KR920009500B1 - L-트립토판의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
제 1도는 제한효소에 대한 pCDtrp157의 절단지도 및 플라스미드의 구축단계를 나타낸다. DS 유전자는 pCDtrp157의 검게 칠한 부분에 포함되어 있는 반면에, L-트립토판 생합성에 관한 유전자는 pCDtrp157의 빗살친 부분에 포함되어 있다. 플라스미드의 크기는 킬로염기(Kb)로 나타낸다.
코리네박테리움(Corynevacterium) 또는 브레비박테리움(Brevibcterium)속에 속하고 L-트립토판을 생산할 수 있는 각종 균주가 재조합 DNA 기술에 의해 구축되었다. 그것에는 안트라닐레이트 신타제(이하 AS로 약칭함)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 DNA 보유 균주(일본국 특허 공개 제156292/1984호), 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스피라제 (이하 PRT로 약칭함), N-5'-포스포리보실 안트라닐레이트 이소메타제(이하 PRAI로 약칭함), 인돌-3-글리세롤 포스페이트 신타제(이하 InGPS로 약칭함) 및 트립토판 신타제(이하 TS로 약칭함)을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 DNA 보유 균주(일본국 특허 공개 제149082/1986호), 3-데옥시-D-아라비노-헵투로소네이트-7-포스페이트 신타제(이하 DS로 약칭함)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 DNA 보유 균주(일본국 특허 공개 제51980/1987호) (상기 유전자를 몇몇 하기 경우에서 각각 AS 유전자, PRT 유전자, PRAI 유전자, InGPS 유전자, TS 유전자 및 DS 유전자로 약칭함), 및 PRAI-InGPS 유전자를 함유하는 재조합 DNA 보유 균주(일본국 특허 공개 제79775/1987호)가 포함된다.
최근 L-트립토판의 수요가 증가함에 따라, 이 아미노산의 제조방법의 개선이 요구되고 있다. 재조합 DNA 기술에 의해 L-트립토판 생산성이 더 높은 신규 균주를 구축하기 위하여 많은 연구를 기울인 결과, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 균주에 DS, AS, PRT, PRAI, InGPS 및 TS의 합성에 관한 모든 유전 정보를 갖는 DNA 단편을 함유하는 재조합 DNA를 도입함으로써 L-트립토판 생산성을 증가시킬 수 있다는 사실을 발견하고, 본 발명을 완성하였다. 상술한 것과 같이, L-트립토판의 생합성에 관한 유전자, 즉 AS, PRT, PRAI, InGPS 및 TS 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 DNA 보유 L-트립토판-생산균주(일본국 특허 공개 제156292/1984, 149082/1986 및 79775/1987호), 및 DS 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 DNA 보유 L-트립토판-생산균주(일본국 특허 공개 제51980/1987호)가 공지되어 있다. 그러나, DS, AS, PRT, PRAI, InGPS 및 TS 유전자를 모두 함유하는 재조합 DNA를 사용한 예는 공지되어 있지 않다. 이 모든 유전자를 동시에 증폭시킴으로써 L-트립토판 생산성이 더 증가될 수 있다는 사실이 본 발명에서 처음으로 기재되었다.
본 발명은 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하고 벡터 DNA 및 DS, AS, PRT, PRAI, InGPS 및 TS의 합성에 관한 모든 유전자를 갖는 DNA 단편으로 이루어진 재조합 DNA를 보유하는 미생물을 배지에 배양시키고, L-트립토판을 배지에 축적시키고, 여기에서 L-트립토판을 회수함을 특징으로 하는 L-트립토판의 제조방법에 관한 것이다. 이리하여 본 발명은 생물 산업분야, 특히 약학 및 동물사료 산업에서 유용한 물질인 L-트립토판의 제조과정에 관한 것이다.
본 발명은 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하고 벡터 DNA 및 DS, AS, PRT, PRAI, InGPS 및 TS의 합성에 관한 모든 유전 정보를 갖는 DNA 단편으로 이루어진 재조합 DNA를 보유하는 미생물을 배지에 배양하고, L-트립토판을 배지에 축적시키고, 여기에서 L-트립토판을 회수함을 특징으로 하는 L-트립토판의 제조방법에 관한 것이다.
DNA 단편으로는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물로부터 유래된 것을 사용할 수 있다.
각 유전자의 공여주로는, 방향족 아미노산의 생합성에서 자기영양성인 어떤 미생물을 사용할 수 있다. 특히 바람직한 유전자는 에스케리키아(Escherichia), 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 세균과 같은 원핵생물로부터 유래된 것이고, 이런 세균으로부터 유래된 방향족 아미노산-생산 변이체로부터 기원된 것이 가장 바람직하다.
글루탐산-생산 코리네형 세균으로 공지된 균주중 어느것을 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 숙주 미생물로 사용할 수 있다. 바람직한 균주를 하기에 기재한다.
코리네박테리움 글루라미쿰(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032
코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870
코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)ATCC 13868
코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium)ATCC 15990
코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)ATCC 17965
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)ATCC 14067
브레비박테리움 임마리오필리움(Brevibacterium immariophilium)ATCC 14068
브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869
브레비박테리움 티오게니탈리스(Brevibacterium thiogentalis)ATCC 19240
상기 균주로부터 변이에 의해 유도된 방향족 아미노산-생산 변이제를 사용하는 것이 더 바람직하다. 이 변이체는 아미노산-요구성 및/또는 아미노산 유사체에 대한 내성을 갖는 균주로서 수득될 수 있다[J. Agric. Chem. Soc., 59(1), p.R 79(1976)].
상기 DNA 단편을 삽입시키기 위한 벡터로는, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물내에서 자율복제할 수 있는 어느 플라스미드를 사용할 수 있다. 이런 플라스미드의 예는 pCG1(일본국 특허 공개 제134500/1982호), pCG2(일본국 특허 공개 제35197/1983호), pCG11(일본국 특허 공개 제183799/1982호), pCE54 및 pCB101(일본국 특허 공개 제105999/1983호), 및 pCE51, pCE52 및 pCE53[Mol. Gen. Genet., 196, 175(1984)]이다.
벡터 DNA 및 DS 코딩 유전자를 함유하는 공여 DNA로 이루어진 재조합 DNA는 통상적인 방법, 예를 들면, 공여 DNA 및 벡터 DNA를 적당한 제한 효소를 사용하여 절단한 후, 필요하다면 말단 트랜스퍼라제 또는 DNA 플리미라제를 사용하여 절단 끝을 처리하고, 두 DNA를 DNA 리가제의 작용에 의해 연결시킴으로써 각종 재조합 DNA와 함께 혼합물로서 수득할 수 있다[Methods in Enzymology, 68, (1987)]. 이렇게 수득된 연결 DNA의 혼합물은 DS 유전자가 결실된 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 변이주를 형질 전환시키기 위해 사용하고, 결실이 완성된 형질 전환체를 선택한다. DS 유전자를 함유하는 재조합 DNA는 플라스미드를 상기 형질 전환체로부터 분리함으로써 수득할 수 있다. 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속 균주의 형질전환은 사용하는 방법에 의해 수행할 수 있다(일본국 특허 공개 제186492/1982호).
벡터 DNA 및 L-트립토판의 생합성에 관한 유전자를 함유하는 공여 DNA로 이루어진 재조합 DNA는 유사한 방법, 즉 L-트립토판 생합성에 관한 어느 하나의 유전자가 결실된 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 트립토판-요구 변이체를 염색체 DNA 및 벡터 DNA로 이루어진 재조합 DNA의 혼합물을 사용하여 형질 전환시키고, L-트립토판 요구성을 갖지 않는 형질 전환체를 선택한 후, 형질 전환체로부터 재조합 DNA를 분리하는 방법으로 수득할 수 있다. L-트립토판 생합성에 관한 유전자는 코리네박테리움, 브레비박테리움 또는 에스케리키아 속의 미생물로부터 유래된 L-트립토판-요구 변이체를 사용하는 상보성 시험에 의해 동정할 수 있다. 시험에 의해, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 L-트립토판의 생합성에 관한 요소인 AS, PRT, PRAI, InGPS 및 TS의 합성에 관한 모든 유전정보는 11.0 킬로염기(Kb)의 Bam HI DNA 단편에 위치한다는 사실이 증명된다[실시에 (3)].
DS 유전자를 함유하는 DNA 단편 및 상기에 수득된 L-트립토판 생합성에 관한 유전자를 함유하는 DNA 단편의 조합으로 두 유전자를 모두 함유하는 재조합 DNA를 수득한다. 이 유전자는 이렇게 수득된 재조합 DNA를 숙주 미생물에 도입함으로써 동시에 증폭시킬 수 있다. 한편, 이 유전자는 또한, 그것이 동일한 세포에 공존할 수 있는 다른 벡터 플라스미드에 포함되어 있고 이 플라스미드가 숙주 미생물에 동시에 도입되어있다면 증폭시킬 수 있다. 두가지 경우에서, L-트립토판의 생산성은 개선될 수 있다.
코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속 야생주의 염색체 DNA를 상기 단계에서 공여체로 사용하면, 형질전환을 통하여 야생형 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 미생물에 도입할 수 있다. 그러나, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 미생물에서 DS는 페닐알라닌 및 티로신에 의해 피이드백 억제를 받으며, AS 및 PRT는 트립토판에 의해 피이드백 억제를 받는다고 공지되어있다 [Agric. Biol, Chem,. 39, 351(1975); 상동, 47, 2295(1983)]. 그러므로, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 미생물에서 더 높은 L-트립토판 생산성을 얻기 위하여 이러한 피이드백 억제를 받지 않는 DS, AS 및 PRT 코딩 변이형 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 사용하는 것이 바람직하다. 변이형 DS, AS, 및 PRT 유전자는 DS, AS 또는 PRT가 피이드백 억제를 받지 않는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 변이주의 염색체 DNA를 공여체로 사용함으로써 수득할 수 있다. 변이체 유전자의 선택은 상술한대로 DS, AS 또는 PRT 결손의 상보성에 기초하여 수행할 수있다. 한편, 이러한 변이형 DS, AS, PRT 유전자는 야생형 DS 유전자 또는 야생형 AS 및 PRT 유전자를 함유하는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 균주를 수용균으로 사용하고 p-플루오로페닐알라닌(이하 PFP로 약칭함)과 같은 페닐알라닌 유사체 또는 5-플루오로트립토판(이하 5FT로 약칭함)과 같은 트립토판 유사체에 내성인 형질 전환체를 선택함으로써 수득할 수 있다. 변이형 DS, AS 및 PRT 유전자를 함유하는 재조합 DNA는 야생형 유전자를 함유하는 재조합 DNA의 제조에서와 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
한편, 이러한 재조합 DNA는 문헌[Mol. Gen. Genet., 145, 101(1978)]에 기술된 방법에 따라 야생형 유전자를 함유하는 재조합 DNA의 시험관내 변이 유발에 의해 또는 통상적인 방법에 따라 야생형 유전자를 함유하는 재조합 DNA보유 균주의 생체내 변이유발에 의해 제조할 수 있다. 야생형 또는 변이형 DS 유전자 및 L-트립토판 생합성에 관한 야생형 또는 변이형 유전자를 함유하는 재조합 DNA는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속 균주에 상기 원형체를 사용하는 형질전환 방법에 의해 도입시킬 수 있다.
이러한 재조합 플라스미드 보유 형질전환체를 사용하는 L-트립토판의 제조는 발효에 의한 통상적인 아미노산 제조방법과 동일한 방법에 의해 수행할 수 있다. 형질 전환체를 탄소원, 질소원, 무기물질, 아미노산, 비타민 및 기타 영양소를 함유하는 통상적인 배양 배지내 호기 조건하 조절온도, pH 등에서 배양하고, 배양액내 축적된 L-트립토판을 여기에서 회수한다.
탄소원으로는, 글루코스, 글리세롤, 프룩토스, 슈크로스, 말토스, 만노스, 전분, 전분 가수분해물 및 당밀과 같은 각종 탄수화물; 다가알콜; 및 피루브산, 푸마르산, 락트산 및 아세트산과 같은 각종 유기산을 사용할 수 있다. 또한 사용되는 균주의 동화 능력에 따라 탄화수소 및 알콜을 사용할 수 있다. 특히, 옥수수 당밀을 사용하는 것이 바람직하다.
질소원으로는, 암모니아; 염화 암모늄, 황산 암모늄, 탄산 암모늄 및 아세트산 암모늄과 같은 각종 무기 및 유기 암모늄 염; 우레아 및 기타 질소-함유 물질; 및 펩톤, NZ-아민, 육즙, 효모 추출액, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어육 또는 그의 소화 생성물 및 번데기 가수분해물과 같은 질소-함유 유기물질을 사용할 수 있다.
무기 물질로는, 인산 수소 이칼륨, 인산이수소칼륨, 황산 암모늄, 염화암모늄, 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 황산제일철, 황산 망간, 탄산 칼슘 등을 사용할 수 있다. 또한 아미노산 및 비오틴 및 티아민과 같은 비타민을 사용하는 배지내 탄소 및 질소원에 따라 필요한대로 가할 수 있다. 또한, 사용되는 균주가 성장에 특정 물질을 요구한다면, 그 물질을 배지에 가해줄 필요가 있다.
배양은 바람직하게는 20∼40℃의 온도, 호기 조건하에서 예를 들면, 교반배양 또는 호기-교반 배양에 의해 수행한다. 배지의 pH는 배양동안 중성 부근으로 유지하는 것이 바람직하다. L-트립토판은 일반적으로 1~5 일동안 배양시킴으로써 배지내에 축적시킨다. 배양 완결 후, 여과 또는 원심분리에 의해 배양액으로부터 세포를 제거하고, 분리된 여액 또는 상층액을 공지된 방법으로 처리(예, 활성탄 및 이온-교환수지를 사용하는 처리)함으로써 L-트립토판을 회수한다.
L-트립토판은 DS 유전자 및 L-트립토판의 생합성에 관한 유전자를 함유하는 재조합 DNA 보유 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 균주를 사용하여 더 높은 수율로 제조할 수 있다.
본 명세서에서, L-트립토판의 생산성이 DS, AS, PRT, PRAI, InGPS 및 TS 유전자를 모두 함유하는 재조합 DNA룰 코리네박테리움 글루타미쿰에 도입함으로써 증가되는 경우를 제시한다. 그러나, 코리네박테리움 글루타미쿰 대신 다른 글루탐산-생산 코리네형 세균을 사용하여 목적을 달성할 수도 있다.
많은 공통적인 미생물 특징에도 불구하고, 소위 고글루탐산 생산성을 갖는 글루탐산-생산 코리네형 세균은 연구가들에 의해 여러 가지 종으로 분류되며, 그 산업적 중요성으로 인해 심지어는 코리네박테리움 및 브레비박테리움과 같은 다른 속으로 분류된다. 그러나 이 미생물은 세포벽의 아미노산 조성 및 DNA의 염기 조성의 상등성으로 인해 한 종으로 분류되어야 한다고 지적되었다. 또한, 이 미생물은 미생물의 연관 정도를 나타내주는 DNA-DNA 히브리드화에서 70∼80% 이상의 상등성을 갖는다고 보고되어 있다[Komatsu, Y. : Report of the Fermentative Research Institute, No. 55, 1(1980), 및 Suzuki, K., Kaneko, T., 및 Komagata, K. : Int. J. Syst. Bacteriol., 31, 131(1981)]. 글루탐산-생산 미생물의 연관정도를 고려해볼 때, 본 발명을 모든 글루탐산-생산 코리네형 세균에 적용할 수 있음을 쉽게 추측할 수 있다. 본 발명의 적용 여부는 재조합 DNA가 글루탐산-생산 코리네형 세균에서 자율 복제할 수 있느냐의 여부 및 DS 유전자 및 L-트립토판 생합성에 관한 유전자가 거기에서 형질 발현될 수 있는지의 여부에 따라 좌우되므로, 글루탐산-생산 코리네형 세균간의 DNA 상등성에 있어서 약간의 차이는 무시될 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰 225-250으로부터 분리되고 (일본국 특허 공개 제183799/1982호), 스펙티노마이신 및/또는 스트렙토마이신 내성 유전자를 갖는 플라스미드 pCG4가 복제될 수 있으며 유전자가 코리네박테리움 및 브레비박테리움 속의 균주와 같은 글루탐산-생산 코리네형 세균에서 형질 발연될 수 있다(일본국 특허 공개 제186492/1982호)는 사실로부터 글루탐산-생산 코리네형 세균의 플라스미드의 복제 및 유전자의 형질 발현을 가능케하는 공통 기능을 갖는다는 점이 명백해진다. 그러므로, DS, AS, PRT, PRAI, InGPS 및 TS 유전자를 모두 함유하는 재조합 DNA를 도입함으로써 L-트립토판-생산 미생물을 구축하는 본 발명의 제조방법을 코리네박테리움 글리타미쿰에 뿐만 아니라 코리네박테리움 및 브레비박테리움 속의 세균을 포함하는 모든 글루탐산-생산 코리네형 세균에 적용할 수 있다.
본 발명의 특정구현예는 하기 실시예를 들어 기술한다.
[실시예]
코리네박테리움 글루타미쿰 K 38의 DS 유전자 및 코리네박테리움 글루타미쿰 K 55의 AS, PRT, PRAI, InGPS 및 TS의 합성에 관한 모든 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 보유 균주에 의한 L-트립토판의 제조
(1) 코리네박테리움 글루타미쿰 K 38(FERM BP-454) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 K 55(FERM BP-864)의 염색체 DNA 및 벡터 플라스미드 pCE53 및 pCG116의 제조 : PFP 및 p-아미노페릴알라닌에 내성인 코리네박테리움 글루타미콤 K 38(FERM BP-454), 및 페닐알라닌 및 티로신 요구성이며 5-메틸트립토판, 트립토판 히드록사메이트, 6-플루오로트립토판, 4-메틸트립토판, PFP, p-아미노페닐알라닌, 티로신 히드록시메이트 및 페닐알라닌 히드록시메이트에 내성인 코리네박테리움 글루타미쿰 K 55(FERM BP-864)를 NB 배지(20g/l 부용분말 및 5g/l 효모 추출액; pH 7.2)에 각각 배양한다. 종 배양액(각각 20ml)을, 각각 100㎍/ml의 페닐알라닌 및 티로신을 함유하는 400ml의 반합성배지 SSM[20g/l 글루코스, 10g/l(NH4)2SO4, 3g/l 우레아, 1g/l 효모 추출액, 1g/l KH2PO4, 0.4g/l MgCl2·6H2O, 10mg/l FeSO4·7H2O, 0.2mg/l MnSO4·4-6H2O, O.9mg/l ZnSO4·7H2O, 0.4mg/l CuSO4·5H2O, 0.09mg/l Na2B4O7·10H2O, 0.04mg/l(NH4)6Mo24·4H2O, 30㎍/l 비오틴 및 1mg/l 티아민 염산염; pH 7.2]에 각각 접종시키고, 30℃에서 교반 배양한다. 660nm에서의 광학 밀도(OD)(이하 특별한 언급이 없는한 광학 밀도는 660nm에서 측정한다)를 도오꾜 쿄덴 비색계(Tokyo Koden Colorimeter)를 사용하여 결정하고, OD가 0.2로 될 때 페니실린 G를 0.5 단위/ml의 농도로 가한다. OD가 0.6으로 될 때까지 더 배양한다.
성장세포를 배양액으로부터 수집하고 TES 완충액[0.03M 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄(이하＂트리스＂로 약칭함), 0.005M 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트, (이하 EDTA로 약칭함) 및 0.05M NaCl; pH 8.0]으로 세척한다. 세척된 세포를 10ml의 리소자임 용액(25% 슈크로스, 0.1M NaCl, 0.05M 트리스 및 0.8mg/ml 리소자임; pH 8.0)에 현탁시키고, 37℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 고분자 염색체 DNA를 사이토, 에이치 및 미우라, 케이의 방법[Saito, H. 및 Miura, K. Biochim, Biophys. Acta, 72, 619(1963)]에 따라 수집 세포로부터 분리한다.
벡터로 사용된 pCE53은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 자율 복제할 수 있는 플라스미드 pCG1을 에스케리키아 콜리에서 자율 복제할 수 있는 플라즈미드 pGA22와 연결시킴으로써 구축된 플라스미드이다[G. An, et al. : J. Bacteriol. 140, 400(1979)]. 그것은 pCG1의 Bgl Ⅱ-절단 부위의 DNA를 pGA22의 두 BamHI-절단 부위 중 테트라 시클린 내성 유전자에 있지 않은 하나의 DNA와 동일한 점착 말단을 사용하여 연결시킴으로써 구축할 수 있다. pCE53은 pGA22에서 유래된 카나마이신-내성 유전자 및 제한요소 BamHI에 대한 하나의 절단 부위와 같은 선택 마커를 갖는다.
또한 벡터로 사용되는 pCG116은 M13mp 18 RF DNA로부터 수득된 링커(Takara Shuzo Co., Ltd.)을 코리네박테리움 글루타미쿰에서 자율 복제할 수 있는 pCG11의 Stu I-Pat I-절단 DNA 단편과 블런트 말단 및 점착 말단을 사용하여 연결시킴으로써 구축된 플라스미드이다. 링커는 M13mp18 RF DNA를 EcoR I을 사용하여 절단시키고, 클레노우 단편(Takara Shuzo Co., Ltd.)을 사용하여 점착 말단을 블런트 말단으로 만든 후, DNA를 Pat I을 사용하여 다시 절단함으로써 수득한다. 플라스미드 pCG116은 약 6.5Kb의 분자 크기를 가지고, BglⅡ, PatⅠ, SalⅠ, XbaⅠ, BemHⅠ, SmaⅠ, KpnⅠ 및 SacⅠ에 대해 각각 하나의 절단 부위를 가지며, 스트랩토마이신- 및/또는 스펙티노마이신-내성 표현형을 부여한다(제1도 참조).
pCE53 및 pCG116을 pCE53 또는 pCG116 보유 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 배양세포로부터 하기 방법에 따라 각각 분리한다.
pCE53 또는 pCG116 보유 코리네박테리움 글리타미쿰 ATCC 13032를 400ml의 SSM 배지내 30℃에서 교반 배양하고, 상기와 동일한 방법으로 페니실린 G를 사용하여 처리하고, OD가 약 0.6으로 될 때까지 계속 배양한다. 성장 세포를 수집하고, TES 완충액으로 세척하고, 10ml의 리소자임 용액에 현탁시킨다. 현탁액을 37℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 반응 혼합물에 2.4ml의 5M NaCl, 0.6ml의 0.5M EDTA(pH 8.5) 및 4% 소듐 라우릴술페이트 및 0.7M NaCl을 함유하는 4.4ml의 용액을 순서대로 가하고, 혼합물을 부드럽게 교반하고 15시간 동안 빙냉한다. 수득된 분해물을 원심분리 튜브로 옮기고, 69400×g, 4℃에서 60분동안 원심분리하여 상층액을 회수한다. 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000(Nakarai Chemicals)을 10중량%의 양으로 여기에 가한다. 혼합물을 부드럽게 교반한 후 빙냉한다. 10시간 후 혼합물을 1500×g에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 회수한다. 그런 후, 5ml의 TES 완충액을 가하여 펠렛을 천천히 용해시키고, 2.0ml의 1.5mg/ml 에티디움 브로마이드를 용액에 가한다. 염화세슘을 가하여 용액의 밀도를 1,580으로 조정한다.
수득된 용액을 105000×g, 18℃에서 48시간 동안 초원심분리하고, UV 조사하여 검출된 원심분리 튜브의 아래부분의 고밀도 밴드를 원심분리 튜브 측면을 뚫어 주사기로 수집하여 pCE53 또는 pCG116 플라스미드 DNA를 함유하는 분획을 회수한다. 분획을 포화량의 염화세슘을 함유하는 동일 부피의 이소프로판을 용액[TES 완충액내 90%(V/V)이소프로판올]으로 5회 처리하는 추출에 의해 에티디움 브로마이드를 제거한다. 그런후, 용액을 TES 완충액으로 투석한다.
(2) DS 유전자를 함유하는 DNA 단편의 클로닝 : 3㎍의 상기 수득된 pCG116플라스미드 DNA를 함유하는 60㎕의 반응 용액 Y-100(10mM 트리스, 6mM MgCl2및 100mM NaCl; pH 7.5)에 각각 6단위의 제한 효소 Sal I 및 BglⅡ(Takara Shuzo Co., Ltd.; 특별한 언급이 없는 한 이하 제한 효소는 Takara Shuzo Co., Ltd 사 제품을 사용한다)를 가하고, 혼합물을 37℃에서 60분 동안 반응시킨다. 반응을 페놀처리로 중지시킨다. 별도로 각각 6단위의 제한 효소 Sal I 및 BglⅡ를 상기 수득된 코리네박테리움 글루타미쿰 K38 (FERM BP-454)의 3㎍ 염색체 DNA를 함유하는 140㎕의 반응 용액에 가하고, 혼합물을 37℃에서 60분 동안 반응시킨다. 반응을 페놀처리로 중지시킨다. 이렇게 수득된 두 반응 혼합물을 혼합하고, 혼합물 부피의 2배 에탄올을 가하여 DNA를 침전시킨다. DNA를 회수하고 200㎕의 물에 현탁시킨다.
200㎕의 DNA현탁액에 10배농도의 T4 리가제용 40㎕의 완충액(660mM 트리스, 66mM MgCl2및 100mM 디티오트레이톨; pH 7.6), 40㎕의 5mM ATP, 300단위의 T4 리가제(Takara Shuzo Co., Ltd.) 및 120㎍의 물을 가하고, 혼합물을 12℃에서 16시간 동안 반응시킨다.
반응 혼합물을 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032를 형질 전환시킨다. 이 균주(4ml)의 종배양액을 40ml의 SSM 배지에 접종하고, 30℃에서 교반배양한다. OD가 0.2로 되면 배양액을 상기(1)과 동일한 방법으로 페니실린 G를 사용하여 처리하고, OD가 0.6으로 될 때까지 계속 배양한다. 성장 세포를 수집하고, 1mg/ml의 리소자임을 함유하는 10ml의 RCGP 배지[ 5g/ℓ 글루코스, 5g/ℓ카스아미노산, 2.5g/ℓ 효모 추출액, 3.5g/ℓ K2HPO4, 1.5g/ℓ KH2PO4, 0.41g/ℓ MgCl2·6H2O, 10mg/ℓ FeSO4·7H2, 2mg/ℓ MnSO4·4-6H2O, 0.9mg/ℓ ZnSO4·7H2O, 0.04mg/ℓ (NH4)Mo7O24·4H2O, 30㎍/ℓ 비오틴, 2mg/ℓ티아민 염산염, 135g/ℓ 디소듐 숙시네이트 및 30g/ℓ 폴리비닐피롤리돈(분자량 ; 10.000); pH 7.6]에 약 109세포/ml의 농도로 현탁시킨다. 현탁액을 L-형 시험관으로 옮기고, 30℃에서 16시간 동안 부드럽게 교반하여 원형체를 제조한다.
그런 후, 0.5ml의 원형체 현탁액을 작은 시험관에 넣고 2,500×g에서 5분동안 원심분리하여 원형체를 분리한다. 원형체를 1ml의 TSMC완충액(10mM MgCl2, 30mM CaCl2, 50mM트리스 및 400mM 슈크로스; pH 7.5)에 현탁시키고, 원심분리로 세척한다. 세척된 원형체를 0.1ml의 TSMC완충액에 재현탁시킨다. 그런 후, 100㎕의 1 : 1 2배 농도의 TSMC 완충액 및 상기 수득된 리가제 반응 혼합물의 혼합물을 원형체 현탁액에 가하고, 혼합물을 20% PEG 6000을 함유하는 0.8ml의 TSMC 완충액과 더 혼합한다. 3분 후, 2ml의 RCGP배지(pH 7.2)를 여기에 가하고 혼합물을 2,500×g에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한다. 침전된 원형체를 1ml의 RCGP배지에 현탁시키고, 현탁액(0.2ml)을 400㎍/ml 스펙티노마이신을 함유하는 RCGP 한천 배지(1.4%한천을 함유하는 RCGP배지; pH 7.2)에 펴 바르고 30℃에서 7일동안 배양한다.
RCGP 한천 배지에서 성장한 콜로니를 스크랩핑하고, 생리식염수를 사용하여 원심분리로 2회 세척한다. 세척된 세포를 1ml의 생리식염수에 현탁시킨다. 현탁액을 3mg/ml PFP 및 100㎍/ml 스펙티노마이신을 함유하는 최소한천 배지 Ml[10g/ℓ 글루코스, 1g/ℓ (NH4)H2PO4, 0.2g/ℓ KCl, 0.2g/ℓ MgSO4·7H20, 10mg/ℓ FeSO4·7H2O, 0.2mg/ℓ MnSO4·4-6H2O, 0.9mg/ℓ ZnSO4·7H2O, 0.4mg/ℓ CuSO4·5H2O, 0.09mg/ℓ Na2B4O7·10H2O, 0.04mg/ℓ (NH4)6Mo7O24, 4H2O, 50㎍/ℓ 비오틴, 2.5mg/ℓ p-아미노벤조산, 1mg/ℓ 티아민염산염 및 16g/ℓ 한천; pH 7.2]에 펴 바른다. 30℃에서 5일동안 배양하고, PFP 및 스펙티노마이신에 내성인 형질 전환체를 선택한다.
플라스미드 DNA를 선택된 형질 전환체로부터 상기 (1)에서의 pCG116의 분리와 동일한 방법으로 분리한다.
각종 제한 효소를 사용하는 소화 및 아가로스겔 전기영동에 의한 분석으로 하나의 형질 전환체로부터 분리되고 pCGDSl으로 명명된 플라스미드 DNA가 5.0Kb의 SalⅠ-BglⅡ절단 DNA단편이 pCG116의 SalⅠ-BglⅡ절단 부위에 삽입된 구조를 가짐이 밝혀진다.(제1도 참조).
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 및 pCGDSl 보유형질전환체의 DS 활성은 피. 알. 스프리나바산, 디. 비. 스프린손등의 방법[P. R. Sprinavasan, D. B. Sprinson, etal., J. Biol. Chem., 234, 716 (1959)]에 따라 결정한다. pCGDSI 보유 형질전환체의 DS 활성이 모균주의 것 보다 8~10배 높고, 형질전환체에서 DS는 페닐알라닌 및 티로신에 의해 억제 받지 않음이 증명된다. 이것은 pCGDSl에 도입된 5.0Kb의 DNA단편이 코리네박테리움 글루타미쿰 K38로 부터 유래된 DS유전자를 함유한다는 사실을 나타낸다.
(3) AS, PRT, PRAI, InGPS 및 TS의 합성에 관한 모든 유전 정보를 보유하는 DNA 단편의 클로닝 : 상기 (1)에서 수득된 3㎍의 pCE53플라스미드 DNA를 함유하는 60㎕의 반응용액 Y-100에 6단위의 제한 효소 BamHI를 가하고, 혼합물을 37℃에서 60분 동안 반응시킨다. 반응 혼합물을 65℃에서 10분동안 가열함으로써 반응을 중지시킨다. 별도로 6단위의 제한 효소 BamHI을 상기(1)에서 수득된 코리네박테리움 글루타미쿰 K55(FERM BP-864)의 염색체 DNA 3㎍을 함유하는 140㎕의 반응용액 Y-100에 가하고, 혼합물을 37℃에서 60분동안 반응시킨다. 반응 혼합물을 65℃에서 10분동안 가열함으로써 반응을 중지시킨다.
수득된 두 반응 혼합물을 혼합하고, 10배 농도의 T4 리가제용 40㎕의 완충액, 40㎕의 5mM ATP, 300단위의 T4 리가제 및 120㎕의 물을 혼합물에 가한다. 혼합물 12℃에서 16시간 동안 반응시킨다.
반응 혼합물을 사용하여 트립토판을 요구하며 α- 및 β- 서브유닛을 갖는 TS의 β-서브유닛 유전자가 결핍된 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 TA108[부다페스트 조약하 일본국 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술 연구소(FRI)에 1988년 4월 9일 자로 FERM BP-1846으로 기탁됨]을 형질 전환시킨다.
TA 108 균주의 종 배양액(4ml)을 50㎍/ml트립토판을 함유하는 40ml의 SSM 배지에 접종시키고, 30℃에서 교반 배양한다. OD가 0.2로 되면, 상기(1)과 동일한 방법으로 페니실린 G를 사용하여 처리하고, OD가 0.6으로 될때까지 계속 배양한다. 성장 세포를 수집하고 (2)와 동일한 방법으로 리소자임을 사용하여 처리하고, 수득된 원형체를 상기 제조된 리가제 반응 혼합물을 사용하여 (2)와 동일한 방법으로 형질전환시킨다. 200㎍/ml 카나미아신을 함유하는 RCGP한천 배지에서 성장한 카나마이신-내성 콜로니를 스크립핑하고, 원심분리에 의해 생리식염수를 사용하여 2회 세척한다. 세척된 세포를 1ml의 생리식염수에 현탁시킨다. 현탁액을 10㎍/ml카나마이신을 함유하는 최소한 천 배지 Ml에 펴 바르고 30℃에서 3일동안 배양한 후, 카나마이신에 내성이며 트립토판을 요구하지 않는 형질 전환체를 선택한다. 이 형질전환체로부터 상기(1)에서 pCE53의 분리와 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 분리한다. 각종 제한 효소에 의한 소화 및 아가로스겔전기 영동에 의한 분석으로 하나의 형질 전환체로부터 분리되고 pCtrpl으로 명명된 플라스미드 DNA가 11.0Kb의 BamHI-절단 DNA단편이 pCE53의 BamHI 절단 부위에 삽입된 구조를 가짐이 밝혀진다(제1도 참조).
11.Kb의 BamHI-절단 DNA단편에 함유된 다른 L-트립토판 생합성 유전자는 하기방법으로 동정된다. pCtrpl을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 코리네박테리움 글루타이쿰 TA105(AS 유전자가 결핍된 균주), TA 106 (PRT 유전자가 결핍된 균주) 및 TA 107(TS-α-서브유닛 유전자 결핍된 균주)를 형질 전환 시킨다. 200㎍/ml 카나마이신을 함유하는 RCGP 한천 배지에서 성장한 모든 카나마이신-내성콜로니는 성장에 트립토판을 요구하지 않음이 증명된다. 이것은 pCtrpl에 도입된 상기 11.0Kb DNA 단편에 AS, PRT, TS-α- 및 TS-β유전자가 존재함을 나타낸다.
별도로, pCtrpl를 사용하여 엠. 다게르트 등의 방법[M. Dagert, et al., Gene, 6, 23 (1979)]에 따라 에스케리키아 콜리 ATCC 23719 (K-12, trpC-)을 형질 전환시킨다. 20㎍/ml 카나마이신을 함유하는 LB한천 배지(10g/ℓ 박토-트립톤, 5-g/ℓ 효모 추출액, lg/ℓ 글루코스, 5g/ℓ NaCl 및 16g/ℓ 한천; pH 7.2)에서 성장한 모든 카나마이신-내성 콜로니는 트립토판 요구성이 결핍되어 있다는 사실이 밝혀진다. 이것이 pCtrpl에 삽입된 상기 11.0Kb DNA 단편에 pCtrpl 및 InGPS 유전자가 존재함을 나타낸다.
(4) 트립토판 유사체에 내성인 플라스미드 pCtrp57의 제조 :
pCtrpl 보유 TA 108 균주를 10㎍/ml 카나마이신을 함유하는 NB 배지에서 대수 성장기인 말기단계까지 배양시킨다. 성장 세포를 수집하고 50mM 트리스-말레에이트 완충액(pH 6.0)을 사용하여 원심분리로 1회세척한다. 세척세포를 50mM 트리스-말레에이트 완충액에 용해시킨 400㎍/ml N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 실온에서 20분 동안 처리한다. 처리 세포를 50mM 트리스-말레에이트 완충액을 사용하여 원심분리로 2회 세척하고, 10㎍/ml 카나마이신을 함유하는 NB 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양한다. 플라스미드 DNA를 성장 세포로부터 (1)과 동일한 방법으로 분리한다. TA 108 균주를 (3)과 동일한 방법으로 수득된 플라스미드와 형질전환 시키고, 200㎍/ml 카나마이신을 함유하는 RCGP 한천 배지에서 성장한 카나마이신-내성 콜로니를 스트랩핑하고, 생리 식염수를 사용하여 원심분리로 2회 세척한다. 세척 세포를 3mg/ml 5FT를 함유하는 최소 한천 배지 M1에 펴 바르고, 30℃에서 3일동안 배양한다. 성장 콜로니로부터 3mg/ml 5FT를 함유하는 M1 한천 배지 및 10㎍/ml 카나마이신을 함유하는 NB 한천 배지에서 성장할 수 있는 콜로니를 선택한다. 선택된 하나의 균주로부터 분리된 플라스미드를 pCtrp57로 명명한다.
pCtrpl 또는 pCtrp57 보유 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 및 TA 108균주의 AS 활성은 에이치, 하기노 등의 방법[H. Hagino, et al., Agric. Biol. Chem., 39, 323(1975)]에 따라 결정하고, 그의 PRT 활성은 제이. 이토 및 씨. 야노프스키의 방법[J. Ito 및 C. Yanofsky., J. Biol. Chem., 97, 734(1969)]에 따라 결정된다. pCtrpl 또는 pCtrp57 보유 TA 108 균주의 AS 및 PRT 활성은 ATCC 13032 균주의 것보다 10배 이상 높다. ATCC 39019 균주, pCtrpl 보유 TA 108 균주 및 pCtrp57 보유 TA 108 균주의 50% AS 활성 억제에 대한 트립토판 농도는 각각 0.002mM, 0.008mM 및 4.0mM인 반면에, 이 세균주의 50% PRT 활성 억제에 대한 트립토판 농도는 각각 0.19mM, 0.19mM 및 4.8mM이다. 이것은 pCtpr57에 의해 코딩된 AS 및 PRT가 pCtrpl에 의해 코딩된 AS 및 PRT와 비교하여 각각 약 500 및 약 25배로 트립토판에 대해 덜 민감하다는 사실을 나타낸다.
(5) pCGDS1에서 AS, PRT, PRAI, InGPS 및 TS의 합성에 관한 모든 유전 정보를 함유하는 DNA 단편의 서브콜로닝
5㎍의 pCtrp57 플라스미드 DNA를 함유하는 100㎕의 반응 용액 Y-100에 0.5 단위의 BglⅡ를 가하고, 혼합물을 37℃에서 10분동안 반응시킴으로써 부분 소화시킨다. 이렇게 형성된 7.5Kb의 DNA 단편을 아가로스겔로 부터 분리한다[Modlecular Cloning, 164(1982)]. 별도로, 5단위의 BglⅡ를 3㎍의 pCGDSI 플라스미드 DNA를 함유하는 100㎍의 반응용액 Y-100에 가하고, 혼합물을 37℃에서 60분 동안 반응시킨다. 페놀처리로 반응을 중지시킨다. 수득된 두 반응 혼합물을 혼합하고, 혼합물 부피의 2배 에탄올을 가하여 DNA를 침전시킨다. DNA를 회수하고 200㎕의 물에 현탁시킨다.
200㎕의 DNA 현탁액에 10배 농도의 T4 리가제용 40㎕의 5mM ATP, 300 단위의 T4 리가제 및 120㎕의 물을 가하고, 혼합물을 12℃에서 16시간 동안 반응시킨다.
반응 혼합물을 사용하여 (3)과 동일한 방법으로 TA 108 균주를 형질 전환시킨다.
400㎍/ml 스펙티노마이신을 함유하는 RCGP 한천 배지에서 성장한 스펙티노마이신-내성 콜로니를 스크랩핑하고, 생리 식염수를 사용하여 원심분리로 2회 세척한다. 세척 세포를 1ml의 생리식염수에 현탁시킨다. 세포현탁액을 3mg/ml PFP 및 100㎍/ml 스펙티노마이신을 함유하는 최소한천배지 M1에 펴바르고, 30℃에서 3일동안 배양한다. 성장 콜로니로부터 PFP 및 스펙티노마이신에 내성이고 트립토판을 요구하지 않는 형질 전환체를 선택한다. 이 형질전환체로부터 (1)과 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 분리한다. 각종 제한 효소에 의한 소화 및 아가로스겔 전기영동에 의한 분석으로 하나의 형질 전환체로 부터 분리되고 pCtrp157로 명명된 플라스미드 DNA가 4.5Kb 및 3.0Kb의 두 BglⅡ-절단 DNA 단편이 pCGDS1의 BglⅡ 절단부위에 삽입된 구조를 가짐이 밝혀진다(제1도 참조).
AS, PRT, PRAI, InGPS 및 TS의 합성에 관한 모든 유전정보가 존재량을 확인하기 위해, 플라스미드 pCDtrp157을 상기와 동일한 방법으로 BglⅡ를 사용하여 부분소화시키고, 7.5Kb의 DNA 단편을 아가로스겔로부터 분리한 후, 이전에 BamHI으로 절단된 pCE53과 연결시킨다. 생성물을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 TA 108 균주를 형질전환시키고, 카나마이신에 내성이고 트립토판을 요구하지 않는 형질전환체를 선택한다. 각종 제한효소에 의한 소화 및 아가로스겔 전기영동에 의한 분석으로 하나의 형질전환체로 부터 분리되고 pCtrp577로 명명된 플라스미드 DNA가 4.5Kb 및 3.0Kb의 두 BglⅡ-절단 DNA단면이 pCE53의 BamHI 절단부위에 삽입된 구조를 가짐이 밝혀졌다. 트립토판 생합성에 관한 유전자를 pCtrp577을 사용하여 (3)과 동일한 방법으로 동정함으로써, AS, PRT, PRAI, InGPS 및 TS의 합성에 관한 모든 유전 정보가 pCE53의 BamHI 절단부위에 삽입된 7.5Kb DNA 단편상에 위치함을 확인한다.
(6) pCGDS1, pCtrp57 및 pCtrp157 보유 균주에 의한 L-트립토판의 제조 :
L-트립토판을 생산하지 않고 페닐알라닌 및 티로신을 요구하지 않는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21854 및 3-브로모피루브산에 민감하며 ATCC 21851 균주로부터 유래된 변이체인 코리네박테리움 글루타미쿰 BPS-13(FERM BP-1777)의 종배양액(각각 4ml)을 각각 50㎍/ml의 페닐알라닌 및 티로신을 함유하는 40ml의 SSM 배치에 각각 접종시키고, 30℃에서 교반 배양한다. OD가 0.2로 되면, 페니실린 G를 사용하여 (1)과 동일한 방법으로 처리하고, OD가 0.6으로 될 때까지 계속 배양한다. 성장 세포를 수집하고 (2)와 동일한 방법으로 리소자임을 사용하여 처리하고, 생성된 원형체를 pCGDS1, pCtrp57 또는 pCDtrp157을 사용하여 (2)와 동일한 방법으로 형질 전환시킨다. 수득된 카나마이신-또는 스펙티노마이신-내성 형질전환체로부터 (1)과 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 분리하고, 그 구조를 각종 제한 효소를 사용하여 소화시킴으로써 분석한다. 이 형질전환체가 pCGDS1, pCDtrp57 또는 pCDtrp157을 보유한다는 사실이 확인된다. 이중에서, pCDtrp157 보유 ATCC 21854 균주는 부다페스트 조약하 FRI에 1988년 4월 9일자로 코리네박테리움 글루타미쿰 K-76(FERM BP-1847)로 기탁되었다.
시험관 배양에 의한 L-트립토판 제조시험을 상기 형질전환체 및 하기에 기술된 그의 각 모균주를 사용하여 수행한다.
각 균주를 3ml의 Sl 배지(20g/ℓ 글루코스, 15g/ℓ 폴리펩톤, 15g/ℓ 효모추출액, 2.5g/ℓ NaCl, 1g/ℓ 우라아, 200mg/ℓ L-티로신 및 200mg/ℓ L-페닐알라닌; pH 7.2)내 30℃에서 24시간 동안 교반 배양한다. 수득된 종배양액(0.5ml)을 큰 시험관에 5ml의 제조 배지 P1[60g/ℓ 글루코스, 1g/ℓ KH2PO4, 1g/ℓ K2HPO4, 1g/ℓ MgSO4, 7H2O, 20g/ℓ(NH4)2SO4, 10g/ℓ 옥수수 침지액, 10mg/ℓ MnSO4, 30㎍/ml 비오틴 및 20g/ℓ CaCO3; pH 7.2]에 접종시킨다. 30℃에서 72시간 동안 교반 배양한다. pCGDS1 또는 pCDtrp157 보유 형질전환체의 배양을 위해, 10㎍/ml 스트렙토 마이신을 배지에 가하고, pCGKS1 또는 pCDtrp157 보유 형질전환체의 배양을 위해, 10㎕/ml 카나마이신을 가한다. 배양 후, 배양 여액을 o-프탈알데히드/2-메르캅토 에탄올-포스트컬럼 변형 방법(postcolumn derivatization method)에 의해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시킴으로써, 형성된 L-트립토판의 양을 결정한다. 결과를 표1에 제시한다.
[표 1]
(7) 2ℓ쟈르 발효기를 사용하는 배양시험:
2ℓ쟈르 발효기를 사용하는 배양시험을 하기 방법으로 BPS-13 및 BPS-13pCDtrp157 균주를 사용하여 수행한다.
각 균주를 20ml의 Sl 배지내 30℃에서 24시간 동안 교반 배양한다. 그런 후, 수득된 10ml의 첫 번째 종배양액을 1ℓ 삼각플라스크내 120ml의 S2 배지[50g/ℓ 슈크로스, 2g/ℓ KH2PO4, 0.5g/ℓ MgSO4·7H2O, 5g/ℓ (NH4)2SO4·1g/ℓ 우레아, 10mg/ℓ FeSO4·7H2O, 10mg/ℓ MnSO4·4-6H2O, 4mg/ℓ CuSO4·5H2O, 40g/ℓ 옥수수 침지액, 222mg/ℓ L-티로신, 362mg/ℓ L-페닐 알라닌, 50㎍/ℓ 비오틴, 100㎍/ℓ 티아민 염산염 및 20g/ℓ CaCO3: pH 7.2]에 접종시킨다. 30℃에서 24시간 동안 교반 배양한다. 그런 후, 수득된 120ml의 두 번째 종 배양액을 2ℓ쟈르 발효기내 550ml의 제조 배지 J1[63g/ℓ 슈크로스, 2g/ℓ KH2PO4·1.2g/ℓ K2HPO4, 1.7g/ℓ MgSO4·7H2O, 17g/ℓ (NH4)2SO4, 13mg/ℓ FeSO4·7H2O, 13mg/ℓ MnSO4·4-6H2O, 6mg/ℓ CuSO4·5H2O, 66g/ℓ 옥수수 침지액, 310mg/ℓ L-티로신, 650mg/ℓ L-페닐 알라닌, 230㎍/ℓ 비오틴 및 450㎍/ℓ 티아민 염산염; pH 6.8]에 접종 시킨다. 암모니아수를 가하여 pH를 6.1로 유지하면서 30℃에서 통기(1vvm) 교반(800rpm)배양한다. 10㎍/ml 스트랩토마이신을 배지에 가하여 BPS-13/pCtrp157 균주를 배양시킨다. 배양과정 동안에 종 배치(205ml)[374g/ℓ 슈크로스, 0.7g/ℓ KH2PO4, 0.5g/ℓ K2HPO4및 600mg/ℓ L-티로신]를 2회 가하고, 당이 완전히 소모될 때까지 계속 배양한다. 배양후, 배양액을 물을 사용하여 1: 100으로 희석하고 60℃에서 5분 동안 가열하고, 배양 여액을 O-프탈알데히드/2-메트캅토에탄올-포스트컬럼 변형 방법에 의해 HPLC 시킴으로써, 형성된 L-트립토판의 양을 결정한다. 결과를 표 2에 제시한다.
[표 2]
Claims (4)
- 벡터 DNA 및 3-데옥시-D-아라비노-헵투로소네이트-7-포스페이트 신타제, 안트라닐레이트 신타제, 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제, N-5'-포스포리보실 안트라닐레이트 이소메라제, 인돌-3-글리세롤 포스페이트 신타제 및 트립토판 신타제의 합성에 관한 모든 유전 정보를 가진 DNA 단편으로 이루어진 재조합 DNA를 보유하고 코리네박테리움(Cornebacterium)속에 속하는 미생물을 배양배지에서 배양하여 L-트립토판을 배양액에 축적시키고; 여기에서 L-트립토판을 회수함을 특징으로 하는 L-트립토판의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, DNA 단편이 코리네박테리움 속에 속하는 미생물로부터 유래된 제조방법.
- 벡터 DNA 및 코리네박테리움 속에 속하는 미생물로부터 유래되고 3-데옥시-D-아라비노-헵투로소네이트-7-포스페이트 신타제, 안트라닐레이트 신타제, 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제, N-5'-포스포리보실 안트라닐레이트 이소메타제, 인돌-3-글리세롤 포스페이트 신타제 및 트립토판 신타제의 합성에 관한 모든 유전 정보를 가진 DNA 단편으로 이루어진 재조합 DNA.
- 벡터 DNA 및 3-데옥시-3-D-아라비노-헵투로소네이트-7-포스페이트 신타제, 안트라닐레이트 신타제 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제, N-5'-포스포리보실 안트라닐레이트 이소메라제, 인돌-3-글리세롤 포스페이트 신타제, 및 트립토판 신타제의 합성에 관한 모든 유전 정보를 보유하는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물로부터 유래된 DNA 단편으로 이루어진 재조합 DNA를 보유하는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물.
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