JPH0755155B2 - アミノ酸の製造法 - Google Patents
アミノ酸の製造法Info
- Publication number
- JPH0755155B2 JPH0755155B2 JP61213572A JP21357286A JPH0755155B2 JP H0755155 B2 JPH0755155 B2 JP H0755155B2 JP 61213572 A JP61213572 A JP 61213572A JP 21357286 A JP21357286 A JP 21357286A JP H0755155 B2 JPH0755155 B2 JP H0755155B2
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- JP
- Japan
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- arginine
- strain
- corynebacterium
- dna
- gene
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はエシェリシア属菌種のアセチルグルタミン酸キ
ナーゼ（以下AGKと略す：大腸菌K12株のargB遺伝子に対
応）,N−アセチル−γ−グルタミルリン酸レダクターゼ
（以下AGPRと略す:argC遺伝子に対応），アルギニノス
クシナーゼ（以下ASと略す:argH遺伝子に対応）の合成
に関与する遺伝情報を担うDNA断片を含有する組換え体D
NA、または該DNA断片とアルギニノコハク酸シンテター
ゼ（以下ASSと略す:argG遺伝子に対応）の合成に関与す
る遺伝情報を担うDNA断片とを含有する組換え体DNAを保
有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物を培地に培養し、培養物中に生成蓄積
したＬ−アルギニン,L−シトルリン，またはＬ−オルニ
チンを採取することを特徴とするＬ−アルギニン,L−シ
トルリン，またはＬ−オルニチンの製造法に関する。従
って本発明はバイオインダストリーの産業分野に関し、
特に医薬，食品において有用なＬ−アルギニン,L−シト
ルリンまたはＬ−オルニチンの製造分野に関する。
ナーゼ（以下AGKと略す：大腸菌K12株のargB遺伝子に対
応）,N−アセチル−γ−グルタミルリン酸レダクターゼ
（以下AGPRと略す:argC遺伝子に対応），アルギニノス
クシナーゼ（以下ASと略す:argH遺伝子に対応）の合成
に関与する遺伝情報を担うDNA断片を含有する組換え体D
NA、または該DNA断片とアルギニノコハク酸シンテター
ゼ（以下ASSと略す:argG遺伝子に対応）の合成に関与す
る遺伝情報を担うDNA断片とを含有する組換え体DNAを保
有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物を培地に培養し、培養物中に生成蓄積
したＬ−アルギニン,L−シトルリン，またはＬ−オルニ
チンを採取することを特徴とするＬ−アルギニン,L−シ
トルリン，またはＬ−オルニチンの製造法に関する。従
って本発明はバイオインダストリーの産業分野に関し、
特に医薬，食品において有用なＬ−アルギニン,L−シト
ルリンまたはＬ−オルニチンの製造分野に関する。
従来の技術 コリネバクテリウム属やブレビバクテリウム属などのコ
リネ型グルタミン酸生産菌を用いる発酵法によるＬ−ア
ルギニンの生産法については、該菌株の野生株から誘導
されたＬ−アルギニン生産能を有する突然変異株を用い
る方法が知られている。
リネ型グルタミン酸生産菌を用いる発酵法によるＬ−ア
ルギニンの生産法については、該菌株の野生株から誘導
されたＬ−アルギニン生産能を有する突然変異株を用い
る方法が知られている。
Ｌ−アルギニン生産性変異株としては、例えばアグリカ
ルチュラル・バイオロジカル・ケミストリィ（Agr.Bio
l.Chem.），36,1675（1972），特公昭54−37235,特開昭
57−150381などに記載されているように、アミノ酸のア
ナログや核酸のアナログに対する耐性変異あるいはそれ
らに核酸塩基の要求性を付与した菌株などが知られてい
る。また、組換えDNA技術により育種された菌株を用い
るＬ−アルギニンの製造法も知られている。例えば、大
腸菌のアルギニン生合成に関与する遺伝子、なかでもAG
K,AGPR,アセチルオルニチンデアセチラーゼ（以下AODと
略す），およびASの合成に関与する遺伝子（argB,argC,
argE,argH）を担うDNA断片を含む組換え体プラスミドDN
A（pEarg1）をコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属菌種に保有させ、該菌株を用いてＬ−アルギ
ニンを発酵生産する方法などが知られている（特開昭60
−66989）。
ルチュラル・バイオロジカル・ケミストリィ（Agr.Bio
l.Chem.），36,1675（1972），特公昭54−37235,特開昭
57−150381などに記載されているように、アミノ酸のア
ナログや核酸のアナログに対する耐性変異あるいはそれ
らに核酸塩基の要求性を付与した菌株などが知られてい
る。また、組換えDNA技術により育種された菌株を用い
るＬ−アルギニンの製造法も知られている。例えば、大
腸菌のアルギニン生合成に関与する遺伝子、なかでもAG
K,AGPR,アセチルオルニチンデアセチラーゼ（以下AODと
略す），およびASの合成に関与する遺伝子（argB,argC,
argE,argH）を担うDNA断片を含む組換え体プラスミドDN
A（pEarg1）をコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属菌種に保有させ、該菌株を用いてＬ−アルギ
ニンを発酵生産する方法などが知られている（特開昭60
−66989）。
また、コリネバクテリウム属やブレビバクテリウム属な
どのコリネ型グルタミン酸生産菌を用いる発酵法によ
り、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンを生産する方
法については、該菌種の野生株から誘導された栄養要求
性突然変異株を用いる方法が知られている。Ｌ−オルニ
チン生産性変異株としては、例えばジャーナル・オブ・
ジェネラル・アンド・アプライド・ミクロバイオロジィ
（J.Gen.Appl.Microbiol.）４,272（1958）に示されて
いるように、シトルリンまたはアルギニンの要求性を付
与した菌株が知られている。Ｌ−シトルリン生産性変異
株としては、例えばアミノ アシッド・ヌクレイック
アシッド（Amino Acid・Nucleic Acid）14,6（1966）
などに記載されているように、Ｌ−アルギニンの要求性
を付与した菌株が知られている。
どのコリネ型グルタミン酸生産菌を用いる発酵法によ
り、Ｌ−オルニチンまたはＬ−シトルリンを生産する方
法については、該菌種の野生株から誘導された栄養要求
性突然変異株を用いる方法が知られている。Ｌ−オルニ
チン生産性変異株としては、例えばジャーナル・オブ・
ジェネラル・アンド・アプライド・ミクロバイオロジィ
（J.Gen.Appl.Microbiol.）４,272（1958）に示されて
いるように、シトルリンまたはアルギニンの要求性を付
与した菌株が知られている。Ｌ−シトルリン生産性変異
株としては、例えばアミノ アシッド・ヌクレイック
アシッド（Amino Acid・Nucleic Acid）14,6（1966）
などに記載されているように、Ｌ−アルギニンの要求性
を付与した菌株が知られている。
発明が解決しようとする問題点 近年、Ｌ−アルギニン,L−オルニチン，およびＬ−シト
ルリンの需要が増大するにつれ、これらのアミノ酸の製
造法の改善がますます望まれている。
ルリンの需要が増大するにつれ、これらのアミノ酸の製
造法の改善がますます望まれている。
問題点を解決するための手段 本発明者は、組換えDNA技術によりコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属菌種のＬ−アルギニン,L
−シトルリン，およびＬ−オルニチンの生産能力が向上
した菌株を得るため、鋭意研究を重ねた。その結果、大
腸菌のAGK,AGPR,AOD,ASに対応する各々の遺伝子（argB,
argC,argE,argH）を含む組換え体プラスミドpEarg1より
AODに対応する遺伝子を欠損させた新たな組換え体プラ
スミド（pEarg2）を保有するコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属菌株を用いれば、pEarg1を保有
する菌株に比べてＬ−アルギニンの生産性が高まるこ
と、pEarg2を保有する菌株は保有しない菌株に比べ、Ｌ
−オルニチンまたはＬ−シトルリンの生産性が高まるこ
と、またpEarg2に大腸菌のASSに対応する遺伝子（arg
G）を含むDNA断片を組み込んだ組換え体DNA（pEarg4）
を保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属菌株を用いれば、pEarg2を保有する菌株に比べ、
Ｌ−アルギニン生産性がさらに高まることを見出し、本
発明を完成するに至った。
属またはブレビバクテリウム属菌種のＬ−アルギニン,L
−シトルリン，およびＬ−オルニチンの生産能力が向上
した菌株を得るため、鋭意研究を重ねた。その結果、大
腸菌のAGK,AGPR,AOD,ASに対応する各々の遺伝子（argB,
argC,argE,argH）を含む組換え体プラスミドpEarg1より
AODに対応する遺伝子を欠損させた新たな組換え体プラ
スミド（pEarg2）を保有するコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属菌株を用いれば、pEarg1を保有
する菌株に比べてＬ−アルギニンの生産性が高まるこ
と、pEarg2を保有する菌株は保有しない菌株に比べ、Ｌ
−オルニチンまたはＬ−シトルリンの生産性が高まるこ
と、またpEarg2に大腸菌のASSに対応する遺伝子（arg
G）を含むDNA断片を組み込んだ組換え体DNA（pEarg4）
を保有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属菌株を用いれば、pEarg2を保有する菌株に比べ、
Ｌ−アルギニン生産性がさらに高まることを見出し、本
発明を完成するに至った。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、エシェリシア属に属する微生物のＮ−アセチ
ルグルタミン酸キナーゼ,N−アセチル−γ−グルタミル
リン酸レダクターゼおよびアルギニノスクシナーゼの合
成に関与する遺伝情報を担うDNA断片、またはＮ−アセ
チルグルタミン酸キナーゼ,N−アセチル−γ−グルタミ
ルリン酸レダクターゼ，アルギニノスクシナーゼおよび
アルギニノコハク酸シンテターゼの合成に関与する遺伝
情報を担うDNA断片とベクターDNAとの組換え体DNAを保
有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アル
ギニン,L−シトルリンまたはＬ−オルニチンを生成蓄積
させ、該培養物から該アミノ酸を採取することを特徴と
するアミノ酸の製造方法を提供する。
ルグルタミン酸キナーゼ,N−アセチル−γ−グルタミル
リン酸レダクターゼおよびアルギニノスクシナーゼの合
成に関与する遺伝情報を担うDNA断片、またはＮ−アセ
チルグルタミン酸キナーゼ,N−アセチル−γ−グルタミ
ルリン酸レダクターゼ，アルギニノスクシナーゼおよび
アルギニノコハク酸シンテターゼの合成に関与する遺伝
情報を担うDNA断片とベクターDNAとの組換え体DNAを保
有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アル
ギニン,L−シトルリンまたはＬ−オルニチンを生成蓄積
させ、該培養物から該アミノ酸を採取することを特徴と
するアミノ酸の製造方法を提供する。
本発明の宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属
またはブレビバクテリウム属に属する微生物としては、
いわゆるコリネ型グルタミン酸生産菌として知られてい
る微生物は全て用いることができるが、好適には下記の
菌株が用いられる。
またはブレビバクテリウム属に属する微生物としては、
いわゆるコリネ型グルタミン酸生産菌として知られてい
る微生物は全て用いることができるが、好適には下記の
菌株が用いられる。
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC31833 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870 コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 ブレビバクテリウム・ディバリカツム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラブム ATCC14067 ブレビバクテリウム・イマリオフィラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・チオゲンタリス ATCC19240 Ｌ−アルギニンを製造する場合、宿主微生物としてＬ−
アルギニン生産性を有しない菌株を用いることもできる
が、すでにＬ−アルギニン生産性を有する菌株を用いる
こともできる。アルギニン生産性を有する菌株として
は、アミノ酸アナログ耐性変異株など公知の菌株が使用
できる。Ｌ−オルニチンあるいはＬ−シトルリンを製造
する場合には、宿主微生物としてアルギニン要求性が付
与され、すでにＬ−オルニチンあるいはＬ−シトルリン
生産性を有する菌株を用いる。
アルギニン生産性を有しない菌株を用いることもできる
が、すでにＬ−アルギニン生産性を有する菌株を用いる
こともできる。アルギニン生産性を有する菌株として
は、アミノ酸アナログ耐性変異株など公知の菌株が使用
できる。Ｌ−オルニチンあるいはＬ−シトルリンを製造
する場合には、宿主微生物としてアルギニン要求性が付
与され、すでにＬ−オルニチンあるいはＬ−シトルリン
生産性を有する菌株を用いる。
本発明においてAGK,AGPR,AS,およびASSに対応する遺伝
子の供給源となる微生物としてはエシェリシア属に属
し、AGK,AGPR,AS,およびASSの活性を有するものであれ
ばいかなる微生物でもよい。具体的に好適な一例として
は、大腸菌K12株の遺伝子を用いることができる。大腸
菌K12株ではAGK,AGPR,AS,ASSは、各々argB,argC,argH,a
rgGと称する遺伝子にコードされている〔ジェネティク
ス（Genetics）51,167（1965）〕。
子の供給源となる微生物としてはエシェリシア属に属
し、AGK,AGPR,AS,およびASSの活性を有するものであれ
ばいかなる微生物でもよい。具体的に好適な一例として
は、大腸菌K12株の遺伝子を用いることができる。大腸
菌K12株ではAGK,AGPR,AS,ASSは、各々argB,argC,argH,a
rgGと称する遺伝子にコードされている〔ジェネティク
ス（Genetics）51,167（1965）〕。
これらの遺伝子の供給源となる染色体DNAは、これらの
酵素の活性を有する微生物の培養菌体をリゾチームおよ
び界面活性剤で処理して溶菌した後除蛋白し、ついでエ
タノールで沈殿させる常法〔バイオキミカ・エ・バイオ
フィジカ・アクタ（Biochem.Biophys.Acta）72,619（19
63）〕により単離できる。
酵素の活性を有する微生物の培養菌体をリゾチームおよ
び界面活性剤で処理して溶菌した後除蛋白し、ついでエ
タノールで沈殿させる常法〔バイオキミカ・エ・バイオ
フィジカ・アクタ（Biochem.Biophys.Acta）72,619（19
63）〕により単離できる。
アルギニン生合成に係わる酵素の遺伝子を含むDNA断片
を組み込むためのベクターとしては、コリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属菌種中で複製できるも
のであれば特に限定されないが、例えばpCG1（特開昭57
−134500）,pCG2（特開昭58−35197）,pCG4,pCG11（い
ずれも特開昭57−183799）,pCE51,pCE52,pCE53〔いずれ
もモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス
（Mol.Gen.Genet.），196,175（1984）〕pCE54,pCB101
（いずれも特開昭58−105999）あるいはそれらから誘導
されたプラスミドを使用することができる。ベクタープ
ラスミドDNAは、特開昭57−134500あるいは特開昭57−1
86489に開示された方法で、それらを保有する菌株の培
養菌体から単離精製することができる。
を組み込むためのベクターとしては、コリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属菌種中で複製できるも
のであれば特に限定されないが、例えばpCG1（特開昭57
−134500）,pCG2（特開昭58−35197）,pCG4,pCG11（い
ずれも特開昭57−183799）,pCE51,pCE52,pCE53〔いずれ
もモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス
（Mol.Gen.Genet.），196,175（1984）〕pCE54,pCB101
（いずれも特開昭58−105999）あるいはそれらから誘導
されたプラスミドを使用することができる。ベクタープ
ラスミドDNAは、特開昭57−134500あるいは特開昭57−1
86489に開示された方法で、それらを保有する菌株の培
養菌体から単離精製することができる。
AGK,AGPR,AS,およびASSに対応する各遺伝子を含む供与
体DNAとベクターDNAとの組換え体DNAは、試験管内で両D
NAを制限酵素で切断した後、DNAリガーゼで連結反応さ
せ、この結合反応物を用いてAGK,AGPR,AS,またはASSが
欠損したコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属の変異株を形質転換し、欠損形質が相補された形質
転換株を選択することによって得ることができる。この
組換えDNA技法は、特開昭57−186492および特開昭57−1
86489に記載の方法に従って行うことができる。
体DNAとベクターDNAとの組換え体DNAは、試験管内で両D
NAを制限酵素で切断した後、DNAリガーゼで連結反応さ
せ、この結合反応物を用いてAGK,AGPR,AS,またはASSが
欠損したコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属の変異株を形質転換し、欠損形質が相補された形質
転換株を選択することによって得ることができる。この
組換えDNA技法は、特開昭57−186492および特開昭57−1
86489に記載の方法に従って行うことができる。
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株
で直接組換え体DNAを選択する代わりに、例えば大腸菌
のようにすでに遺伝子組換え技法が確立している宿主−
ベクター系を用いることもできる。すなわち、AGK,AGP
R,AS,ASSに対応する各遺伝子を含む供与体DNAと大腸菌
ベクターDNAの試験管内で切断、再結合した反応物を用
い、AGK,AGPR,AS,またはASSが欠損した大腸菌の変異株
を形質転換し、欠損形質が相補された形質転換株を選択
することによって目的遺伝子をクローン化することがで
きる。このクローン化したDNAとコリネバクテリウム属
およびブレビバクテリウム属菌種のベクターDNAを試験
管内で制限酵素で切断した後、DNAリガーゼで再結合反
応させ、この結合反応物を用いて再度、前述のアルギニ
ン生合成酵素が欠損した大腸菌変異株を形質転換し、コ
リネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム属菌種
のベクターDNAの選択マーカーを有し、しかも欠損形質
が相補された形質転換株を選択することによっても同様
な組換え体DNAが取得できる。宿主大腸菌でクローン化
したDNAとコリネバクテリウム属あるいはブレビバクテ
リウム属菌種のベクターDNAとの組換え体の選択は大腸
菌を用いず、アルギニン生合成に関与する酵素が欠損し
たコリネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム属
菌種の変異株を形質転換し、欠損形質が相補された形質
転換株を選択することによっても目的の組換え体DNAを
取得することができる。
で直接組換え体DNAを選択する代わりに、例えば大腸菌
のようにすでに遺伝子組換え技法が確立している宿主−
ベクター系を用いることもできる。すなわち、AGK,AGP
R,AS,ASSに対応する各遺伝子を含む供与体DNAと大腸菌
ベクターDNAの試験管内で切断、再結合した反応物を用
い、AGK,AGPR,AS,またはASSが欠損した大腸菌の変異株
を形質転換し、欠損形質が相補された形質転換株を選択
することによって目的遺伝子をクローン化することがで
きる。このクローン化したDNAとコリネバクテリウム属
およびブレビバクテリウム属菌種のベクターDNAを試験
管内で制限酵素で切断した後、DNAリガーゼで再結合反
応させ、この結合反応物を用いて再度、前述のアルギニ
ン生合成酵素が欠損した大腸菌変異株を形質転換し、コ
リネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム属菌種
のベクターDNAの選択マーカーを有し、しかも欠損形質
が相補された形質転換株を選択することによっても同様
な組換え体DNAが取得できる。宿主大腸菌でクローン化
したDNAとコリネバクテリウム属あるいはブレビバクテ
リウム属菌種のベクターDNAとの組換え体の選択は大腸
菌を用いず、アルギニン生合成に関与する酵素が欠損し
たコリネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム属
菌種の変異株を形質転換し、欠損形質が相補された形質
転換株を選択することによっても目的の組換え体DNAを
取得することができる。
AGK,AGPR,ASの遺伝子（argB,argC,argH）を含むDNAの具
体的に好適な例として、特開昭60−66989に記載されて
いるpEarg1があげられる。pEarg1は大腸菌K12株のジー
ンバンク中のプラスミドpLC20−10〔セル（Cell）９,9
1,（1976）〕とプラスミドpCE53〔モレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティクス（Mol.Gen.Genet.）19
6,175（1984）〕との組換え体として取得したプラスミ
ドで、大腸菌のAGK,AGPR,ASの遺伝子（argB,argC,arg
H）に加えてAODの遺伝子（argE）を含有するものであ
る。pEarg1よりargB,argC,argHのみを含むプラスミドを
作製するには、例えば実施例１に示されるようにargEの
構造遺伝子に対応するDNA断片の一部を削除すればよ
い。
体的に好適な例として、特開昭60−66989に記載されて
いるpEarg1があげられる。pEarg1は大腸菌K12株のジー
ンバンク中のプラスミドpLC20−10〔セル（Cell）９,9
1,（1976）〕とプラスミドpCE53〔モレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティクス（Mol.Gen.Genet.）19
6,175（1984）〕との組換え体として取得したプラスミ
ドで、大腸菌のAGK,AGPR,ASの遺伝子（argB,argC,arg
H）に加えてAODの遺伝子（argE）を含有するものであ
る。pEarg1よりargB,argC,argHのみを含むプラスミドを
作製するには、例えば実施例１に示されるようにargEの
構造遺伝子に対応するDNA断片の一部を削除すればよ
い。
argG遺伝子のクローン化はASS活性を有する大腸菌K12株
亜株、例えばWA802株（FERM BP−718）の染色体DNAを
供与体として、前記の方法により実施できる。
亜株、例えばWA802株（FERM BP−718）の染色体DNAを
供与体として、前記の方法により実施できる。
また、argB,argC,argHおよびargG各遺伝子を全て含む組
換え体DNAは、たとえばargG遺伝子を含むDNA断片と、前
記のargB,argC,argH各遺伝子を含むプラスミドとを連結
することにより取得することができる。
換え体DNAは、たとえばargG遺伝子を含むDNA断片と、前
記のargB,argC,argH各遺伝子を含むプラスミドとを連結
することにより取得することができる。
以上のように取得したargB,argC,argHを含む組換え体DN
A、argGを含む組換え体DNA、あるいはargB,argC,argH,a
rgGを全て含む組換え体DNAは、特開昭57−186492および
特開昭57−186489に示したプロトプラストを使用する方
法により、コリネバクテリウム属あるいはブレビバクテ
リウム属菌種に導入することができる。これらの組換え
体DNA保有株によるＬ−アルギニン,L−シトルリン，あ
るいはＬ−オルニチンの生産は、従来の発酵法によるこ
れらアミノ酸の製造に用いられる方法により行うことが
できる。すなわち、該形質転換株を炭素源，窒素源，無
機物，アミノ酸，ビタミンなどを含有する通常の培地
中、好気的条件下、温度,pHなどを調節しつつ培養を行
えば、培養物中にＬ−アルギニン,L−シトルリン，ある
いはＬ−オルニチンが生成蓄積するので、これを採取す
る。
A、argGを含む組換え体DNA、あるいはargB,argC,argH,a
rgGを全て含む組換え体DNAは、特開昭57−186492および
特開昭57−186489に示したプロトプラストを使用する方
法により、コリネバクテリウム属あるいはブレビバクテ
リウム属菌種に導入することができる。これらの組換え
体DNA保有株によるＬ−アルギニン,L−シトルリン，あ
るいはＬ−オルニチンの生産は、従来の発酵法によるこ
れらアミノ酸の製造に用いられる方法により行うことが
できる。すなわち、該形質転換株を炭素源，窒素源，無
機物，アミノ酸，ビタミンなどを含有する通常の培地
中、好気的条件下、温度,pHなどを調節しつつ培養を行
えば、培養物中にＬ−アルギニン,L−シトルリン，ある
いはＬ−オルニチンが生成蓄積するので、これを採取す
る。
炭素源としてはグルコース，グリセロール，フラクトー
ス，シュークロース，マルトース，マンノース，澱粉，
澱粉加水分解液，糖蜜などの炭水化物、ポリアルコー
ル，ピルビン酸，フマール酸，乳酸，酢酸などの各種有
機酸が使用できる。さらに菌の資化性によって、炭化水
素，アルコール類なども用いうる。とくに廃糖蜜は好適
に用いられる。
ス，シュークロース，マルトース，マンノース，澱粉，
澱粉加水分解液，糖蜜などの炭水化物、ポリアルコー
ル，ピルビン酸，フマール酸，乳酸，酢酸などの各種有
機酸が使用できる。さらに菌の資化性によって、炭化水
素，アルコール類なども用いうる。とくに廃糖蜜は好適
に用いられる。
窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム，
硫酸アンモニウム，炭酸アンモニウム，酢酸アンモニウ
ムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは
尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン,NZ−ア
ミン，肉エキス，酵母エキス，コーン・スチープ・リカ
ー，カゼイン加水分解物，フィッシュミールあるいはそ
の消化物，脱脂大豆粕あるいはその消化物，蛹加水分解
物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能であ
る。
硫酸アンモニウム，炭酸アンモニウム，酢酸アンモニウ
ムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは
尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン,NZ−ア
ミン，肉エキス，酵母エキス，コーン・スチープ・リカ
ー，カゼイン加水分解物，フィッシュミールあるいはそ
の消化物，脱脂大豆粕あるいはその消化物，蛹加水分解
物などの窒素含有有機物など種々のものが使用可能であ
る。
さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム，燐酸第
二水素カリウム，硫酸アンモニウム，塩化アンモニウ
ム，硫酸マグネシウム，塩化ナトリウム，硫酸第一鉄，
硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する。微
生物の生育に必要とするビタミン，アミノ酸源などは、
前記したような他の培地成分に従って培地に供給されれ
ば特に加えなくてもよい。
二水素カリウム，硫酸アンモニウム，塩化アンモニウ
ム，硫酸マグネシウム，塩化ナトリウム，硫酸第一鉄，
硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する。微
生物の生育に必要とするビタミン，アミノ酸源などは、
前記したような他の培地成分に従って培地に供給されれ
ば特に加えなくてもよい。
培養は振盪培養あるいは通気撹拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が好適である。培
養中の培地のpHは中性付近に維持することが望ましい。
培養期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−アルギニン,L
−シトルリン，あるいはＬ−オルニチンが蓄積する。
下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が好適である。培
養中の培地のpHは中性付近に維持することが望ましい。
培養期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−アルギニン,L
−シトルリン，あるいはＬ−オルニチンが蓄積する。
培養終了後、菌体を除去して活性炭処理，イオン交換樹
脂処理などの公知の方法で培養液からＬ−アルギニン,L
−シトルリン，あるいはＬ−オルニチンを回収する。
脂処理などの公知の方法で培養液からＬ−アルギニン,L
−シトルリン，あるいはＬ−オルニチンを回収する。
このようにしてargB,argC,argHを含む組換え体DNAを保
有させたコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌株を用いることにより非保有株に比べ高い収率で
Ｌ−アルギニン,L−シトルリン，あるいはＬ−オルニチ
ンを生産することが、またargB,argC,argHおよびargGを
含む組換え体DNAを保有させたコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属菌株を用いることにより非保
有株に比べ高い収率でＬ−アルギニンを生産することが
できる。かかる微生物として、具体的にはたとえばコリ
ネバクテリウム・グルタミクムK62（アルギニン生産性;
FERM BP−1112），コリネバクテリウム・グルタミクム
K63（アルギニン生産性;FERM BP−1113）があげられ
る。それらは、シトルリン生産菌コリネバクテリウム・
グルタミクムK61（FERM BP−1111）とともに工業技術
院微生物工業技術研究所（微工研）に昭和61年７月24日
付で寄託されている。
有させたコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌株を用いることにより非保有株に比べ高い収率で
Ｌ−アルギニン,L−シトルリン，あるいはＬ−オルニチ
ンを生産することが、またargB,argC,argHおよびargGを
含む組換え体DNAを保有させたコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属菌株を用いることにより非保
有株に比べ高い収率でＬ−アルギニンを生産することが
できる。かかる微生物として、具体的にはたとえばコリ
ネバクテリウム・グルタミクムK62（アルギニン生産性;
FERM BP−1112），コリネバクテリウム・グルタミクム
K63（アルギニン生産性;FERM BP−1113）があげられ
る。それらは、シトルリン生産菌コリネバクテリウム・
グルタミクムK61（FERM BP−1111）とともに工業技術
院微生物工業技術研究所（微工研）に昭和61年７月24日
付で寄託されている。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例 （１） 大腸菌のアルギニン要求性変異株の取得 アルギニン生合成遺伝子のクローニングおよびクローン
化した遺伝子の確認のために、アルギニン生合成遺伝子
を欠損した大腸菌株を以下のように取得した。
化した遺伝子の確認のために、アルギニン生合成遺伝子
を欠損した大腸菌株を以下のように取得した。
大腸菌K12株亜株WA802（メチオニン要求性;FERM BP−7
18）にＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン（NTG）400γ/mlを用いて通常の変異処理を施した
後、ペニシリンを用いる栄養要求株の濃縮法〔エックス
ペリメント・イン・モレキュラー・ジェネティクス（Ex
periment in Molecular Genetics）p.230,コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー（1972）〕に従って
アルギニン要求株を濃縮後選択した。得られたアルギニ
ン要求株の変異遺伝子の同定は、各アルギニン生合成酵
素の活性を測定することによって行った。
18）にＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン（NTG）400γ/mlを用いて通常の変異処理を施した
後、ペニシリンを用いる栄養要求株の濃縮法〔エックス
ペリメント・イン・モレキュラー・ジェネティクス（Ex
periment in Molecular Genetics）p.230,コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー（1972）〕に従って
アルギニン要求株を濃縮後選択した。得られたアルギニ
ン要求株の変異遺伝子の同定は、各アルギニン生合成酵
素の活性を測定することによって行った。
活性測定法は、AGK,AODおよびASについては、ジャーナ
ル・オブ・ジェネラル・ミクロバイオロジィ（J.Gen.Mi
crobiol.）69,365（1971）、AGPRについては、バイオキ
ミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochem.Biophys.
Acta）108,306（1965）、ASSについては、ジャーナル・
オブ・バイオケミストリィ（J.Biochem.）85,1309（197
9）に従って行った。その結果、AGK（argB）欠損変異株
としてEA−21、AGPR（argC）欠損変異株としてEA−35、
AOD（argE）欠損変異株としてEA−４、ASS（argG）欠損
変異株としてEA−51、AS（argH）欠損変異株としてEA−
77を取得した。
ル・オブ・ジェネラル・ミクロバイオロジィ（J.Gen.Mi
crobiol.）69,365（1971）、AGPRについては、バイオキ
ミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochem.Biophys.
Acta）108,306（1965）、ASSについては、ジャーナル・
オブ・バイオケミストリィ（J.Biochem.）85,1309（197
9）に従って行った。その結果、AGK（argB）欠損変異株
としてEA−21、AGPR（argC）欠損変異株としてEA−35、
AOD（argE）欠損変異株としてEA−４、ASS（argG）欠損
変異株としてEA−51、AS（argH）欠損変異株としてEA−
77を取得した。
（２） 大腸菌のargB,argC,argH各遺伝子を含みargE遺
伝子を含まないプラスミドDNAの作製 特開昭60−66989に示されているように、大腸菌のargB,
argC,argH,argE各遺伝子からなるクラスターを含む組換
え体DNApEarg1は、pLC20−10とpCE53との組換え体とし
て取得できる。pCL20−10は大腸菌K12株のジーンバンク
中から得られ、上記遺伝子群を有することが知られてい
る〔セル（Cell）９,91（1976）〕。pCE53はモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Mol.Gen.Ge
net.）196,175（1984）に示したプラスミドで、選択マ
ーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を有し、大腸菌と
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属など
のコリネ型グルタミン酸生産菌の双方で複製する。pEar
g1は第１図に示すような各種制限酵素の切断部位を有し
ているが、このうち２ヶ所存在するSal I切断部位は、
いずれもargEの構造遺伝子内に存在することが示されて
いる〔ジーン（Gene）５,207（1979）〕。
伝子を含まないプラスミドDNAの作製 特開昭60−66989に示されているように、大腸菌のargB,
argC,argH,argE各遺伝子からなるクラスターを含む組換
え体DNApEarg1は、pLC20−10とpCE53との組換え体とし
て取得できる。pCL20−10は大腸菌K12株のジーンバンク
中から得られ、上記遺伝子群を有することが知られてい
る〔セル（Cell）９,91（1976）〕。pCE53はモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Mol.Gen.Ge
net.）196,175（1984）に示したプラスミドで、選択マ
ーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を有し、大腸菌と
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属など
のコリネ型グルタミン酸生産菌の双方で複製する。pEar
g1は第１図に示すような各種制限酵素の切断部位を有し
ているが、このうち２ヶ所存在するSal I切断部位は、
いずれもargEの構造遺伝子内に存在することが示されて
いる〔ジーン（Gene）５,207（1979）〕。
pEarg1からargB,argC,argH各遺伝子を含み、argE遺伝子
を含まないプラスミドDNAの取得は以下の方法により行
った。まずpEarg1を保有する大腸菌K12株亜株WA802の培
養菌体から、アンらの方法〔ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジィ（J.Bacteriol.）140,400（1979）〕に従い
単離した。pEarg1プラスミドDNA2μｇを含む制限酵素Sa
l I用反応緩衝液〔10mMトリス（ヒドロキシルメチル）
アミノメタン（以下トリスと略す）,150mM NaCl,7mM
MgCl2,pH8.0〕100μに５単位のSal I（宝酒造社製,8
単位／μ）を添加し、37℃で１時間反応させた。該消
化物を65℃で１時間加温した後、10倍濃度のT4リガーゼ
反応緩衝液（660mMトリス,66mM MgCl2,100mMジチオス
レイトール,pH7.6）12μ,ATP（100mM）３μ,T4リガ
ーゼ（宝酒造社製,350単位／μ）１μを加え、４℃
で24時間反応させた。このリガーゼ反応混合物を形質転
換に供した。受容菌としては、（１）で取得したargEを
欠損した大腸菌K12株亜株EA−４（アルギニン，メチオ
ニン要求性）を用いた。EA−４のコンピテント・セルは
ダジェルトらの方法〔ジーン（Gene）６,23（1979）〕
で調製した。
を含まないプラスミドDNAの取得は以下の方法により行
った。まずpEarg1を保有する大腸菌K12株亜株WA802の培
養菌体から、アンらの方法〔ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジィ（J.Bacteriol.）140,400（1979）〕に従い
単離した。pEarg1プラスミドDNA2μｇを含む制限酵素Sa
l I用反応緩衝液〔10mMトリス（ヒドロキシルメチル）
アミノメタン（以下トリスと略す）,150mM NaCl,7mM
MgCl2,pH8.0〕100μに５単位のSal I（宝酒造社製,8
単位／μ）を添加し、37℃で１時間反応させた。該消
化物を65℃で１時間加温した後、10倍濃度のT4リガーゼ
反応緩衝液（660mMトリス,66mM MgCl2,100mMジチオス
レイトール,pH7.6）12μ,ATP（100mM）３μ,T4リガ
ーゼ（宝酒造社製,350単位／μ）１μを加え、４℃
で24時間反応させた。このリガーゼ反応混合物を形質転
換に供した。受容菌としては、（１）で取得したargEを
欠損した大腸菌K12株亜株EA−４（アルギニン，メチオ
ニン要求性）を用いた。EA−４のコンピテント・セルは
ダジェルトらの方法〔ジーン（Gene）６,23（1979）〕
で調製した。
すなわち、Ｌ培地（バクトトリプトン10g,酵母エキス5
g,グルコース1gおよびNaCl5gを水１に含み、pH7.2に
調整した培地）50mlにEA−４株を植菌し、東京光電比色
計で660nmにおける吸光度（OD）（以下、特記しないか
ぎり吸光度は660nmで測定）が0.5になるまで37℃で培養
した。培養液を氷水中で10分間冷却してから遠心した。
冷却した0.1M CaCl220mlに菌体を再懸濁し、０℃に20
分間置いた。菌体を再遠心し、0.1M CaCl20.5mlに懸濁
し、０℃で18時間置いた。CaCl2処理した菌液150μに
前記リガーゼ反応混合物50μを添加混合し、０℃に10
分間置いてから37℃で５分間加温した。次いでＬ培地2m
lを添加し、37℃で２時間振盪培養した。生理食塩水で
２回遠心洗浄後、25μg/ml相当のカナマイシンを添加し
たＬ寒天培地〔Ｌ培地１に寒天16gを含む培地〕に塗
布し、37℃で１日培養した。出現した形質転換株は、メ
チオニン30μg/mlを含むデービス最少寒天培地〔グルコ
ース2g,（NH4）2SO41g,K2HPO47g,KH2PO42g,MgSO4・7H2O
0.1g,クエン酸３ナトリウム塩0.5g,サイアミン塩酸塩4m
g,および寒天16gを水１に含み、pH7.2に調整した培
地〕，およびメチオニンとアルギニン各30μg/mlを含む
デービス最少寒天培地に塗布し、アルギニン要求性を調
べた。このうちアルギニン要求性を示した形質転換株の
培養菌体から、前記のpEarg1を単離したのと同様の方法
によりプラスミドDNAを単離した。このプラスミドDNAは
制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析した結
果、第１図に示すようにpEarg1の２ヶ所のSal I切断部
位にはさまれた0.5KbのDNA断片が欠失した構造を有して
いた。このプラスミドをpEarg2と命名した。
g,グルコース1gおよびNaCl5gを水１に含み、pH7.2に
調整した培地）50mlにEA−４株を植菌し、東京光電比色
計で660nmにおける吸光度（OD）（以下、特記しないか
ぎり吸光度は660nmで測定）が0.5になるまで37℃で培養
した。培養液を氷水中で10分間冷却してから遠心した。
冷却した0.1M CaCl220mlに菌体を再懸濁し、０℃に20
分間置いた。菌体を再遠心し、0.1M CaCl20.5mlに懸濁
し、０℃で18時間置いた。CaCl2処理した菌液150μに
前記リガーゼ反応混合物50μを添加混合し、０℃に10
分間置いてから37℃で５分間加温した。次いでＬ培地2m
lを添加し、37℃で２時間振盪培養した。生理食塩水で
２回遠心洗浄後、25μg/ml相当のカナマイシンを添加し
たＬ寒天培地〔Ｌ培地１に寒天16gを含む培地〕に塗
布し、37℃で１日培養した。出現した形質転換株は、メ
チオニン30μg/mlを含むデービス最少寒天培地〔グルコ
ース2g,（NH4）2SO41g,K2HPO47g,KH2PO42g,MgSO4・7H2O
0.1g,クエン酸３ナトリウム塩0.5g,サイアミン塩酸塩4m
g,および寒天16gを水１に含み、pH7.2に調整した培
地〕，およびメチオニンとアルギニン各30μg/mlを含む
デービス最少寒天培地に塗布し、アルギニン要求性を調
べた。このうちアルギニン要求性を示した形質転換株の
培養菌体から、前記のpEarg1を単離したのと同様の方法
によりプラスミドDNAを単離した。このプラスミドDNAは
制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析した結
果、第１図に示すようにpEarg1の２ヶ所のSal I切断部
位にはさまれた0.5KbのDNA断片が欠失した構造を有して
いた。このプラスミドをpEarg2と命名した。
このプラスミドDNAを用いてEA−４株を前記と同様に再
形質転換した結果、得られたカナマイシン耐性形質転換
株は全てアルギニン要求性を有していた。しかし、argB
を欠損した大腸菌K12株亜株EA−21,argCを欠損した大腸
菌K12株亜株EA−35およびargHを欠損した大腸菌K12株亜
株EA−77（以上いずれもアルギニン，メチオニン要求
性）をpEarg2で形質転換した結果、得られたカナマイシ
ン耐性形質転換株はすべてアルギニン非要求性であっ
た。このことよりpEarg2はargB,argC,argH各遺伝子を含
み、argE遺伝子は含まないプラスミドであることが判明
した（第１図参照）。
形質転換した結果、得られたカナマイシン耐性形質転換
株は全てアルギニン要求性を有していた。しかし、argB
を欠損した大腸菌K12株亜株EA−21,argCを欠損した大腸
菌K12株亜株EA−35およびargHを欠損した大腸菌K12株亜
株EA−77（以上いずれもアルギニン，メチオニン要求
性）をpEarg2で形質転換した結果、得られたカナマイシ
ン耐性形質転換株はすべてアルギニン非要求性であっ
た。このことよりpEarg2はargB,argC,argH各遺伝子を含
み、argE遺伝子は含まないプラスミドであることが判明
した（第１図参照）。
（３） pEarg2保有株によるＬ−アルギニン,L−シトル
リン,L−オルニチンの生産 コリネバクテリウム・グルタミクムATCC31833,コリネバ
クテリウム・ハーキュリスATCC13868,ブレビバクテリウ
ム・フラブムATCC14067,L−オルニチン生産性菌株コリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC13232,およびコリネ
バクテリウム・グルタミクムATCC13032よりアルギニン
要求株として分離したシトルリン生産性菌株コリネバク
テリウム・グルタミクムK61（FERM BP−1111）のプロ
トプラストを形質転換してpEarg2を導入した。コリネバ
クテリウム・グルタミクムATCC31833,コリネバクテリウ
ム・ハーキュリスATCC13868,ブレビバクテリウム・フラ
ブムATCC14067,コリネバクテリウム・グルタミクムATCC
13232,コリネバクテリウム・グルタミクムK61（FERM B
P−1111）をそれぞれNB培地（粉末ブイヨン20g,酵母エ
キス5gを水１に含みpH7.2に調整した培地）にて30℃
で一昼夜振盪培養し、その種培養0.1mlを10mlのSSM培地
〔グルコース10g,NH4Cl4g,尿素2g,酵母エキス1g,KH2PO4
1g,K2HPO43g,MgCl2・6H2O0.4g,FeSO4・7H2O10mg,MnSO4
・４〜6H2O0.2mg,ZnSO4・7H2O0.9mg,CuSO4・5H2O0.4mg,
Na2B4O7・10H2O0.09mg,（NH4）6Mo7O24・4H2O0.04mg,ビ
オチン30μg,サイアミン塩酸塩1mgを純水１に含みpH
7.2に調整した培地〕，あるいはアルギニン200μg/mlを
添加したSSM培地10mlの入ったＬ字型試験管に接種し、
モノ−型培養槽にて30℃で振盪培養した。ODが0.15にな
った時点で0.5単位/mlになるようにペニシリンＧを添加
した。さらに培養を続け、ODが約0.6になったところで
細胞を集菌し、RCGP培地〔グルコース5g,カザミノ酸5g,
酵母エキス2.5g,K2HPO43.5g,KH2PO41.5g,MgCl2・6H2O0.
41g,FeSO4・7H2O10mg,MnSO4・４〜6H2O2mg,ZnSO4・7H2O
0.9mg,（NH4）6Mo7O24・4H2O0.04mg,ビオチン30μg,サ
イアミン塩酸塩2mg,コハク酸二ナトリウム135g,ポリビ
ニルピロリドン（分子量10,000）30gを水１に含む培
地〕に1mg/mlのリゾチームを含む液2.5ml（pH7.6）に約
109細胞/mlとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して30
℃で15時間緩やかに振盪反応してプロトプラスト化し
た。このプロトプラスト菌液0.5mlを小試験管にとり、
2,500×ｇで５分間遠心分離し、TSMC緩衝液〔10mM MgC
l2,30mM CaCl2,50mMトリス,400mMショ糖,pH7.5〕1mlに
懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1mlに再懸濁した。
この菌液に２倍濃度のTSMC緩衝液とpEarg2プラスミドDN
A溶液との１対１混合液100μを加えて混和し、次いで
TSMC緩衝液中に20％ポリエチレングリコール（PEG）6,0
00（半井化学薬品社製）を含む液1.0mlを添加して混合
した。３分後2,500×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄
液を除去し、沈降したプロトプラストを1mlのRCGP培地
（pH7.4）に懸濁してから30℃で２時間緩やかに振盪し
た。ついでこのプロトプラスト懸濁液の0.3mlをカナマ
イシン400μg/mlを含むRCGP寒天培地（RCGP培地に1.6％
寒天を含む培地、pH7.4）に塗抹し、３℃で８日間培養
した。
リン,L−オルニチンの生産 コリネバクテリウム・グルタミクムATCC31833,コリネバ
クテリウム・ハーキュリスATCC13868,ブレビバクテリウ
ム・フラブムATCC14067,L−オルニチン生産性菌株コリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC13232,およびコリネ
バクテリウム・グルタミクムATCC13032よりアルギニン
要求株として分離したシトルリン生産性菌株コリネバク
テリウム・グルタミクムK61（FERM BP−1111）のプロ
トプラストを形質転換してpEarg2を導入した。コリネバ
クテリウム・グルタミクムATCC31833,コリネバクテリウ
ム・ハーキュリスATCC13868,ブレビバクテリウム・フラ
ブムATCC14067,コリネバクテリウム・グルタミクムATCC
13232,コリネバクテリウム・グルタミクムK61（FERM B
P−1111）をそれぞれNB培地（粉末ブイヨン20g,酵母エ
キス5gを水１に含みpH7.2に調整した培地）にて30℃
で一昼夜振盪培養し、その種培養0.1mlを10mlのSSM培地
〔グルコース10g,NH4Cl4g,尿素2g,酵母エキス1g,KH2PO4
1g,K2HPO43g,MgCl2・6H2O0.4g,FeSO4・7H2O10mg,MnSO4
・４〜6H2O0.2mg,ZnSO4・7H2O0.9mg,CuSO4・5H2O0.4mg,
Na2B4O7・10H2O0.09mg,（NH4）6Mo7O24・4H2O0.04mg,ビ
オチン30μg,サイアミン塩酸塩1mgを純水１に含みpH
7.2に調整した培地〕，あるいはアルギニン200μg/mlを
添加したSSM培地10mlの入ったＬ字型試験管に接種し、
モノ−型培養槽にて30℃で振盪培養した。ODが0.15にな
った時点で0.5単位/mlになるようにペニシリンＧを添加
した。さらに培養を続け、ODが約0.6になったところで
細胞を集菌し、RCGP培地〔グルコース5g,カザミノ酸5g,
酵母エキス2.5g,K2HPO43.5g,KH2PO41.5g,MgCl2・6H2O0.
41g,FeSO4・7H2O10mg,MnSO4・４〜6H2O2mg,ZnSO4・7H2O
0.9mg,（NH4）6Mo7O24・4H2O0.04mg,ビオチン30μg,サ
イアミン塩酸塩2mg,コハク酸二ナトリウム135g,ポリビ
ニルピロリドン（分子量10,000）30gを水１に含む培
地〕に1mg/mlのリゾチームを含む液2.5ml（pH7.6）に約
109細胞/mlとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して30
℃で15時間緩やかに振盪反応してプロトプラスト化し
た。このプロトプラスト菌液0.5mlを小試験管にとり、
2,500×ｇで５分間遠心分離し、TSMC緩衝液〔10mM MgC
l2,30mM CaCl2,50mMトリス,400mMショ糖,pH7.5〕1mlに
懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1mlに再懸濁した。
この菌液に２倍濃度のTSMC緩衝液とpEarg2プラスミドDN
A溶液との１対１混合液100μを加えて混和し、次いで
TSMC緩衝液中に20％ポリエチレングリコール（PEG）6,0
00（半井化学薬品社製）を含む液1.0mlを添加して混合
した。３分後2,500×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄
液を除去し、沈降したプロトプラストを1mlのRCGP培地
（pH7.4）に懸濁してから30℃で２時間緩やかに振盪し
た。ついでこのプロトプラスト懸濁液の0.3mlをカナマ
イシン400μg/mlを含むRCGP寒天培地（RCGP培地に1.6％
寒天を含む培地、pH7.4）に塗抹し、３℃で８日間培養
した。
出現したカナマイシン耐性形質転換抹を400mlSSM培地で
振盪培養し、ODが0.15になったところで0.5単位/mlとな
るようにペニシリンＧを添加し、さらにODが0.65になる
まで培養した。培養液から菌体を集菌し、TES緩衝液
（トリス0.03M,EDTA0.005M,NaCl0.05M,pH8.0）で洗浄
後、リゾチーム液（25％ショ糖,0.1M NaCl,0.05Mトリ
ス,0.8mg/mlリゾチーム:pH8.0）10mlに懸濁し、37℃で
４時間反応させた。反応液に5M NaCl2.4ml,0.5M EDTA
（pH8.0）0.6ml,および４％ラウリル硫酸ナトリウムと
0.7M NaClからなる溶液4.4mlを順次添加し、緩やかに
混和してから氷水中に15時間置いた。溶解物全量を遠心
管に移し、４℃で60分間69,400×ｇの遠心分離にかけ上
澄液を回収した。これに重量百分率10％相当のPEG6,000
（半井化学薬品社製）を加え、静かに混和して溶解後、
氷水中に置いた。10時間後、1,500×ｇで10分間遠心分
離してペレットを回収した。TES緩衝液5mlを加えてペレ
ットを静かに再溶解してから1.5mg/mlエチジウムブロマ
イド2.0mlを添加し、これに塩化セシウムを加えて静か
に溶解し、密度を1.580に合わせた。この溶液を105,000
×g,18℃で48時間超遠心分離にかけた。この密度勾配遠
心により共有結合で閉じられた環状のDNAは、紫外線照
射することによって遠心チューブ中下方の密度の高いバ
ンドとして見出された。このバンドを注射器で遠心チュ
ーブの側面から抜きとることによってプラスミドを分離
した。ついで分離液を等容量のイソプロピルアルコール
液〔容量百分率90％イソプロピルアルコール,10％TES緩
衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含
む）〕で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去
し、しかる後にTES緩衝液に対して透析した。こうして
プラスミドDNAを得た。
振盪培養し、ODが0.15になったところで0.5単位/mlとな
るようにペニシリンＧを添加し、さらにODが0.65になる
まで培養した。培養液から菌体を集菌し、TES緩衝液
（トリス0.03M,EDTA0.005M,NaCl0.05M,pH8.0）で洗浄
後、リゾチーム液（25％ショ糖,0.1M NaCl,0.05Mトリ
ス,0.8mg/mlリゾチーム:pH8.0）10mlに懸濁し、37℃で
４時間反応させた。反応液に5M NaCl2.4ml,0.5M EDTA
（pH8.0）0.6ml,および４％ラウリル硫酸ナトリウムと
0.7M NaClからなる溶液4.4mlを順次添加し、緩やかに
混和してから氷水中に15時間置いた。溶解物全量を遠心
管に移し、４℃で60分間69,400×ｇの遠心分離にかけ上
澄液を回収した。これに重量百分率10％相当のPEG6,000
（半井化学薬品社製）を加え、静かに混和して溶解後、
氷水中に置いた。10時間後、1,500×ｇで10分間遠心分
離してペレットを回収した。TES緩衝液5mlを加えてペレ
ットを静かに再溶解してから1.5mg/mlエチジウムブロマ
イド2.0mlを添加し、これに塩化セシウムを加えて静か
に溶解し、密度を1.580に合わせた。この溶液を105,000
×g,18℃で48時間超遠心分離にかけた。この密度勾配遠
心により共有結合で閉じられた環状のDNAは、紫外線照
射することによって遠心チューブ中下方の密度の高いバ
ンドとして見出された。このバンドを注射器で遠心チュ
ーブの側面から抜きとることによってプラスミドを分離
した。ついで分離液を等容量のイソプロピルアルコール
液〔容量百分率90％イソプロピルアルコール,10％TES緩
衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含
む）〕で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去
し、しかる後にTES緩衝液に対して透析した。こうして
プラスミドDNAを得た。
これらのプラスミドを制限酵素消化とアガロースゲル電
気泳動で解析した結果、各種制限酵素切断様式で特徴付
けられるpEarg2と同一の構造を有するものであることが
わかった。
気泳動で解析した結果、各種制限酵素切断様式で特徴付
けられるpEarg2と同一の構造を有するものであることが
わかった。
こうして形質転換株コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC31833/pEarg2,コリネバクテリウム・ハーキュリスA
TCC13868/pEarg2,ブレビバクテリウム・フラブムATCC14
067/pEarg2,コリネバクテリウム・グルタミクムATCC132
32/pEarg2およびコリネバクテリウム・グルタミクムK61
/pEarg2を取得した。このうち形質転換株コリネバクテ
リウム・グルタミクムATCC31833/pEarg2はコリネバクテ
リウム・グルタミクムK62（FERM BP−1112）として微
工研に寄託されている。
ATCC31833/pEarg2,コリネバクテリウム・ハーキュリスA
TCC13868/pEarg2,ブレビバクテリウム・フラブムATCC14
067/pEarg2,コリネバクテリウム・グルタミクムATCC132
32/pEarg2およびコリネバクテリウム・グルタミクムK61
/pEarg2を取得した。このうち形質転換株コリネバクテ
リウム・グルタミクムATCC31833/pEarg2はコリネバクテ
リウム・グルタミクムK62（FERM BP−1112）として微
工研に寄託されている。
また同様の操作によってコリネバクテリウム・グルタミ
クムATCC31833,コリネバクテリウム・ハーキュリスATCC
13868,ブレビバクテリウム・フラブムATCC14067,コリネ
バクテリウム・グルタミクムATCC13232,およびコリネバ
クテリウム・グルタミクムK61にpEarg1を導入し、各々
の形質転換株を得た。
クムATCC31833,コリネバクテリウム・ハーキュリスATCC
13868,ブレビバクテリウム・フラブムATCC14067,コリネ
バクテリウム・グルタミクムATCC13232,およびコリネバ
クテリウム・グルタミクムK61にpEarg1を導入し、各々
の形質転換株を得た。
得られたpEarg1,pEarg2各形質転換株について、以下の
ようにＬ−アルギニン,L−シトルリン，あるいはＬ−オ
ルニチンの生産試験を行った。
ようにＬ−アルギニン,L−シトルリン，あるいはＬ−オ
ルニチンの生産試験を行った。
NB培地中で30℃,16時間振盪培養した種培養0.5mlを生産
培地5ml〔廃糖蜜80g（グルコース換算），（NH4）2SO44
0g,KH2PO40.5g,K2HPO40.5g,CaCO320gを水１に含み、p
H7.0に調整した培地〕の入った試験管に接種し、30℃で
72時間振盪培養した。ただし、Ｌ−シトルリンまたはＬ
−オルニチンの生産試験では、該生産培地5mlに100μg/
mlのＬ−アルギニンを添加した。培養後、培養濾液をペ
ーパークロマトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後
比色定量してＬ−アルギニン,L−シトルリン，およびＬ
−オルニチンの生成量を測定した。
培地5ml〔廃糖蜜80g（グルコース換算），（NH4）2SO44
0g,KH2PO40.5g,K2HPO40.5g,CaCO320gを水１に含み、p
H7.0に調整した培地〕の入った試験管に接種し、30℃で
72時間振盪培養した。ただし、Ｌ−シトルリンまたはＬ
−オルニチンの生産試験では、該生産培地5mlに100μg/
mlのＬ−アルギニンを添加した。培養後、培養濾液をペ
ーパークロマトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後
比色定量してＬ−アルギニン,L−シトルリン，およびＬ
−オルニチンの生成量を測定した。
結果を第１表，第２表，第３表に示す。
以上の結果より、pEarg1（argB,argC,argHおよびargE遺
伝子を含有）よりargE遺伝子を欠失させて得たプラスミ
ドpEarg2の導入株では、pEarg1導入株に比べ、アルギニ
ン，オルニチンまたはシトルリンの生産性が向上するこ
とが明らかになった。
伝子を含有）よりargE遺伝子を欠失させて得たプラスミ
ドpEarg2の導入株では、pEarg1導入株に比べ、アルギニ
ン，オルニチンまたはシトルリンの生産性が向上するこ
とが明らかになった。
（４） 大腸菌argG遺伝子を含むプラスミドDNAの調製 大腸菌argG遺伝子を含む染色体DNAは、前記の大腸菌K12
株亜株WA802（FERM BP−718）より常法〔バイオキミカ
・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochem.Biophys.Act
a）72,619（1963）〕により単離した。
株亜株WA802（FERM BP−718）より常法〔バイオキミカ
・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochem.Biophys.Act
a）72,619（1963）〕により単離した。
ベクターとして使用したpBR322（アンピシリン耐性，テ
トラサイクリン耐性）は宝酒造社製の市販品を用いた。
pBR322プラスミドDNA1μｇおよびWA802染色体DNA3μｇ
を含む制限酵素Ban III用反応液（10mMトリス,50mM Na
Cl,7mM MgCl2,pH7.5）100μに16単位のBan III（東
洋紡績社製）を添加し、37℃で60分間反応後、65℃で40
分間加温して反応を停止した。該反応消化物に10倍濃度
のT4リガーゼ緩衝液12μ,100mM ATP3μおよびT4リ
ガーゼ（宝酒造社製）350単位を加え、12℃で16時間反
応させた。このリガーゼ反応混合物を（１）で取得した
大腸菌K12株亜株EA−51（アルギニン，メチオニン要求
性）の形質転換に供した。EA−51株のコンピテント・セ
ルは実施例（２）に記した方法により調製した。選択培
地は30μg/mlのメチオニン，および50μg/mlのアンピシ
リンを添加したデービス最少寒天培地を用いた。出現し
た形質転換株の培養菌体から前記のアンらの方法により
プラスミドDNAを単離した。形質転換株から得られ、pEa
rg3と命名したプラスミドは、各種制限酵素での消化と
アガロースゲル電気泳動による解析の結果、pBR322の唯
一のBan III（Cla Iと切断認識部位が同一）切断部位に
７キロベースのBan III DNA断片が挿入された構造であ
ることが示された。pEarg3を用い、EA−51株を前記と同
様に再形質転換したところ、アンピシリン耐性で選択さ
れた形質転換株は全てアルギニン非要求性を示した。こ
のことから大腸菌argG遺伝子がクローン化されているこ
とが確認された。pEarg3の作製過程を第１図に示す。
トラサイクリン耐性）は宝酒造社製の市販品を用いた。
pBR322プラスミドDNA1μｇおよびWA802染色体DNA3μｇ
を含む制限酵素Ban III用反応液（10mMトリス,50mM Na
Cl,7mM MgCl2,pH7.5）100μに16単位のBan III（東
洋紡績社製）を添加し、37℃で60分間反応後、65℃で40
分間加温して反応を停止した。該反応消化物に10倍濃度
のT4リガーゼ緩衝液12μ,100mM ATP3μおよびT4リ
ガーゼ（宝酒造社製）350単位を加え、12℃で16時間反
応させた。このリガーゼ反応混合物を（１）で取得した
大腸菌K12株亜株EA−51（アルギニン，メチオニン要求
性）の形質転換に供した。EA−51株のコンピテント・セ
ルは実施例（２）に記した方法により調製した。選択培
地は30μg/mlのメチオニン，および50μg/mlのアンピシ
リンを添加したデービス最少寒天培地を用いた。出現し
た形質転換株の培養菌体から前記のアンらの方法により
プラスミドDNAを単離した。形質転換株から得られ、pEa
rg3と命名したプラスミドは、各種制限酵素での消化と
アガロースゲル電気泳動による解析の結果、pBR322の唯
一のBan III（Cla Iと切断認識部位が同一）切断部位に
７キロベースのBan III DNA断片が挿入された構造であ
ることが示された。pEarg3を用い、EA−51株を前記と同
様に再形質転換したところ、アンピシリン耐性で選択さ
れた形質転換株は全てアルギニン非要求性を示した。こ
のことから大腸菌argG遺伝子がクローン化されているこ
とが確認された。pEarg3の作製過程を第１図に示す。
（５） pEarg2と大腸菌argG断片との組換えプラスミド
の作製 実施例（２）で作製したpEarg2と実施例（４）でクロー
ン化した大腸菌argG断片とを組み換えて、argB,argC,ar
gH,argGの４遺伝子を全て含むプラスミドpEarg4を作製
した。
の作製 実施例（２）で作製したpEarg2と実施例（４）でクロー
ン化した大腸菌argG断片とを組み換えて、argB,argC,ar
gH,argGの４遺伝子を全て含むプラスミドpEarg4を作製
した。
pEarg2DNA2μｇを含む制限酵素Ban III用反応液100μ
に0.単位のBan IIIを添加し、37℃で１時間反応後65℃
で40分間加温して反応を停止した。一方、pEarg3DNA2μ
ｇを含むBan III用反応液100μに４単位のBan IIIを
添加し、37℃で１時間反応後65℃で40分間加温して反応
を停止した。両反応消化物を混合した後、10倍濃度のT4
リガーゼ緩衝液23μ,100mM ATP ５μ，およびT4
リガーゼ350単位を加え、12℃で16時間反応させた。こ
のリガーゼ反応混合物を用いてEA−51株の形質転換を行
った。選択培地は30μg/mlのメチオニン，および25μg/
mlのカナマイシンを添加したデービス最少寒天培地を用
いた。出現した形質転換株の培養菌体から得られ、pEar
g4と命名したプラスミドは、各種制限酵素での消化とア
ガロースゲル電気泳動による解析の結果、pEarg2の２ヶ
所のBan III切断部位のうちカナマイシン耐性遺伝子外
にある部位に、pEarg3でみられた７キロベースのBan II
I断片が挿入された構造をしていることが示された。pEa
rg4を用い、（１）で取得したEA−21,EA−35,EA−77,お
よびEA−51を形質転換したところ、カナマイシン耐性で
選択された各形質転換株はアルギニン非要求性を示し、
pEarg4にはargB,argC,argHおよびargGの４遺伝子が含ま
れていることが確かめられた。
に0.単位のBan IIIを添加し、37℃で１時間反応後65℃
で40分間加温して反応を停止した。一方、pEarg3DNA2μ
ｇを含むBan III用反応液100μに４単位のBan IIIを
添加し、37℃で１時間反応後65℃で40分間加温して反応
を停止した。両反応消化物を混合した後、10倍濃度のT4
リガーゼ緩衝液23μ,100mM ATP ５μ，およびT4
リガーゼ350単位を加え、12℃で16時間反応させた。こ
のリガーゼ反応混合物を用いてEA−51株の形質転換を行
った。選択培地は30μg/mlのメチオニン，および25μg/
mlのカナマイシンを添加したデービス最少寒天培地を用
いた。出現した形質転換株の培養菌体から得られ、pEar
g4と命名したプラスミドは、各種制限酵素での消化とア
ガロースゲル電気泳動による解析の結果、pEarg2の２ヶ
所のBan III切断部位のうちカナマイシン耐性遺伝子外
にある部位に、pEarg3でみられた７キロベースのBan II
I断片が挿入された構造をしていることが示された。pEa
rg4を用い、（１）で取得したEA−21,EA−35,EA−77,お
よびEA−51を形質転換したところ、カナマイシン耐性で
選択された各形質転換株はアルギニン非要求性を示し、
pEarg4にはargB,argC,argHおよびargGの４遺伝子が含ま
れていることが確かめられた。
また、このpEarg4を用いてコリネバクテリウム・グルタ
ミクムLA−A36（アルギニン要求性）を形質転換した。
該株は、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC31833
由来のリゾチーム感受性変異株ATCC31834から通常用い
られる変異処理により誘導されたアルギニン要求性の変
異株であり、アルギニン生合成の中間体であるシトルリ
ンを生育要求物質であるアルギニンに代替できないこ
と、およびpEarg2を導入してもアルギニン要求性はかわ
らないことから、その欠損変異はASS遺伝子（大腸菌のa
rgG遺伝子産物に対応）にあると推察されるものであ
る。コリネバクテリウム・グルタミクムLA−A36の種培
養0.1mlをNB培地10mlに植菌し、30℃で振盪培養した。O
D0.6になった時点で集菌し、以下実施例（３）と同様の
操作を行ってpEarg4による形質転換を行った。選択培地
は400μg/mlのカナマイシンを含むRCGP寒天培地を用い
た。得られたカナマイシン耐性形質転換株についてその
アルギニン要求性を調べたところ、全ての株がアルギニ
ン非要求性を示した。従って大腸菌argG遺伝子はコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種中にお
いても発現することが確認された。pEarg4の作製過程を
第１図に示す。
ミクムLA−A36（アルギニン要求性）を形質転換した。
該株は、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC31833
由来のリゾチーム感受性変異株ATCC31834から通常用い
られる変異処理により誘導されたアルギニン要求性の変
異株であり、アルギニン生合成の中間体であるシトルリ
ンを生育要求物質であるアルギニンに代替できないこ
と、およびpEarg2を導入してもアルギニン要求性はかわ
らないことから、その欠損変異はASS遺伝子（大腸菌のa
rgG遺伝子産物に対応）にあると推察されるものであ
る。コリネバクテリウム・グルタミクムLA−A36の種培
養0.1mlをNB培地10mlに植菌し、30℃で振盪培養した。O
D0.6になった時点で集菌し、以下実施例（３）と同様の
操作を行ってpEarg4による形質転換を行った。選択培地
は400μg/mlのカナマイシンを含むRCGP寒天培地を用い
た。得られたカナマイシン耐性形質転換株についてその
アルギニン要求性を調べたところ、全ての株がアルギニ
ン非要求性を示した。従って大腸菌argG遺伝子はコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種中にお
いても発現することが確認された。pEarg4の作製過程を
第１図に示す。
（６） pEarg4保有株によるＬ−アルギニンの生産 コリネバクテリウム・グルタミクムATCC31833,コリネバ
クテリウム・ハーキュリスATCC13868,およびブレビバク
テリウム・フラブムATCC14067を実施例（３）と同様な
方法でプロトプラスト化し、pEarg4を導入した。
クテリウム・ハーキュリスATCC13868,およびブレビバク
テリウム・フラブムATCC14067を実施例（３）と同様な
方法でプロトプラスト化し、pEarg4を導入した。
これら形質転換株より実施例（３）で示したのと同様な
方法によりプラスミドを単離し、各種制限酵素消化とア
ガロースゲル電気泳動による解析を行った結果、pEarg4
と同一の構造を有するものであることが確認された。こ
れら形質転換株のうち、コリネバクテリウム・グルタミ
クムATCC31833/pEarg4は、コリネバクテリウム・グルタ
ミクムK63（FERM BP−1113）として微工研に寄託され
ている。
方法によりプラスミドを単離し、各種制限酵素消化とア
ガロースゲル電気泳動による解析を行った結果、pEarg4
と同一の構造を有するものであることが確認された。こ
れら形質転換株のうち、コリネバクテリウム・グルタミ
クムATCC31833/pEarg4は、コリネバクテリウム・グルタ
ミクムK63（FERM BP−1113）として微工研に寄託され
ている。
pEarg4保有株,pEarg2保有株，およびプラスミド非保有
株のＬ−アルギニン生産試験を実施例（３）と同様の方
法により行った。
株のＬ−アルギニン生産試験を実施例（３）と同様の方
法により行った。
結果を第４表に示す。
以上の結果より、pEarg2（argB,argC,argH遺伝子を含
有）と大腸菌由来のargG遺伝子を含むDNA断片とを組み
換えて得たプラスミドpEarg4の導入株では、pEarg2導入
株に比べアルギニンの生産性が向上することが明らかに
なった。
有）と大腸菌由来のargG遺伝子を含むDNA断片とを組み
換えて得たプラスミドpEarg4の導入株では、pEarg2導入
株に比べアルギニンの生産性が向上することが明らかに
なった。
発明の効果 本発明によれば、エシェリシア属菌種のAGK,AGPR,ASの
合成に関与する遺伝子（argB,argC,argH）を含有する組
換え体DNA,あるいは該遺伝子とASSの合成に関与する遺
伝子（argG）を含有する組換え体DNAを保有させること
により、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌種におけるＬ−アルギニン,L−シトルリン，ある
いはＬ−オルニチンの生産性を向上させることができ
る。
合成に関与する遺伝子（argB,argC,argH）を含有する組
換え体DNA,あるいは該遺伝子とASSの合成に関与する遺
伝子（argG）を含有する組換え体DNAを保有させること
により、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌種におけるＬ−アルギニン,L−シトルリン，ある
いはＬ−オルニチンの生産性を向上させることができ
る。
第１図は、pEarg2,pEarg3,pEarg4の制限酵素BamH I,Ban
III,Pst I,Sal Iの切断地図とその作製過程を示す。図
中BmはBamH I,BnはBan III,PはPst I,SはSal Iを表す。
プラスミドの大きさは、キロベース（Kb）で表示されて
いる。pEarg2,pEarg3,pEarg4の太い実線部分はpEarg1由
来のアルギニン生合成遺伝子群（argB,argC,argH）を含
むDNA断片を、白ヌキ太線部分は、WA802株染色体DNAよ
りクローン化したargG遺伝子を含むDNA断片を表してい
る。
III,Pst I,Sal Iの切断地図とその作製過程を示す。図
中BmはBamH I,BnはBan III,PはPst I,SはSal Iを表す。
プラスミドの大きさは、キロベース（Kb）で表示されて
いる。pEarg2,pEarg3,pEarg4の太い実線部分はpEarg1由
来のアルギニン生合成遺伝子群（argB,argC,argH）を含
むDNA断片を、白ヌキ太線部分は、WA802株染色体DNAよ
りクローン化したargG遺伝子を含むDNA断片を表してい
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 13/10 Ｃ 2121−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 13/10 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/10 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:185） Ｃ１２Ｒ 1:185）
Claims (2)
- 【請求項１】エシェリシア属に属する微生物のＮ−アセ
チルグルタミン酸キナーゼ,N−アセチル−γ−グルタミ
ルリン酸レグクターゼおよびアルギニノスクシナーゼの
合成に関与する遺伝情報を担い、かつアセチルオルニチ
ンデアセチラーゼの合成に関与する遺伝情報は担わない
DNA断片、またはＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ,N
−アセチル−γ−グルタミルリン酸レダクターゼ，アル
ギニノスクシナーゼおよびアルギニノコハク酸シンター
ゼの合成に関与する遺伝情報を担い、かつアセチルオル
ニチンデアセチラーゼの合成に関与する遺伝情報は担わ
ないDNA断片とベクターDNAとの組換え体DNAを保有する
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−アルギニ
ン,L−シトルリンまたはＬ−オルニチンを生成蓄積さ
せ、該培養物から該アミノ酸を採取することを特徴とす
るアミノ酸の製造法。 - 【請求項２】組換え体DNAを保有する微生物が、コリネ
バクテリウム・グルタミクムK62（FERM BP−1112）ま
たはコリネバクテリウム・グルタミクムK63（FERM BP
−1113）である特許請求の範囲１項記載のアミノ酸の製
造方法。
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|---|---|---|---|
| JP61213572A JPH0755155B2 (ja) | 1986-09-10 | 1986-09-10 | アミノ酸の製造法 |
| EP87113188A EP0259858B1 (en) | 1986-09-10 | 1987-09-09 | Process for producing amino acids |
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| KR1019870010053A KR900004424B1 (ko) | 1986-09-10 | 1987-09-10 | 아미노산의 제조방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61213572A JPH0755155B2 (ja) | 1986-09-10 | 1986-09-10 | アミノ酸の製造法 |
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Family
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