JPH0411893A - 芳香族アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、発酵法によるＬ−トリプトファン、法に関す
る。これらの芳香族アミノ酸は、医薬、食品、飼料等の
種々の分野に利用される重要なアミノ酸である。

従来の技術 ］リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する、いわゆるコリネ型グルタミン酸生産菌を用いた発
酵法によるＬ　−）　ＩＪブトファン、Ｌ−チロシンお
よびＬ−ファニルアラニンの製造法としては、アミノ酸
要求性を付与した変異株、芳香族アミノ酸のアナログに
対する耐性を付与した変異株あるいはそれらの変異形質
を併有する菌株を用いる方法がよく知られている〔農芸
化学会誌、５０．　（１）ρ、Ｒ，７９（１９７６））
。

さらに、近年、コリネ型グルタミン酸生産菌に組換えＤ
ＮＡ技術を適用できるようになり、組換え体プラスミド
を導入することによって、芳香族アミノ酸の生合成に係
わる酵素の遺伝子を増幅した菌株を用いる方法も開発さ
れている（特開平１２６５８９２、特開昭６３−９４９
８５）。

Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンの製ｉ告発明
が解決しようとする課題 り一トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬフェニルア
ラニンの需要は増大しており、工業的により有利な製造
法を開発することが望まれている。

課題を解決するための手段 本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属し、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよ
びＬ−フェニルアラニンから選ばれる少なくとも１つの
芳香族アミノ酸の取り込み活性が著しく低下し、かつＬ
−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルア
ラニンかう選ばれる少なくとも１つの芳香族アミノ酸生
産能を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該微生
物が生産能を有する芳香族アミノ酸を生成蓄積させ、該
培養物から該アミノ酸を採取することを特徴とする芳香
族アミノ酸の製造法を提供する。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明で用いられる微生物としては、コリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属に属し、芳香族アミノ
酸生産能を有し、かつ＞）ＩＪブトファン、Ｌ−チロシ
ンおよびＬ−フェニルアラニンから選ばれる少なくとも
１つの芳香族アミノ酸の取り込み活性が著しく低下した
菌株であれば−１ずれでも使用できる。これらの微生物
が、さらに他の性質、例えば各種栄養要求性、薬剤耐性
、薬剤感受性などを併せて持っていてもよい。

このような変異株を誘導する際に用５１られる親株とし
ては、次のような菌株をあげることができる。

コリネバクテリウム・グルタミクム　ＡＴＣＣ１３０３
２コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス　ＡＴ（：Ｃ１３８
６８コリネバクテリウム・リリウム　　　　ＡＴＣＣ１
５９９０ブレビバクテリウム・フラブム　　　ＡＴＣＣ
１４０６７ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ＡＴ［”Ｃ１３８６９ ブレビバクテリウム・ディバリカツム＾ＴＣＣ１４０２
０ブレビバクテリウム・チオゲニタリスＡＴ［：Ｃ１９
２４０芳香族アミノ酸生産性変異株は、公知の栄養要求
性変異あるいは芳香族アミノ酸アナログ耐性変異、さら
にはそれらの変異を併せ持つ菌株を誘導することによっ
て得られる。また、組換えＤＮＡ技術を用いて芳香族ア
ミノ酸の生合成に係わる酵素の遺伝子をクローニングし
、それを含む組換え体プラスミドを導入することによっ
ても得ることができる。

本発明の芳香族アミノ酸の取り込み活性が著しく低下し
た芳香族アミノ酸生産菌は、公知の芳香族アミノ酸生産
能を有する菌株に、芳香族アミノ酸の取り込み活性を著
しく低下させる変異を付与することによって取得できる
。逆に、芳香族アミ−）酸の取り込み活性が著しく低下
した変異株に、芳香族アミノ酸の生産性を誘起する栄養
要求性、芳香族アミノ酸アナログ耐性などの変異形質を
付与してもよい。また、芳香族アミノ酸生産性変異株と
芳香族ア捻ノ酸の取り込み活性が著しく低下した変異株
との細胞融合によって、両度異形質を獲得した染色体組
換え株を得ても目的が達成される。

本発明における芳香族アミノ酸の取り込み活性が著しく
低下した変異株は、Ｌ−）ＩＪブトファン、Ｌ−チロシ
ンまたはＬ−フェニルアラニン要求株から誘導すること
ができる。すなわち、通常の変異処理法、例えば紫外線
照射またはＮ−メチルＮ′−二トローＮ−ニトロソグア
ニジン（ＮＴＧ）や亜硝酸などの化学処理を施した後、
親株が生育できる低濃度の要求アミノ酸を含む最少培地
では生育できないかもしくは生育不良であるが、要求ア
ミノ酸を低濃度のジペプチドの形で添加した最少培地で
は良好に生育する変異株を分離することによって取得す
ることができる。

本発明の微生物による芳香族アミノ酸の生産は、通常の
培養法で実施することができる。使用培地としては、炭
素源、窒素源、無機物その他使用菌株の必要とする微量
の栄養素を程よく含有するものならば、合成培地または
天然培地いずれも使用できる。

炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解物、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコール
、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各種有機
酸が使用できる。さらに微生物の資化性によって、炭化
水素、アルコール類なども用いられる。特に廃糖蜜は好
適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアまたは塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは尿
素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチーブ・リカ
ー、カセ°イン加水分解物、フィツシュミールまたはそ
の消化物などの窒素含有有機物など種々のものが使用で
きる。

さらに無機物としては、リン酸第−水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄
、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する。

培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は、一般に２０〜４０℃が好適であ
る。培地のｐＨは、中性付近に維持することが望ましい
。培養期間は、通常１〜５日間である。

培養液から芳香族アミノ酸を採取する方法は、培養終了
後、菌体を除去して濃縮晶析する方法、活性炭処理ある
いはイオン交換樹脂処理などの公知の方法によって行わ
れる。

以下に、実施例をあげて、本発明を具体的に説明する。

実施例１ コリネバクテリウム・グルタミクムにＹ９１８２　（野
生株＾ＴＣＣ１３０３２株からフェニルアラニン要求株
として誘導され、ブＬ／′：フエネートデヒドラターゼ
活性を欠損している）〔アグリカルチュラル・アンド・
バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏ
ｌ。

Ｃｈｅｍ、）　３９　　、３３Ｈ１９７５）］を、］特
開平１−２６５８９に開示されたコリネバクテリウム・
グルタミクムの３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−へプツロ
ソネート７−ホスフェートシンターゼ遺伝子およびトリ
プトファン生合成酵素遺伝子群を含む組換え体プラスミ
ドｐｃＤｔｒρ１５７を用いて、以下のようにして形質
転換し、スペクチノマイシンに耐性となった形質転換株
を選択することにより、フェニルアラニン要求性を有し
、かつＬ−）ＩＪブトファン生産能を有する微生物を誘
導した。

ｐｃＤｔｒｐ１５７は、それを保有するに７６株（Ｆ　
Ｅ　Ｒ！ＪＢＰ−１８４７）から、次の方法で単離した
。

ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ１酵母エキス５ｇを水１
βに含み、ｐＨ７，２に調整した培地）で増殖したに７
６株の種培養２０ｍ１を７エニルアラニンおよびチロシ
ン各１００■／ｍｌを含む半合成培地ＳＳＭｆ’グルコ
ース２０ｇ、　（ＮＨ４）２５０４１０ｇ、尿素３ｇ、
酵母エキスＩｇＳＫＨ２Ｐ０４１ｇ、　ＭｇＣｌ！２・
６Ｈ２００、４ｇ　、　Ｆｅ５Ｏｎ　・７ＬＯ１０ｍｇ
、　ＭｎＳＯ４・４〜６）１２００．２ｍｇ１ＺｎＳＬ
　・７）１２００．９ｍｇ５ＣｕＳＯ＜　・５ＨＪ　０
．４ｍｇ、ＮａＪ４０７・１０Ｈ２００，０９ｍｇ、　
（ＮＨ＜）６ＭＯ７０２＜　・４）１２００．０４ｍｇ
。

ビオチン３０ａｇおよびサイアミン塩酸塩１ｍｇを水１
βに含み、ｐＨ７，２に調整した培地］　　４００ｍに
接種して、３０℃で振盪培養し、ＯＤが０．２になった
時点で培養液に０．５単位／ｍｌの濃度となるようにペ
ニシリンＧを添加した。さらに培養を維持し、ＯＤが０
．６になるまで生育させた。菌体を集菌し、ＴＥＳ緩衝
液〔ｏ、ｏ３Ｍ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、０．００５Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
、０．０５Ｍ　ＮａＣＡ、　ｐＨＢ、□Ｂ　テ洗浄後、
リゾチーム溶液・：２５％ショ糖、Ｏ，ＩＭ　ＮａＣｊ
７．０．０５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、０．８ｍｇ／ｍｌリゾチーム、ｐＨ８，０〕１０　
ｍに懸濁し、３７℃で２時間反応させた。反応液に５Ｍ
　ＮａＣｊ！　２．４ｍ＆、０．５Ｍエチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム（ｐＨ８，５）０、６ｍＲ１４％ラ
ウリル硫酸ナトリウムと０．７Ｍ　ＮａＣ１からなる溶
液４．４ｍｌを順次添加し、緩やかに混和してから氷水
上に１５時間装いた。溶菌物を遠心管に移し、４℃で６
０分間６９．４００Ｘ　ｇの遠心分離にかけ上澄液を回
収した。これに重量百分率１０％相当のポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）　６，０００（半井化学薬品社製）
を加え、静かに混和して溶解後、氷水上に置いた。１０
時間後、１，５００Ｘｇで１０分間遠心分離してペレッ
トを回収した。

ＴＥＳ緩衝液５ｒＩＪ１を加えてペレットを静かに再溶
解してから、１．５■／ｍｌエチジウムブロマイド２．
０ｍｌを添加し、これに塩化セシウムを加えて静かに溶
解し、密度を１．５８０に合わせた。この溶液を１０５
．０００Ｘ　ｇ、　１８℃で４８時間超遠心分離にかけ
、紫外線照射下に検知される遠心チューブ下方の密度の
高い位置のバンドを、遠心チューブの側面から注射器で
抜きとることによって、ｐＣＤｔｒｐ１５７プラスミド
ＤＮＡを分離した。この分画液を等容量のイソプロピル
アルコール液〔容量百分率９０％イソプロピルアルコー
ル、１０％ＴＥＳｉｌｆｌ液（この混液中に飽和溶解量
の塩化セシウムを含む）〕で５回処理してエチジウムブ
ロマイドを抽出除去し、しかる後にＴＥＳ緩衝液に対し
て透析した。

このようにして得られたｐｃＤｔｒｐ１５７ブラスミド
ＤＮＡを用いて、ＫＹ９１Ｂ２株を以下のようにして形
質転換した。

ＫＹ９１８２株の種培養４ｍｌを、グリシルフェニルア
ラニン１００ｇ／ｍｃを含むＳＳＭ培地４０ｍ１に植菌
し、３０℃で振盪培養した。ＯＤが０．２になった時点
で上記と同様な方法でペニシリンＧ処理後、ＯＤが０．
６になるまで生育させた。菌体を集菌し、該細胞をＲＣ
ＧＰ培地ロ培地ロールコース５ｇミノ酸５ｇ、酵母エキ
ス２．５ｇ、　Ｋ２ＨＰＯ４３，５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１
，５ｇ、　ＭｇＣＬ・６１１Ｊ　　０．４１ｇ、　Ｆｅ
ＳＯ４７Ｈ２０１０ｍｇ５Ｍｎ５Ｌ　・４〜６ｔｌａ０
２ｍｇ、　２ｎＳＬ　・７Ｈ２００，９ｍｇ、（’ｌ８
４）　６Ｍ０７０２ｓ　’　４Ｈ２００，０４ｍｇ、ビ
オチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩２ｍｇ、コハク酸ニ
ナトリウム１３５ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量１
０．０００＞３０ｇを水１１に含む培地〕に１ｍｇ／ｍ
ｃのリゾチームを含む溶液（ｐ）１７．６）　１０　ｒ
ｎｌに約１０９細胞／ｍｌとなるように懸濁し、Ｌ型試
験管に移して３０℃で１６時時間巾かに振盪反応してプ
ロトプラスト化した。

このプロトプラスト菌液０．５ｍｌを小試験管にとり、
２，５００Ｘｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣ緩衝液Ｃ
ｌ０ｍＭ　ＭｇＣｆ　２．３０ｍＭ　［：ａＣｊ！　２
．５０ｍＭ　）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
、４００ｍＭショ糖、ｐＨ７，５１１−に再懸濁して遠
心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衝液０．１　ｍｌ！’に再懸濁し
た。この菌液に２倍高濃度のＴＳＭＣ緩衝液とｐｃＤｔ
ｒｐ１５７ブラスミドＤＮＡ溶液の１対１混合液１００
頭を加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液中に２０％Ｐ
ＥＧ６，０００を含む液０．８ｍｌを添加して混合した
。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）　２ｍ＋２を添
加し、２，５００Ｘｇで５分間遠心分離にかけて上澄液
を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲＣＧＰ
培地に懸濁してから、この菌液０．２−を、スペクチノ
マイシン４００Ｊ１ｇ／ｎｆを含むＲＣＧＰ寒天培地（
ＲＣＧＰ培地に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ７，２）
に塗布して３０℃で７日間培養し、スペクチノマイシン
に耐性となった形質転換株を選択した。

これらの形質転換株から、上記と同様な方法によりプラ
スミドＤＮＡを単離した。これらのプラスミドの各種制
限酵素での切断解析により、形質転換株がｐｃＤｔｒｐ
１５７を保有することを確認した。

このようにして、ｐｃＤｔｒｐ１５７を保有する形質転
換株ＫＹ９１８２／　ｐｃＤｔｒｐ１５７株を得た。

同様に、ＫＹ９１８２株を特開昭６３−９４９８５に開
示されたコリネバクテリウム・グルタミクムの３デオキ
シ−Ｄ−アラビノーヘプツロソネート７−ホスフエート
シンターゼ遺伝子およびコリスメートムターゼ遺伝子を
含む組換え体プラスミドｐｃＤｓ−ＣＭＩを用いて形質
転換し、スペクチノマイシンに耐性となった形質転換株
を選択することにより、フェニルアラニン要求性を有し
、かつＬ−チロシン生産能を有する微生物を誘導した。

ρＣＤ　Ｓ　−ＣＭ　１は、それを保有するに６８株（
ＦＥＲＭ　ＢＰ−１１２２）から上記と同様な方法によ
り単離したものを用５）、上記と同様な方法でＫＹ９１
８２株を形質転換し、ｐｃ’ｓＣＭＩを保有する形質転
換株ＫＹ９１Ｂ２／ｆｌｃＤｓ−Ｃｕ２株を得た。

このようにして得られたＫＹ９１Ｂ２／　ｐｃＤｔｒｐ
１５７株およびＫＹ９１８２／　ｐＣＤＳ−Ｃｕ２株を
親株として、以下のようにして芳香族アミノ酸の取り込
み活性低下変異株を誘導した。

ＫＹ９１８２／　ｐｃＤｔｒｐ１５７株およびＫＹ９１
８２／　ｐｃＤｓ−Ｃｕ２株をそれぞれＮＢ培地３ｍｌ
で３０℃、ＯＤが約０．６になるまで生育させた。得ら
れた培養液より菌体を集ｉ、　５０＋＋＋Ｍ）リス・マ
レイン酸緩衝液（ｐｆ１６．０）で１回洗浄後、ＮＴＧ
　　４００Ｊ１ｇ／ｍｆ！を含む同緩衝液３ｍ＆中で、
室温で２０分間処理した。処理菌体を同緩衝液で２回遠
心洗浄後、ＮＢ＠地３−中、３０℃で２時間培養した。

この培養液を生理食塩水で１０−５〜１０−’に希釈後
、その０．１　ｎｉｌをＮＢ寒天培地（ＮＢ培地に１．
４％寒天を含む培地、ｐＨ７，２＞に塗布し、３０℃で
３日間培養した。生育コロニーを、フェニルアラニン１
０■／ｍｌまたはグリシルフェニルアラニン１５■／ｌ
を含む最少寒天培地Ｍ１　〔グルコース１０ｇ、（ＮＨ
４）　Ｈ２ＰＯ４１ｇ　、　ＫＣβ０．２ｇ、　ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２００，２ｇ５ＦｅＳＯ１・７）１２０　１
０ｍｇ−ＭｌｌＳＯ４・４〜６）１２００．２ｍｇ、　
２ｎＳＬ　・７）１２００．９ｍｇ、　Ｃｕ５Ｌ’　５
）１２００．４ｍｇ、　ＮａＪ４０ｔ　”　１０ＨａＯ
Ｏ，０９ｍｇ、（ＮＨ４）　６Ｍ０７０２４・４Ｈ，０
０゜０４ｍｇ、ビオチン５０■、ｐ−アミノ安息香酸２
．５ｍｇ、サイアミン塩酸塩１ｍｇおよび寒天１６ｇを
水１１中に含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地〕に各々
レプリカし、前者で生育せず後者で生育できる株を分離
し、得られた変異株の芳香族アミノ酸の取り込み活性を
、親株ＫＹ９１８２とともに測定した。芳香族アミノ酸
の取り込み活性の測定は次のようにして行った。得られ
た変異株およびＫＹ９１８２株を、それぞれグリシルフ
ェニルアラニン１１００Ｊ１／ｍｌを含むＭ１液体培地
で、ＯＤが約２になるまで培養した。培養菌体を、１　
ｍＭ　Ｍｇ５Ｌ・７Ｈ２０を含む０．１Ｍ）リス・リン
酸緩衝液（ｐ）１７．２）で２回遠心洗浄後、同緩衝液
にＯＤが１０になるように懸濁した。この洗浄菌体０．
１ｍｌを、１　ｍＭ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，１０ｍ　
！、！グルコース、１００　ｑ／ｄクロラムフェニコー
ルを含む０．１ＭＩＪス・リン酸緩衝液（ｐ１４７、２
）　　０．９　ｍに加え、３０℃で３分間加温した。

次し）で、＋４Ｃ−Ｌ−フェニルアラニン、”Ｃ−Ｌチ
ロシン、または”Ｃ−Ｌ−トリプトファン溶液を１０ｔ
ｄ！　（０，０１，ｕ、ｍｏｌ、０．１〜０．５μ［：
ｉ）添加し、３０℃で反応を開始した。１分おきに０．
１ｍｌずつ分取し、メンブレンフィルター（孔径０．４
５μｍ）を用いて濾過後、菌体を同フィルター上で冷ト
リス・リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）　１　ｍで５回洗浄
した。フィルターを乾燥し、液体シンチレータ−により
放射活性を測定した。第１表に示すように、”Ｃ−Ｌ−
フェニルアラニン、１４Ｃ−Ｌ−チロシンおよび’Ｃ−
Ｌ−）ＩＪブトファンの取り込み活性は、いずれも０．
３〜０．４に低下していた。

第　　　１　　　表 Ｙ９１８２ このようにして得られたＫＹ９１８２／　ｐＣＤｔｒｐ
１５７株およびＫＹ９１８２／ρＣＤＳ−Ｃｕ２株より
誘導された芳香族アミノ酸の取り込み活性低下変異株は
、それぞれコリネバクテリウム・グルタミクムに８４お
よびに８５として、平成２年３月３０日付で工業技術院
微生物工業技術研究所に、ブダペスト条約に基づいて、
ＦＥＲＩＪ　ＢＰ〜２８４２、ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８４
３として寄託されている。

実施例２ 実施例１で得られたコリネバクテリウム・グルタミクム
に８４およびに８５株を用いて、Ｌ−トリプトファンお
よびＬ−チロシンの生産試験を、それぞれ以下のように
して行った。

Ｋ８４株およびｐｃＤｔｒｐ１５７を保有するにＹ９１
８２株をスペクチノマイシン１００μｇ／ｍ＆を含む種
培地５３（グルコース２０ｇ１ポリペプトン１５ｇ１酵
母エキス１５　ｇ、　ＮａＣｊ！　２．５ｇ、尿素１ｇ
、グリシルフェニルアラニン２００ｍｇを水１１に含み
、ｐ　Ｈ７，２ｉ：調整した培地）３−中で３０ｔ、２
４時間振盪培養した種培養０．５ｍｌをスペクチノマイ
シンｌ　００　ａｇ／ｍを含む生産培地ＰＩ　　〔グル
コース６０ｇ、　ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、　Ｋ２ＨＰＯ４１
ｇ、　Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０１ｇ。

（ＮＨ＜）ｚｓ［］４２０ｇ、　ｍｌ−：／−スチーブ
・ｌＪカー１０ｇ。

Ｍｎ５Ｏａ　１０ｍｇ、　ヒｔ　’Ｐ　ン３０ｇ、［：
ａ［：Ｏｓ　２０　ｇを水ＩＩに含み、ｐ　Ｈ７，２に
調整した培地〕５ｍｌの入った大型試験管にそれぞれ接
種し、３０℃で７２時間振盪培養した。培養後、培養ｐ
液を高速液体クロ体化法〔プロシイディング・オブ・ザ
・ナショナル・アカテ゛ミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　７２　、６１９＜１９７５）
）により定量して、Ｌ−）ＩＪブトファンの生成量を測
定した。

結果を第２表に示す。

第２表 ＫＹ９１Ｂ２／ｐｃＤｔｒｐ１５７　　　　　　　１．
１に８５株およびｐｃＤｓ−ＣＭＩを保有するＫＹ９１
Ｂ２株のし一子ロシン生産試験を、上記のＬ−）！Ｊブ
トファン生産試験と同様な方法により行った。培養後、
培養液１−に６Ｎ　Ｎａ叶溶液を５０μＱ加え、６５℃
で５分間加熱し、析出しているチロシンを完全に溶解さ
せた後、培養戸液を高速液体クロマトグラフィーを用い
たＯＰＡポストカラム誘導体化法により定量して、Ｌ−
チロシンの生成量を測定した。

結果を第３表に示す。

第 表 ＫＹ９１８２／　ｐＣＤＳ−ＣＭＩ　　　　　　　　　
４゜６実施例３ コリネバクテリウム・グルタミクムにＹ９２９５　（＾
ＴＣＣ１３０３２株から誘導されたチロシン要求株）〔
アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　３９　
、３３１（１９７５）二を、特開昭６３−１０５６８８
に開示された大腸菌の３デオキシ−Ｄ−アラビノ−へブ
シロソネートー７−ホスフエートシンターゼ遺伝子及び
コリスメートムターゼ−プレフェネートデヒドラターゼ
遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＥａｒｏＧ−ｐｈｅ
Ａ３を用いて形質転換し、カナマイシンに耐性となった
形質転換株を選択することにより、チロシン要求性を有
し、かつＬ−フェニルアラニン生産能を有する微生物を
誘導した。

ｐＥａｒｏＧ−ｐｈｅＡ３は、それを保有するに６７株
（ＦＥＲＭＢＰ−１１２１）から、実施例１と同様な方
法により単離した。また、形質転換株の取得は、実施例
１と同様な方法により行った。ただし、形質転換株の選
択には、スペクチノマイシンの代わりにカナマイシン２
００■／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地を用いた。

このようにして得られたＫＹ９２９５／　ｐＥａｒｏＧ
−ｐｈｅＡ３株を親株として、以下のようにして芳香族
アミノ酸の取り込み活性低下変異株を誘導した。

ＫＹ９２９５／　ｐＥａｒｏＧ−ｐｈｅＡ３株を、実施
例１と同様な方法によりＮＴＧで処理した。処理菌体を
５０ｍＭトリス・マレイン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で２
回遠心洗浄後、〜ＢＮ地３ｍｌ中、３０℃で２時間培養
した。この培養液を生理食塩水で１０−５〜１０〜６に
希釈後、その０．１−をＮＢ寒天培地に塗布し、３０℃
で３日間培養した。

生育コロニーを、チロシン１０■／−またはグリシルチ
ロシン１５ｇ／ｍ＆を含む最少寒天培地Ｍ１に各々レプ
リカし、前者で生育せず後者で生育できる株を分離した
。このようにして得られた変異株の１株、Ｋ２Ｓ株の芳
香族アミノ酸の取り込み活性を、親株ＫＹ９２９５とと
もに測定した。

芳香族アミノ酸の取り込み活性の測定は、グリシルチロ
シン１００μｇ／ｍ＆を含むＭ１液体培地で培養した菌
体を用いて、実施例１と同様な方法で測定した。第４表
に示すように、Ｋ２Ｓ株における＋４ｃＬ−フェニルア
ラニン、”Ｃ−Ｌ−チロシンおよび”Ｃ−Ｌ−トリプト
ファンの取り込み活性は、ＫＹ９２９５株のそれを１と
したとき、いずれも０．２〜０．３に低下していた。

第４表 Ｙ９２９５ １　　　　　　　　１に のようにして、にＹ９２９５／ｐＥａｒｏＧ−ｐｈｅＡ
３株より誘導された芳香族アミノ酸の取り込み活性低下
変異株、コリネバクテリウム・グルタミクムに８６は、
平成２年１０月１９日付で工業技術院微生物工業技術研
究所に、ブダペスト条約に基づいて、ＦＥＲＭ　ＢＦ−
３１３３として寄託されている。

実施例４ 実施例３で得られたコリネバクテリウム・グルタミクム
に８６を用いて、Ｌ−フェニルアラニンの生産試験を以
下にようにして行った。

Ｋ８６株およびｐＥａｒｏＧ−ｐｈｅＡ３を保有するＫ
Ｙ９２９５株を、カナマイシン２０μｇ／ｍｃを含む種
培地Ｓ４　（グルコース２０ｇ１ポリペプトン１５ｇ１
酵母エキス１５ｇ。

ＮａＣｊ！　　２．：＋ｇ１尿素尿素１グ、グリシルチ
ロシン２０　ｍｇを水ＩＡに含み、ｐｆ１７．２に調整
した培地）３ｍｌ中で、３０℃、２４時間振盪培養した
種培養０，５ｍｌを、カナマイシン１００■／ｍｌおよ
びグリシルチロシン２００■／ｍＩ２を含むＰ１生産培
地５ｍｌの入った大型試験管にそれぞれ接種し、３０℃
で７２時間振盪培養した。培養後、培養ｐ液を高速液体
クロマトグラフィーを用いたＯＰＡポストカラム誘導体
化法により定量して、Ｌ−フェニルアラニンの生成量を
測定した。

結果を第５表に示す。

第 〕 表 ＜ｇ／ＩＩ） ＫＹ９２９５／ｐＥａｒｏＧ−ｐｈｅＡ３３．２ に８６ ４．０ 本発明によれば、芳香族アミノ酸の取り込み活性を著し
く低下させることにより、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属菌におけるＬ−）ＩＪ７’）ファ
ン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンの生産性
を向上させることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
   し、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−フェ
   ニルアラニンから選ばれる少なくとも１つの芳香族アミ
   ノ酸の取り込み活性が著しく低下し、かつＬ−トリプト
   ファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンから
   選ばれる少なくとも１つの芳香族アミノ酸生産能を有す
   る微生物を培地に培養し、培養物中に該微生物が生産能
   を有する芳香族アミノ酸を生成蓄積させ、該培養物から
   該アミノ酸を採取することを特徴とする芳香族アミノ酸
   の製造法。