JP3369231B2 - 芳香族アミノ酸の製造法 - Google Patents
芳香族アミノ酸の製造法Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、発酵法によるL-トリプ
トファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンな
どの芳香族アミノ酸の製造法に関する。 L-トリプトフ
ァンは、医薬、食品あるいは飼料工業等において、Ｌ−
チロシンはとくに医薬において、Ｌ−フェニルアラニン
は医薬、食品工業においてそれぞれ利用される重要なア
ミノ酸である。
トファン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンな
どの芳香族アミノ酸の製造法に関する。 L-トリプトフ
ァンは、医薬、食品あるいは飼料工業等において、Ｌ−
チロシンはとくに医薬において、Ｌ−フェニルアラニン
は医薬、食品工業においてそれぞれ利用される重要なア
ミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】コリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属する微生物を用いた発酵法による芳香族
アミノ酸の製造法としては、アミノ酸要求性を付与した
変異株、芳香族アミノ酸のアナログに対する耐性を付与
した変異株、あるいはそれらの変異形質を併有する菌株
を用いる方法がよく知られている〔農芸化学会誌、５
０、（１）p.R.７９（１９７６）〕。
テリウム属に属する微生物を用いた発酵法による芳香族
アミノ酸の製造法としては、アミノ酸要求性を付与した
変異株、芳香族アミノ酸のアナログに対する耐性を付与
した変異株、あるいはそれらの変異形質を併有する菌株
を用いる方法がよく知られている〔農芸化学会誌、５
０、（１）p.R.７９（１９７６）〕。
【０００３】さらに、近年、アミノ酸生産性微生物にお
ける宿主ベクター系が確立され、組換え体プラスミドを
導入することによって、芳香族アミノ酸の生合成経路上
の律速ステップとなっている酵素の遺伝子を増幅した菌
株を用いる方法も開発されている（特開昭５９−１５６
２９２、特開昭６０−３４１９７、特開昭６０−２４１
９２、特開平１−２６５８９２）。
ける宿主ベクター系が確立され、組換え体プラスミドを
導入することによって、芳香族アミノ酸の生合成経路上
の律速ステップとなっている酵素の遺伝子を増幅した菌
株を用いる方法も開発されている（特開昭５９−１５６
２９２、特開昭６０−３４１９７、特開昭６０−２４１
９２、特開平１−２６５８９２）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】飼料添加物などとして
有用なL-トリプトファン、医薬品として有用なＬ−チロ
シン、または医薬、食品工業において有用なＬ−フェニ
ルアラニンを、工業的により安価に製造する方法の開発
が求められている。
有用なL-トリプトファン、医薬品として有用なＬ−チロ
シン、または医薬、食品工業において有用なＬ−フェニ
ルアラニンを、工業的により安価に製造する方法の開発
が求められている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】トランスケトラーゼは、
ペントースリン酸回路において下記の２つの反応を触媒
することから、芳香族アミノ酸生合成の一方の初発基質
であるエリスロース−４−リン酸の合成または分解に重
要な役割を担っていると考えられる。 (i) フルクトース−６−リン酸＋グリセルアルデヒド
−３−リン酸→／←エリスロース−４−リン酸＋キシル
ロース−５−リン酸 (ii) リボース−５−リン酸＋キシルロース−５−リン
酸→／←グリセルアルデヒド−３−リン酸＋セドヘプツ
ロース−７−リン酸 本発明者らは、このトランスケトラーゼの効果を検討し
たところ、微生物のトランスケトラーゼの合成に関与す
る遺伝子（以下、トランスケトラーゼ遺伝子と称すこと
もある）を含む組換え体ＤＮＡをL-トリプトファン、Ｌ
−チロシンまたはＬ−フェニルアラニン生産菌に導入す
ることにより、より高収率でこれらアミノ酸を製造でき
ることを見いだし、本発明を完成するに至った。従来、
トランスケトラーゼに着目して芳香族アミノ酸生産菌を
改良した例は知られておらず、トランスケトラーゼ遺伝
子の増幅により芳香族アミノ酸の生産性が向上すること
は、本発明者らにより初めて見いだされたものである。
ペントースリン酸回路において下記の２つの反応を触媒
することから、芳香族アミノ酸生合成の一方の初発基質
であるエリスロース−４−リン酸の合成または分解に重
要な役割を担っていると考えられる。 (i) フルクトース−６−リン酸＋グリセルアルデヒド
−３−リン酸→／←エリスロース−４−リン酸＋キシル
ロース−５−リン酸 (ii) リボース−５−リン酸＋キシルロース−５−リン
酸→／←グリセルアルデヒド−３−リン酸＋セドヘプツ
ロース−７−リン酸 本発明者らは、このトランスケトラーゼの効果を検討し
たところ、微生物のトランスケトラーゼの合成に関与す
る遺伝子（以下、トランスケトラーゼ遺伝子と称すこと
もある）を含む組換え体ＤＮＡをL-トリプトファン、Ｌ
−チロシンまたはＬ−フェニルアラニン生産菌に導入す
ることにより、より高収率でこれらアミノ酸を製造でき
ることを見いだし、本発明を完成するに至った。従来、
トランスケトラーゼに着目して芳香族アミノ酸生産菌を
改良した例は知られておらず、トランスケトラーゼ遺伝
子の増幅により芳香族アミノ酸の生産性が向上すること
は、本発明者らにより初めて見いだされたものである。
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
よれば、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属し、トランスケトラーゼの活性が親株に比べて
高まっており、かつ芳香族アミノ酸生産能を有する微生
物を培地に培養し、培養物中に芳香族アミノ酸を生成蓄
積させ、該培養物から芳香族アミノ酸を採取することを
特徴とする芳香族アミノ酸の製造法を提供することがで
きる。
よれば、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属し、トランスケトラーゼの活性が親株に比べて
高まっており、かつ芳香族アミノ酸生産能を有する微生
物を培地に培養し、培養物中に芳香族アミノ酸を生成蓄
積させ、該培養物から芳香族アミノ酸を採取することを
特徴とする芳香族アミノ酸の製造法を提供することがで
きる。
【０００７】本発明におけるトランスケトラーゼの活性
が親株に比べて高まっているコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属する微生物は、組換えＤＮ
Ａ技術を用いてトランスケトラーゼの合成に関与する遺
伝子をクローニングし、それを含む組換え体プラスミド
を宿主微生物に導入することによって得られる。宿主微
生物として用いるコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物としては、コリネ型グルタ
ミン酸生産菌として知られている微生物は全て用いるこ
とができるが、好適には下記の菌株が用いられる。 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６
８ コリネバクテリウム リリウム ＡＴＣＣ１５９９０ コリネバクテリウム メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６
５ ブレビバクテリウム ディバリカツム ＡＴＣＣ１４０
２０ ブレビバクテリウム フラブム ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム イマリオフィラム ＡＴＣＣ１４
０６８ ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ
１３８６９ ブレビバクテリウム チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２
４０ これらの細菌から変異誘導された芳香族アミノ酸生産性
菌株はさらに好ましい宿主として用いることができる。
これら生産性変異株は、公知の栄養要求性変異あるいは
芳香族アミノ酸アナログ耐性変異、さらにはそれらの変
異を併せ持つ菌株を誘導することによって得られる。ま
た、組換えＤＮＡ技術を用いて芳香族アミノ酸の生合成
に係わる酵素の遺伝子をクローニングし、それを含む組
換え体プラスミドを導入することによっても得ることが
できる。
が親株に比べて高まっているコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属に属する微生物は、組換えＤＮ
Ａ技術を用いてトランスケトラーゼの合成に関与する遺
伝子をクローニングし、それを含む組換え体プラスミド
を宿主微生物に導入することによって得られる。宿主微
生物として用いるコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物としては、コリネ型グルタ
ミン酸生産菌として知られている微生物は全て用いるこ
とができるが、好適には下記の菌株が用いられる。 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６
８ コリネバクテリウム リリウム ＡＴＣＣ１５９９０ コリネバクテリウム メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６
５ ブレビバクテリウム ディバリカツム ＡＴＣＣ１４０
２０ ブレビバクテリウム フラブム ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム イマリオフィラム ＡＴＣＣ１４
０６８ ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ
１３８６９ ブレビバクテリウム チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２
４０ これらの細菌から変異誘導された芳香族アミノ酸生産性
菌株はさらに好ましい宿主として用いることができる。
これら生産性変異株は、公知の栄養要求性変異あるいは
芳香族アミノ酸アナログ耐性変異、さらにはそれらの変
異を併せ持つ菌株を誘導することによって得られる。ま
た、組換えＤＮＡ技術を用いて芳香族アミノ酸の生合成
に係わる酵素の遺伝子をクローニングし、それを含む組
換え体プラスミドを導入することによっても得ることが
できる。
【０００８】得られるトランスケトラーゼ遺伝子を含む
組換え体プラスミドを、宿主として用いるコリネバクテ
リム属またはブレビバクテリウム属菌株の染色体に組込
ませることによっても本発明の微生物を得ることができ
る。さらに、クローン化したトランスケトラーゼ遺伝子
の発現に関与する領域を試験管内で操作して、この改変
遺伝子を宿主染色体のトランスケトラーゼ遺伝子と置換
してもよい。
組換え体プラスミドを、宿主として用いるコリネバクテ
リム属またはブレビバクテリウム属菌株の染色体に組込
ませることによっても本発明の微生物を得ることができ
る。さらに、クローン化したトランスケトラーゼ遺伝子
の発現に関与する領域を試験管内で操作して、この改変
遺伝子を宿主染色体のトランスケトラーゼ遺伝子と置換
してもよい。
【０００９】本発明におけるトランスケトラーゼの合成
に関与する遺伝子の供与源となる微生物としては、トラ
ンスケトラーゼ活性を有する微生物ならばいかなる微生
物でもよい。原核生物である細菌、たとえばエシェリシ
ア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属ま
たはバチルス属に属する菌株の遺伝子が望ましい。具体
的な例としてはコリネバクテリウム グルタミクムＡＴ
ＣＣ３１８３３があげられる。
に関与する遺伝子の供与源となる微生物としては、トラ
ンスケトラーゼ活性を有する微生物ならばいかなる微生
物でもよい。原核生物である細菌、たとえばエシェリシ
ア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属ま
たはバチルス属に属する菌株の遺伝子が望ましい。具体
的な例としてはコリネバクテリウム グルタミクムＡＴ
ＣＣ３１８３３があげられる。
【００１０】該ＤＮＡを組み込むためのベクターとして
は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
菌種中で自律複製できるものであれば特に限定されない
が、例えば、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００）、
ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７）、ｐＣＧ４、ｐＣ
Ｇ１１（いずれも特開昭５７−１８３７９９）、ｐＣＧ
１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５
８−１０５９９９）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ
５３〔いずれもモレキュラー アンド ジェネラル ジ
ェネティクス（Ｍｏｌ. Ｇｅｎ. Ｇｅｎｅｔ.） １９
６、１７５（１９８４）に記載〕などのプラスミドを使
用することができる。
は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
菌種中で自律複製できるものであれば特に限定されない
が、例えば、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００）、
ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７）、ｐＣＧ４、ｐＣ
Ｇ１１（いずれも特開昭５７−１８３７９９）、ｐＣＧ
１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５
８−１０５９９９）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ
５３〔いずれもモレキュラー アンド ジェネラル ジ
ェネティクス（Ｍｏｌ. Ｇｅｎ. Ｇｅｎｅｔ.） １９
６、１７５（１９８４）に記載〕などのプラスミドを使
用することができる。
【００１１】トランスケトラーゼをコードする遺伝子を
含む供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡ
は、試験管内で両ＤＮＡを制限酵素で切断した後、ＤＮ
Ａリガーゼで処理するか、またはその切断末端をターミ
ナルトランスフェラーゼやＤＮＡポリメラーゼなどで処
理した後、ＤＮＡリガーゼを作用させて結合する常法
〔メソッズ イン エンザイモロジィ（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６８、（１９７
９）〕により種々の組換え体混成物とともに生成させる
ことができる。この混成物を用いて、シキミ酸要求性変
異株として取得されるコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属のトランスケトラーゼ遺伝子欠損変異
株を形質転換し、シキミ酸要求性が非要求性に回復した
形質転換株を選択後、この形質転換株の有するプラスミ
ドを単離することによって、トランスケトラーゼをコー
ドする遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを取得できる。
含む供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡ
は、試験管内で両ＤＮＡを制限酵素で切断した後、ＤＮ
Ａリガーゼで処理するか、またはその切断末端をターミ
ナルトランスフェラーゼやＤＮＡポリメラーゼなどで処
理した後、ＤＮＡリガーゼを作用させて結合する常法
〔メソッズ イン エンザイモロジィ（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６８、（１９７
９）〕により種々の組換え体混成物とともに生成させる
ことができる。この混成物を用いて、シキミ酸要求性変
異株として取得されるコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属のトランスケトラーゼ遺伝子欠損変異
株を形質転換し、シキミ酸要求性が非要求性に回復した
形質転換株を選択後、この形質転換株の有するプラスミ
ドを単離することによって、トランスケトラーゼをコー
ドする遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを取得できる。
【００１２】得られた組換え体ＤＮＡを用いるコリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属微生物の形質
転換法としては、プロトプラスト化した宿主微生物を用
いる方法（特開昭５７−１８６４９２および特開昭５７
−１８６４９）により実施することができる。トランス
ケトラーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミドを宿主微生
物の染色体に組み込ませる方法としては、該組換え体プ
ラスミドからコリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌種中で自律複製する機能に関する領域（レプ
リコン）を削除したプラスミドを作製後、これを用いて
宿主微生物を形質転換する方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、
１０７、６１（１９９１）〕や、トランスケトラーゼ遺
伝子をコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属菌種中で自律複製できないベクターに挿入した組換え
体プラスミドを作製して、これを接合伝達により他菌
種、たとえばエシェリシア コリから宿主として用いる
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属微生
物に導入する方法〔バイオテクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ）、９、８４（１９９１）〕により実
施することができる。後者の方法によれば、発現に関与
する領域を操作して発現量を高めたトランスケトラーゼ
遺伝子を宿主染色体のトランスケトラーゼ遺伝子と置換
することもできる。
クテリウム属またはブレビバクテリウム属微生物の形質
転換法としては、プロトプラスト化した宿主微生物を用
いる方法（特開昭５７−１８６４９２および特開昭５７
−１８６４９）により実施することができる。トランス
ケトラーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミドを宿主微生
物の染色体に組み込ませる方法としては、該組換え体プ
ラスミドからコリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌種中で自律複製する機能に関する領域（レプ
リコン）を削除したプラスミドを作製後、これを用いて
宿主微生物を形質転換する方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、
１０７、６１（１９９１）〕や、トランスケトラーゼ遺
伝子をコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属菌種中で自律複製できないベクターに挿入した組換え
体プラスミドを作製して、これを接合伝達により他菌
種、たとえばエシェリシア コリから宿主として用いる
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属微生
物に導入する方法〔バイオテクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ）、９、８４（１９９１）〕により実
施することができる。後者の方法によれば、発現に関与
する領域を操作して発現量を高めたトランスケトラーゼ
遺伝子を宿主染色体のトランスケトラーゼ遺伝子と置換
することもできる。
【００１３】以上のようにして得られた、トランスケト
ラーゼの活性が親株に比べて高まっているコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物の
微生物による芳香族アミノ酸の生産は、通常の発酵法に
よるアミノ酸の製造に用いられる培養方法により行うこ
とができる。すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素
源、無機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する合成ま
たは天然培地中、好気的条件下、温度、ｐＨなどを調節
しつつ培養をし、培養物中に芳香族アミノ酸を生成蓄積
させ、これを採取する。炭素源としては、グルコース、
フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、
グリセロール、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水
化物、ポリアルコール類、ピルビン酸、フマール酸、乳
酸、酢酸などの各種有機酸が使用できる。さらに微生物
の資化性によって、炭化水素、アルコール類なども用い
られる。とくに廃糖蜜は好適に用いられる。
ラーゼの活性が親株に比べて高まっているコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物の
微生物による芳香族アミノ酸の生産は、通常の発酵法に
よるアミノ酸の製造に用いられる培養方法により行うこ
とができる。すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素
源、無機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する合成ま
たは天然培地中、好気的条件下、温度、ｐＨなどを調節
しつつ培養をし、培養物中に芳香族アミノ酸を生成蓄積
させ、これを採取する。炭素源としては、グルコース、
フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、
グリセロール、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水
化物、ポリアルコール類、ピルビン酸、フマール酸、乳
酸、酢酸などの各種有機酸が使用できる。さらに微生物
の資化性によって、炭化水素、アルコール類なども用い
られる。とくに廃糖蜜は好適に用いられる。
【００１４】窒素源としてはアンモニアまたは塩化アン
モニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩
類あるいは尿素および他の窒素含有物質ならびにペプト
ン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス、コーン ス
チープ リカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミー
ルまたはその消化物などの窒素含有有機物など種々のも
のが使用可能である。
モニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩
類あるいは尿素および他の窒素含有物質ならびにペプト
ン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス、コーン ス
チープ リカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミー
ルまたはその消化物などの窒素含有有機物など種々のも
のが使用可能である。
【００１５】さらに無機物としては、リン酸第一水素カ
リウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムな
どを使用する。ビタミン、アミノ酸は、使用する培地の
炭素源、窒素源などによって異なるが、必要に応じ、ビ
オチン、サイアミン、グルタミン酸などを添加する。ま
た、使用する菌株が、要求性を示す場合は、その要求物
質を添加する。
リウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムな
どを使用する。ビタミン、アミノ酸は、使用する培地の
炭素源、窒素源などによって異なるが、必要に応じ、ビ
オチン、サイアミン、グルタミン酸などを添加する。ま
た、使用する菌株が、要求性を示す場合は、その要求物
質を添加する。
【００１６】培養は、振とう培養または通気攪はん培養
などの好気的条件下に行う。培養温度は一般に２０〜４
０℃が好適である。培地のｐＨは中性付近に維持するこ
とが望ましい。培養期間は通常１〜５日間で培地中に芳
香族アミノ酸が蓄積する。培養終了後、菌体を除去して
活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法で培
養液から芳香族アミノ酸を回収する。
などの好気的条件下に行う。培養温度は一般に２０〜４
０℃が好適である。培地のｐＨは中性付近に維持するこ
とが望ましい。培養期間は通常１〜５日間で培地中に芳
香族アミノ酸が蓄積する。培養終了後、菌体を除去して
活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法で培
養液から芳香族アミノ酸を回収する。
【００１７】このようにして、トランスケトラーゼの活
性が親株に比べて高まっているコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属菌株を用いることにより、高
い収率で芳香族アミノ酸を生産することができる。本明
細書では、コリネバクテリウム グルタミクムに、トラ
ンスケトラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入し、
芳香族アミノ酸の生産性の向上について例示したが、代
わりに他のコリネ型グルタミン酸生産菌を用いても目的
は達成される。
性が親株に比べて高まっているコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属菌株を用いることにより、高
い収率で芳香族アミノ酸を生産することができる。本明
細書では、コリネバクテリウム グルタミクムに、トラ
ンスケトラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入し、
芳香族アミノ酸の生産性の向上について例示したが、代
わりに他のコリネ型グルタミン酸生産菌を用いても目的
は達成される。
【００１８】以下に、本発明の実施例を示す。
【００１９】
実施例
コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
のトランスケトラーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミド
を保有する菌株によるL-トリプトファン、L-チロシンお
よびL-フェニルアラニンの生産
のトランスケトラーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミド
を保有する菌株によるL-トリプトファン、L-チロシンお
よびL-フェニルアラニンの生産
【００２０】（１）コリネバクテリウム グルタミクム
ＡＴＣＣ３１８３３の染色体ＤＮＡおよびベクターｐＣ
Ｇ１１６の調製 ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水１
リットルに含み、ｐＨ7.2 に調整した培地）で増殖した
コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
の種培養２０ｍｌを半合成培地ＳＳＭ〔グルコース２０
ｇ、（ＮＨ4 ） 2ＳＯ4 １０ｇ、尿素３ｇ、酵母エキ
ス１ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０.
４ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４
〜６Ｈ2Ｏ０.２ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.９ｍ
ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０.４ｍｇ、Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１
０Ｈ2Ｏ ０.０９ｍｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ
０.０４ｍｇ、ビオチン３０μｇおよびサイアミン塩酸
塩１ｍｇを水１リットルに含み、ｐＨ７.２に調整した
培地〕４００ｍｌに接種して３０℃で振とう培養した。
東京光電比色計で６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を
測定（以下特記しない限り吸光度は６６０ｎｍで測定）
し、ＯＤが０.２になった時点で培養液へ０.５単位／ｍ
ｌの濃度になるようにペニシリンＧを添加した。さら
に、培養を継続し、ＯＤが０.６になるまで生育させ
た。
ＡＴＣＣ３１８３３の染色体ＤＮＡおよびベクターｐＣ
Ｇ１１６の調製 ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水１
リットルに含み、ｐＨ7.2 に調整した培地）で増殖した
コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
の種培養２０ｍｌを半合成培地ＳＳＭ〔グルコース２０
ｇ、（ＮＨ4 ） 2ＳＯ4 １０ｇ、尿素３ｇ、酵母エキ
ス１ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０.
４ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４
〜６Ｈ2Ｏ０.２ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.９ｍ
ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０.４ｍｇ、Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１
０Ｈ2Ｏ ０.０９ｍｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ
０.０４ｍｇ、ビオチン３０μｇおよびサイアミン塩酸
塩１ｍｇを水１リットルに含み、ｐＨ７.２に調整した
培地〕４００ｍｌに接種して３０℃で振とう培養した。
東京光電比色計で６６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を
測定（以下特記しない限り吸光度は６６０ｎｍで測定）
し、ＯＤが０.２になった時点で培養液へ０.５単位／ｍ
ｌの濃度になるようにペニシリンＧを添加した。さら
に、培養を継続し、ＯＤが０.６になるまで生育させ
た。
【００２１】培養液から菌体を集菌し、ＴＥＳ緩衝液
[０.０３Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（以下トリスと略す）、０.００５Ｍエチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム（以下、ＥＤＴＡと略す）、０.０
５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８.０]で洗浄後、リゾチーム溶液
（２５％ショ糖、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０５Ｍトリ
ス、０.８ｍｇ／ｍｌリゾチーム、ｐＨ８.０）１０ｍｌ
に懸濁し、３７℃で２時間反応を行った。集菌した菌体
から斎藤−三浦の方法〔Ｓａｉｔｏ,Ｈ. ａｎｄ Ｍｉ
ｕｒａ,Ｋ.：バイオキミカ エ バイオフィジカ アク
タ（Ｂｉｏｃｈｉ.Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ａｃｔａ）、７
２、６１９（１９６３）〕に従って染色体ＤＮＡを単離
した。
[０.０３Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（以下トリスと略す）、０.００５Ｍエチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム（以下、ＥＤＴＡと略す）、０.０
５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８.０]で洗浄後、リゾチーム溶液
（２５％ショ糖、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０５Ｍトリ
ス、０.８ｍｇ／ｍｌリゾチーム、ｐＨ８.０）１０ｍｌ
に懸濁し、３７℃で２時間反応を行った。集菌した菌体
から斎藤−三浦の方法〔Ｓａｉｔｏ,Ｈ. ａｎｄ Ｍｉ
ｕｒａ,Ｋ.：バイオキミカ エ バイオフィジカ アク
タ（Ｂｉｏｃｈｉ.Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ａｃｔａ）、７
２、６１９（１９６３）〕に従って染色体ＤＮＡを単離
した。
【００２２】ベクターとして用いるｐＣＧ１１６は、コ
リネバクテリウム グルタミクムのプラスミドｐＣＧ１
１（特開昭５７−１８３７９９）上のＳｔｕＩおよびＰ
ｓｔＩで切断して得られる断片の両端部位に、Ｍ１３ｍ
ｐ１８ＲＦ ＤＮＡ（宝酒造社製）をＥｃｏＲＩで切断
後、クレノーフラグメント（Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡポリ
メラーゼＩ）（宝酒造社製）で平滑末端に修復し、さら
にＰｓｔＩで切断して得たリンカーを結合させたプラス
ミドである。ｐＣＧ１１６は分子長約６.５ｋｂのプラ
スミドで、単一の制限酵素切断部位としてＢｇｌＩＩ、
ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓｍａ
Ｉ、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩを有し、スペクチノマイシ
ンおよび／またはストレプトマイシン耐性の表現型を与
える（第１図参照）。
リネバクテリウム グルタミクムのプラスミドｐＣＧ１
１（特開昭５７−１８３７９９）上のＳｔｕＩおよびＰ
ｓｔＩで切断して得られる断片の両端部位に、Ｍ１３ｍ
ｐ１８ＲＦ ＤＮＡ（宝酒造社製）をＥｃｏＲＩで切断
後、クレノーフラグメント（Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡポリ
メラーゼＩ）（宝酒造社製）で平滑末端に修復し、さら
にＰｓｔＩで切断して得たリンカーを結合させたプラス
ミドである。ｐＣＧ１１６は分子長約６.５ｋｂのプラ
スミドで、単一の制限酵素切断部位としてＢｇｌＩＩ、
ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓｍａ
Ｉ、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩを有し、スペクチノマイシ
ンおよび／またはストレプトマイシン耐性の表現型を与
える（第１図参照）。
【００２３】ｐＣＧ１１６はこれを保有させたコリネバ
クテリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３の培養菌
体から次の方法で単離した。ｐＣＧ１１６を保有させた
コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
を、４００ｍｌＳＳＭ培地で、３０℃にて振とう培養
し、上記と同様にしてペニシリンＧ処理後、リゾチーム
溶液１０ｍｌに懸濁し、３７℃で２時間反応させた。反
応液に５Ｍ ＮａＣｌ ２.４ｍｌ、０.５Ｍ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８.５）０.６ｍｌ、４％ラウリル硫酸ナトリウム
と０.７Ｍ ＮａＣｌからなる溶液４.４ｍｌを順次添加
し、緩やかに混和してから氷水上に１５時間置いた。溶
菌物を遠心管に移し、４℃で６０分間６９,４００×ｇ
の遠心分離にかけ上澄み液を回収した。これに重量百分
率１０％相当のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６、
０００（半井化学薬品社製）を加え、静かに混和して溶
解後、氷水上に置いた。１０時間後、１,５００×ｇで
１０分間遠心分離してペレットを回収した。ＴＥＳ緩衝
液５ｍｌを加えてペレットを静かに再溶解してから１.
５ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイド２ｍｌを添加し、こ
れに塩化セシウムを加えて静かに溶解し、密度を１.５
８０に合わせた。この溶液を１０５,０００×ｇ、１８
℃で４８時間超遠心分離にかけ、紫外線照射下に検知さ
れる遠心チューブ下方の密度の高い位置のバンドを遠心
チューブの側面から注射器で抜き取ることによって、ｐ
ＣＧ１１６プラスミドＤＮＡを分離した。この分画液を
等容量のイソプロピルアルコール液[容量百分率９０％
イソプロピルアルコール、１０％ＴＥＳ緩衝液（この混
液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む）]で５回処理
してエチジウムブロマイドを抽出除去し、しかる後にＴ
ＥＳ緩衝液に対して透析した。
クテリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３の培養菌
体から次の方法で単離した。ｐＣＧ１１６を保有させた
コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
を、４００ｍｌＳＳＭ培地で、３０℃にて振とう培養
し、上記と同様にしてペニシリンＧ処理後、リゾチーム
溶液１０ｍｌに懸濁し、３７℃で２時間反応させた。反
応液に５Ｍ ＮａＣｌ ２.４ｍｌ、０.５Ｍ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８.５）０.６ｍｌ、４％ラウリル硫酸ナトリウム
と０.７Ｍ ＮａＣｌからなる溶液４.４ｍｌを順次添加
し、緩やかに混和してから氷水上に１５時間置いた。溶
菌物を遠心管に移し、４℃で６０分間６９,４００×ｇ
の遠心分離にかけ上澄み液を回収した。これに重量百分
率１０％相当のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６、
０００（半井化学薬品社製）を加え、静かに混和して溶
解後、氷水上に置いた。１０時間後、１,５００×ｇで
１０分間遠心分離してペレットを回収した。ＴＥＳ緩衝
液５ｍｌを加えてペレットを静かに再溶解してから１.
５ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイド２ｍｌを添加し、こ
れに塩化セシウムを加えて静かに溶解し、密度を１.５
８０に合わせた。この溶液を１０５,０００×ｇ、１８
℃で４８時間超遠心分離にかけ、紫外線照射下に検知さ
れる遠心チューブ下方の密度の高い位置のバンドを遠心
チューブの側面から注射器で抜き取ることによって、ｐ
ＣＧ１１６プラスミドＤＮＡを分離した。この分画液を
等容量のイソプロピルアルコール液[容量百分率９０％
イソプロピルアルコール、１０％ＴＥＳ緩衝液（この混
液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む）]で５回処理
してエチジウムブロマイドを抽出除去し、しかる後にＴ
ＥＳ緩衝液に対して透析した。
【００２４】（２）トランスケトラーゼ遺伝子欠損変異
株の分離 コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
をＮＢ培地３ｍｌ中で３０℃にて、ＯＤが約０.６にな
るまで生育させた。集菌後、５０ｍＭトリスマレイン酸
緩衝液（ｐＨ６.０）で一回洗浄し、Ｎ-メチル-Ｎ’-ニ
トロ-Ｎ-ニトロソグアニジン４００μｇ／ｍｌを含む同
緩衝液３ｍｌ中で、室温にて２０分間処理した。処理菌
体を同緩衝液で２回遠心洗浄後、ＮＢ培地３ｍｌ中で、
３０℃にて１時間培養した。この培養液を生理食塩水で
１０-5 -１０-6に希釈後、その０.１ｍｌをＮＢ寒天培
地（ＮＢ培地に１.４％寒天を含む培地、ｐＨ７.２）に
塗布し、３０℃にて２日間培養した。
株の分離 コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
をＮＢ培地３ｍｌ中で３０℃にて、ＯＤが約０.６にな
るまで生育させた。集菌後、５０ｍＭトリスマレイン酸
緩衝液（ｐＨ６.０）で一回洗浄し、Ｎ-メチル-Ｎ’-ニ
トロ-Ｎ-ニトロソグアニジン４００μｇ／ｍｌを含む同
緩衝液３ｍｌ中で、室温にて２０分間処理した。処理菌
体を同緩衝液で２回遠心洗浄後、ＮＢ培地３ｍｌ中で、
３０℃にて１時間培養した。この培養液を生理食塩水で
１０-5 -１０-6に希釈後、その０.１ｍｌをＮＢ寒天培
地（ＮＢ培地に１.４％寒天を含む培地、ｐＨ７.２）に
塗布し、３０℃にて２日間培養した。
【００２５】生育コロニーを、最少寒天培地Ｍ１〔グル
コース１０ｇ、（ＮＨ4）Ｈ2ＰＯ4１ｇ、ＫＣｌ ０.２
ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.２ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ１０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ０.２ｍｇ、Ｚ
ｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.９ｍｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ
０.４ｍｇ、Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ ０.０９ｍｇ、
（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ０.０４ｍｇ、ビオチ
ン５０μｇ、ｐ−アミノ安息香酸２.５ｍｇ、サイアミ
ン塩酸塩１ｍｇおよび寒天１６ｇを水１リットルに含
み、ｐＨ７.２に調整した培地〕およびシキミ酸５０μ
ｇ／ｍｌを含むＭ１寒天培地に各々塗布し、前者で生育
せず後者で生育できる株を分離した。これらシキミ酸要
求性変異株のトランスケトラーゼ活性を、以下のように
して測定した。トリス ５０ｍＭ（ｐＨ７.５）、ＮＡ
ＤＨ ０.２ｍＭ、チアミンピロフォスフェート０.０１
ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １ｍＭ、キシルロース−５−リン酸
０.５ｍＭ、リブロース−５−リン酸 ０.５ｍＭ、グ
リセロール−３−リン酸−デヒドロゲナーゼおよびトリ
オースフォスフェート−イソメラーゼ混合液（ベーリン
ガー マンハイム社製）２０μｇを含む反応液に粗酵素
液を加えて１.５ｍｌとし、３０℃で反応を開始した。
生成したグリセルアルデヒド−３−リン酸を３４０ｎｍ
における吸光度の減少にて測定した。その結果、ＲＡ６
０と命名した一株がトランスケトラーゼ活性の欠損した
変異株であることを同定した。
コース１０ｇ、（ＮＨ4）Ｈ2ＰＯ4１ｇ、ＫＣｌ ０.２
ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.２ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ１０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ０.２ｍｇ、Ｚ
ｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.９ｍｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ
０.４ｍｇ、Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ ０.０９ｍｇ、
（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ０.０４ｍｇ、ビオチ
ン５０μｇ、ｐ−アミノ安息香酸２.５ｍｇ、サイアミ
ン塩酸塩１ｍｇおよび寒天１６ｇを水１リットルに含
み、ｐＨ７.２に調整した培地〕およびシキミ酸５０μ
ｇ／ｍｌを含むＭ１寒天培地に各々塗布し、前者で生育
せず後者で生育できる株を分離した。これらシキミ酸要
求性変異株のトランスケトラーゼ活性を、以下のように
して測定した。トリス ５０ｍＭ（ｐＨ７.５）、ＮＡ
ＤＨ ０.２ｍＭ、チアミンピロフォスフェート０.０１
ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １ｍＭ、キシルロース−５−リン酸
０.５ｍＭ、リブロース−５−リン酸 ０.５ｍＭ、グ
リセロール−３−リン酸−デヒドロゲナーゼおよびトリ
オースフォスフェート−イソメラーゼ混合液（ベーリン
ガー マンハイム社製）２０μｇを含む反応液に粗酵素
液を加えて１.５ｍｌとし、３０℃で反応を開始した。
生成したグリセルアルデヒド−３−リン酸を３４０ｎｍ
における吸光度の減少にて測定した。その結果、ＲＡ６
０と命名した一株がトランスケトラーゼ活性の欠損した
変異株であることを同定した。
【００２６】（３）トランスケトラーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片のクローニング 上記（１）で調製したｐＣＧ１１６プラスミドＤＮＡお
よびコリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８
３３の染色体ＤＮＡを各々１μｇ含むＹ−１００反応液
（トリス１０ｍＭ、ＭｇＣｌ2 ６ｍＭ ＮａＣｌ １
００ｍＭ、ｐＨ７.５）２００μｌに２０単位のＳａｌ
Ｉを添加し、３７℃で６０分間反応させた。６５℃で１
０分間加温して反応を停止させた後、１０倍濃度のＴ４
リガーゼ用緩衝液（トリス ６６０ｍＭ ＭｇＣｌ2
６６ｍＭ、ジチオスレイトール１００ｍＭ、ｐＨ７.
６）４０μｌ、５ｍＭ ＡＴＰ４０μｌ、Ｔ４リガーゼ
（宝酒造社製）３００単位および水１２０μｌを加え、
１２℃で１６時間反応させた。このリガーゼ反応混合物
を上記（２）で取得したコリネバクテリウム グルタミ
クムのトランスケトラーゼ遺伝子欠損株ＲＡ６０の形質
転換に供した。コリネバクテリウム グルタミクムＲＡ
６０の種培養４ｍｌをシキミ酸１００μｇ／ｍｌを含む
ＳＳＭ培地４０ｍｌに植菌し、３０℃で振とう培養し
た。ＯＤが０.２になった時点で上記（１）と同様な方
法でペニシリンＧ処理後、ＯＤが０.６になるまで生育
させた。菌体を集菌し、該細胞をＲＣＧＰ培地〔グルコ
ース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２.５ｇ、Ｋ2Ｈ
ＰＯ4 ３.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １.５ｇ、ＭｇＣｌ2・６
Ｈ2Ｏ ０.４１ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ、Ｍ
ｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
０.９ｍｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ０.０４ｍ
ｇ、ビオチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩２ｍｇ、コハ
ク酸二ナトリウム１３５ｇ、ポリビニルピロリドン（分
子量１０、０００）３０ｇを水１リットルに含む培地〕
に１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む溶液（ｐＨ７.６）
１０ｍｌに約１０9細胞／ｍｌとなるように懸濁し、Ｌ
型試験管に移して３０℃で１６時間穏やかに振とう反応
してプロトプラスト化した。このプロトプラスト菌液
０.５ｍｌを小試験管にとり、２,５００×ｇで５分間遠
心分離し、ＴＳＭＣ緩衝液（ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、Ｃ
ａＣｌ2 ３０ｍＭ、トリス ５０ｍＭ、ショ糖 ４０
０ｍＭ、ｐＨ７.５）１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、
ＴＳＭＣ緩衝液０.１ｍｌに再懸濁した。この菌液に２
倍濃度のＴＳＭＣ緩衝液と上記リガーゼ反応液の１対１
混合液１００μｌを加えて混和し、ついでＴＳＭＣ緩衝
液中に２０％ＰＥＧ６,０００を含む液０.８ｍｌを添加
して混合した。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７.２）２
ｍｌを添加し、２,５００×ｇで５分間遠心分離にかけ
て上澄み液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌ
のＲＣＧＰ培地に懸濁してから、この菌液０.２ｍｌを
スペクチノマイシン４００μｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒
天培地（ＲＣＧＰ培地に１.４％寒天を含む培地、ｐＨ
７.２）に塗布し、３０℃で７日間培養した。
ＮＡ断片のクローニング 上記（１）で調製したｐＣＧ１１６プラスミドＤＮＡお
よびコリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８
３３の染色体ＤＮＡを各々１μｇ含むＹ−１００反応液
（トリス１０ｍＭ、ＭｇＣｌ2 ６ｍＭ ＮａＣｌ １
００ｍＭ、ｐＨ７.５）２００μｌに２０単位のＳａｌ
Ｉを添加し、３７℃で６０分間反応させた。６５℃で１
０分間加温して反応を停止させた後、１０倍濃度のＴ４
リガーゼ用緩衝液（トリス ６６０ｍＭ ＭｇＣｌ2
６６ｍＭ、ジチオスレイトール１００ｍＭ、ｐＨ７.
６）４０μｌ、５ｍＭ ＡＴＰ４０μｌ、Ｔ４リガーゼ
（宝酒造社製）３００単位および水１２０μｌを加え、
１２℃で１６時間反応させた。このリガーゼ反応混合物
を上記（２）で取得したコリネバクテリウム グルタミ
クムのトランスケトラーゼ遺伝子欠損株ＲＡ６０の形質
転換に供した。コリネバクテリウム グルタミクムＲＡ
６０の種培養４ｍｌをシキミ酸１００μｇ／ｍｌを含む
ＳＳＭ培地４０ｍｌに植菌し、３０℃で振とう培養し
た。ＯＤが０.２になった時点で上記（１）と同様な方
法でペニシリンＧ処理後、ＯＤが０.６になるまで生育
させた。菌体を集菌し、該細胞をＲＣＧＰ培地〔グルコ
ース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２.５ｇ、Ｋ2Ｈ
ＰＯ4 ３.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １.５ｇ、ＭｇＣｌ2・６
Ｈ2Ｏ ０.４１ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ、Ｍ
ｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ２ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
０.９ｍｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ０.０４ｍ
ｇ、ビオチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩２ｍｇ、コハ
ク酸二ナトリウム１３５ｇ、ポリビニルピロリドン（分
子量１０、０００）３０ｇを水１リットルに含む培地〕
に１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む溶液（ｐＨ７.６）
１０ｍｌに約１０9細胞／ｍｌとなるように懸濁し、Ｌ
型試験管に移して３０℃で１６時間穏やかに振とう反応
してプロトプラスト化した。このプロトプラスト菌液
０.５ｍｌを小試験管にとり、２,５００×ｇで５分間遠
心分離し、ＴＳＭＣ緩衝液（ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ、Ｃ
ａＣｌ2 ３０ｍＭ、トリス ５０ｍＭ、ショ糖 ４０
０ｍＭ、ｐＨ７.５）１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、
ＴＳＭＣ緩衝液０.１ｍｌに再懸濁した。この菌液に２
倍濃度のＴＳＭＣ緩衝液と上記リガーゼ反応液の１対１
混合液１００μｌを加えて混和し、ついでＴＳＭＣ緩衝
液中に２０％ＰＥＧ６,０００を含む液０.８ｍｌを添加
して混合した。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７.２）２
ｍｌを添加し、２,５００×ｇで５分間遠心分離にかけ
て上澄み液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌ
のＲＣＧＰ培地に懸濁してから、この菌液０.２ｍｌを
スペクチノマイシン４００μｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒
天培地（ＲＣＧＰ培地に１.４％寒天を含む培地、ｐＨ
７.２）に塗布し、３０℃で７日間培養した。
【００２７】寒天培地上に生育したコロニーをかき集
め、生理食塩水で２回遠心洗浄後、生理食塩水１ｍｌに
懸濁した。この菌液をスペクチノマイシン１００μｇ／
ｍｌを含有する最少寒天培地Ｍ１上に再塗布して３０℃
で２日間培養し、スペクチノマイシン耐性で、シキミ酸
非要求性となった形質転換株を選択した。これらの形質
転換株から、上記（１）でｐＣＧ１１６を単離したのと
同様な方法でプラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株
の一株から得られ、ｐＣＴＫ１０２と命名したプラスミ
ドは、各制限酵素による切断産物をアガロースゲル電気
泳動法で解析した結果、ｐＣＧ１１６のＳａｌＩ部位に
約４.６ｋｂのＳａｌＩＤＮＡ断片が挿入された構造を
有していることがわかった（第１図参照）。コリネバク
テリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３およびｐＣ
ＴＫ１０２を保有する形質転換株について、トランスケ
トラーゼ活性を上記（２）と同様な方法で測定した。Ａ
ＴＣＣ３１８３３株のトランスケトラーゼ活性を１とし
たときのｐＣＴＫ１０２を保有する形質転換株のトラン
スケトラーゼ活性は１０倍以上に増加していたことか
ら、ｐＣＴＫ１０２に挿入されている約４.６ｋｂのＤ
ＮＡ断片上には、トランスケトラーゼ遺伝子が存在して
いることを確認した。このようにして得られたｐＣＴＫ
１０２を保有するコリネバクテリウム グルタミクムＡ
ＴＣＣ１３０３２菌株は、平成４年１１月２５日付でコ
リネバクテリウム グルタミクムＫ８７（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４０８０）として工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）にブダぺスト条約に基づいて寄託されてい
る。
め、生理食塩水で２回遠心洗浄後、生理食塩水１ｍｌに
懸濁した。この菌液をスペクチノマイシン１００μｇ／
ｍｌを含有する最少寒天培地Ｍ１上に再塗布して３０℃
で２日間培養し、スペクチノマイシン耐性で、シキミ酸
非要求性となった形質転換株を選択した。これらの形質
転換株から、上記（１）でｐＣＧ１１６を単離したのと
同様な方法でプラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株
の一株から得られ、ｐＣＴＫ１０２と命名したプラスミ
ドは、各制限酵素による切断産物をアガロースゲル電気
泳動法で解析した結果、ｐＣＧ１１６のＳａｌＩ部位に
約４.６ｋｂのＳａｌＩＤＮＡ断片が挿入された構造を
有していることがわかった（第１図参照）。コリネバク
テリウム グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３およびｐＣ
ＴＫ１０２を保有する形質転換株について、トランスケ
トラーゼ活性を上記（２）と同様な方法で測定した。Ａ
ＴＣＣ３１８３３株のトランスケトラーゼ活性を１とし
たときのｐＣＴＫ１０２を保有する形質転換株のトラン
スケトラーゼ活性は１０倍以上に増加していたことか
ら、ｐＣＴＫ１０２に挿入されている約４.６ｋｂのＤ
ＮＡ断片上には、トランスケトラーゼ遺伝子が存在して
いることを確認した。このようにして得られたｐＣＴＫ
１０２を保有するコリネバクテリウム グルタミクムＡ
ＴＣＣ１３０３２菌株は、平成４年１１月２５日付でコ
リネバクテリウム グルタミクムＫ８７（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４０８０）として工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）にブダぺスト条約に基づいて寄託されてい
る。
【００２８】（４）ｐＣＴＫ１０２を保有する菌株によ
る芳香族アミノ酸の生産 L-トリプトファン生産性菌株コリネバクテリウム グル
タミクムＢＰＳ−１３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１７７７）、
Ｌ−フェニルアラニン生産性菌株コリネバクテリウム
グルタミクムＫ５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６９）および
Ｌ−チロシン生産性菌株コリネバクテリウム グルタミ
クムＡＴＣＣ２１５７１の種培養４ｍｌをＬ−フェニル
アラニンおよびＬ−チロシン各５０μ／ｍｌを含むＳＳ
Ｍ培地４０ｍｌに各々植菌して３０℃で振とう培養し
た。ＯＤが０.２になった時点で上記（１）と同様な方
法でペニシリンＧ処理後、ＯＤが０.６になるまで生育
させた。菌体を集菌し、該細胞を上記（３）と同様な方
法によりリゾチーム処理してプロトプラスト化した。各
プロトプラストをｐＣＴＫ１０２を用いて上記（３）と
同様な方法により形質転換した。スペクチノマイシンに
耐性となった各形質転換株から上記（１）と同様な方法
によりプラスミドＤＮＡを単離した。これらのプラスミ
ドの各種制限酵素での切断解析により、各形質転換株が
ｐＣＴＫ１０２を保有することを確認した。
る芳香族アミノ酸の生産 L-トリプトファン生産性菌株コリネバクテリウム グル
タミクムＢＰＳ−１３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１７７７）、
Ｌ−フェニルアラニン生産性菌株コリネバクテリウム
グルタミクムＫ５２（ＦＥＲＭ ＢＰ−７６９）および
Ｌ−チロシン生産性菌株コリネバクテリウム グルタミ
クムＡＴＣＣ２１５７１の種培養４ｍｌをＬ−フェニル
アラニンおよびＬ−チロシン各５０μ／ｍｌを含むＳＳ
Ｍ培地４０ｍｌに各々植菌して３０℃で振とう培養し
た。ＯＤが０.２になった時点で上記（１）と同様な方
法でペニシリンＧ処理後、ＯＤが０.６になるまで生育
させた。菌体を集菌し、該細胞を上記（３）と同様な方
法によりリゾチーム処理してプロトプラスト化した。各
プロトプラストをｐＣＴＫ１０２を用いて上記（３）と
同様な方法により形質転換した。スペクチノマイシンに
耐性となった各形質転換株から上記（１）と同様な方法
によりプラスミドＤＮＡを単離した。これらのプラスミ
ドの各種制限酵素での切断解析により、各形質転換株が
ｐＣＴＫ１０２を保有することを確認した。
【００２９】これら各形質転換株と各々の親株の芳香族
アミノ酸生産試験を太型試験管培養により次のように行
った。種培地Ｓ１〔グルコース２０ｇ、ポリペプトン１
５ｇ、酵母エキス１５ｇ、ＮａＣｌ ２.５ｇ、尿素１
ｇ、Ｌ−チロシン２００ｍｇ、Ｌ−フェニルアラニン２
００ｍｇを水１ｌに含み、ｐＨ７.２に調整した培地〕
３ｍｌ中で３０℃、２４時間振とう培養した種培養０.
５ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｐ１〔グルコース６０ｇ、Ｋ
Ｈ2ＰＯ4 １ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ １ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２０ｇ、コーン スチー
プ リカー １０ｇ、ＭｎＳＯ4 １０ｍｇ、ビオチン
３０μｇ、ＣａＣＯ3 ２０ｇを水１リットルに含み、
ｐＨ７.２に調整した培地〕の入った太型試験管にそれ
ぞれ接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。なお、
形質転換株の種培養およびＰ１生産培地での培養は、ス
ペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌ存在下で行った。培
養後、Ｌ−チロシン生産性菌株の培養液には６Ｎ−Ｎａ
ＯＨ溶液を５０μｌ／ｍｌ加え、６５℃で５分間加熱
し、析出しているＬ−チロシンを完全に溶解させた。各
培養ろ液を高速液体クロマトグラフィーを用いたＯＰＡ
ポストカラム誘導体化法〔アナリティカル ケミストリ
ー（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．），５１，１３３８（１９７
９）〕により定量して、L-トリプトファン、Ｌ−フェニ
ルアラニンおよびＬ−チロシンの生成量を測定した。結
果を第１表に示す。
アミノ酸生産試験を太型試験管培養により次のように行
った。種培地Ｓ１〔グルコース２０ｇ、ポリペプトン１
５ｇ、酵母エキス１５ｇ、ＮａＣｌ ２.５ｇ、尿素１
ｇ、Ｌ−チロシン２００ｍｇ、Ｌ−フェニルアラニン２
００ｍｇを水１ｌに含み、ｐＨ７.２に調整した培地〕
３ｍｌ中で３０℃、２４時間振とう培養した種培養０.
５ｍｌを５ｍｌの生産培地Ｐ１〔グルコース６０ｇ、Ｋ
Ｈ2ＰＯ4 １ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2
Ｏ １ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２０ｇ、コーン スチー
プ リカー １０ｇ、ＭｎＳＯ4 １０ｍｇ、ビオチン
３０μｇ、ＣａＣＯ3 ２０ｇを水１リットルに含み、
ｐＨ７.２に調整した培地〕の入った太型試験管にそれ
ぞれ接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。なお、
形質転換株の種培養およびＰ１生産培地での培養は、ス
ペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌ存在下で行った。培
養後、Ｌ−チロシン生産性菌株の培養液には６Ｎ−Ｎａ
ＯＨ溶液を５０μｌ／ｍｌ加え、６５℃で５分間加熱
し、析出しているＬ−チロシンを完全に溶解させた。各
培養ろ液を高速液体クロマトグラフィーを用いたＯＰＡ
ポストカラム誘導体化法〔アナリティカル ケミストリ
ー（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．），５１，１３３８（１９７
９）〕により定量して、L-トリプトファン、Ｌ−フェニ
ルアラニンおよびＬ−チロシンの生成量を測定した。結
果を第１表に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
【発明の効果】本発明によれば、微生物のトランスケト
ラーゼの合成に関与する遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを
導入することによって、コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種における芳香族アミノ酸の生産
性を向上させることができる。
ラーゼの合成に関与する遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを
導入することによって、コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種における芳香族アミノ酸の生産
性を向上させることができる。
【図１】は、ｐＣＴＫ１０２の制限酵素切断地図とその
作製工程を示す。黒塗部分の染色体ＤＮＡ断片上にはト
ランスケトラーゼ遺伝子が含まれている。
作製工程を示す。黒塗部分の染色体ＤＮＡ断片上にはト
ランスケトラーゼ遺伝子が含まれている。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
//(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 13/22
Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:13
(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:15）
(Ｃ１２Ｐ 13/22
Ｃ１２Ｒ 1:15）
(Ｃ１２Ｐ 13/22
Ｃ１２Ｒ 1:13）
(56)参考文献 米国特許5168056（ＵＳ，Ａ)
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏ
ｌ．114，Ｎｏ．10（1992，Ｍａｙ）ｐ.
3956−3962
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏ
ｌ．112，Ｎｏ．４（1990）ｐ．1657−
1659
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12P 13/00 - 13/24
C12N 15/00 - 15/90
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (3)
- 【請求項１】 ＦＥＲＭ ＢＰ−４０８０が保有するプ
ラスミドｐＣＴＫ１０２に含まれるトランスケトラーゼ
をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドを含有す
るコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に
属する微生物であり、かつ芳香族アミノ酸生産能を有す
る微生物を培地に培養し、培養物中に芳香族アミノ酸を
生成蓄積させ、該培養物から芳香族アミノ酸を採取する
ことを特徴とする芳香族アミノ酸の製造法。 - 【請求項２】 コリネバクテリウム グルタミクムＫ８
７（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０８０）。 - 【請求項３】 ＦＥＲＭ ＢＰ−４０８０が保有するプ
ラスミドｐＣＴＫ１０２に含有される、制限酵素Ｓａｌ
Ｉ認識部位を両端に有する約４．６ｋｂのＤＮＡ。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32410592A JP3369231B2 (ja) | 1992-12-03 | 1992-12-03 | 芳香族アミノ酸の製造法 |
| DE69328761T DE69328761T2 (de) | 1992-12-03 | 1993-12-01 | Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin |
| EP93119361A EP0600463B1 (en) | 1992-12-03 | 1993-12-01 | Process for producing L-tryptophan, L-tyrosine or L-Phenylalanine |
| US08/424,621 US5605818A (en) | 1992-12-03 | 1995-04-19 | Process for producing L-tryptophan, L-tyrosine or L-phenylalanine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32410592A JP3369231B2 (ja) | 1992-12-03 | 1992-12-03 | 芳香族アミノ酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06169785A JPH06169785A (ja) | 1994-06-21 |
| JP3369231B2 true JP3369231B2 (ja) | 2003-01-20 |
Family
ID=18162221
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32410592A Expired - Lifetime JP3369231B2 (ja) | 1992-12-03 | 1992-12-03 | 芳香族アミノ酸の製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5605818A (ja) |
| EP (1) | EP0600463B1 (ja) |
| JP (1) | JP3369231B2 (ja) |
| DE (1) | DE69328761T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE19523279A1 (de) * | 1995-06-27 | 1997-01-09 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren mittels rekombinanter Mikroorganismen mit erhöhter Sekretionsrate |
| JP4294123B2 (ja) | 1998-07-03 | 2009-07-08 | 協和発酵バイオ株式会社 | ホスホリボシルピロリン酸を経由して生合成される代謝産物の製造法 |
| US6586214B1 (en) * | 1999-09-15 | 2003-07-01 | Degussa Ag | Method for increasing the metabolic flux through the pentose phosphate cycle in coryneform bacteria by regulation of the phosphoglucose isomerase (pgi gene) |
| BR0010713A (pt) * | 2000-03-17 | 2002-02-13 | Degussa | Processo para a preparação fermentativa de l-aminoácidos com amplificação do gene tkt |
| US20030109014A1 (en) * | 2000-03-17 | 2003-06-12 | Kevin Burke | Process for the fermentative preparation of L-amino acids with amplification of the tkt gene |
| US20030185754A1 (en) * | 2001-01-16 | 2003-10-02 | Genset, S.A. | Treatment of CNS disorders using D-amino acid oxidase and D-aspartate oxidase antagonists |
| US20030166554A1 (en) * | 2001-01-16 | 2003-09-04 | Genset, S.A. | Treatment of CNS disorders using D-amino acid oxidase and D-aspartate oxidase antagonists |
| US6620850B2 (en) * | 2001-09-19 | 2003-09-16 | University Of Florida | Materials and methods for treatment of neurological disorders involving overactivation of glutamatergic ionotropic receptors |
| US6794164B2 (en) | 2002-01-07 | 2004-09-21 | Novozymes Biopharma Ab | Process for the isolation of polyhydroxy cyclic carboxylic acids |
| DE102005032429A1 (de) | 2005-01-19 | 2006-07-20 | Degussa Ag | Allele des mqo-Gens aus coryneformen Bakterien |
| DE102005013676A1 (de) | 2005-03-24 | 2006-09-28 | Degussa Ag | Allele des zwf-Gens aus coryneformen Bakterien |
| DE102005023829A1 (de) | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Degussa Ag | Allele des opcA-Gens aus coryneformen Bakterien |
| DE102005043979A1 (de) | 2005-09-15 | 2007-03-22 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Produktion von Aminosäuren in aminosäureproduzierenden Mikroorganismen |
| DE102005047596A1 (de) | 2005-10-05 | 2007-04-12 | Degussa Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien |
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| WO2011110927A1 (en) | 2010-03-12 | 2011-09-15 | Council Of Scientific & Industrial Research | A method for the extraction of shikimic acid |
| EP2479279A1 (de) | 2011-01-20 | 2012-07-25 | Evonik Degussa GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Aminosäuren |
| DE102011006716A1 (de) | 2011-04-04 | 2012-10-04 | Evonik Degussa Gmbh | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung |
| DE102011118019A1 (de) | 2011-06-28 | 2013-01-03 | Evonik Degussa Gmbh | Varianten des Promotors des für die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierenden gap-Gens |
| EP2628792A1 (de) | 2012-02-17 | 2013-08-21 | Evonik Industries AG | Zelle mit verringerter ppGppase-Aktivität |
| PL2700715T3 (pl) | 2012-08-20 | 2019-03-29 | Evonik Degussa Gmbh | Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów z zastosowaniem ulepszonych szczepów z rodziny Enterobacteriaceae |
| EP2762571A1 (de) | 2013-01-30 | 2014-08-06 | Evonik Industries AG | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren |
| KR101504900B1 (ko) * | 2013-06-27 | 2015-03-23 | 백광산업 주식회사 | 트랜스케톨라아제 유전자 프로모터 변이체 및 이의 용도 |
| WO2021048353A1 (en) | 2019-09-11 | 2021-03-18 | Evonik Operations Gmbh | Coryneform bacteria with a heterologous threonine transporter and their use in the production of l-threonine |
Family Cites Families (7)
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| JPS5546717B1 (ja) * | 1970-07-17 | 1980-11-26 | ||
| JPS5814199B2 (ja) * | 1979-10-31 | 1983-03-17 | 味の素株式会社 | Ｌ−フエニルアラニンの製造法 |
| JPS59156292A (ja) * | 1983-02-17 | 1984-09-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | トリプトフアンの製造法 |
| DE3464934D1 (en) * | 1983-04-13 | 1987-08-27 | Ajinomoto Kk | Process for the production of l-tryptophan by a fermentation process |
| JPS61260892A (ja) * | 1985-05-14 | 1986-11-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−フエニルアラニンの製造法 |
| JP2656300B2 (ja) * | 1988-04-18 | 1997-09-24 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ−トリプトファンの製造法 |
| US5168056A (en) * | 1991-02-08 | 1992-12-01 | Purdue Research Foundation | Enhanced production of common aromatic pathway compounds |
-
1992
- 1992-12-03 JP JP32410592A patent/JP3369231B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-12-01 EP EP93119361A patent/EP0600463B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-01 DE DE69328761T patent/DE69328761T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-19 US US08/424,621 patent/US5605818A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１１２，Ｎｏ．４（１９９０）ｐ．１６５７−１６５９ |
| Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１１４，Ｎｏ．１０（１９９２，Ｍａｙ）ｐ．３９５６−３９６２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06169785A (ja) | 1994-06-21 |
| DE69328761D1 (de) | 2000-07-06 |
| EP0600463B1 (en) | 2000-05-31 |
| EP0600463A2 (en) | 1994-06-08 |
| DE69328761T2 (de) | 2001-01-25 |
| EP0600463A3 (en) | 1995-06-21 |
| US5605818A (en) | 1997-02-25 |
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