JPH01265892A - Ｌ−トリプトファンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネ
ート−７−ホスフェートシンターゼ（以下ＤＳと略す）
、アンスラニル酸シンターゼ（以下ＡＳと略す）、アン
スラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下Ｐ
ＲＴと略ｔ）、Ｎ−５′−ボスホリボシルアランスラニ
ル酸イソメラーゼ（以下ＰＲＡＩと略す）、インドール
−３−グリセロールリン酸シンタ〜ゼ（以下１ｎＧＰＳ
と略す）およびトリプトファンンンターゼ（以下ＴＳと
略す）の合成に関与する遺伝子（以下それぞれＤＳ遺伝
子、ＡＳ遺伝子、ＰＲＴ遺伝子。

ＰＲＡＩ遺伝子、ｒｎＧＰｓ遺伝子、ＴＳ遺伝子と称す
こともある）の全てを含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ
との組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属に属する微生物に保有させ、該微生物
を培地に培養し、培養物中にＬ　−）　ＩＪブトファン
を生成Ｍ積させ、該培養物からＬ−）ＩＪブトファンを
採取することを特徴ヨするＬ−）！Ｊブトファンの製造
法に関する。

従って、本発明はバイオインダストリーの産業分野に関
し、特に医薬、飼料工業において有用なＬ−トリプトフ
ァンの製造分野に関する。

従来の技術 紐換えＤＮＡ技術により、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属し、Ｌ−）　ＩＪブトファン
生産能を有する菌株が種々作成されている。たとえば、
ΔＳ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（特開昭５９−１５６
２９２）　、　　ＰＲＴ遺伝子、ＰＲＡＩ遺伝子、Ｉｎ
ＧＰＳ遺伝子およびＴＳ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（
特開昭６ｌ−１４９０８２）　、　　ＤＳ遺伝子を含む
組換え体ＤＮＡ　（特開昭６２−５１９８０＞　。

ＰＲＡ　Ｉ−Ｉ　ｎＧＰＳ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ
（特開昭６２−７９７７５）をそれぞれ導入した＞）リ
プトファン生産閑などが知られている。

発明が解決しようとする課題および解決のための手段 近年、Ｌ、−）ＩＪブトファンの需要が増大するにつれ
てその’ＪＪａ法の改善が強く望まれている。本発明者
は、このような状況を考慮し、組換えＤＮＡ技術を有効
に活用し、すぐれたＬ−）ＩＪブトファン生産菌を造成
するため鋭意研究を重ねた。その結果、微生物のＤＳ、
ＡＳ、ＰＲＴ、ＰＲＡＩ。

Ｔ　ｎＧＰＳおよびＴＳの合成に関与する遺伝情報の全
てを含むＤＮＡ断片を組み込んだ組換え体ＤＮＡをコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種に導
入することにより、該菌株のＬ−）ＩＪブトファン生産
能が改良されることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。微生物の遺伝子を含む組換え体プラスミドＤＮＡを
保有するし−トリプトファン生産菌としては、前記のよ
うに、トリプトファン生合成系遺伝子（特開昭５９−１
５６２９２゜特開昭６１−１４９０８２．　特開昭６２
−７９７７５）　、　　またはＤＳ遺伝子（特開昭６２
−５１９８０）を用いた例は知られているが、ＤＳ、Δ
Ｓ、ＰＲＴ、ＰＲＡＩ。

ＩｎＧＰＳおよびＴＳの全ての遺伝子を併用した例は知
られておらず、これらすべての遺伝子の同時増幅により
、Ｌ’−）ＩＪブトファンの生産性が一段吉向上するこ
七は本発明により初めて見出されたものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明は、微生物のＤＳ、ＡＳ、ＰＲＴ、ＰＲＡ　Ｉ。

ＩｎＧＰＳおよびＴＳの合成に関与する遺伝情報の全て
を含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体ＤＮＡを保有
するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−）ＩＪ
ブトファンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−１ブトフ
アンを採取することを特徴とするＩ、）ＩＪブトファン
の製造法を提供する。

該ＤＮＡ断片としては、コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物に由来するものがあ
げられる。

上記各遺伝子の供給源となる微生物としては、芳香族ア
ミノ酸の生合成において自己栄養性の微生物であればい
かなる微生物でもよい。とりわけ、原核生物である細菌
、たとえばエシェリンア属。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する菌株の遺伝子が望ましく、とくにこれらの細菌から
誘導された芳香族アミノ酸生産性変異株由来の遺伝子が
好適である。

宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物としては、コリネ型
グルタミン酸生産菌として知られている微生物は全て用
いることができるが、好適には下記の菌株が用いられる
。

コリネバクテリウム・グルタミン酸　八ＴＣＣ１３０３
２コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス　ＡＴＣＣ１３８６
８コリネバクテリウム・リリウム　　　ＡＴＣＣ１５９
９０コリネバクテリウム・メラセコーラ　八ＴＣＣ１７
９６５フ゛レヒ゛バクテリウム・テ゛イバリカ゛ンムへ
ＴＣＣ１４０２０フ゛レヒ゛バクテリウム・フラフ゛ム
　　　八ＴＣＣ１４０６７ブレビハクテリウム・イマリ
オフィラムＡＴＣＣ１４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・ヂオゲニクリスへＴＣＣ１９２４
０これらの細菌から変異誘導された芳香族アミノ酸生産
性菌株はさらに好ましい宿主として用いることができる
。これら生産性変異株はアミノ酸要求性、アミノ酸アナ
ログ耐性あるいはこれを併有する菌株として取得するこ
とができる〔農芸化学会誌、刑、　（１）　ｐ、Ｒ，７
９（１９７６）　）。

該ＤＮＡを組み込むためのベクターとしては、コリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種中で自律
複製できるものであれば特に限定されないが、例えばｐ
ｃＧｌ（特開昭５７−１３４５００）　。

ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１．９７＞、　　ｐＣＧ４
．　　ｐｃＧｌｌ（いずれも特開昭５７−１８３７９９
）、　Ｉ）　ＣＢ５４．　　ｐ　ＣＢ１０１（いずれも
特開昭５８−１０５９９９）、　ｐ　ＣＢ５１゜ｐＣＥ
５２．ｐＣＥ５３　（いずれもモレキュラー・アンド・
ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ、　ＧｅｎＧｅｎ
ｅｔ、）　１９６．１７５　（１９８４）　：］などの
プラスミドを使用することができる。

ＤＳをコードする遺伝子を含む供与体ＤＮＡとベクター
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを制
限酵素で切断した後、ＤＮＡ！Ｊガーゼで処理するか、
またはその切断末端をターミナルトランスフェラーゼや
ＤＮＡポリメラーセなどで処理した後、ＤＮＡＩＪガー
ゼを作用させて結合する常法〔メソッヅ・イン・エンチ
モロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　８ｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）　６８　（１９７９）　〕により種々の組換え体混
成物とともに生成させることができる。この混成物を用
いて、ＤＳをコードする遺伝子の欠失したコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属の変異株を形質転
換し、欠損形質が相補された形質転換株を選択し、この
形質転換株の有するプラスミドを単離することによって
ＤＳをコードする遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを取得で
きる。コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属微生物の形質転換法としては、プロトプラストを用い
る方法（特開昭５７−１８６４９２および特開昭５７−
１８６４８９　）により実施することができる。

同様にして、トリプトファン生合成系遺伝子を含む供与
体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを得るこ
とができる。すなわち、染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡ
との組換え体混成物を用いて、コリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属のトリプトファン生合成系遺
伝子のいずれかが欠損したトリプトファン要求性変異株
を形質転換し、トリプトファン非要求性となった形質転
換株からトリプトファン生合成系遺伝子を含む組換え体
ＤＮＡを取得できる。トリプトファン生合成系遺伝子の
同定は、コリネバクテリウム属。

ブレビバクテリウム属またはニジエリシア属に属する微
生物から変異誘導され、遺伝子の欠損部位が既に同定さ
れているトリプトファン要求性変異株を用いた相補試験
により行うことができる。この方法により、コリネバク
テリウム・グルタミクムにおいては、トリプトファン生
合成に係わるＡＳ、ＰＲＴ、ＰＲＡＩ、ＩｎＧＰＳおよ
びＴＳの合成に関与する全ての遺伝情報が、１１．０キ
ロベース（Ｋｂ）のＢａｍＨＩ　　ＤＮΔ断片上に存在
することが示された〔実施例１（３））。

以上のようにして取得したＤＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片
とトリプトファン生合成系遺伝子を含むＤＮＡ断片とを
さらに組み換えて、両遺伝子を同時に含む組換え体ＤＮ
Ａを得ることができる。

この組換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入することにより
、上記両遺伝子を増幅することができる。

細胞内で共存できる別個のベクターＤＮＡに各々の遺伝
子を組み換え、それらの組換え体ＤＮＡを宿主微生物に
共有させても上記両遺伝子を増幅でき、同様なり、−）
’Ｊブトファンを著量蓄積する菌株を得ることができる
。

上記の工程において、コリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属菌種の野生株の染色体ＤＮＡを供与源
とした場合には、野生型のＤＳ遺伝子およびトリプトフ
ァン生合成系遺伝子を含む組換え体ＤＮＡとしてコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属微生物に導
入できる。しかしながら、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属菌種において、ＤＳはフェニルア
ラニンおよびチロンンでフィードバンク阻害を受け、ま
たＡＳおよびＰＲＴはトリプトファンでフィードバック
阻害を受けることが知られている〔アグリカルチュラル
・アンド・バイオロジカル・ケミストリー　（Ａｇｒｉ
ｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　３９．　３５１（１９７
５）、　　同書　４７．２２９５　（１９８３）　〕。

従って、これらのフィードバンク阻害から解除された変
異型のＤＳ、　ＡＳおよびＰＲＴをコードする遺伝子を
有する組換え体ＤＮＡを用いる方が、コリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属微生物に高いＬ−）Ｉ
Ｊブトファン生産能を付与できるので好ましい。変異型
のＤＳ、ＡＳおよびＰＲＴ遺伝子は、フィードバック阻
害から解除された変異型のＤＳ、ＡＳまたはＰＲＴをコ
ードする遺伝子を有するコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属の変異株の染色体ＤＮＡを供与源と
して、前記のようにＤＳ遺伝子またはトリプトファン生
合成系遺伝子の欠損変異の相補により得ることができる
。あるいは、野生型のＤＳまたはＡＳおよびＰＲＴを有
するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
菌種を受容菌として、各々、フェニルアラニンのアナロ
グ、例えばパラ−フルオロフェニルアラニン（以下、Ｐ
ＦＰと略す）、トリプトファンのアナログ゛、例えば５
−フルオロトリプトファン（以下、５ＦＴと略す）に耐
性となった形質転換株を選択することによっても、クロ
ーニングすることができる。変異型のＤＳ。

ＡＳおよびＰＲＴをコードする遺伝子を有する組換え体
ＤＮＡの作製は、野生型の両遺伝子を有する組換え体Ｄ
ＮＡを作製するのと同様な方法で実施可能である。変異
型のＤＳ、ＡＳおよびＰＲＴをコードする遺伝子を有す
る組換え体ＤＮＡは、野生型の両遺伝子を有する組換え
体ＤＮＡを１０ｖｉｔｒｏで変異処理〔モレキュラー・
アンド・ジェネラル−ジエネティクス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ
、Ｇｅｎｅｔ、）　１４５゜１０１　（１９７８）：］
するか、あるいは、その組換え体ＤＮＡを保有する微生
物を常法通り変異処理することによっても得ることがで
きる。野生型または変異型のＤＳ遺伝子およびトリプト
ファン生合成系遺伝子を同時に含む組換え体ＤＮＡは、
前記のようなプロトプラストを用いる形質転換法により
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属微生
物に導入できる。

これらの組換え体ＤＮＡ保有株によるＬ−１−！１ブト
ファンの生産は、発酵法によるアミノ酸の製造に用いら
れる培養方法により行うことができる。

すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無機物１　
アミノ酸、ビタミンなどを含有する培地中、好気的条件
下、温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行えば、培養物
中にＬ−）ＩＪブトファンが生成蓄積するのでこれを採
取する。

炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコール
、ピルビン酸、フマール酸。

乳酸、酢酸などの各種有機酸が使用できる。さらに微生
物の資化性によって、炭化水素、アルコール類なども用
いられる。特に廃糖蜜は好適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアまたは塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは尿
素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィツシュミールまたはその
消化物。

輛加水分解物などの窒素含有有機物など種々のものが使
用可能である。

さらに無機物としては、リン酸第−水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム。

塩化アンモニウム、硫酸マグネンウム、塩化ナトリウム
、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなど
を使用する。ビタミン、アミノ酸としては、使用する培
地の炭素源、窒素源などによって異なるが、必要に応じ
、ビオチン、サイアミンなどを添加する。また使用する
菌株が、要求性を示す場合は、その要求物質を添加する
。

培養は振盪培養または通気撹拌培養などの好気的条件下
に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である。

培地のｐＨは中性側近に維持することが望ましい。培養
期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−）ＩＪブトファン
が蓄積する。培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、
イオン交換樹脂処理などの公知の方法で培養液からＬ−
）ＩＪブトファンを回収する。

このようにして、ＤＳ遺伝子およびトリプトファン生合
成系遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保有させたコリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株を用いる
ことにより、高い収率でＬ−トリプトファンを生産する
ことができる。

本明細書では、コリネバクテリウム・グルタミクムに、
ＤＳ、ＡＳ、ＰＲＴ、ＰＲＡＩ、１ｎＧＰＳおよびＴＳ
の合成に関与する遺伝情報の全てを含む組換え体ＤＮＡ
を導入し、Ｌ−）ＩＪブトファンの生産性の向上につい
て例示したが、代わりに他のコリ木型グルタミン酸生産
菌を用いても目的は達成される。

グルタミン酸高生産能を有するいわゆるコリネ型グルタ
ミン酸生産菌は、主な菌学的性質を同じくしているにも
かかわらず、産業上の重要性から、各研究者により、種
々の菌名が付されており、属名までも、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属など種々である。し
かしながら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成や
ＤＮＡの塩基組成が画一的であることから、同一の菌種
であることが指摘されていた。さらに、これらの菌種間
には、７０〜８０％以上のＤＮＡの相同性があることが
明らかにされ、非常に近縁な微生物であることが明白で
ある〔コマツ　ワイ（１（ｏｍａｔｓｕＹ２）ニレポー
ト　オブ　ザ　ファーメンテイティブ　リサーチ　イン
スティチュート（ｌ（ｅｐｏｒｔ　ｏｆｔｈｅ　Ｐｅｒ
ｍｅｎｔａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔ
ｕｔｅ）、　　Ｎｏ、５５゜１、　　（１９８０）およ
びスズキ　ケイ１．カネコ　ティ、。

コマガタ　ケイ　（Ｓｕｚｕｋｉ、　Ｋ、、　Ｋａｎｅ
ｋｏ、　Ｔ、、　ａｎｄＫｏｍａｇａｔａ、　Ｋ、）　
　：インターナショナル　リサーチル　オブ　ンステマ
ティック　ハクテリオロジイ（Ｉｎｔ、Ｊ、５ｙｓｔ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、　　３１．１３１　（１９８
１）参照〕。

上記の事実を踏まえればコリネ型グルタミン酸生産菌全
般での効果が容易に類推される。その効果の有無は組換
え体ＤＮＡがコリネ型グルタミン酸生産菌全般で自律的
に複製し、ＤＳ遺伝子およびトリプトファン生合成系遺
伝子が形質発現できるか否かに係わり、コリネ型グルタ
ミン酸生産菌間のＤＮＡ相同性などにおける若干の相違
は何ら関係ない。しかるにこれらの菌種がプラスミドの
複製と遺伝子発現に係わる機能を等しく保持しているこ
とは、特開昭５７−１８３７９９に開示したコリネバク
テリウム・グルタミクム２２５−２５０株から分離され
、スペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイン
ン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＣＧ４がコリネバク
テリウム属およびブレビバクテリウム属菌種などコリネ
型グルタミン酸生産菌内で同じく複製でき、またその耐
性遺伝子が発現される（特開昭５７−１８６４９２）　
　ことから明らかである。従って、本発明のＤＳ、ＡＳ
、ＰＲＴ。

ＰＲＡＩ、ＩｎＧＰＳおよびＴＳの合成に関与する遺伝
情報の全てを含む組換え体ＤＮＡを導入することによる
＞）ＩＪブトファン生産菌の作製法を適用し得る菌株は
、コリネバクテリウム・グルタミクムに限らずコリネバ
クテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種を含むコ
リネ型グルタミン酸生産菌全てが含まれる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１゜ コリネバクテリウム・グルタミクムに３８のＤＳ遺伝子
およびコリネバクテリウム・グルタミクムに５５のＡＳ
、ＰＲＴ、ＰＲＡＩ、ＩｎＧＰＳおよびＴＳの合成に関
与する全ての遺伝子を同時に含む組換え体プラスミドを
保有する菌株によるトリプトファンの生産 （１）　　コリネバクテリウム・グルタミクムに３８（
ＦＥＲ，Ｍ　　ＢＰ−４５４）とコリネバクテリウム・
グルタミクムに５５　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８６４）の
染色体ＤＮＡおよびベクターｐＣＥ５３とｐＣＧ１１６
の調製 ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水１
βに含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地）で増殖したコ
リネバクテリウム・グルタミクムに３８　（ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−４５４）　　（ｐＦｐおよびパラ−アミノフェ
ニルアラニンの耐性形質を有している）およびコリネバ
クテリウム・グルタミクムに５５　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−８６４）（フェニルアラニンおよびチロシン要求性で
、５−メチルトリプトファン、トリプトファンハイドロ
キサメート、６−フルオロトリプトファン、４−メチル
トリプトファン、ＰＰＰ、　　パラ−アミノフェニルア
ラニン、チロンンハイドロキザメートおよびフェニルア
ラニンハイドロキサメートの耐性形質を有している）の
種培養２３ｍ１をフェニルアラニンおよびチロシン各１
００μｇ　／ｍ　Ｉを含む半合成培地ＳＳＭＣグルコー
ス２０ｇ、（Ｎ　Ｈ４）　２　Ｓ　Ｏ４１０ｇ　、尿素
３ｇ。

酵母エキス１ｇ、Ｋ）１２ｐ○４１ｇ、ＭｇＣｊＬ・６
Ｈ２００，４ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１０ｍｇ。

Ｍｎ３Ｏ４・４〜６Ｈ２００，２ｍｇ、ＺｎＳ０４Ｈ７
８２００，９ｍｇ、ＣｕＳ○、・５Ｈ２００，４ｍｇ。

Ｎ　ａ２Ｂ４０７’１０Ｈ２００，０９ｍｇ、（ＮＨ４
）６ＭＯ７０２４−４Ｈ２００，０４ｍｇ、ビオチン３
０μｇおよびサイアミン塩酸塩１　ｍｇを水１βに含み
、ｐＨ７２に調整した培地〕４００ｍｌに接種して３０
℃で振盪培養した。東京光電比色計で６６０ｎｍにおけ
る吸光度（ＯＤ）を測定（以下特記しないかぎり吸光度
は６６０ｎｍで測定）し、ＯＤが０．２になった時点で
培養液へ０．５単位／ｍｌの濃度となるようにペニシリ
ンＧを添加した。さらに培養を継続し、ＯＤが０．６に
なるまで生育させた。

培養液から菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液１：０．０３Ｍ
）リス（ヒドロキシメチル）アミツメクン（以下トリス
と略す）、０．００５Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナト
リウム（以下、ＥＤＴＡと略す）、０．０５Ｍ　　Ｎａ
Ｃｌ！、ｐＨ８，０〕で洗浄後、リゾチーム溶液（２５
％ショ糖、０．１Ｍ　　ＮａＣＣ０，０５Ｍ）リス、０
．８　ｍｇ／ｍ１リゾチーム、ｐＨ８，０）１０ｍｌに
懸濁し、３７℃で２時間反応を行った。集菌した菌体か
ら斎藤−三浦の方法［５ａｉｔｏ、　１１．　ａｎｄ　
Ｍｉｕｒａ、　Ｋ。

バイオキミカ・工・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ａｃｔａ）、７２．
　６１９（１９６３）　　］に従って高分子染色体ＤＮ
Ａを単離した。

ベクターとして用いるｐＣＥ５３は、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムのプラスミドｐｃｃｔ　　（特開昭５
７−１３４５００）　とニジエリシア・コリのプラスミ
ドｐｃΔ２２１：Ｇ、　Ａｎ、　ｅｔ　ａｌ：　ジャー
ナル・オブ・バタテリオロジイ　（ＪＢａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、）　１４０．４００　（１９７９）参照〕を和合連
結させたプラスミドである。詳しくはｐｃＧｌ上のＢｇ
β■切断部位とｐＧＡ２２上に２カ所あるＢａｍＨＩ切
断部位のうちテトラザイクリン耐性遺伝子内でないＢａ
ｍＨＩ切断部位とで、両制限酵素の同一接着末端を利用
して連結したものである。ｐＣＥ５３はｐＧＡ２２由来
のカナマインン耐性遺伝子などの選択マーカーを有し、
制限酵素ＢａｍＨＩに対する切断部位は１カ所である。

同じく、ベクターとして用いるｐｃｃｚ６は、コリネバ
クテリウム・グルタミクムのプラスミド１）ＣＧＩＩ（
特開昭５７−１３４５００　）上の５ｔｕｌおよびＰｓ
ｔＩ切断部位に、Ｍ１３ｍｐ１８　　ＲＦ　　ＤＮＡ（
全酒造社製）をＥｃｏＲＩで切断後、クレノー断片（全
酒造社製）で平滑末端に修復し、さらにＰｓｔＩで切断
して得たリンカ−を両者の各々、平滑末端、接着末端を
利用して結合させたプラスミドである。ｐｃＧ１１６は
分子長約６．５　Ｋ　ｂのプラスミドで、単一の制限酵
素切断部位としてＢｇＡＩＩ。

ＰｓｔＩ、Ｓａｊ！Ｉ、Ｘｂａｌ、ＢａｍＨＩ。

Ｓｍａ　１．Ｋｐｎ　ＩおよびＳ２Ｃｌを有し、ストレ
プトマイシンおよび／またはスペクチノマイシン耐性の
表現型を与える（第１図参照）。

ｐＣＥ５３およびｐｃＧ１１６は各々を保有するコリネ
バクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の培養
菌体から次の方法でそれぞれ単離した。

ｐＣＥ５３またはｐｃＧ１１６を保有するコリネバクテ
リウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２を、４００ｍ
ｌＳＳＭ培地で、３０℃にて振盪培養し、上記と同様に
してペニシリンＧ処理後、ＯＤが約０．６になるまで生
育させた。

菌体を集菌しＴＥＳ緩衝液で洗浄後、リゾチーム溶液Ｉ
　Ｑｍｌに懸濁し、３７℃で２時間反応させた。反応液
に５Ｍ　ＮａＣＪ！　　２．４ｍｌ、０．５ＭＥＤＴＡ
　（ｐＨ８，５）０．６ｍｌ、４％ラウリル硫酸ナトリ
ウムと０．７Ｍ　　ＮａＣ１からなる溶液４．４ｍｌを
順次添加し、緩やかに混和してから氷水上に１５時間装
いた。溶菌物を遠心管に移し、４℃で６０分間６９．４
００　ｘ　ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収した。これ
に重量百分率１０％相当のポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）　６，０００（半片化学薬品社製）を加え、静か
に混和して溶解後、氷水上に置いた。１０時間後、Ｌ　
５００×ｇで１０分間遠心分離してペレットを回収した
。ＴＥＳ緩衝緩衝液５奢ｌえてペレットを静かに再溶解
してから１．５　ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイド２０
ｍ１を添加し、これに塩化センラムを加えて静かに溶解
し、密度を１５８０に合わせた。

この溶液を１０５，０００ｘｇ、　１８℃で４８時間超
遠心分離にかけ、紫外線照射下に検知される遠心チュー
ブ下方の密度の高い位置のバンドを遠心チューブの側面
から注射器で抜きとることによって、ｐＣＥ５３および
ｐｃＧ１１６プラスミドＤＮＡをそれぞれ分離した。こ
の分画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容量百
分率９０％イソプロピルアルコール、１０％ＴＥＳ緩衝
液（この混液中に飽和溶解量の塩化センラムを含む）〕
で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、し
かる後にＴＥＳ緩衝液に対して透析した。

（２）ＤＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニング上記
で調製したｐｃＧ１１６プラスミドＤＮＡ３μｇを含む
反応液Ｙ−１００（）リスｌＱｍＭ。

ＭｇＣＬ　　６ｍＭ、ＮａＣ１１００ｍＭ。

ｐＨ７，５）６０μｐに６単位のＳａβ■　（全酒造社
製、以下特記しないかぎり制限酵素は全酒造社製）およ
びＢｇβ■を添加し、３７℃で６０分間反応させた。一
方、コリネバクテリウム・グルタミクムに３８　（ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−４５４）の染色体ＤＮＡ　３μｇを含む
ｙ−ｉｏｏ反応液１４０μｌ！に６単位のＳａｄ　Ｉお
よびＢｇβ■を添加し、３７℃で６０分間反応させた。

いずれもフェノール処理により反応を停止させた。両反
応液を混合し、２容のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱
回収後、水２００μｇに溶解した。

このＤＮＡ溶液２００ρに１０倍濃度のＴ４リガーゼ用
緩衝液（トリス６６０ｍＭ、ＭｇＣβ２６６ｍＭ、　　
ジチオスレイトール１００ｍＭ。

ｐＨ７，６）４０ａＱ、５ｍＭ　　ＡＴＰ　　４０ｔｔ
（１゜Ｔ４’Ｊガーゼ（全酒造社製）３００単位および
水１２０μａを加え、１２℃で１６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＴＣＣ１３０３２の形質転換に供した。コリネ
バクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の種培
養４ｍｌを３３Ｍ培地４　Ｑｍｌに植菌し、３０℃で振
盪培養した。

ＯＤが０２になった時点で上記（１）と同様な方法でペ
ニンリンＧ処理後、ＯＤが０６になるまで生育させた。

菌体を集菌し、該細胞をＲＣＧＰ培地〔グルコース５ｇ
１カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、に２ＨＰ○４
３．５ｇ、ＫＨ２Ｐ○４１．５ｇ、ＭｇＣＬ・６Ｈ２０
０，４１ｇ、ＦｅＳＯ４・７　Ｈ２０１０ｍｇ、、Ｍｎ
　ＳＱＬ　・４〜６　Ｈ２Ｏ２ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ
２００，９ｍｇ、　（Ｎ　Ｈ４）　ｅＭＯ７０２４・４
　Ｈ２００，０４ｍｇ、ビオチン３０μｇ、ザイアミン
塩酸塩２ｍｇ、コハク酸ニナトリウム１３５ｇ、ポリビ
ニルピロリドン（分子最１０．０００）３０ｇを水１１
に含む培地〕に１ｍｇ／ｍｌのりゾチームを含む溶液（
ｐ　Ｈ７，６）　１０ｍ１に約１０９細胞／　ｍ　ｌと
なるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で１６時
時間中かに振盪反応してプロトプラスト化した。

このプロトプラスト菌液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり、
２．５００ｘｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣ緩衝液（
Ｍｇ　Ｃ１２１０ｍＭ、　Ｃａ　ＣＣ３０ｍＭ、トリス
５０ｍＭ、ショ糖４００ｍＭ。

ｐＨ７，５）１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ
緩衝液０１ｍ１に再懸濁した。この菌液に２倍高濃度の
ＴＳＭＣ緩衝液と上記リガーゼ反応液の１対１混合液１
００μｇを加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液中に２
０％ＰＥＧ６，０００を含む液Ｑ、３ｍｌを添加して混
合した。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐ　Ｈ７，２）　２ｍ
ｌを添加し、２．５００×ｇで５分間遠心分離にかけて
上澄液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲ
ＣＧＰ培地に懸濁してから、この菌液０．２ｍｌをスペ
クチノマインン４００μｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培
地（ＲＣＧＰ培地に１４％寒天を含む培地、ｐＨ７２）
に塗布し、３０℃で７日間培養した。

寒天培地上に生育したコロニーをかき集め、生理食塩水
で２回遠心洗浄後、生理食塩水１ｍｌに懸濁した。この
菌液をＰ　Ｐ　Ｐ　３　ｍｇ／ｍｌおよびスペクチノマ
イシン１００μｇ／ｍｌを含有する最少寒天培地Ｍ１［
グルコース１０ｇ、　　（ＮＨ４）Ｊ（２Ｐ○４　１ｇ
、ＫＣＡ　　Ｏ，２ｇ、Ｍｇ５Ｏ＋・７８２００．２ｇ
、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１０ｍｇ。

Ｍｎ５Ｏ＜・４〜６８２０　０．２ｍｇ、ＺｎＳＯ２・
７Ｈ２００，９ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４ｍｇ
。

Ｎａ２Ｂ、０７−　ＩＱＨ２００，０９ｍｇ、（Ｎ　Ｈ
４）　６Ｍ　ｏ　７０２４・４Ｈ２００，０４ｍｇ、ビ
オチン５０μｇ、Ｉ）−アミノ安息香酸２．５　ｍｇ、
ザイアミン塩酸塩１ｍｇおよび寒天１６ｇを水ｌｌ中に
含み、ｐＨ７，２に調整した培地〕上に再塗布して３０
℃で５日間培養し、ＰＰＰおよびスペクチノマイシンに
耐性となった形質転換株を選択した。

これらの形質転換株から、上記（１）でｐＣ６１１６を
単離したのと同様な方法でプラスミドＤＮＡを単離した
。形質転換株の一株から得られ、ｐＣＧＤＳ　１と命名
したプラスミドは、各種制限酵素による切断産物をアガ
ロースゲル電気泳動法で解析した結果、ｐｃＧ１１６の
Ｓａβ１−ＢｇＩ！ＴＩ切断部位に５．　ＯＫ　ｂのＳ
ａｆｌＩ−ＢｇＡ］ｌＤＮＡ断片が挿入された構造を有
していることがわかった（第１図参照）。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
およびｐＣＧＤＳ　１を保有する形質転換株について、
ＤＳ活性をＰ、　Ｒ，５ｐｒｉｎａｖａｓａｎとり、Ｂ
、　５ｐｒｉｎｓｏｎ　らの方法〔ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリ＝（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、＞　　２３混７１６　（１９５９）　）に従
って測定した。ＡＴＣＣ１３０３２株のＤＳ活性を１と
したときのｐＣＧＤＳ　ｌを保有する形質転換株のＤＳ
活性は８〜１０倍に増加しており、また、フェニルアラ
ニンおよびチロシンによる阻害を受けないことから、ｐ
ＣＧＤＳ　ｌに挿入されている５、　ＯＫ　ｂのＤＮＡ
断片上には、コリネバクテリウム・グルタミクムに３８
株由来のＤＳ遺伝子が存在することが判明した。

（３）ＡＳ、ＰＲＴ、ＰＲＡＩ、Ｉ　ｎＧＰＳおよびＴ
Ｓの合成に関与する遺伝情報の全てを含むＤＮＡ断片の
クローニング 上記（１）で調製したｐＣＥ５３プラスミドＤＮＡ３μ
ｇを含むＹ−１０，０反応液６０ＩＬ＋！に６単位のＢ
ａｍＨＩを添加し、３７℃で６０分間反応させた。一方
、コリネバクテリウム・グルタミクムに５５　　（ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ−８６／ｌ）の染色体ＤＮＡ３μｇを含む
Ｙ−１００反応液１４０μρに６単位のＢａｍＨＩを添
加し、３７℃で６０分間反応させた。いずれも６５℃で
１０分間加温して反応を停止させた。

両反応液を混合し、１０倍濃度のＴ’４１Ｊガーセ用緩
衝液４０ａＱ、５ｍＭ　　ＡＴＰ４０ｎ。

Ｔ４１Ｊガーゼ（宝酒造社製）３００単位および水１２
０μｇを加え、１２℃で１６時間反応させた。

このリガーセ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＴＡ１０８（ＴＳの２つのサブユニット、αおよ
びβのうち、βサブユニツト遺伝子を欠損しており、ト
リプトファンの要求性を有している）（昭和６３年４月
９日付で微工研にＦＥＲＭ　ＢＰ−１８４６として寄託
）の形質転換に供した。ＴＡ１０８の種培養４ｍｌを、
トリプトファン５０μｇ　７ｍ　ｌを含むＳＳＭ培地４
０ｍ１に植菌して３０℃で振盪培養した。

ＯＤが０２になった時点で上記（１）と同様な方法でペ
ニンリンＧ処理後、ＯＤが０．６になるまで生育させた
。菌体を集菌し、該細胞を上記（２）と同様な方法によ
りリゾチーム処理してプロトプラスト化した。このプロ
トプラストを上記リガーセ反応混合物を用いて上記（２
）と同様な方法により形質転換した。カナマイシン２０
０μｇ　／　ｍ　１を含むＲＣＧＰ寒天培寒天−地上し
たカナマイシン耐性コロニーをかき集約、生理食塩水で
２回遠心洗浄後、生理食塩水１ｍｌに懸濁した。この菌
液をカナマイシン１０μｇ／ｍｌを含有する最少寒天培
地Ｍ１上に再塗布して３０℃で３日間培養し、カナマイ
シン耐性で、トリプトファン非要求性となった形質転換
株を選択した。これらの形質転換株から上記（１）でｐ
ＣＥ５３を単離したのと同様な方法でプラスミドＤＮＡ
を単離した。形質転換株の一株から得られ、ｐｃｔｒｐ
ｌと命名したプラスミドは、各種制限酵素による切断産
物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐｃＥｓ
３のＥ３ａｍＨＩ３ｇ部位に１１．ＯＫｂのＢａｍＨＩ
ＤＮＡ断片が挿入された構造を有していることがわかっ
た（第１図参照）。

このｉｔ、ｏＫｂのＢａｍＨＩＤＮＡ断片に含まれる他
のトリプトファン生合成系遺伝子の同定を行った。ｐｃ
ｔｒｐｌを用い、コリネバクテリウム・グルタミクムＴ
Ａ１０５（ＡＳ遺伝子を欠損している）、ＴＡＩ　Ｏ６
（ＰＲＴ遺伝子を欠損している）およびＴＡ　１０７　
（ＴＳ−αサブユニット遺伝子を欠損している）を上記
（３）と同様な方法により形質転換した。カナマイシン
２００μｇ　７ｍ　］を含むＲＣＧＰ寒天培寒天−地上
したカナマイシン耐性コロニーはいずれもトリプトファ
ン非要求性であることから、ｐｃｔｒｐＨ：挿入されて
いる１１．ＯＫｂのＤＮＡ断片上には、少なくともＡＳ
、ＰＲＴ。

ＴＳ−αおよびＴＳ−βの各遺伝子が存在することが判
明した。

次に、ｐｃｔｒｐｌを用い、エンエリンア・コリＡＴＣ
Ｃ２３７１９（Ｋ−１２，ｔｒｐＣ−）をＭ、Ｄａｇｅ
ｒｔ　らの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）　６．２３（１９
７９）　〕に従って形質転換した。カナマイシン２０μ
ｇ　／　ｍ　］を含むＬＢ寒天培地（バクトドリプトン
１０ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコースＩｇ。

ＮａＣβ　５ｇおよび寒天１６ｇを水１β中に含み、ｐ
　Ｈ７，２に調整した培地）上に生育したカナマイシン
耐性コロニーはいずれもトリプトファン非要求性である
ことから、ｐｃｔｒｐｌに挿入されている１　１．　Ｏ
Ｋ　ｂのＤＮＡ断片上には、ＰＲＡＩおよびＩｎＧＰＳ
の合成に関与する遺伝情報も存在することが判明した。

（４）トリプトファンアナログ耐性プラスミドｐＣｔｒ
ｐ５７の取得 ｐｃｔｒｐｌを保有するＴＡ１０８株をカナマイシン１
０μｇ　／　ｍ　１を含むＮＢ培地て対数増殖の後期ま
で増殖させた。菌体を５０ｍＭ）ＩＪス・マイレン酸緩
衝液（ｐＨ６，０）で１回遠心洗浄後、Ｎ−メチル−Ｎ
′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン４００μｇ　７ｍ
　ｌを含む５０ｍＭ）リス・マレイン酸緩衝液中で室温
で２０分間処理した。処理菌体を５０ｍＭ）リス・マレ
イン酸緩衝液で２回遠心洗浄後、洗浄菌体をカナマイシ
ンｌＯμｇ　７ｍ　ｌを含むＮＢ培地中、３０℃で１６
時間培養し、上記〔１）と同様な方法でプラスミドＤＮ
Ａを単離した。単離したプラスミドＤＮＡを用い、ＴＡ
１０８株を上記（３）と同様な方法で形質転換した。カ
ナマイシン２００μｇ／ｍ１を含むＲＣＧＰ寒天培地上
に生育したカナマイシン耐性コロニーをかき集め、生理
食塩水を用いて２回遠心洗浄後、５　Ｆ　Ｔ　　３　ｍ
ｇ／ｍｌを含む最少寒天培地Ｍ１に塗布して、３０℃で
３日間培養した。出現したコロニーから５ＦＴ　　３ｍ
ｇ　７ｍ　］を含むＭ１寒天培地およびカナマイシン１
０μｇ　７ｍ　ｌを含むＮＢ寒天培地上で生育できるコ
ロニーを選択した。その−株から分離したプラスミドを
ｐＣｔｒｐ５７と命名した。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
およびｐｃｔｒｐｌまたはｐＣｔｒｐ５７を保有するＴ
Ａ１０８株について、ＡＳ活性をＨ，Ｈａｇｉｎｏ　ら
の方法〔アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル
・ケミストリー（ＡｇｒｉｃＢｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）
　　３９．３２３　（１９７５）〕に従って、またＰＲ
Ｔ活性をＪ、ｌｔｏとＣ，Ｙａｎｏｆｓｋｙの方法［ジ
ャーナル・オブ・バタテリオロジイ（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）　　９７．７３４　（１９６９）］に従っ
てそれぞれ測定した。ΔＴＣＣ１３０３２株のＡＳおよ
びＰＲＴ活性を各々１としたときのｐｃｔｒｐｌまたは
ｐＣｔｒｐ５７を保有するＴＡ　１０８株のＡＳおよび
ＰＲＴ活性はいずれも１０倍以上に増加していた。また
、ΔＴＣＣ３９０１９株。

ｐＣｔｒｐｌを保有するＴＡ　１０８株およびｐＣｔｒ
ｐ５７を保有するＴＡ１０８株のＡＳの５０％阻害トリ
プトファン濃度は、各々、０．００２ｍＭ、　　０．０
０８ｍＭ、　　４．０ｍＭであり、ＰＲＴの５０％阻害
トリプトファン濃度は、各々、Ｏ，’１９ｍＭ、　　０
．１９ｍＭ、　　４．８ｍＭであった。このことから、
ｐＣｔｒｐ５７のコードするＡＳおよびＰＲＴは、ｐｃ
ｔｒｐｌのコードするＡＳおよびＰＲＴに比べ、各々約
５００倍。

約２５倍トリプトファンに対して非感受性になっている
ことがわかった。

（５）ＡＳ、ＰＲＴ、ＰＲＡＩ、Ｉ　ｎＧＰＳおよびＴ
Ｓの合成に関与する遺伝情報の全てを含むＤＮＡ断片の
ｐＣＧＤＳ　１へのサブクローニング ｐＣｔｒｐ５７プラスミドＤＮＡ　　５μｇを含むＹ−
１００反応液１００μｇに０．５単位のＢｇβ■を加え
、３７℃で１０分間部分消化後、アガロースゲルから７
．５　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片を分画〔モレキュラー　クロ
ーニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、　１
６４　（１９８２））　した。また、ｐＣＧＤＳ　ｌプ
ラスミドＤＮＡ　　３μｇを含むＹ−１００反応液１０
０μｇに５単位のＢｇｌ！Ｕを加え３７℃で６０分間反
応後、フェノール処理により反応を停止させた。両反応
液を混合し、２容のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱回
収後、水２００μＱに溶解した。

このＤＮＡ溶液２００μｐに１０倍濃度のＴ４リガーゼ
用緩衝液４０ａｆ１．　５ｍＭ　ＡＴＰ　　４０ρ、Ｔ
４’Ｊガーゼ（全酒造社製）３００単位および水１２０
μｇを加え、１２℃で１６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物を用いて、ＴＡ１０８株を上記
（３）と同様な方法により形質転換した。

スペクチノマイシン４００μｇ　７ｍ　ｌを含むＲＣＧ
Ｐ寒天培地上に生育したスペクチノマイシン耐性コロニ
ーをかき集め、生理食塩水で２回遠心洗浄後、生理食塩
水１ｍｌに懸濁した。この菌液をＰ　Ｐ　Ｐ　３　ｍｇ
／ｍｌおよびスペクチノマイシン１００μｇ　７ｍ　］
を含有する最少寒天培地Ｍｌ上に再塗布して３０℃で３
日間培養し、ＰＰＰおよびスペクチノマイシン耐性で、
トリプトファン非要求性となった形質転換株を選択した
。これらの形質転換株から上記（１）と同様な方法でプ
ラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株の一株から得ら
れ、ｐｃＤｔｒｐ１５７と命名したプラスミドは各種制
限酵素による切断産物をアガロースゲル電気泳動て解析
した結果、ｐＣＧＤＳ　ｌのＢｇｐｎ切断部位に４．５
　Ｋ　ｂおよび３．　ＯＫ　ｂの２つのＢｇｎｎＤＮΔ
断片が挿入された構造を有していることがわかった（第
１図参照）。

このようにして得たｐＣＤｔｒＴ）１５７に、ＡＳ、Ｐ
ＲＴ、ＰＲＡＩ、ＩｎＧＰＳおよびＴＳの合成に関与す
る全ての遺伝情報が存在するかどうかを調べるため、ｐ
ｃＤｔｒｐ１５７プラスミドＤＮＡを上記と同様にして
ＢｇＲＨで部分消化後、アガロースゲルから７．５　Ｋ
　ｂのＤＮＡ断片を分画し、ＢａｍＨＩで切断したｐＣ
Ｅ５３に連結した。この連結物を用いて上記と同様にし
てＴＡ１０８株を形質転換し、カナマインン耐性でトリ
プトファン非要求性となった形質転換株を選択した。形
質転換株の一株から得たプラスミドｐＣｔｒｐ５７７は
、各種制限酵素による切断産物をアガロースゲル電気泳
動で解析した結果、ｐＣＥ５３のＢａｍＨＩ切断部位に
４、５　Ｋ　ｂおよび３．　ＯＫ　ｂの２つのＢｇｆｆ
ｌＩＤＮＡ断片が挿入された構造を存していることがわ
かった。このｐＣｔｒｐ５７７を用い、上記（３）と同
様な方法でトリプトファン生合成系遺伝子の同定を行っ
た結果、ｐＣＥ５３の１３ａｍＨＩ切断部位に挿入され
た７、　５　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片上には、ＡＳ、ＰＲＴ
、ＰＲＡＩ、ＩｎＧＰＳおよびＴＳの合成に関与する全
ての遺伝情報が存在することを確認した。

（６）　　ｐｃＧＤｓｌ、ｐＣｔｒｐ５７またはｐＣＤ
ｔｒｐ１５７を保有する菌株によるトリプトファンの生
産 Ｌ−１ブトファン非生産性菌株コリネバクテリウム・グ
ルタミクムＡＴＣＣ２１８５４〔フェニルアラニンおよ
びチロシンの要求性を有している〕およびＬ−トリプト
ファン生産性菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＢ
ＰＳ−１３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１７７７）（ＡＴＣＣ２
１８５１から誘導した３−ブロモピルビン酸感受性変異
を有する菌株）の種培養４ｍｌをフェニルアラニンおよ
びチロンン各５０μｇ／ｍｌを含むＳＳＭ培地４０ｍ１
に植菌して３０℃で振盪培養した。ＯＤが０．２になっ
た時点Ｃ上記（１）と同様な方法でペニシリンＧ処理後
、ＯＤが０６になるまで生育させた。菌体を集菌し、該
細胞を上記（２）と同様な方法によりリゾチーム処理し
てプロトプラスト化した。このプロトプラストをｐＣＧ
ＤＳｌ、ｐＣｔｒｐ５７およびｐＣＤｔｒｐ１５７を用
いて上記（２）と同様な方法により形質転換した。スペ
クチノマイシンまたはカナマインンに耐性となった形質
転換株から上記（１）と同様な方法によりプラスミドＤ
ＮＡを単離した。

これらのプラスミドの各種制限酵素での切断解析により
、形質転換株が、ｐｃＧＤｓｌ、ｐＣｔｒｐ５７または
ｐｃＤｔｒｐ１５７を保有することを確言忍した。この
よう１ごして得られたｐｃＤｔｒｐ１５７を保有するＡ
ＴＣＣ２１８５４菌株は、昭和６３年４月９日付でコリ
ネバクテリウム・グルタミクムに７６　（ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−１８４７）として微工研に寄託されている。

形質転換株と各々の親株のり、−ト！ｊブトファン生産
試験を大型試験管培養により次のように行った。

種培地Ｓｌ（グルコース２０ｇ、　ポリペプトン１５ｇ
、酵母エキス１５ｇ、　Ｎａ（、ｆ２２．５ｇ。

尿素１ｇ、Ｌ−チロシン２００ｍｇ、Ｌ−フェニルアラ
ニン２００ｍｇを水１βに含み、ｐ　Ｈ７，２に調整し
た培地〕３ｍｌ中で３０℃、２４時間振種培養した種培
養３．５ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｐ１〔クルコース６０
ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ。

ＫＨ２Ｏ４Ｉｇ、Ｍｇ５Ｏ＜・７８２０　１ｇ。

（ＮＨ＋）２ＳＯ４２０ｇ、コーン・スチープ・リカー
１０　ｇ、　Ｍｎ　Ｓ０４　１０ｍｇ、　　ビオチン３
０μｇ、ＣａＣＯ３２０ｇを水ＩＩ！に含み、ｐ　Ｈ７
，２に調整した培地〕の入った大型試験管にそれぞれ接
種し、３０℃で７２時間振盪培養した。培養後、培養ｐ
液を高速液体クロマトグラフィーを用いた○ＰＡポスト
カラム誘導体化法により定量して、Ｌ−トリプトファン
の生成中を測定した。

結果を第１表に示す。

第　　　　１　　　　表 八ＴＣＣ２１８５４０ 八ＴＣＣ２＋８５４／ｐｃＧＤｓ１　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０八ＴＣＣ２１８５４／ｐｃ
ｔｒｐ５７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
３．５に７６　（八ＴＣＣ２１８５４／ｐｃＤｔｒｐ１
５７）　　　　　　　　　　　　　５．６ＢＰＳ−１３
７，５ ＢＰＳ−１３／ＩＩＣＧＯ３１８，２ ８ＰＳ−１３／ｐＣｔｒｐ５７　　９．６ＢＰＳ−１３
／ｐｃＤｔｒｐ１５７　　１１．０（７）２！ジャーフ
ァーメンタ−による培養試験ＢＰＳｉＢ株と該菌株のｐ
ｃＤｔｒｐ１５７の保有株については、２βジャーファ
ーメンタ−による培養試験を次のように行った。

２０ｍ１の第１種培地Ｓ１中で３０℃、２４時間振盪培
養した第２種培養１　Ｑｍｌを、１２　Ｑｍｌの第２種
培地３２［シュクロース５０ｇ、ＫＨ２Ｐ○４２ｇ、Ｍ
ｇＳＯ４・７Ｈ２００，５ｇ。

（ＮＨ，）２Ｓ０，５ｇ、尿素１ｇ、Ｆｅ５０．・７　
Ｈ２０１，Ｏｍｇ、　　Ｍ　ｎ　ＳＣ２・４−６８２０
　１０ｍｇ、　Ｃｕ５Ｏ，・５Ｈ２０４ｍｇ、　コーン
・スチープ・リカー４０ｇ、Ｉ−−チロシン２２２ｍｇ
。

Ｌ−フェニルアラニン３６２ｍｇ、　　ビオチン５０μ
ｇ、サイアミン塩酸塩１００μｇ、　　Ｃａ　ＣＯ３２
０ｇを水１βに含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地〕の
入った１β容三角フラスコにそれぞれ接種し、３０℃で
２４時間振盪培養した。この第２種培養１２　Ｑｍｌを
、５５０＋ｒ＋ｌの生産培地Ｊ１〔シュークロース６３
ｇ、ＫＨ２ＰＯ４２ｇ。

Ｋ２ＨＰＯ４１，２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１，７ｇ
、　（ＮＨＩ）２Ｓ○４　１７ｇ、Ｆｅ５０＋・７Ｈ７
Ｈ２Ｏ１３，Ｍｎ５Ｏｎ・４〜６８２０　１３ｍｇ。

Ｃｕ　Ｓ　０４　・５　Ｈ２Ｏ６ｍｇ、　コーン・スチ
ープ・リカー６６ｇ、Ｌ−チロシン３１０ｍｇ、Ｌ−フ
ェニルアラニン６５０ｍｇ、　ビオチン２３０μｇ。

サイアミン塩酸塩４５０μｇを水１１に含み、ｐ　Ｈ６
，８に調整した培地〕の入った２βジャーファーメンタ
−に接種し、３０℃、ｌｖｖｍ。

８００ｒｐｍ条件下で、ｐＨ６，１にアンモニア水にて
調整しながら、菌体を増殖させた。途中、２０５ｍｌの
フィード液〔シュークロース３７４ｇ、）（）（２ｐ○
、、０．７ｇ、に２ＨＰＯ４０，５ｇ。

Ｌ−チロンン６００ｍｇを水ｌβに含む培地〕を２回添
加し、糖を消費した時点て培養を終了した。培養液を水
で１００倍に希釈し６０℃で５分加熱後、培養Ｆ液を高
速液体クロマトグラフィーを用いたＯＰΔボストカラム
誘導体化法により定量してＬ−）ＩＪブトファンの生成
量を測定した。

結果を第２表に示す。

第　　　　２　　　　表 ＢＰＳ−１３２０，１ ＢＰＳ−１３／ｐｃＤｔｒｐ１５７３２．６発明の効果 本発明によれば、微生物のＤＳ、ＡＳ、ＰＲＴ。

ＰＲＡＩ、ＩｎＧＰＳおよびＴＳの合成に関与する遺伝
情報の全てを含む組換え体ＤＮＡを保有させて、コリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種におけ
るＬ−トリプトファンの生産性を付与、あるいは向上さ
せることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｃＤｔｒｐ１５７の制限酵素切断地図とその
作製工程を示す。太い実線部分の染色体ＤＮＡ断片上に
はＤＳ遺伝子が、また斜線部分の染色体ＤＮＡ断片上に
はトリプトファン生合成系遺伝子が含まれている。プラ
スミドの大きさはキロベース（Ｋｂ）で表示されている
。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社昭和６３年
／７月２２日

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロ
   ソネート−７−ホスフェートシンターゼ、アンスラニル
   酸シンターゼ、アンスラニル酸ホスホリボシルトランス
   フェラーゼ、Ｎ−５′−ホスホリボシルアンスラニル酸
   イソメラーゼ、インドール−３−グリセロールリン酸シ
   ンターゼおよびトリプトファンシンターゼの合成に関与
   する遺伝情報の全てを含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ
   との組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属ま
   たはブレビバクテリウム属に属する微生物を培地に培養
   し、培養物中にＬ−トリプトファンを生成蓄積させ、該
   培養物からＬ−トリプトファンを採取することを特徴と
   するＬ−トリプトファンの製造法。
2. （２）該ＤＮＡ断片がコリネバクテリウム属またはブレ
   ビバクテリウム属に属する微生物に由来することを特徴
   とする請求項１記載の方法。
3. （３）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
   属に属する微生物由来の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
   ヘプツロソネート−７−ホスフェートシンターゼ、アン
   スラニル酸シンターゼ、アンスラニル酸ホスホリボシル
   トランスフェラーゼ、Ｎ−５′−ホスホリボシルアンス
   ラニル酸イソメラーゼ、インドール−３−グリセロール
   リン酸シンターゼおよびトリプトファンシンターゼの合
   成に関与する遺伝情報の全てを含み、コリネバクテリウ
   ム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物にトリ
   プトファンのアナログに対する耐性を付与することがで
   きるＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとが結合した組換え体
   ＤＮＡ。
4. （４）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
   属に属する微生物由来の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
   ヘプツロソネート−７−ホスフェートシンターゼ、アン
   スラニル酸シンターゼ、アンスラニル酸ホスホリボシル
   トランスフェラーゼ、Ｎ−５′−ホスホリボシルアンス
   ラニル酸イソメラーゼ、インドール−３−グリセロール
   リン酸シンターゼおよびトリプトファンシンターゼの合
   成に関与する遺伝情報の全てを含むＤＮＡ断片とベクタ
   ーＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリ
   ウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物。