JP4294123B2 - ホスホリボシルピロリン酸を経由して生合成される代謝産物の製造法 - Google Patents
ホスホリボシルピロリン酸を経由して生合成される代謝産物の製造法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、トランスケトラーゼの活性を欠損、または親株に比べて低下させた変異株を用い、生合成経路上、ホスホリボシルピロリン酸（以下、ＰＲＰＰと略す）から合成される有用物質を発酵法で製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物の代謝経路上、ＰＲＰＰから合成される有用物質としては、プリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオシド、ピリミジンヌクレオシド、プリン塩基、ピリミジン塩基、フラビンヌクレオチド等の核酸関連物質、Ｌ−ヒスチジン、リボフラビン等が知られている。
【０００３】
上記核酸関連物質、Ｌ−ヒスチジン、リボフラビン等は、これまで発酵法、発酵法および合成法を組合わせた方法等を用い、工業的に生産されている〔高尾彰一ら編、応用微生物学、文永堂出版（１９９６）；相田浩ら編、アミノ酸発酵、学会出版センター（１９８６）；特開平６-２２５７７６〕。
微生物において、ＰＲＰＰはペントースリン酸経路の中間体リボース ５−リン酸からＰＲＰＰ合成酵素によって生合成される。
【０００４】
リボース ５−リン酸の生合成経路としては、グルコース ６−リン酸デヒドロゲナーゼ反応経由の酸化的ペントースリン酸経路が知られており、また、トランスケトラーゼ反応経由の非酸化的ペントースリン酸経路上の酵素が全て可逆であることより、該非酸化的ペントースリン酸経路も関与していると考えられている（図１）。
【０００５】
既にエシェリヒアコリではリボース ５−リン酸の生合成に、その両経路が関与していることがラベルしたグルコースの代謝実験によって明らかにされている〔Biochemistry, 12, 10, 1969 (1973)〕。さらに、エシェリヒア コリやコリネバクテリウム グルタミクムにおいて、グルコース ６−リン酸デヒドロゲナーゼを欠損してもリボースの要求性を示さないことから、リボース ５−リン酸はトランスケトラーゼ反応経由の非酸化的ペントースリン酸経路によって供給されることが遺伝的にも示されている〔D. G. Fraenkel and R. T. Vinopal,Ann. Rev. Microbiol., 27, 69-100 (1973); E. D. Ihnen and A. L. Demain, J. Bacteriol., 98, 1151-1158 (1969)〕。
【０００６】
上記知見は、トランスケトラーゼの活性を高めることにより、非酸化的経路からリボース ５−リン酸およびＰＲＰＰへの供給が高まり、ＰＲＰＰから生合成される物質の生成量が向上することを推測させるものである。
また、バチルス サチルス等のバチルス属細菌のイノシン生産菌において、トランスケトラーゼの活性を欠損した株は、リボースを培地中に著量蓄積してしまい、プリンヌクレオチドの生産収率は低下することが報告されている〔K. Sasajima and M. Yoneda, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 2, 175-213 (1984)〕。
【０００７】
上記知見もまた、ＰＲＰＰから生合成される物質の生産にトランスケトラーゼの活性が必要であることを推測させるものである。
これまでに、生物全般にわたり、ＰＲＰＰを経由して生合成されるいかなる代謝産物においても、該生物のトランスケトラーゼ活性を欠損または低下させることにより、これら代謝産物の生産効率を向上させることができるとの知見はない。
【０００８】
ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物、特に、核酸関連物質、Ｌ−ヒスチジン、リボフラビン等は、その需要が増大しており、工業的により有利な製造法を開発することが強く望まれている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物の工業的により有利な製造法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
従来の生産菌の育種は、目的とする代謝産物の生合成に関わる末端生合成経路の代謝増強を主眼として進められ、大きな成功を収めてきた。
本発明者らは、更なる代謝産物の生産性向上には、該末端生合成経路の代謝増強とは別の改変、即ち、出発基質の供給能力やプールを高める中央代謝の改変が必要であると考え、微生物において中央代謝経路を操作することによる、種々の代謝産物へのカーボンフローに対する影響を鋭意検討した。
【００１１】
その結果、ペントースリン酸経路の酵素であるトランスケトラーゼの活性を欠損させるか、または親株に比べて低下させることにより、生合成経路上、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物の生産効率を向上させることができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記、（１）〜（８）に関する。
【００１２】
（１）コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属する微生物のトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させることを特徴とする、該微生物において、代謝経路上、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物の生産を増強させる方法。
（２）増強される代謝産物が、プリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオシド、ピリミジンヌクレオシド、プリン塩基、ピリミジン塩基、フラビンヌクレオチド、Ｌ−ヒスチジン、リボフラビン等である、上記（１）の方法。
【００１３】
（３）微生物が、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＰＨ８、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＦＭ４１、エシェリヒア コリ ＡＩ８０／ｐＦＭ２０１等である、上記（１）の方法。
（４）コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属し、かつトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた微生物を培地に培養し、培養液中に、代謝経路上、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物から選ばれる１もしくは数個の代謝産物を生成蓄積させ、該代謝産物を採取することを特徴とする、該代謝産物の製造方法。
【００１４】
（５）製造される代謝産物が、プリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオシド、ピリミジンヌクレオシド、プリン塩基、ピリミジン塩基、フラビンヌクレオチド、Ｌ−ヒスチジン、リボフラビン等である、上記（４）の方法。
（６）微生物が、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＰＨ８、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＦＭ４１、エシェリヒア コリ ＡＩ８０／ｐＦＭ２０１等である、上記（４）の方法。
【００１５】
（７）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属し、かつトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた微生物。
（８）微生物が、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＰＨ８、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＦＭ４１等である、上記（７）の微生物。
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられる微生物としては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属し、かつトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた菌株であれば、変異株、細胞融合株、形質導入株あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて造成した組換え株のいずれであってもよい。
【００１７】
該微生物として、例えば、トランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた、コリネバクテリウム グルタミクム、コリネバクテリウム アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム ハーキュリス、コリネバクテリウムリリウム、コリネバクテリウム メラセコーラ、ブレビバクテリウム ディバリカツム、ブレビバクテリウム フラブム、ブレビバクテリウム イマリオフィラム、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム チオゲニタリス、エシェリヒアコリ等をあげることができる。
【００１８】
該微生物として、好適には、アミノ酸発酵に用いられている、いわゆるコリネ型グルタミン酸生産菌やエシェリヒアコリ、あるいは核酸発酵やリボフラビン発酵に用いられているコリネバクテリウムアンモニアゲネス等をあげることができる。
本発明の、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属し、かつトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた微生物は、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属する公知の微生物に、トランスケトラーゼの活性を欠損または低下させる変異を、通常の変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法、形質導入法あるいは細胞融合法を用いて付与することにより取得できる。
【００１９】
具体的な例として、以下に記載の方法で本発明の菌株を取得することができる。
本発明の菌株は、シキミ酸要求性かつリボース非資化性を指標として選択することにより取得することができる。
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属する微生物を、通常の変異処理法、例えば紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニンジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の化学処理を施した後、親株では生育可能なグルコースを単一の炭素源として含む最少培地において、生育できないかもしくは生育不良であり、シキミ酸を添加した該最少培地では良好に生育する変異株を分離することにより、シキミ酸要求変異株を取得する。
【００２０】
該シキミ酸要求変異株を、シキミ酸を含有しかつグルコースまたはリボースを単一の炭素源として含む最少培地にそれぞれ塗布し、グルコース培地では生育可能であるが、リボース培地では生育できないかもしくは生育不良である変異株を選択する。該菌株はトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下した変異株である。
以上の方法で、シキミ酸要求性に加えてリボース非資化性を有する、トランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた変異株を取得することができる。
【００２１】
また、トランスケトラーゼをコードする遺伝子をインビトロで破壊したトランスケトラーゼ遺伝子を用いた通常の遺伝子置換法によっても、トランスケトラーゼ変異株を取得することができる。
トランスケトラーゼをコードする遺伝子としては、公知のもの〔G. A. Sprenger, Biochim. Biophys. Acta., 1216, 307 (1993)； A. Iida et al., J. Bacteriol., 175, 5375-5383 (1993)；特開平６―１６９７８５〕を利用することができる。
【００２２】
本発明の菌株は、シキミ酸要求性かつリボース非資化性を指標として選択することにより取得することができるが、トランスケトラーゼの活性が親株に比べて少しでも低下している菌株の中には、必ずしもシキミ酸の要求性やリボースの非資化性を備えてはいないものもある。しかしながら、該菌株も本発明の微生物としてあげることができる。
該微生物は、シキミ酸要求性を示すトランスケトラーゼ変異株から、さらにシキミ酸を全く要求しなくなった復帰変異、シキミ酸の要求量が減少した復帰変異、あるいはリボースの資化性が部分的または完全に回復した復帰変異等を誘導することによって取得することができる。
【００２３】
本発明の微生物は、代謝経路上、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物の生産が増強された微生物である。
上記微生物の具体的な例として、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６等をあげることができる。
更に、上記により取得した、トランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた微生物に、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物から選ばれる、目的とする代謝産物の生産能を向上させる公知の方法、例えば変異手法や組換えＤＮＡ技術を用いて、分解経路や分岐経路を遮断したり、生合成経路上の鍵酵素のフィードバック調節の解除や活性増強を図る方法を用いることにより、目的とする代謝産物をより効率良く製造することのできる菌株を取得することができる。
【００２４】
組換えＤＮＡ技術として、例えば、目的とする代謝産物の生合成遺伝子を含む組換え体プラスミドを宿主に導入することにより、該代謝産物の生産能の向上した菌株を取得することができる。
具体的には、ヒスチジンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミド、例えばｐＰＨ８をトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させたコリネバクテリウム グルタミクムに導入することにより、ヒスチジンを著量生産する株を取得することができる。具体的な菌株として、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＰＨ８等をあげることができる。
【００２５】
リボフラビンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミド、例えばｐＦＭ４１をトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させたコリネバクテリウム グルタミクムに導入することにより、リボフラビンを著量生産する株を取得することができる。具体的な菌株として、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＦＭ４１等をあげることができる。
【００２６】
リボフラビンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミド、例えばｐＦＭ２０１をトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させたエシェリヒア コリに導入することにより、リボフラビンを著量生産する株を取得することができる。具体的な菌株として、エシェリヒア コリ ＡＩ８０／ｐＦＭ２０１等をあげることができる。
【００２７】
変異手法として、例えば、以下に記載した方法を用いることにより、目的とする代謝産物の生産能の向上した菌株を取得することができる。
イノシンの製造ではアデニン要求性でかつプリンアナログの耐性を付与する方法（発酵と工業、Vol.36、No.12 、1036-1048、1978）、イノシン酸の製造ではアデニンおよびグアニン要求性でかつマンガン非感受性を付与する方法〔高尾彰一ら編、応用微生物学、文永堂出版（１９９６）〕、グアノシンの製造ではアデニンおよびヒスチジン要求性でかつメチオニンスルホキシド、サイコフラニンおよびデコイニンの耐性を付与する方法〔高尾彰一ら編、応用微生物学、文永堂出版（１９９６）〕、ウリジンやシチジンなどのピリミジンヌクレオシドの製造ではピリミジンアナログの耐性を付与する方法〔バイオインダストリー, 12, 6, 36-43 (1995）〕、アデニンやウラシルなどの塩基の製造では２-フルオロアデニンなどのプリンアナログの耐性を付与する方法（農芸化学会誌、第48巻、第1号、63-68、1974； 同会誌、第52巻、第3号、129-133、1978）、Ｌ-ヒスチジンの製造では２−チアゾールアラニンや１，２，４−トリアゾールアラニンなどのヒスチジンアナログの耐性を付与する方法〔相田浩ら編、アミノ酸発酵、学会出版センター（１９８６）〕等をあげることができる。
【００２８】
これらの公知の方法を用いてトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた微生物を改良することにより、目的とした代謝産物の生産能の向上した菌株を取得することができる。
本発明の微生物を培地に培養し、培養液中に、代謝経路上、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物から選ばれる１もしくは数個の代謝産物を生成蓄積させ、該代謝産物を採取することにより、該代謝産物を製造することができる。
【００２９】
本発明の微生物の培養は、通常の培養法に従って実施することができる。
使用培地としては、炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミン、その他使用菌株の必要とする微量の栄養素を程よく含有するものならば、合成培地または天然培地のいずれも使用できる。用いる菌株が使用培地で生育にシキミ酸を要求する場合は、培地に少量のシキミ酸を添加すればよい。シキミ酸の代わりに芳香族アミノ酸を少量添加することによっても同様の目的を達成することができる。
【００３０】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、グリセロール、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜等の炭水化物、ポリアルコール類、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸等の各種有機酸が使用できる。さらに微生物の資化性によって、炭化水素、アルコール類等も用いることができる。
窒素源としては、アンモニアまたは塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の各種無機および有機アンモニウム塩類、あるいは尿素および他の窒素含有物質、ならびにペプトン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたはその消化物等の窒素含有有機物等をあげることができる。
【００３１】
無機物としては、リン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等をあげることができる。
アミノ酸、ビタミンは使用する培地の炭素源、窒素源等によって異なるが、必要に応じ、添加することができる。
【００３２】
培養は、振とう培養または通気攪拌培養等の好気的条件下に行う。培養温度は、一般に２０〜４０℃が好適である。培地のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。培養期間は通常１〜５日間である。
培養液中に生成蓄積された、目的とする代謝産物は以下の方法で採取することができる。
【００３３】
培養終了後、菌体を除去し、濃縮晶析する方法、活性炭処理法、あるいはイオン交換樹脂法等の公知の方法〔遠藤 勲ら、化学工学会（編）「バイオセパレーションプロセス便覧」、共立出版(1996)〕を用いることにより目的とする代謝産物を採取することができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１ コリネバクテリウム グルタミクムのトランスケトラーゼ欠損変異株の取得
コリネバクテリウム グルタミクムＬ２２〔野生株ＡＴＣＣ３１８３３から誘導されたリゾチーム感受性変異株；R. Katsumata et al., Proc. 4th Eur. Congr. Biotechnol., 4, 767 (1987)〕をＮＢ培地〔粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕３ｍｌ中に植菌し、３０℃でＯＤ660が約０．６になるまで培養した。
【００３５】
培養後、遠心分離により集菌し、得られた菌体を５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で一回洗浄し、ＮＴＧ４００ｍｇ／Ｌを含む同緩衝液３ｍｌ中、室温で２０分間変異処理を行った。
該処理菌体を同緩衝液で２回遠心洗浄後、ＮＢ培地３ｍｌ中、３０℃で１時間培養した。
【００３６】
該培養液を生理食塩水で１０-5〜１０-6に希釈し、得られた希釈液０．１ｍｌをＮＢ寒天培地〔ＮＢ培地に寒天を１．４％含む培地、ｐＨ７．２〕に塗布し、３０℃で２日間培養した。
寒天培地上に生育してきたコロニーを、最少寒天培地Ｍ１〔グルコース １０ｇ、（ＮＨ4）Ｈ2ＰＯ4 １ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ０．２ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．９ｍｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．４ｍｇ、Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ ０．０９ｍｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ０．０４ｍｇ、ビオチン ５０mｇ、ｐ-アミノ安息香酸 ２．５ｍｇ、チアミン塩酸塩 １ｍｇおよび寒天 １６ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕およびシキミ酸５０ｍｇ／Ｌを含むＭ１寒天培地に各々塗布し、培養した。
【００３７】
最少寒天培地Ｍ１では生育せず、シキミ酸５０ｍｇ／Ｌを含むＭ１寒天培地で生育できる株を、シキミ酸要求変異株として分離した。
分離されたシキミ酸要求変異株を、シキミ酸５０ｍｇ／Ｌを含むＭ１寒天培地および該培地中のグルコースをリボースに置き換えた培地に各々塗布し、培養した。
【００３８】
シキミ酸５０ｍｇ／Ｌを含むＭ１寒天培地で生育するが、該培地中のグルコースをリボースに置き換えた培地では生育できない株を、シキミ酸要求性でかつリボース非資化性の変異株として分離した。
分離されたシキミ酸要求性でかつリボース非資化性の変異株を、シキミ酸５０ｍｇ／Ｌを含むＭ１培地で培養後、遠心分離して得た菌体から超音波破砕による公知の方法に従って粗酵素液を調製した〔M. Ikeda and R. Katsumata, Appl. Environ. Microbiol., 58, 781-785 (1992)〕。
【００３９】
該粗酵素液用いて、トランスケトラーゼの活性を以下のようにして測定した。
トリス ５０ｍＭ（ｐＨ７．５）、ＮＡＤＨ ０．２ｍＭ、チアミンピロリン酸０．０１ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １ｍＭ、キシルロース-５−リン酸 ０．５ｍＭ、リブロース-５−リン酸 ０．５ｍＭ、グリセロール-３-リン酸デヒドロゲナーゼおよびトリオースフォスフェートイソメラーゼ混合液（ベーリンガーマンハイム社製）２０mｇを含む反応液に粗酵素液を加えて１．５ｍｌとし、３０℃で反応を行った。
【００４０】
３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの吸光度の減少を測定することにより、生成されるグリセルアルデヒド-３-リン酸量を測定した。
該測定により、分離されたシキミ酸要求性でかつリボース非資化性の変異株より、グリセルアルデヒド-３-リン酸を全く生成しない、トランスケトラーゼ活性を欠損した変異株ＴＫＴ６株を選択した。
【００４１】
コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６株は、ブダペスト条約に基づいて、平成１０年６月３０日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５-８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−６３９９号として寄託されている。
【００４２】
実施例２ シキミ酸非要求性復帰株の分離
ＴＫＴ６株を、ＮＢ培地３ｍｌ中、３０℃で２４時間培養した。
培養後、遠心分離により集菌した。
得られた菌体を生理食塩水で３回遠心洗浄後、生理食塩水に菌濃度が約１０9／ｍｌになるように懸濁した。
【００４３】
該菌懸濁液０．１ｍｌをＭ１寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。
該Ｍ１寒天培地上で生育可能な株をシキミ酸非要求性復帰株として取得した。
シキミ酸非要求性復帰株はいずれも、リボース資化性およびトランスケトラーゼの活性ともに野生型に戻っていた。
該結果は、シキミ酸要求性およびリボース非資化性の両形質がトランスケトラーゼ活性の欠損に起因して生じていることを示している。
上記で取得されたシキミ酸非要求性復帰株（トランスケトラーゼ欠損変異の復帰株）の内の一株をＲＥＶ３と命名した。
【００４４】
実施例３ コリネバクテリウム グルタミクムのトランスケトラーゼ欠損変異株によるアデニンの製造
コリネバクテリウム グルタミクムＬ２２、ＴＫＴ６およびＲＥＶ３のアデニンの製造を以下のように行った。
グルコース１０ｇ／Ｌを添加したＮＢ培地３ｍｌに、上記３株を各々植菌し、３０℃で２０時間培養した。
【００４５】
各培養液０．１ｍｌを、シキミ酸１００ｍｇ／Ｌの入ったＭ１培地５ｍｌを含む太型試験管にそれぞれ接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。
各培養液をろ過し、得られたろ液中のアデニンの生成量を、イオン交換カラム〔Shodex Asahipak GS-320 7E（旭化成社製）〕ＨＰＬＣを用い、波長２５４ｎｍにおける吸収強度を測定することにより求めた。
結果を第１表に示す。
【００４６】
【表１】
トランスケトラーゼ活性を欠損したＴＫＴ６株のみ、培養液中にアデニンを分泌蓄積していた。
【００４７】
ＴＫＴ６株から得られたトランスケトラーゼの復帰株ＲＥＶ３では再びアデニンを生産しなくなることから、ＴＫＴ６株におけるアデニンの生成はトランスケトラーゼの欠損に起因していることがわかる。
【００４８】
実施例４ コリネバクテリウム グルタミクムのトランスケトラーゼ欠損変異株によるＬ−ヒスチジンの製造
トランスケトラーゼの欠損がコリネバクテリウム グルタミクムによるヒスチジン生産に与える効果を調べるため、Ｌ２２株、ＴＫＴ６株およびＲＥＶ３株に、ヒスチジンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＰＨ８を導入してヒスチジン生産能を増強し、それら３株のヒスチジンの蓄積量を比較した。
【００４９】
ｐＰＨ８はコリネバクテリウム グルタミクムのプラスミドベクターｐＣＧ１１のＢｇｌＩＩ部位にコリネバクテリウム グルタミクムのヒスチジン生合成に関与する遺伝子を有する約１０．６ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたスペクチノマイシン耐性マーカーを有するプラスミドである。
ｐＰＨ８を有するコリネバクテリウム グルタミクムは米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにコリネバクテリウム グルタミクムＫ３２（ＡＴＣＣ３９２８１）として寄託されている。
【００５０】
ｐＰＨ８は、ＡＴＣＣ３９２８１株から通常のアルカリ溶解法〔J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕によって単離することができる。
ｐＰＨ８のＬ２２株、ＴＫＴ６株およびＲＥＶ３株への導入は、コリネ型細菌で一般的に用いられているプロトプラスト法〔R. Katsumata et al., J. Bacteriol., 159, 306-311 (1984)〕やジーン・パルサー装置（Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA）を用いたエレクトロポレーション法（電圧２．５ｋＶ、電気容量２５mＦ、抵抗２００W）〔J. Sambrook et al., MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕により実施することができ、本実験においてはプロトプラスト法を用いた。
【００５１】
ｐＰＨ８を保有するＬ２２株、ＴＫＴ６株およびＲＥＶ３株を用いたヒスチジンの製造は以下のようにして行った。
スペクチノマイシンおよびシキミ酸をそれぞれ１００ｍｇ／Ｌ添加したＳ５種培地〔グルコース ２０ｇ、ポリペプトン １５ｇ、酵母エキス １５ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、尿素 １ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕３ｍｌに上記３株を各々植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。
【００５２】
得られた各培養液０．５ｍｌを、スペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌおよびシキミ酸２００ｍｇ／Ｌを添加したＰ１生産培地〔グルコース ６０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２０ｇ、コーン スチープ リカー ５ｇ、ＭｎＳＯ4 １０ｍｇ、ビオチン ３０mｇ、ＣａＣＯ3 ２０ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕５ｍｌの入った太型試験管にそれぞれ接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。
【００５３】
各培養液をろ過し、得られたろ液中のＬ-ヒスチジンの生成量を、ＨＰＬＣを用いたＯＰＡポストカラム誘導体化法〔Anal. Chem., 51, 1338 (1979)〕により定量した。
結果を第２表に示す。
【００５４】
【表２】
ＴＫＴ６／ｐＰＨ８株ではＬ２２／ｐＰＨ８株に比べ、Ｌ-ヒスチジンの蓄積量が約２倍に向上している。一方、ＲＥＶ３／ｐＰＨ８株のＬ-ヒスチジンの蓄積量はＬ２２／ｐＰＨ８株と同レベルであることから、ＴＫＴ６／ｐＰＨ８株におけるＬ-ヒスチジン生産性の向上はトランスケトラーゼの欠損に起因していることは明白である。
【００５５】
実施例５ コリネバクテリウム グルタミクムのトランスケトラーゼ欠損変異株によるリボフラビンの製造
トランスケトラーゼの欠損がコリネバクテリウム グルタミクムによるリボフラビン生産に与える効果を調べるため、Ｌ２２株、ＴＫＴ６株およびＲＥＶ３株に、リボフラビンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＦＭ４１を導入してリボフラビン生産能を増強し、それら３株のリボフラビンの蓄積量を比較した。
【００５６】
ｐＦＭ４１はコリネバクテリウム グルタミクムのプラスミドベクターｐＣＧ１１のＢｇｌＩＩ部位にコリネバクテリウム アンモニアゲネスのリボフラビン生合成に関与する遺伝子を有する約４．２ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたスペクチノマイシン耐性マーカーを有するプラスミドである。
ｐＦＭ４１を有するコリネバクテリウム アンモニアゲネスは工業技術院微生物工業技術研究所に、コリネバクテリウム アンモニアゲネスＦＭ４１（ＦＥＲＭＢＰ−４００３）として寄託されている。
【００５７】
ＦＭ４１株からのｐＦＭ４１の単離および、ｐＦＭ４１のＬ２２株、ＴＫＴ６株およびＲＥＶ３株への導入は、実施例４記載の方法に準じて実施した。
ｐＦＭ４１を保有するＬ２２株、ＴＫＴ６株およびＲＥＶ３株を用いたリボフラビンの製造は以下のようにして行った。
スペクチノマイシンおよびシキミ酸をそれぞれ１００ｍｇ／Ｌ添加したＳ５種培地３ｍｌに上記３株を各々植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。
【００５８】
得られた各培養液０．５ｍｌを、スペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌおよびシキミ酸２００ｍｇ／Ｌを添加したＰ１生産培地５ｍｌの入った太型試験管にそれぞれ接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。
各培養液をろ過し、得られたろ液中のリボフラビンの生成量を、逆相カラム〔ＲＰ―１８（メルク社製）〕ＨＰＬＣを用い、発光波長５３０ｎｍおよび励起波長４５０ｎｍにおける蛍光強度を測定することにより、定量した。
結果を第３表に示す。
【００５９】
【表３】
ＴＫＴ６／ｐＦＭ４１株ではＬ２２／ｐＦＭ４１株に比べリボフラビンの蓄積量が２倍以上に向上している。一方、ＲＥＶ３／ｐＦＭ４１株のリボフラビンの蓄積量はＬ２２／ｐＦＭ４１株と同レベルであることから、ＴＫＴ６／ｐＦＭ４１株におけるリボフラビン生産性の向上はトランスケトラーゼの欠損に起因していることは明白である。
【００６０】
実施例６ エシェリヒア コリのトランスケトラーゼ活性低下株によるリボフラビンの製造
トランスケトラーゼの欠損がエシェリヒア コリによるリボフラビンの生産に与える効果を調べるため、エシェリヒア コリ ＥＪ５００株およびそのトランスケトラーゼ変異株ＡＩ８０に、リボフラビンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＦＭ２０１を導入してリボフラビン生産能を付与し、両組換え株のリボフラビンの蓄積量を比較した。
【００６１】
ＡＩ８０株は、ＥＪ５００株（Ｗ３１１０ ｃｆｓ）からＴｎ１０の転移により得られたトランスケトラーゼ変異株で、２つのトランスケトラーゼ遺伝子の内の一方のｔｋｔＡ遺伝子がＴｎ１０の挿入によって破壊されているため、トランスケトラーゼの活性が親株の約３０％に低下している〔A. Iida et al., J. Bacteriol., 175, 5375-5383 (1993)〕。
【００６２】
ｐＦＭ２０１は、ｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターの下流にコリネバクテリウム アンモニアゲネスのリボフラビン生合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されたアンピシリン耐性マーカーを有するプラスミドであり、特開平６―２２５７７６に記載された方法で調製した。
ｐＦＭ２０１のＥＪ５００株およびＡＩ８０株への導入は、通常のエレクトロポレーション法やカルシウム法〔J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕により実施することができ、本実験においてはカルシウム法を用いた。
【００６３】
ｐＦＭ２０１を保有するＥＪ５００株およびＡＩ８０株のリボフラビンの製造は以下のようにして行った。
１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地〔バクトトリプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕３ｍｌに上記２株を各々植菌し、３０℃で１６時間振とう培養した。
【００６４】
得られた各培養液０．１ｍｌを、アンピシリンおよびシキミ酸をそれぞれ１００ｍｇ／Ｌ添加したＰ６生産培地〔グルコース ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、ＮＨ4Ｃｌ １ｇ、ＮａＨＰＯ4 ６ｇ、チアミン塩酸塩 ４ｍｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕５ｍｌの入った太型試験管にそれぞれ接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。
【００６５】
各培養ろ液中のリボフラビンの生成量を実施例５記載の方法に準じて、ＨＰＬＣを用いて定量した。
結果を第４表に示す。
【００６６】
【表４】
ＡＩ８０／ｐＦＭ２０１株ではＥＪ５００／ｐＦＭ２０１株に比べ、リボフラビンの蓄積量が約１．８倍に向上しており、トランスケトラーゼ活性を低下させることによりリボフラビンの生産性が向上することが示された。
【００６７】
【発明の効果】
本発明によれば、トランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた変異株を用いることにより、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物の工業的により有利な製造法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、グルコースからＰＲＰＰまでの代謝経路を示した図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、トランスケトラーゼの活性を欠損、または親株に比べて低下させた変異株を用い、生合成経路上、ホスホリボシルピロリン酸（以下、ＰＲＰＰと略す）から合成される有用物質を発酵法で製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物の代謝経路上、ＰＲＰＰから合成される有用物質としては、プリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオシド、ピリミジンヌクレオシド、プリン塩基、ピリミジン塩基、フラビンヌクレオチド等の核酸関連物質、Ｌ−ヒスチジン、リボフラビン等が知られている。
【０００３】
上記核酸関連物質、Ｌ−ヒスチジン、リボフラビン等は、これまで発酵法、発酵法および合成法を組合わせた方法等を用い、工業的に生産されている〔高尾彰一ら編、応用微生物学、文永堂出版（１９９６）；相田浩ら編、アミノ酸発酵、学会出版センター（１９８６）；特開平６-２２５７７６〕。
微生物において、ＰＲＰＰはペントースリン酸経路の中間体リボース ５−リン酸からＰＲＰＰ合成酵素によって生合成される。
【０００４】
リボース ５−リン酸の生合成経路としては、グルコース ６−リン酸デヒドロゲナーゼ反応経由の酸化的ペントースリン酸経路が知られており、また、トランスケトラーゼ反応経由の非酸化的ペントースリン酸経路上の酵素が全て可逆であることより、該非酸化的ペントースリン酸経路も関与していると考えられている（図１）。
【０００５】
既にエシェリヒアコリではリボース ５−リン酸の生合成に、その両経路が関与していることがラベルしたグルコースの代謝実験によって明らかにされている〔Biochemistry, 12, 10, 1969 (1973)〕。さらに、エシェリヒア コリやコリネバクテリウム グルタミクムにおいて、グルコース ６−リン酸デヒドロゲナーゼを欠損してもリボースの要求性を示さないことから、リボース ５−リン酸はトランスケトラーゼ反応経由の非酸化的ペントースリン酸経路によって供給されることが遺伝的にも示されている〔D. G. Fraenkel and R. T. Vinopal,Ann. Rev. Microbiol., 27, 69-100 (1973); E. D. Ihnen and A. L. Demain, J. Bacteriol., 98, 1151-1158 (1969)〕。
【０００６】
上記知見は、トランスケトラーゼの活性を高めることにより、非酸化的経路からリボース ５−リン酸およびＰＲＰＰへの供給が高まり、ＰＲＰＰから生合成される物質の生成量が向上することを推測させるものである。
また、バチルス サチルス等のバチルス属細菌のイノシン生産菌において、トランスケトラーゼの活性を欠損した株は、リボースを培地中に著量蓄積してしまい、プリンヌクレオチドの生産収率は低下することが報告されている〔K. Sasajima and M. Yoneda, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 2, 175-213 (1984)〕。
【０００７】
上記知見もまた、ＰＲＰＰから生合成される物質の生産にトランスケトラーゼの活性が必要であることを推測させるものである。
これまでに、生物全般にわたり、ＰＲＰＰを経由して生合成されるいかなる代謝産物においても、該生物のトランスケトラーゼ活性を欠損または低下させることにより、これら代謝産物の生産効率を向上させることができるとの知見はない。
【０００８】
ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物、特に、核酸関連物質、Ｌ−ヒスチジン、リボフラビン等は、その需要が増大しており、工業的により有利な製造法を開発することが強く望まれている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物の工業的により有利な製造法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
従来の生産菌の育種は、目的とする代謝産物の生合成に関わる末端生合成経路の代謝増強を主眼として進められ、大きな成功を収めてきた。
本発明者らは、更なる代謝産物の生産性向上には、該末端生合成経路の代謝増強とは別の改変、即ち、出発基質の供給能力やプールを高める中央代謝の改変が必要であると考え、微生物において中央代謝経路を操作することによる、種々の代謝産物へのカーボンフローに対する影響を鋭意検討した。
【００１１】
その結果、ペントースリン酸経路の酵素であるトランスケトラーゼの活性を欠損させるか、または親株に比べて低下させることにより、生合成経路上、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物の生産効率を向上させることができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記、（１）〜（８）に関する。
【００１２】
（１）コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属する微生物のトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させることを特徴とする、該微生物において、代謝経路上、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物の生産を増強させる方法。
（２）増強される代謝産物が、プリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオシド、ピリミジンヌクレオシド、プリン塩基、ピリミジン塩基、フラビンヌクレオチド、Ｌ−ヒスチジン、リボフラビン等である、上記（１）の方法。
【００１３】
（３）微生物が、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＰＨ８、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＦＭ４１、エシェリヒア コリ ＡＩ８０／ｐＦＭ２０１等である、上記（１）の方法。
（４）コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属し、かつトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた微生物を培地に培養し、培養液中に、代謝経路上、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物から選ばれる１もしくは数個の代謝産物を生成蓄積させ、該代謝産物を採取することを特徴とする、該代謝産物の製造方法。
【００１４】
（５）製造される代謝産物が、プリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオシド、ピリミジンヌクレオシド、プリン塩基、ピリミジン塩基、フラビンヌクレオチド、Ｌ−ヒスチジン、リボフラビン等である、上記（４）の方法。
（６）微生物が、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＰＨ８、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＦＭ４１、エシェリヒア コリ ＡＩ８０／ｐＦＭ２０１等である、上記（４）の方法。
【００１５】
（７）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属し、かつトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた微生物。
（８）微生物が、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＰＨ８、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＦＭ４１等である、上記（７）の微生物。
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられる微生物としては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属し、かつトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた菌株であれば、変異株、細胞融合株、形質導入株あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて造成した組換え株のいずれであってもよい。
【００１７】
該微生物として、例えば、トランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた、コリネバクテリウム グルタミクム、コリネバクテリウム アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム ハーキュリス、コリネバクテリウムリリウム、コリネバクテリウム メラセコーラ、ブレビバクテリウム ディバリカツム、ブレビバクテリウム フラブム、ブレビバクテリウム イマリオフィラム、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム チオゲニタリス、エシェリヒアコリ等をあげることができる。
【００１８】
該微生物として、好適には、アミノ酸発酵に用いられている、いわゆるコリネ型グルタミン酸生産菌やエシェリヒアコリ、あるいは核酸発酵やリボフラビン発酵に用いられているコリネバクテリウムアンモニアゲネス等をあげることができる。
本発明の、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属し、かつトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた微生物は、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属する公知の微生物に、トランスケトラーゼの活性を欠損または低下させる変異を、通常の変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法、形質導入法あるいは細胞融合法を用いて付与することにより取得できる。
【００１９】
具体的な例として、以下に記載の方法で本発明の菌株を取得することができる。
本発明の菌株は、シキミ酸要求性かつリボース非資化性を指標として選択することにより取得することができる。
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属する微生物を、通常の変異処理法、例えば紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニンジン（ＮＴＧ）や亜硝酸等の化学処理を施した後、親株では生育可能なグルコースを単一の炭素源として含む最少培地において、生育できないかもしくは生育不良であり、シキミ酸を添加した該最少培地では良好に生育する変異株を分離することにより、シキミ酸要求変異株を取得する。
【００２０】
該シキミ酸要求変異株を、シキミ酸を含有しかつグルコースまたはリボースを単一の炭素源として含む最少培地にそれぞれ塗布し、グルコース培地では生育可能であるが、リボース培地では生育できないかもしくは生育不良である変異株を選択する。該菌株はトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下した変異株である。
以上の方法で、シキミ酸要求性に加えてリボース非資化性を有する、トランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた変異株を取得することができる。
【００２１】
また、トランスケトラーゼをコードする遺伝子をインビトロで破壊したトランスケトラーゼ遺伝子を用いた通常の遺伝子置換法によっても、トランスケトラーゼ変異株を取得することができる。
トランスケトラーゼをコードする遺伝子としては、公知のもの〔G. A. Sprenger, Biochim. Biophys. Acta., 1216, 307 (1993)； A. Iida et al., J. Bacteriol., 175, 5375-5383 (1993)；特開平６―１６９７８５〕を利用することができる。
【００２２】
本発明の菌株は、シキミ酸要求性かつリボース非資化性を指標として選択することにより取得することができるが、トランスケトラーゼの活性が親株に比べて少しでも低下している菌株の中には、必ずしもシキミ酸の要求性やリボースの非資化性を備えてはいないものもある。しかしながら、該菌株も本発明の微生物としてあげることができる。
該微生物は、シキミ酸要求性を示すトランスケトラーゼ変異株から、さらにシキミ酸を全く要求しなくなった復帰変異、シキミ酸の要求量が減少した復帰変異、あるいはリボースの資化性が部分的または完全に回復した復帰変異等を誘導することによって取得することができる。
【００２３】
本発明の微生物は、代謝経路上、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物の生産が増強された微生物である。
上記微生物の具体的な例として、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６等をあげることができる。
更に、上記により取得した、トランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた微生物に、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物から選ばれる、目的とする代謝産物の生産能を向上させる公知の方法、例えば変異手法や組換えＤＮＡ技術を用いて、分解経路や分岐経路を遮断したり、生合成経路上の鍵酵素のフィードバック調節の解除や活性増強を図る方法を用いることにより、目的とする代謝産物をより効率良く製造することのできる菌株を取得することができる。
【００２４】
組換えＤＮＡ技術として、例えば、目的とする代謝産物の生合成遺伝子を含む組換え体プラスミドを宿主に導入することにより、該代謝産物の生産能の向上した菌株を取得することができる。
具体的には、ヒスチジンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミド、例えばｐＰＨ８をトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させたコリネバクテリウム グルタミクムに導入することにより、ヒスチジンを著量生産する株を取得することができる。具体的な菌株として、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＰＨ８等をあげることができる。
【００２５】
リボフラビンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミド、例えばｐＦＭ４１をトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させたコリネバクテリウム グルタミクムに導入することにより、リボフラビンを著量生産する株を取得することができる。具体的な菌株として、コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６／ｐＦＭ４１等をあげることができる。
【００２６】
リボフラビンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミド、例えばｐＦＭ２０１をトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させたエシェリヒア コリに導入することにより、リボフラビンを著量生産する株を取得することができる。具体的な菌株として、エシェリヒア コリ ＡＩ８０／ｐＦＭ２０１等をあげることができる。
【００２７】
変異手法として、例えば、以下に記載した方法を用いることにより、目的とする代謝産物の生産能の向上した菌株を取得することができる。
イノシンの製造ではアデニン要求性でかつプリンアナログの耐性を付与する方法（発酵と工業、Vol.36、No.12 、1036-1048、1978）、イノシン酸の製造ではアデニンおよびグアニン要求性でかつマンガン非感受性を付与する方法〔高尾彰一ら編、応用微生物学、文永堂出版（１９９６）〕、グアノシンの製造ではアデニンおよびヒスチジン要求性でかつメチオニンスルホキシド、サイコフラニンおよびデコイニンの耐性を付与する方法〔高尾彰一ら編、応用微生物学、文永堂出版（１９９６）〕、ウリジンやシチジンなどのピリミジンヌクレオシドの製造ではピリミジンアナログの耐性を付与する方法〔バイオインダストリー, 12, 6, 36-43 (1995）〕、アデニンやウラシルなどの塩基の製造では２-フルオロアデニンなどのプリンアナログの耐性を付与する方法（農芸化学会誌、第48巻、第1号、63-68、1974； 同会誌、第52巻、第3号、129-133、1978）、Ｌ-ヒスチジンの製造では２−チアゾールアラニンや１，２，４−トリアゾールアラニンなどのヒスチジンアナログの耐性を付与する方法〔相田浩ら編、アミノ酸発酵、学会出版センター（１９８６）〕等をあげることができる。
【００２８】
これらの公知の方法を用いてトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた微生物を改良することにより、目的とした代謝産物の生産能の向上した菌株を取得することができる。
本発明の微生物を培地に培養し、培養液中に、代謝経路上、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物から選ばれる１もしくは数個の代謝産物を生成蓄積させ、該代謝産物を採取することにより、該代謝産物を製造することができる。
【００２９】
本発明の微生物の培養は、通常の培養法に従って実施することができる。
使用培地としては、炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミン、その他使用菌株の必要とする微量の栄養素を程よく含有するものならば、合成培地または天然培地のいずれも使用できる。用いる菌株が使用培地で生育にシキミ酸を要求する場合は、培地に少量のシキミ酸を添加すればよい。シキミ酸の代わりに芳香族アミノ酸を少量添加することによっても同様の目的を達成することができる。
【００３０】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、グリセロール、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜等の炭水化物、ポリアルコール類、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸等の各種有機酸が使用できる。さらに微生物の資化性によって、炭化水素、アルコール類等も用いることができる。
窒素源としては、アンモニアまたは塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の各種無機および有機アンモニウム塩類、あるいは尿素および他の窒素含有物質、ならびにペプトン、ＮＺ−アミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたはその消化物等の窒素含有有機物等をあげることができる。
【００３１】
無機物としては、リン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等をあげることができる。
アミノ酸、ビタミンは使用する培地の炭素源、窒素源等によって異なるが、必要に応じ、添加することができる。
【００３２】
培養は、振とう培養または通気攪拌培養等の好気的条件下に行う。培養温度は、一般に２０〜４０℃が好適である。培地のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。培養期間は通常１〜５日間である。
培養液中に生成蓄積された、目的とする代謝産物は以下の方法で採取することができる。
【００３３】
培養終了後、菌体を除去し、濃縮晶析する方法、活性炭処理法、あるいはイオン交換樹脂法等の公知の方法〔遠藤 勲ら、化学工学会（編）「バイオセパレーションプロセス便覧」、共立出版(1996)〕を用いることにより目的とする代謝産物を採取することができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１ コリネバクテリウム グルタミクムのトランスケトラーゼ欠損変異株の取得
コリネバクテリウム グルタミクムＬ２２〔野生株ＡＴＣＣ３１８３３から誘導されたリゾチーム感受性変異株；R. Katsumata et al., Proc. 4th Eur. Congr. Biotechnol., 4, 767 (1987)〕をＮＢ培地〔粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕３ｍｌ中に植菌し、３０℃でＯＤ660が約０．６になるまで培養した。
【００３５】
培養後、遠心分離により集菌し、得られた菌体を５０ｍＭトリスマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で一回洗浄し、ＮＴＧ４００ｍｇ／Ｌを含む同緩衝液３ｍｌ中、室温で２０分間変異処理を行った。
該処理菌体を同緩衝液で２回遠心洗浄後、ＮＢ培地３ｍｌ中、３０℃で１時間培養した。
【００３６】
該培養液を生理食塩水で１０-5〜１０-6に希釈し、得られた希釈液０．１ｍｌをＮＢ寒天培地〔ＮＢ培地に寒天を１．４％含む培地、ｐＨ７．２〕に塗布し、３０℃で２日間培養した。
寒天培地上に生育してきたコロニーを、最少寒天培地Ｍ１〔グルコース １０ｇ、（ＮＨ4）Ｈ2ＰＯ4 １ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ０．２ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．９ｍｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．４ｍｇ、Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ ０．０９ｍｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ０．０４ｍｇ、ビオチン ５０mｇ、ｐ-アミノ安息香酸 ２．５ｍｇ、チアミン塩酸塩 １ｍｇおよび寒天 １６ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕およびシキミ酸５０ｍｇ／Ｌを含むＭ１寒天培地に各々塗布し、培養した。
【００３７】
最少寒天培地Ｍ１では生育せず、シキミ酸５０ｍｇ／Ｌを含むＭ１寒天培地で生育できる株を、シキミ酸要求変異株として分離した。
分離されたシキミ酸要求変異株を、シキミ酸５０ｍｇ／Ｌを含むＭ１寒天培地および該培地中のグルコースをリボースに置き換えた培地に各々塗布し、培養した。
【００３８】
シキミ酸５０ｍｇ／Ｌを含むＭ１寒天培地で生育するが、該培地中のグルコースをリボースに置き換えた培地では生育できない株を、シキミ酸要求性でかつリボース非資化性の変異株として分離した。
分離されたシキミ酸要求性でかつリボース非資化性の変異株を、シキミ酸５０ｍｇ／Ｌを含むＭ１培地で培養後、遠心分離して得た菌体から超音波破砕による公知の方法に従って粗酵素液を調製した〔M. Ikeda and R. Katsumata, Appl. Environ. Microbiol., 58, 781-785 (1992)〕。
【００３９】
該粗酵素液用いて、トランスケトラーゼの活性を以下のようにして測定した。
トリス ５０ｍＭ（ｐＨ７．５）、ＮＡＤＨ ０．２ｍＭ、チアミンピロリン酸０．０１ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １ｍＭ、キシルロース-５−リン酸 ０．５ｍＭ、リブロース-５−リン酸 ０．５ｍＭ、グリセロール-３-リン酸デヒドロゲナーゼおよびトリオースフォスフェートイソメラーゼ混合液（ベーリンガーマンハイム社製）２０mｇを含む反応液に粗酵素液を加えて１．５ｍｌとし、３０℃で反応を行った。
【００４０】
３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの吸光度の減少を測定することにより、生成されるグリセルアルデヒド-３-リン酸量を測定した。
該測定により、分離されたシキミ酸要求性でかつリボース非資化性の変異株より、グリセルアルデヒド-３-リン酸を全く生成しない、トランスケトラーゼ活性を欠損した変異株ＴＫＴ６株を選択した。
【００４１】
コリネバクテリウム グルタミクム ＴＫＴ６株は、ブダペスト条約に基づいて、平成１０年６月３０日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５-８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−６３９９号として寄託されている。
【００４２】
実施例２ シキミ酸非要求性復帰株の分離
ＴＫＴ６株を、ＮＢ培地３ｍｌ中、３０℃で２４時間培養した。
培養後、遠心分離により集菌した。
得られた菌体を生理食塩水で３回遠心洗浄後、生理食塩水に菌濃度が約１０9／ｍｌになるように懸濁した。
【００４３】
該菌懸濁液０．１ｍｌをＭ１寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。
該Ｍ１寒天培地上で生育可能な株をシキミ酸非要求性復帰株として取得した。
シキミ酸非要求性復帰株はいずれも、リボース資化性およびトランスケトラーゼの活性ともに野生型に戻っていた。
該結果は、シキミ酸要求性およびリボース非資化性の両形質がトランスケトラーゼ活性の欠損に起因して生じていることを示している。
上記で取得されたシキミ酸非要求性復帰株（トランスケトラーゼ欠損変異の復帰株）の内の一株をＲＥＶ３と命名した。
【００４４】
実施例３ コリネバクテリウム グルタミクムのトランスケトラーゼ欠損変異株によるアデニンの製造
コリネバクテリウム グルタミクムＬ２２、ＴＫＴ６およびＲＥＶ３のアデニンの製造を以下のように行った。
グルコース１０ｇ／Ｌを添加したＮＢ培地３ｍｌに、上記３株を各々植菌し、３０℃で２０時間培養した。
【００４５】
各培養液０．１ｍｌを、シキミ酸１００ｍｇ／Ｌの入ったＭ１培地５ｍｌを含む太型試験管にそれぞれ接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。
各培養液をろ過し、得られたろ液中のアデニンの生成量を、イオン交換カラム〔Shodex Asahipak GS-320 7E（旭化成社製）〕ＨＰＬＣを用い、波長２５４ｎｍにおける吸収強度を測定することにより求めた。
結果を第１表に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
ＴＫＴ６株から得られたトランスケトラーゼの復帰株ＲＥＶ３では再びアデニンを生産しなくなることから、ＴＫＴ６株におけるアデニンの生成はトランスケトラーゼの欠損に起因していることがわかる。
【００４８】
実施例４ コリネバクテリウム グルタミクムのトランスケトラーゼ欠損変異株によるＬ−ヒスチジンの製造
トランスケトラーゼの欠損がコリネバクテリウム グルタミクムによるヒスチジン生産に与える効果を調べるため、Ｌ２２株、ＴＫＴ６株およびＲＥＶ３株に、ヒスチジンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＰＨ８を導入してヒスチジン生産能を増強し、それら３株のヒスチジンの蓄積量を比較した。
【００４９】
ｐＰＨ８はコリネバクテリウム グルタミクムのプラスミドベクターｐＣＧ１１のＢｇｌＩＩ部位にコリネバクテリウム グルタミクムのヒスチジン生合成に関与する遺伝子を有する約１０．６ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたスペクチノマイシン耐性マーカーを有するプラスミドである。
ｐＰＨ８を有するコリネバクテリウム グルタミクムは米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにコリネバクテリウム グルタミクムＫ３２（ＡＴＣＣ３９２８１）として寄託されている。
【００５０】
ｐＰＨ８は、ＡＴＣＣ３９２８１株から通常のアルカリ溶解法〔J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕によって単離することができる。
ｐＰＨ８のＬ２２株、ＴＫＴ６株およびＲＥＶ３株への導入は、コリネ型細菌で一般的に用いられているプロトプラスト法〔R. Katsumata et al., J. Bacteriol., 159, 306-311 (1984)〕やジーン・パルサー装置（Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA）を用いたエレクトロポレーション法（電圧２．５ｋＶ、電気容量２５mＦ、抵抗２００W）〔J. Sambrook et al., MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕により実施することができ、本実験においてはプロトプラスト法を用いた。
【００５１】
ｐＰＨ８を保有するＬ２２株、ＴＫＴ６株およびＲＥＶ３株を用いたヒスチジンの製造は以下のようにして行った。
スペクチノマイシンおよびシキミ酸をそれぞれ１００ｍｇ／Ｌ添加したＳ５種培地〔グルコース ２０ｇ、ポリペプトン １５ｇ、酵母エキス １５ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、尿素 １ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕３ｍｌに上記３株を各々植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。
【００５２】
得られた各培養液０．５ｍｌを、スペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌおよびシキミ酸２００ｍｇ／Ｌを添加したＰ１生産培地〔グルコース ６０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２０ｇ、コーン スチープ リカー ５ｇ、ＭｎＳＯ4 １０ｍｇ、ビオチン ３０mｇ、ＣａＣＯ3 ２０ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕５ｍｌの入った太型試験管にそれぞれ接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。
【００５３】
各培養液をろ過し、得られたろ液中のＬ-ヒスチジンの生成量を、ＨＰＬＣを用いたＯＰＡポストカラム誘導体化法〔Anal. Chem., 51, 1338 (1979)〕により定量した。
結果を第２表に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
実施例５ コリネバクテリウム グルタミクムのトランスケトラーゼ欠損変異株によるリボフラビンの製造
トランスケトラーゼの欠損がコリネバクテリウム グルタミクムによるリボフラビン生産に与える効果を調べるため、Ｌ２２株、ＴＫＴ６株およびＲＥＶ３株に、リボフラビンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＦＭ４１を導入してリボフラビン生産能を増強し、それら３株のリボフラビンの蓄積量を比較した。
【００５６】
ｐＦＭ４１はコリネバクテリウム グルタミクムのプラスミドベクターｐＣＧ１１のＢｇｌＩＩ部位にコリネバクテリウム アンモニアゲネスのリボフラビン生合成に関与する遺伝子を有する約４．２ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたスペクチノマイシン耐性マーカーを有するプラスミドである。
ｐＦＭ４１を有するコリネバクテリウム アンモニアゲネスは工業技術院微生物工業技術研究所に、コリネバクテリウム アンモニアゲネスＦＭ４１（ＦＥＲＭＢＰ−４００３）として寄託されている。
【００５７】
ＦＭ４１株からのｐＦＭ４１の単離および、ｐＦＭ４１のＬ２２株、ＴＫＴ６株およびＲＥＶ３株への導入は、実施例４記載の方法に準じて実施した。
ｐＦＭ４１を保有するＬ２２株、ＴＫＴ６株およびＲＥＶ３株を用いたリボフラビンの製造は以下のようにして行った。
スペクチノマイシンおよびシキミ酸をそれぞれ１００ｍｇ／Ｌ添加したＳ５種培地３ｍｌに上記３株を各々植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。
【００５８】
得られた各培養液０．５ｍｌを、スペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌおよびシキミ酸２００ｍｇ／Ｌを添加したＰ１生産培地５ｍｌの入った太型試験管にそれぞれ接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。
各培養液をろ過し、得られたろ液中のリボフラビンの生成量を、逆相カラム〔ＲＰ―１８（メルク社製）〕ＨＰＬＣを用い、発光波長５３０ｎｍおよび励起波長４５０ｎｍにおける蛍光強度を測定することにより、定量した。
結果を第３表に示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
実施例６ エシェリヒア コリのトランスケトラーゼ活性低下株によるリボフラビンの製造
トランスケトラーゼの欠損がエシェリヒア コリによるリボフラビンの生産に与える効果を調べるため、エシェリヒア コリ ＥＪ５００株およびそのトランスケトラーゼ変異株ＡＩ８０に、リボフラビンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＦＭ２０１を導入してリボフラビン生産能を付与し、両組換え株のリボフラビンの蓄積量を比較した。
【００６１】
ＡＩ８０株は、ＥＪ５００株（Ｗ３１１０ ｃｆｓ）からＴｎ１０の転移により得られたトランスケトラーゼ変異株で、２つのトランスケトラーゼ遺伝子の内の一方のｔｋｔＡ遺伝子がＴｎ１０の挿入によって破壊されているため、トランスケトラーゼの活性が親株の約３０％に低下している〔A. Iida et al., J. Bacteriol., 175, 5375-5383 (1993)〕。
【００６２】
ｐＦＭ２０１は、ｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターの下流にコリネバクテリウム アンモニアゲネスのリボフラビン生合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されたアンピシリン耐性マーカーを有するプラスミドであり、特開平６―２２５７７６に記載された方法で調製した。
ｐＦＭ２０１のＥＪ５００株およびＡＩ８０株への導入は、通常のエレクトロポレーション法やカルシウム法〔J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕により実施することができ、本実験においてはカルシウム法を用いた。
【００６３】
ｐＦＭ２０１を保有するＥＪ５００株およびＡＩ８０株のリボフラビンの製造は以下のようにして行った。
１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地〔バクトトリプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕３ｍｌに上記２株を各々植菌し、３０℃で１６時間振とう培養した。
【００６４】
得られた各培養液０．１ｍｌを、アンピシリンおよびシキミ酸をそれぞれ１００ｍｇ／Ｌ添加したＰ６生産培地〔グルコース ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、ＮＨ4Ｃｌ １ｇ、ＮａＨＰＯ4 ６ｇ、チアミン塩酸塩 ４ｍｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕５ｍｌの入った太型試験管にそれぞれ接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。
【００６５】
各培養ろ液中のリボフラビンの生成量を実施例５記載の方法に準じて、ＨＰＬＣを用いて定量した。
結果を第４表に示す。
【００６６】
【表４】
【００６７】
【発明の効果】
本発明によれば、トランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた変異株を用いることにより、ＰＲＰＰを経由して生合成される代謝産物の工業的により有利な製造法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、グルコースからＰＲＰＰまでの代謝経路を示した図である。
Claims (5)
- コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属し、かつアデニン、Ｌ−ヒスチジンまたはリボフラビンの生産能を有する微生物のトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させることを特徴とする、アデニン、Ｌ−ヒスチジンまたはリボフラビンの生産を増強させる方法。
- コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属し、アデニン、Ｌ−ヒスチジンまたはリボフラビンの生産能を有し、かつトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた微生物を培地に培養し、培養液中に、アデニン、Ｌ−ヒスチジンまたはリボフラビンを生成蓄積させ、採取することを特徴とする、アデニン、Ｌ−ヒスチジンまたはリボフラビンの製造方法。
- 微生物が、コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９９、又はコリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９９にコリネバクテリウム アンモニアゲネス ＦＥＲＭ ＢＰ−４００３が保有する組換え体プラスミドを導入して得られる微生物である、請求項１または２記載の方法。
- コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９９。
- コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ ＢＰ−６３９９にコリネバクテリウム アンモニアゲネス ＦＥＲＭ ＢＰ−４００３が保有する組換え体プラスミドを導入して得られる微生物。
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