アルギ
ニン、Ｌ−シトルリン、あるいはＬ−オルニチンが蓄積
する。

培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、イオン交換樹
脂処理などの公知の方法で培養液からし一アルギニン、
Ｌ−シトルリン、あるいはＬ−オルニチンを回収する。

このようにしてａｒｇＢ、ａｒｇＣ，ａｒｇＨを含む組
換え体ＤＮＡを保有させたコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属菌株を用いることにより非保有株
に比べ高い収率でＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、あ
るいはＬ−オルニチンを生産することが、またａｒｇＢ
、ａｒｇＣ。

ａｒｇＨおよびａｒｇＧを含む組換え体ＤＮＡを保有さ
せたコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
菌株を用いることにより非保有株に比べ高い収率でＬ−
アルギニンを生産することができる。かかる微生物とし
て、具体的にはたとえばコリネバクテリウム・グルタミ
クムに６２（アルギニン生産性；ＦＥＲＭ　　ＢＰｉｌ
１２）。

コリネバクテリウム・グルタミクムに６３（アルギニン
生産性；ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１１３）があげられる。

それらは、シトルリン生産菌コリネバクテリウム・グル
タミクムに６１　（ＦＥＲＭＢＰ−１１１１）とともに
工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に昭和６１
年７月２４日付で寄託されている。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例 （１）大腸菌のアルギニン要求性変異株の取得アルギニ
ン生合成遺伝子のクローニングおよびクローン化した遺
伝子の確認のために、アルギニン生合成遺伝子を欠損し
た大腸菌株を以下のように取得した。

大腸菌に１２株亜株ＷＡ８０２（メチオニン要求性；Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−７１８）にＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、４００　ｒ／ｍ
ｌを用いて通常の変異処理を施した後、ペニシリンを用
いる栄養要求株の濃縮法〔エックスペリメント・イン・
モレキ５　ラ−’ジェネティクス（Ｂｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　ｐ
、２３０．コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ
−（１９７２）　）に従ってアルギニン要求株を濃縮後
選択した。得られたアルギニン要求株の変異遺伝子の同
定は、各アルギニン生合成酵素の活性を測定することに
よって行った。

活性測定法は、ＡＧＫ、ＡＯＤおよびＡＳについては、
ジャーナル・オブ・ジェネラル・ミクロバイオロジイ（
Ｊ、にｅｎ１Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　６９゜３６５　
（１９７１）、ＡＣＰＲについては、バイオキミカ・工
・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）　　且８．３０６　（１９
６５）　、Ａ　Ｓ　Ｓについては、ジャーナル・オブ・
バイオケミストリイ（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　　８５
．１３０９　（１９７９）　　に従って行った。その結
果、ＡＧＫ　（ａ　ｒｇＢ）欠損変異株としてＥＡ−２
１、ＡＣＰＲ（ａｒｇＣ）欠損変異株としてＥＡ−３５
、ＡＯＤ（ａｒｇＥ）欠損変異株としてＥＡ−４、ＡＳ
Ｓ　（ａｒｇＧ）欠損変異株としてＥＡ−５１、ＡＳ　
（ａｒｇＨ）欠損変異株としてＥＡ−７７を取得した。

（２）大腸菌のａｒｇＢ、ａｒｇＣ，ａｒｇＨ各遺伝子
を含みａｒｇＥ遺伝子を含まないプラスミドＤＮＡの作
製 特開昭６０−６６９８９に示されているように、大腸菌
のａｒｇＢ、ａｒｇＣ，ａ’ｒｇＨ。

ａｒｇＥ各遺伝子からなるクラスターを含む組換え体Ｄ
ＮＡｐＥａｒｇｌは、ｐＬｃ２０−１０とｐＣＥ５３と
の組換え体として取得できる。

ｐＬｃ２０−１０は大腸菌に１２株のシーンバンク中か
ら得られ、上記遺伝子群を有することが知られティる〔
セル（Ｃｅｌｌ）　９　、９１　（１９７６））。

ｐＣＥ５３はモレキュラー・アンド・ジェネラル−ジェ
ネティクｘ　（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）　１９
６゜１７５　（１９８４）　　に示したプラスミドで、
選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を有し、大
腸菌とコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属などのコリネ型グルタミン酸生産菌の双方で複製する
。ｐＥａｒｇｌは第１図に示すような各種制限酵素の切
断部位を有しているが、このうち２ケ所存在する５ａ１
１切断部位は、いずれもａｒｇＥの構造遺伝子内に存在
することが示されている〔ジーン（Ｇｅｎｅ）　５　、
２０７（１９７９）　）。

ｐＥａｒｇｌからａｒｇＢ、ａｒｇＣ，ａｒｇＨ各遺伝
子を含み、ａｒｇＥ遺伝子を含まないプラスミドＤＮＡ
の取得は以下の方法により行った。まずｐＥａｒｇｌを
保有する大腸菌に１２株亜株ＷＡ８０２の培養菌体から
、アンらの方法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ
（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１４０．４００　（１９７９
）　）に従い単離゛シた。ｐＥａｒｇｌプラスミドＤＮ
Ａ２ｔｔｇを含む制限酵素５ａｊｔ　Ｉ用反応緩衝液Ｃ
１０ｍＭ）！Ｊス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン
（以下トリスと略す）、１５０ｍＭ　　ＮａＣｌ１，７
ｍＭＭｇＣＲ２，ｐＨ８，０：］　１００頭に５単位の
Ｓａｊ！Ｉ（全酒造社製、８単位／ρ）を添加し、３７
℃で１時間反応させた。該消化物を６５℃で１時間加温
した後、１０倍濃度のＴ４リガーゼ反応緩衝液（６６０
ｍＭ）リス、６６ｍＭＭｇＣｊ！２，１０９ｍＭジチオ
スレイトール。

ｐＨ７，６）１２Ａ＋２．ＡＴＰ　（１００ｍＭ）３ｍ
。

Ｔ’４’ｌガーゼ（宝酒造社製、３５０単位／ρ）１ｇ
を加え、４℃で２４時間反応させた。このリガーゼ反応
混合物を形質転換に供した。受容菌としては、（１）で
取得したａｒｇＥを欠損した大腸菌に１２株亜株ＥＡ−
４（アルギニン、メチオニン要求性）を用いた。ＥＡ−
４のコンピテント・セルはダジエルトらの方法〔ジーン
（Ｇｅｎｅ）　６　、２３　（１９７９）　）で調製し
た。

すなわち、Ｌ培地（バタトトリブトン１０ｇ。

酵母エキス５ｇ、グルコース１ｇおよびＮａ（１℃５ｇ
を水１βに含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地）５０ｍ
ｌにＥＡ−４株を植菌し′、東京光電比色計で６６０’
ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）＜以下、特記しないかぎり
吸光度は６６０ｎｍで測定）が０．５になるまで３７℃
で培養した。培養液を氷水中で１０分間冷却してから遠
心した。冷却した０、ＩＭ　　Ｃａ（１２２０ｍ１に菌
体を再懸濁し、０℃に２０分間置いた。菌体を再遠心し
、０、ＩＭ　　ＣａＣｌ１２０．５ｍｌに懸濁し、０℃
で１８時間装いた。Ｃａ　Ｃｊ！　２処理した菌液１５
０誠に前記リガーゼ反応混合物５０ｍを添加混合し、０
℃に１０分間置いてから３７℃で５分間加温した。次い
でＬ培地２印ｌを添加し、３７℃で２時間振盪培養した
。生理食塩水で２回遠心洗浄後、２５■／ｍｌ相当のカ
ナマイシンを添加したし寒天培地〔Ｌ培地１１に寒天１
６ｇを含む培地〕に塗布し、３７℃で１日培養した。出
現した形質転換株は、メチオモン３０■／ｍｌを含むデ
ービス最少寒天培地〔グルコース２ｇ。

（ＮＨ４）２３０４１ｇ、に２ＨＰ０４７ｇ。

ＫＨ２ＰＯ４２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１ｇ　。

クエン酸３ナトリウム塩０．５　ｇ　、サイアミン塩酸
塩４ｍｇ、および寒天１６ｇを水１１に含み、・　ｐ　
Ｈ７，２に調整した培地〕、およびメチオニンとアルギ
ニン各３０ｇ／ｍｌを含むグービス最少寒天培地に塗布
し、アルギニン要求性を調べた。

このうちアルギニン要求性を示した形質転換株の培養菌
体から、前記のｐＥａｒｇｌを単離したのと同様の方法
によりプラスミドＤＮＡを単離した。このプラスミドＤ
ＮＡは制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析し
た結果、第１図に示すようにｐＥａ　ｒ　ｇ　１の２ケ
所のＳａｊ！　Ｉ切断部位にはさまれた０、　５　Ｋ　
ｂのＤＮＡ断片が欠失した構造を有していた。このプラ
スミドをｐＥａｒｇ２と命名した。

このプラスミドＤＮＡを用いてＥＡ−４株を前記と同様
に再形質転換した結果、得られたカナマイシン耐性形質
転換株は全てアルギニン要求性を有していた。しかし、
ａｒｇＢを欠損した大腸菌に１２株亜株ＥＡ−２１．ａ
ｒｇＣを欠損した大腸菌に１２株亜株ＥＡ−３５および
ａｒｇＨを欠損した大腸菌に１２株亜株ＥＡ−７７（以
上□いずれもアルギニン、メチオニン要求性）をｐＥａ
ｒｇ２で形質転換した結果、得られたカナマイシン耐性
形質転換株はすべてアルギニン非要求性であった。この
ことよりｐＥａ　ｒ　ｇ　２はａｒｇＢ、ａｒｇＣ，ａ
ｒｇＨ各遺伝子を含み、ａｒｇＥ遺伝子は含まないプラ
スミドであることが判明した（第１図参照）。

（３）　　ｐ　Ｅ　ａ　ｒ　ｇ　２保有株によるし一ア
ルギニン。

Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチンの生産コリネバクテリ
ウム・グルタミクムΔＴＣＣ３１８３３、コリネバクテ
リウム・ハーキュリスＡＴＣ０１３８６８，ブレビバク
テリウム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７，Ｌ−オルニチ
ン生産性菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣ
Ｃ１３２３２，およびコリネバクテリウム・グルタミク
ムＡＴＣＣＩ　３０３２よりアルギニン要求株として分
離したシトルリン生産性菌株コリネバクテリウム・グル
タミクムに６１（ＦＥＲ’Ｍ　　ＢＰ−１１１１）のプ
ロトプラストを形質転換してｐＥａｒｇ２を導入した。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡ’　Ｔ　ＣＣ３１
８３３、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１
３８６８，ブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣＩ　
４０６７．コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
１３２３２，コリネバクテリウム・グルタミクムに６１
　（ＦＥＲＭＢＰ−１１１１）をそれぞれＮＢ培地（粉
末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水ＩＩｌに含みｐ
　Ｈ７，２に調整した培地）にて３０℃で一昼夜振盪培
養し、その種培養０．１ｍｌを１０ｍ１の３５Ｍ培地〔
グルコースＬｏｇ、ＮＨ４Ｃβ　４ｇ。

尿素２ｇ、酵母エキス１　ｇ、ＫＨ２ＰＯ＜　　１ｇ　
。

Ｋ２ＨＰＯ４３ｇ、ＭｇＣＬ・６　Ｈ２００，４ｇ　。

Ｆ　ｅ　３０４　・７　Ｈ２０１０ｍｇ、ＭｎＳＯ４・
４〜６８２０　０．２ｍｇ、ＺｎＳＯ４’　７　Ｈ２０
０，９ｍｇ＋Ｃｕ５Ｏ６’　５Ｈ２００，４ｍｇ、Ｎａ
２Ｂ４Ｏ７”１０Ｈ２００，０９ｍｇ、　　（ＮＨ４）
ｓＭＯｔｏ□４・４　ＨｚＯｏ、　０４　ｍｇ、ビオチ
ン３０■、サイアミン塩酸塩１　ｍｇを純水１ｊ２に含
みｐ　Ｈ７，２に調整した培地〕、あるいはアルギニン
２００■／ｍｌを添加したＳＳＭ培地１０ｍ〕の入った
Ｌ字型試験管に接種し、モノー型培養槽にて３０℃で振
盪培養した。ＯＤが０．１５になった時点で０．５単位
／ｍｌになるようにペニシリンＧを添加した。

さらに培養を続け、ＯＤが約０．６になったところで細
胞を集菌し、ＲＣＧＰ培地〔グルコース５ｇ、カザミノ
酸５ｇ、酵母エキス２．５　ｇ　。

Ｋ２ＨＰＯ４３，５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ。

Ｍｇ（１２・６Ｈ２００，４１ｇ、Ｆｅ５０．・７Ｈ２
０１０＋ｎｇ、Ｍｎ５Ｏ，・４〜６８２０　２ｍｇ。

ＺｎＳＯ４・７　Ｈ２００，９ｍｇ＋　（Ｎ　Ｈ４）６
Ｍ　０７０２４・４　Ｈ２００；（１４ｍｇ、ビオチン
３０ｇ、サイアミン塩酸塩２■、コハク酸二ナトリウム
１３５ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量１０．　ＯＯ
Ｏ”）３０ｇを水ＩＩ！、に含む培地〕に１ｍｇ／ｍｌ
のりゾチームを含む液２．５ｍｌ　（ｐＨ７，６）に約
１０９細胞／ｍｌとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移
して３０℃で１５５時間緩かに振盪反応してプロトプラ
スト化した。このプロトプラスト菌液Ｑ、５ｍｌを小試
験管にとり、２，５００Ｘｇで５分間遠心分離し、ＴＳ
ＭＣ緩衝液［：１０ｍＭＭｇＣ１２，３０ｍＭ　　Ｃａ
ＣＣ，５０ｍＭトリス、４００ｍＭシヨ糖、　ｐＨ７，
５）１ｍｌに懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衝液Ｑ、
１ｍｌに再懸濁した。この菌液に２倍濃度のＴＳＭＣ緩
衝液とｐＥａ　ｒ　ｇ　２プラスミドＤＮＡ溶液との１
対１混合液ｔｏｏｌＩＩｌを加えて混和し、次いでＴＳ
ＭＣＭＷｉ液中に２０％ポリエチレングリコール（ＰＥ
、Ｃ）　６，０００　（半井化学薬品社製）を含む液１
．Ｑｍｌを添加して混合した。３分後２．５００ｘｇで
５分間遠心分離にかけて上澄液を除去し、沈降したプロ
トプラストを１ｍｌのＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，４）に懸
濁してから３０℃で２時間緩やかに振盪した。ついでこ
のプロトプラスト懸濁液のＱ、３ｍｌをカナマイシン４
００ｐＨ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地
に１．６％寒天を含む培地、ｐ　Ｈ７，４）に塗抹し、
３０℃で８日間培養した。

出現したカナマイシン耐性形質転換株を４００ｍ１　Ｓ
　Ｓ　Ｍ培地で振盪培養し、ＯＤが０．１５になったと
ころで０．５単位／ｍｌとなるようにペニシリンＧを添
加し、さらにＯＤが０．６５になるまで培養した。培養
液から菌体を集菌し、ＴＥＳ緩衝液（トリス０．０３Ｍ
、ＥＤＴＡ　　０．００５Ｍ。

ＮａＣｊｉ！　　０．０５Ｍ、ｐＨ８，０）で洗浄後、
リゾチーム液（２５％シヨ糖、０．１Ｍ　　ＮａＣ１゜
０．０５Ｍ）リス、　０．８ｍｇ／ｍｌリゾチーム：ｐ
Ｈ８，０）１０ｍｌに懸濁し、３７℃で４時間反応させ
た。反応液に５Ｍ　　ＮａＣ１２，４ｍｌ、　０．５Ｍ
　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）　０．６ｍｌ、および４％
ラウリル硫酸ナトリウムと０．７Ｍ　　Ｎａ（ｌからな
る溶液４．４ｍｌを順次添加し、緩やかに混和してから
氷水中に１５時間装いた。溶解物全量を遠心管に移し、
４℃で６０分間６９，４００ｘｇの遠心分離にかけ上澄
液を回収した。これに重量百分率１０％相当のＰＥＧ６
，０００（半井化学薬品社製）を加え、静かに混和して
溶解後、氷水中に置いた。１０時間後、１．５００ｘｇ
で１０分間遠心分離してペレットを回収した。

ＴＢＳ緩衝緩衝液５警ｌえてペレットを静かに再溶解し
てから１．５　ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイド２．０
ｍｌを添加し、これに塩化セシウムを加えて静かに溶解
し、密度を１．５８０に合わせた。この溶液を１０５．
ＯＯＯｘｇ、１８℃で４８時間超遠心分離にかけた。こ
の密度匂配遠心により共有結合で閉じられた環状のＤＮ
Ａは、紫外線照射することによって遠心チューブ中下方
の密度の高いバンドとして見出された。このバンドを注
射器で遠心チューブの側面から抜きとることによってプ
ラスミドを分離した。ついで分離液を等容量のイソプロ
ピルアルコール液〔容量百分率９０％イソプロピルアル
コール、１０％ＴＢＳ緩衝液（この混液中に飽和溶解量
の塩化、セシウムを含む）〕で５回処理してエチジウム
ブロマイドを抽出除去し、しかる後にＴＢＳ緩衝液に対
して透析した。こうしてプラスミドＤＮＡを得た。

これらのプラスミドを制限酵素消化とアガロースゲル電
気泳動で解析した結果、各種制限酵素切断様式で特徴付
けられるｐＥａｒｇ２と同一の構造を有するものである
ことがわかった。

こうして形質転換株コリネバクテリウム・グルタミクム
ＡＴｃｃ３１８３３／ｐＥａｒｇ２゜コリネバクテリウ
ム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８／ｐＥａｒｇ２．
ブレビバクテリウム・フラブムＡＴｃｃ１４０６７／ｐ
Ｅａｒｇ２゜コリネバクテリウム・グルクミクムΔＴＣ
Ｃ１３２３２／ｐＥａｒｇ２右よびコリネバクテリウム
・グルタミクムに６１／ｐＥａｒｇ２を取得した。この
うち形質転換株コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴ
ＣＣ３１８３３／ｐＥａｒｇ２はコリネバクテリウム・
グルタミクムに６２　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１１２）
として微工研に寄託されている。

また同様の操作によってコリネバクテリウム・グルタミ
クムＡＴＣＣ３１８３３，コリネバクテリウム・ハーキ
ュリスＡＴＣＣ１３８６８゜ブレビバクテリウム・フラ
ブムＡＴＣＣ１４０６コリネバクテリウム・グルタミク
ムＡＴＣＣ１３２３２、およびコリネバクテリウム・グ
ルタミクムに６１　　にｐＥａｒｇｌを導入し、各々の
形質転換株を得た。

得られたｐＥａｒｇｌ、ｐＥａｒｇ２各形質転換株につ
いて、以下のようにＬ−アルギニン。

Ｌ−シトルリン、あるいはＬ−オルニチンの生産試験を
行った。

ＮＢ培地中で３０℃、１６時間振盪培養した種培養Ｑ、
５ｍｌを生産培地５ｍｌ　（廃糖蜜８０ｇ（グルコース
換算）、（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ。

ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ、に２ＨＰＯ４０，５ｇ。

Ｃａ　ＣＯｓ　　２０　ｇを水１１に含み、ｐ　Ｈ７，
０に調整した培地〕の入った試験管に接種し、３０℃で
７２時間振盪培養した。ただし、Ｌ−シトルリンまたは
Ｌ−オルニチンの生産試験では、該生産培地５ｍｌに１
００■／ｍｌのし一アルギニンを添加した。培養後、培
養濾液をペーパークロマトグラフィーにかけ、ニンヒド
リン発色後比色定量してＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリ
ン。

およびＬ−オルニチンの生成量を測定した。

結果を第１表、第２表、第３表に示す。

７、　　　　　　　　　　第　　　　１　　　　表第　
　　　２　　　　表 第　　　　３　　　　表 以上の結果より、ｐＥａｒｇｌ　（ａｒｇＢ。

ａｒｇＣ，ａｒｇＨおよびａｒｇＥ遺伝子を含有）より
ａｒｇＥ遺伝子を欠失させて得たプラスミドｐＥａｒｇ
２の導入株では、ｐＥａｒｇ１導入株に比導入子ルギニ
ン、オルニチンまたはシトルリンの生産性が向上するこ
とが明らかになった。

（４）大腸菌ａｒｇＧ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの
調製 大腸菌ａｒｇＧ遺伝子を含む染色体ＤＮＡは、前記の大
腸菌に１２株亜株ＷＡ８０２　（ＦＥＲＭＢＰ−７１８
）より常法〔バイオキミカ・工・バイオフィジカ・アク
タ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ）　７２．６１９　（１９６３））により単離
した。

ベクターとして使用したｐＢＲ３２２（アンピシリン耐
性、テトラサイクリン耐性）は全酒造社製の市販品を用
いた。ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ１■およびＷＡ８
０２染色体ＤＮＡ３■を含む制限酵素Ｂａｎ１Ｉ用反応
液（１０ｍＭトリス、５ＱｍＭ　　ＮａＣ１，７ｍＭ　
　ＭｇＣｌ２゜ｐＨ７゜５　）、１００Ａ＋２に１６単
位のＢａｎ１ＩＩ　（東洋紡績社製）を添加し、３７℃
で６０分間反応後、６５℃で４０分間加温して反応を停
止した。

該反応消化物に１０倍濃度のＴ４’Ｊガーゼ緩衝液１２
ｍ１．ｌｏＯｍＭ　　ＡＴＰ３ｍおよびＴ４リガーゼ（
全酒造社製）３５０単位を加え、１２℃で１６時間反応
させた。このリガーゼ反応混合物を（１）で取得した大
腸菌に１２株亜株ＥΔ−５１（アルギニン、メチオニン
要求性）の形質転換に供した。ＥＡ−５１株のコンピテ
ント・セルは実施例（２）に記した方法により調製した
。

選択培地は３０ＩＩｇ／ｍｌのメチオニン、および５０
■／ｍｌ　ｔ：Ｄアンピシリンを添加したデービス最少
寒天培地を用いた。出現した形質転換株の培養菌体から
前記のアンらの方法によりプラスミドＤＮＡを単離した
。形質転換株から得られ、ｐＥａｒｇ３と命名したプラ
スミドは、各種制限酵素での消化とアガロースゲル電気
泳動による解析の結果、ｐＢＲ３２２の唯一のＢａｎ１
ｌＩ（Ｃ］ａＪと切断認識部位が同一）切断部位に７キ
ロベースのＢａｎ１ｌＩＤＮＡ断片が挿入された構造で
あることが示された。ｐＥａｒｇ３を用い、ＥＡ−５１
株を前記と同様に再形質転換したところ、アンピシリン
耐性で選択された形質転換株は全てアルギニン非要求性
を示した。

このことから大腸菌ａｒｇＱ遺伝子がり６−ン化されて
いることが確認された。ｐＥａｒｇ３の作製過程を第１
図に示す。

（５）　　ｐ’　Ｅ　ａ　ｒ　ｇ　２と大腸菌ａｒｇＧ
断片との組換えプラスミドの作製 実施例（２）で作製したｐＥａｒｇ２と実施例（４）で
クローン化した大腸菌ａｒｇＱ断片とを組み換えて、ａ
ｒｇＢ、ａｒｇＣ，ａｒｇＨ，ａｒｇＧの４遺伝子を全
て含むプラスミドｐＥａｒｇ４を作製した。

ｐＥａｒｇ２　　ＤＮＡ２ｇを含む制限酵素Ｂａｎ１Ｉ
用反応液１００ｍに０．３単位のＢａｎ１ＩＩを添加し
、３７℃で１時間反応後６５℃で４０分間加温して反応
を停止した。一方、ｐＥａ　ｒ　ｇ　３ＤＮＡ２μｇを
含むＢａｎＩＩＩ用反応液１００’ａ（ｌに４単位のＢ
ａｎ１ＩＩを添加し、３７℃で１時間反応後６５℃で４
０分間加温して反応を停止した。

両反応消化物を混合した後、１０倍濃度のＴ４リガーゼ
緩衝液２３ｍ、１００ｍＭ　　ΔＴＰ５パ、およびＴ４
リガーゼ３５０単位を加え、１２℃で１６時間反応させ
た。このリガーゼ反応混合物を用いてＥＡ−５１株の形
質転換を行った。選択培地は３０■／ｍｌのメチオニン
、および２５ｍ／ｍｌのカナマイシンを添加したデービ
ス最少寒天培地を用いた。出現した形質転換株の培養菌
体から得られ、ｐＥａｒｇ４と命名したプラスミドは、
各種制限酵素での消化とアガロースゲル電気泳動による
解析の結果、ｐＥａｒｇ２の２ケ所のＢａｎＩＩＩ切断
部位のうちカナマイシン耐性遺伝子外にある部位に、ｐ
Ｅａｒｇ３でみられた７キロベースのＢａｎ１ＩＩ断片
が挿入された構造をしていることが示された。ｐＥａｒ
ｇ４を用い、（１）で取得したＥＡ−２１゜ＥＡ−３５
，ＥＡ−７７、およびＥＡ−５１を形質転換したところ
、カナマイシン耐性で選択された各形質転換株は全てア
ルギニン非要求性を示し、ｐＥａｒｇ４にはａｒｇＢ、
ａｒｇＣ。

ａｒｇＨおよびａｒｇＧの４遺伝子が含まれていること
が確かめられた。

また、このｐＥａｒｇ４を用いてコリネバクテリウム・
グルタミクムＬＡ−Ａ３６（アルギニン要求性）を形質
転換した。核子は、コリネバクテリウム・グルタミクム
ＡＴＣＣ３１８３３由来のリゾチーム感受性変異株ＡＴ
ＣＣ３１８３４、から通常用いられる変異処理により誘
導されたアルギニン要求性の変異株であり、アルギニン
生合成の中間体であるシトルリンを生育要求物質である
アルギニンに代替できないこと、およびｐＥａｒｇ２を
導入してもアルギニン要求性はかわらないことから、そ
の欠損変異はＡＳＳ遺伝子（大腸菌のａｒｇＧ遺伝子産
物に対応）にあると推察されるものである。コリネバク
テリウム・グルタミクムＬＡ−Ａ３６の種培養０．１ｍ
ｌをＮＢ培地１０ｍ１に植菌し、３０℃で振盪培養した
。ＯＤ　０．６になった時点で集菌し、以下実施例（３
）と同様の操作を行ってｐＥａｒｇ４による形質転換を
行った。選択培地は４００■／ｍ１のカナマイシンを含
むＲＣＧＰ寒天培地を用いた。得られたカナマイシン耐
性形質転換株についてそのアルギニン要求性を調べたと
ころ、全ての株がアルギニン非要求性を示した。従って
大腸菌ａｒｇＱ遺伝子はコリネバクテリウム属またはブ
レビバク、チリウム属菌種中においても発現することが
確認された。ｐＥａｒｇ４の作製過程を第１図に示す。

（６）　　ｐＥ　ａ　ｒ　ｇ　４保有株によるし一アル
ギニンの生産 コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６
８，およびブレビバクテリウム・フラグＡＡＴＣＣ１４
０６７を実施例（３）と同様な方法でプロトプラスト化
し、ｐＥａｒｇ４を導入した。

これら形質転換株より実施例（３）で示したのと同様な
方法によりプラスミドを単離し、各種制限酵素消化とア
ガロースゲル電気泳動による解析を行った結果、ｐＥａ
ｒｇ４と同一の構造を有するものであることが確認され
た。これら形質転換株のうち、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムＡＴＣＣ３１８３３／ｐＥａｒｇ４は、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムに６３（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−１１１３）として微工研に寄託されている。

ｐＥａｒｇ４保有株、ｐＥａｒｇ２保有株。

およびプラスミド非保有株のし一アルギニン生産試験を
実施例（３）と同様の方法により行った。

結果を第４表に示す。

第　　　　４　　　　表 以上の結果より、ｐＥａｒｇ２（ａｒｇＢ。

ａｒｇＣ，ａｒｇＨ遺伝子を含有）と大腸菌由来のａｒ
ｇＧ遺伝子を含むＤＮＡ断片とを組みＤＮＡよりクロー
ン化したａｒｇＧ遺伝子を含む換えて得たプラスミドｐ
Ｅａｒｇ４の導入株では、ｐＥａｒｇ２導入株に比導入
用ギニンの生産性が向上することが明らかになった。

発明の効果 本発明によれば、エシェリシア属菌種の八〇Ｋ。

ＡＣ，ＰＲ，ＡＳの合成に関与する遺伝子（ａｒｇＢ。

ａｒｇＣ，ａｒｇＨ）を含有する組換え体ＤＮＡ。

あるいは該遺伝子とＡＳＳの合成に関与する遺伝子（ａ
ｒｇＧ）を含有する組換え体ＤＮＡを保有させることに
より、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属菌種におけるＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、ある
いはＬ−オルニチンの生産性を向上させることができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＥａｒｇ２．ｐＥａｒｇ３．ｐＥａｒｇ４
の制限酵素ＢａｍＨＩ、Ｂａｎｎ１．ＰｓｔＩ。 ５ａ１１の切断地図とその作製過程を示す。図中Ｂｍは
ＢａｍＨＩ、ＢｎはＢａｎ１ＩＩ、ＰはＰｓｔＩ。 Ｓは５ａＩ２Ｉを表す。プラスミドの大きさは、キロベ
ース（Ｋｂ）で表示されている。ｐＥａｒｇ２゜ｐＥａ
ｒｇ３．ｐＥａｒｇ４の太い実線部分はｐＥａｒ、ｇｌ
由来のアルギニン生合成遺伝子群（ａｒｇＢ、ａｒｇＣ
，ａｒｇＨ）を含むＤＮＡ断片を、白ヌキ太線部分は、
ＷＡ８０２株染色体Ｌ）ＮＡ＠斤ケ衣し−（０心。 区 手続補正書く自発） 昭和６２年ｑ月　７日 １、事件の表示 昭和６１年特許願第２１３５７２号 ２、発明の名称 アミノ酸の製造法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　１００ 住　所　　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名　称
　　（１０２）協和醗酵工業株式会社図面 ５、補正の内容

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）エシェリシア属に属する微生物のＮ−アセチルグ
   ルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチル−γ−グルタミルリ
   ン酸レダクターゼおよびアルギニノスクシナーゼの合成
   に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片、またはＮ−アセ
   チルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチル−γ−グルタ
   ミルリン酸レダクターゼ、アルギニノスクシナーゼおよ
   びアルギニノコハク酸シンテターゼの合成に関与する遺
   伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体
   ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属またはブレビバ
   クテリウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物中
   にＬ−アルギニン、Ｌ−シトルリンまたはＬ−オルニチ
   ンを生成蓄積させ、該培養物から該アミノ酸を採取する
   ことを特徴とするアミノ酸の製造法。
2. （２）エシェリシア属に属する微生物のＮ−アセチルグ
   ルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチル−γ−グルタミルリ
   ン酸レダクターゼおよびアルギニノスクシナーゼの合成
   に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ
   との組換え体ＤＮＡ。
3. （３）エシェリシア属に属する微生物のＮ−アセチルグ
   ルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチル−γ−グルタミルリ
   ン酸レダクターゼ、アルギニノスクシナーゼおよびアル
   ギニノコハク酸シンテターゼの合成に関与する遺伝情報
   を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡ
   。
4. （４）エシェリシア属に属する微生物のＮ−アセチルグ
   ルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチル−γ−グルタミルリ
   ン酸レダクターゼおよびアルギニノスクシナーゼの合成
   に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ
   との組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属ま
   たはブレビバクテリウム属に属する微生物。
5. （５）エシェリシア属に属する微生物のＮ−アセチルグ
   ルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチル−γ−グルタミルリ
   ン酸レダクターゼ、アルギニノスクシナーゼおよびアル
   ギニノコハク酸シンテターゼの合成に関与する遺伝情報
   を担うＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡ
   を保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
   ウム属に属する微生物。