JP2021521795A - 発酵によってヒスタミンを生産するための改変された生合成経路 - Google Patents

Abstract

本開示は、ヒスタミンを発酵生産するための微生物細胞の改変を記載し、新規な改変された微生物細胞及び培養物、並びに関連するヒスタミンの生産方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、2018年4月20日に出願された米国特許仮出願第62/660,875号の利益を主張するものである。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の下でなされた発明に対する権利に関する記載
本発明は、DARPAによって付与された契約番号第HR0011-15-9-0014号の下で、政府支援を伴ってなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。

参照による配列表の組み込み
本出願は配列表を含み、この配列表は、ASCIIフォーマットで電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。2019年4月17日に作成されたこのASCIIコピーは、ZMGNP011WO_Seq_List_ST25.txtという名称であり、312,107バイトのサイズである。

本開示の分野
本開示は全体として、発酵によってヒスタミンを生産するために微生物を改変する(engineering)分野に関する。

生体アミンは、生物学的活性を有する有機塩基であり、これは、発酵食品及び発酵飲料で多く見られる。ヒスタミンは、ヨーグルト(13〜36mg/kg)[1]、味噌(24mg/kg)[2]、及び赤ワイン(24mg/L)[3]等の発酵食品において本質的に存在することが知られている。ヒト消化管で生存する一部の細菌もまたヒスタミンを作り、ヒスタミンは、抗炎症効果によって免疫系を調節するように機能する[4]。発酵食品におけるヒスタミンの生産は、ヒスチジンを含有するタンパク質源及びヒスチジンデカルボキシラーゼを含有する微生物に依存する。ヒスタミンは、酵素ヒスチジンデカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.22)によって特異的に触媒されるヒスチジンの脱炭酸生成物である。単純な非タンパク質の炭素源及び窒素源からの産業用発酵でのヒスタミンの生産は、アミノ酸前駆体であるヒスチジンの生合成が向上した経路の組み立て及び高度に活性なヒスチジンデカルボキシラーゼを要する。

米国特許出願公開第2011/0045563号 米国特許第7,659,097号 米国特許出願公開第2010/0297749号 米国特許出願公開第2009/0282545号 国際公開第WO2011/034863号 米国特許出願公開第2014/0068797号 米国特許出願公開第2014-0315985号 米国特許出願公開第2009/0203102号 米国特許出願公開第2010/0048964号 米国特許出願公開第2010/0003716号 国際公開第WO 2009/076676号 国際公開第WO 2010/003007号 国際公開第WO 2009/132220号 国際公開第WO 2004/033646号

Bacillus subtilisの公益財団法人かずさDNA研究所コドン表:www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=1423&aa=1&style=N Yarrowia lipolyticaの公益財団法人かずさDNA研究所コドン表:www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4952&aa=1&style=N Corynebacteria glutamicumの公益財団法人かずさDNA研究所のコドン表:www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=340322&aa=1&style=N Saccharomyces cerevisiaeの公益財団法人かずさDNA研究所のコドン表:http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4932&aa=1&style=N Berka & Barnett、Biotechnology Advances、(1989)、7(2):127〜154 Romanosら、Yeast、(1992)8(6):423〜488 Saunders & Warmbrodt、「Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast」(1993)、National Agricultural Library、Beltsville、Md. Lindbergら、MetaB. Eng.、(2010)12(1):70〜79 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第4版(Sambrookら、2012) 「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait編、1984) 「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications」(R. I. Freshney編、第6版、2010) 「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.) 「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら編、1987及び定期更新) 「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullisら編、1994) Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology、第2版、J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994) Goeddel、Gene Expression Technology: Methods In Enzymology 185、Academic Press、San Diego、Calif. (1990) Jinek Mら、「A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity」、Science 337:816〜21、2012 「In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9」、Nature 520(7546):186〜91、2015年4月9日 Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardtら編、American Society for Microbiology、Washington、D.C. (1994) Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology、第2版(1989) Sinauer Associates, Inc.、Sunderland、Mass

本開示は、以下を含む、ヒスタミンを生産するための、改変された(engineered)微生物細胞、当該微生物細胞の培養物、及び方法を含む。

実施形態1:非天然の(non-native)ヒスチジンデカルボキシラーゼを発現する改変された微生物細胞であって、ヒスタミンを生産する、改変された微生物細胞。

実施形態2:1つ又は複数の上流ヒスタミン経路酵素の増大した活性を含み、前記増大した活性が、コントロール細胞と比較して増大している、実施形態1に記載の改変された微生物細胞。

実施形態3:1つ又は複数の上流ヒスタミン経路酵素が、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリボシル-ATPピロホスファターゼ、ホスホリボシル-AMPシクロヒドロラーゼ、5'ProFARイソメラーゼ、イミダゾール-グリセロールリン酸シンターゼ、イミダゾール-グリセロールリン酸デヒドラターゼ、ヒスチジノール-リン酸アミノトランスフェラーゼ、ヒスチジノール-リン酸ホスファターゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、及びリボースリン酸ピロホスホキナーゼからなる群から選択される、実施形態2に記載の改変された微生物細胞。

実施形態4:1つ又は複数のヒスタミン経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素の低減した活性を含み、前記低減した活性が、コントロール細胞と比較して低減している、実施形態1から3のいずれか一つに記載の改変された微生物細胞。

実施形態5:1つ又は複数のヒスタミン経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素が、エノラーゼ、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、ペントースリン酸経路糖イソメラーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、リブロース-5-リン酸エピメラーゼ、及びリブロース-5-リン酸イソメラーゼからなる群から選択される、実施形態4に記載の改変された微生物細胞。

実施形態6:低減した活性が、前記1つ又は複数の酵素の遺伝子の天然の(native)プロモーターをあまり活性でないプロモーターで置き換えることによって達成される、実施形態4又は実施形態5に記載の改変された微生物細胞。

実施形態7:フィードバックが緩和された (feedback-deregulated)グルコース-6リン酸デヒドロゲナーゼ又はフィードバックが緩和されたATPホスホリボシルトランスフェラーゼを更に発現する、実施形態1から6のいずれか一つに記載の改変された微生物細胞。

実施形態8:非天然のヒスチジンデカルボキシラーゼを発現させるための手段を含み、ヒスタミンを生産する、改変された微生物細胞。

実施形態9:改変された微生物細胞が、1つ又は複数の上流ヒスタミン経路酵素の活性を増大させるための手段を含み、前記増大した活性が、コントロール細胞と比較して増大している、実施形態8に記載の改変された微生物細胞。

実施形態10: 1つ又は複数の上流ヒスタミン経路酵素が、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリボシル-ATPピロホスファターゼ、ホスホリボシル-AMPシクロヒドロラーゼ、5'ProFARイソメラーゼ、イミダゾール-グリセロールリン酸シンターゼ、イミダゾール-グリセロールリン酸デヒドラターゼ、ヒスチジノール-リン酸アミノトランスフェラーゼ、ヒスチジノール-リン酸ホスファターゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、及びリボースリン酸ピロホスホキナーゼからなる群から選択される、実施形態9に記載の改変された微生物細胞。

実施形態11:改変された微生物細胞が、1つ又は複数のヒスタミン経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素の活性を低減させるための手段を含み、前記低減した活性が、コントロール細胞と比較して低減している、実施形態8から10のいずれか一つに記載の改変された微生物細胞。

実施形態12:1つ又は複数のヒスタミン経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素が、エノラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ペントースリン酸経路糖イソメラーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース-5-リン酸エピメラーゼ、及びリブロース-5-リン酸イソメラーゼからなる群から選択される、実施形態11に記載の改変された微生物細胞。

実施形態13:低減した活性が、前記1つ又は複数の酵素の遺伝子の天然のプロモーターをあまり活性でないプロモーターで置き換えるための手段によって達成される、実施形態11又は実施形態12に記載の改変された微生物細胞。

実施形態14:グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ又はフィードバックが緩和されたATPホスホリボシルトランスフェラーゼを発現するための手段を更に含む、実施形態8から13のいずれか一つに記載の改変された微生物細胞。

実施形態15:真菌細胞を含む、実施形態1から14のいずれか一つに記載の改変された微生物細胞。

実施形態16:酵母細胞を含む、実施形態15に記載の改変された微生物細胞。

実施形態17:酵母細胞が、Saccharomyces属又はYarrowia属の細胞である、実施形態16に記載の改変された微生物細胞。

実施形態18:酵母細胞が、Saccharomyces属及びcerevisiae種の細胞である、実施形態17に記載の改変された微生物細胞。

実施形態19:酵母細胞が、Yarrowia属及びlipolytica種の細胞である、実施形態17に記載の改変された微生物細胞。

実施形態20:非天然のヒスチジンデカルボキシラーゼが、Chromobacterium sp. LK1又はAcinetobacter baumannii株AB0057由来のヒスチジンデカルボキシラーゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するヒスチジンデカルボキシラーゼを含む、実施形態1から19のいずれか一つに記載の改変された微生物細胞。

実施形態21:改変された微生物細胞が、1つ又は複数の上流ヒスタミン経路酵素の増大した活性を含み、前記増大した活性が、コントロール細胞と比較して増大しており、1つ又は複数の上流ヒスタミン経路酵素が、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼを含む、実施形態1及び16から20のいずれか一つに記載の改変された微生物細胞。

実施形態22:ATPホスホリボシルトランスフェラーゼの増大した活性が、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼの異種発現によって達成される、実施形態21に記載の改変された微生物細胞。

実施形態23:異種ATPホスホリボシルトランスフェラーゼが、S. cerevisiae由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態22に記載の改変された微生物細胞。

実施形態24:Corynebacterium glutamicumのATPホスホリボシルトランスフェラーゼのフィードバックが緩和されたバリアントを含む、実施形態16から23のいずれか一つに記載の改変された微生物細胞。

実施形態25:細菌細胞である、実施形態1から14のいずれか一つに記載の改変された微生物細胞。

実施形態26:細菌細胞が、Corynebacteria属又はBacillus属の細胞である、実施形態25に記載の改変された微生物細胞。

実施形態27:細菌細胞が、Corynebacteria属及びglutamicum種の細胞である、実施形態26に記載の改変された微生物細胞。

実施形態28:細菌細胞が、Bacillus属及びsubtilisの細胞である、実施形態26に記載の改変された微生物細胞。

実施形態29:非天然のヒスチジンデカルボキシラーゼが、Acinetobacter baumannii又はLactobacillus sp.(株30a)由来のヒスチジンデカルボキシラーゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するヒスチジンデカルボキシラーゼを含む、実施形態25から28のいずれか一つに記載の改変された微生物細胞。

実施形態30:改変された微生物細胞が、1つ又は複数の上流ヒスタミン経路酵素の増大した活性を含み、前記増大した活性が、コントロール細胞と比較して増大しており、1つ又は複数の上流ヒスタミン経路酵素が、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ及びイミダゾール-グリセロールリン酸デヒドラターゼを含む、実施形態1及び25から29のいずれか一つに記載の改変された微生物細胞。

実施形態31:ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ又はイミダゾール-グリセロールリン酸デヒドラターゼの増大した活性が、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ又はイミダゾール-グリセロールリン酸デヒドラターゼの異種発現によって達成される、実施形態30に記載の改変された微生物細胞。

実施形態32:異種ATPホスホリボシルトランスフェラーゼが、Saccharomyces cerevisiae S288c若しくはSalmonella typhimurium LT2由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有する、又は、異種イミダゾール-グリセロールリン酸デヒドラターゼが、Corynebacterium glutamicum由来のイミダゾール-グリセロールリン酸デヒドラターゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態31に記載の改変された微生物細胞。

実施形態33:Salmonella typhimuriumのATPホスホリボシルトランスフェラーゼのフィードバックが緩和されたバリアントを含む、実施形態25から32のいずれか一つに記載の改変された微生物細胞。

実施形態34:培養されると、培養培地1L当たり少なくとも20mgのレベルでヒスタミンを生産する、実施形態1から33のいずれか一つに記載の改変された微生物細胞。

実施形態35:培養されると、培養培地1L当たり少なくとも300mgのレベルでヒスタミンを生産する、実施形態34に記載の改変された微生物細胞。

実施形態36:実施形態1から35のいずれか一つに記載の改変された微生物細胞の培養物。

実施形態37:改変された微生物細胞が、培養物が600nmで10〜500の光学密度を有するような濃度で存在する、実施形態36に記載の培養物。

実施形態38:ヒスタミンを含む、実施形態36又は37に記載の培養物。

実施形態39:培養培地1L当たり少なくとも20mgのレベルでヒスタミンを含む、実施形態36から38のいずれか一つに記載の培養物。

実施形態40:ヒスタミンを生産するために適した条件下で細胞を培養する工程を含む、実施形態1から35のいずれか一項に記載の改変された微生物細胞を培養する方法。

実施形態41:最初のグルコースレベルが1〜100g/Lの範囲であり、その後に制御された糖添加が行われる、フェドバッチ培養を含む、実施形態40に記載の方法。

実施形態42:発酵基質が、グルコース、並びに、尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される窒素源を含む、実施形態40又は41に記載の方法。

実施形態43:培養物が培養の間にpH制御されている、実施形態40から42のいずれか一つに記載の方法。

実施形態44:培養物が培養の間に通気されている、実施形態40から43のいずれか一つに記載の方法。

実施形態45:改変された微生物細胞が、培養培地1L当たり少なくとも20mgのレベルでヒスタミンを生産する、実施形態40から44のいずれか一つに記載の方法。

実施形態46:ヒスタミンを培養物から回収する工程を更に含む、実施形態40から45のいずれか一つに記載の方法。

実施形態47:ヒスタミンを生産するように改変された微生物細胞を使用してヒスタミンを調製するための方法であって、(a)非天然のヒスチジンデカルボキシラーゼを微生物細胞において発現させる工程、(b)微生物細胞を、適切な培養培地において、微生物細胞によるヒスタミンの生産を可能にする条件下で培養する工程であって、ヒスタミンが培養培地に放出される工程、及びヒスタミンを培養培地から単離する工程を含む、方法。

ヒスタミンの生合成経路を示す図である。 1ラウンド目の改変をされた宿主であるCorynebacteria glutamicumによる発酵の後の、細胞外培養液において測定されたヒスタミンの力価を示す図である。(実施例1、Table 1(表2)も参照されたい。) 1ラウンド目の改変をされた宿主であるSaccharomyces cerevisiaeによる発酵の後の、細胞外培養液において測定されたヒスタミンの力価を示す図である。(実施例1、Table 1(表2)も参照されたい。) 2ラウンド目の改変をされた宿主であるCorynebacteria glutamicumによる発酵の後の、細胞外培養液において測定されたヒスタミンの力価を示す図である。(実施例1、Table 2(表3)も参照されたい。) 2ラウンド目の改変をされた宿主であるSaccharomyces cerevisiaeによる発酵の後の、細胞外培養液において測定されたヒスタミンの力価を示す図である。(実施例1、Table 2(表3)も参照されたい。) 1ラウンド目の改変をされた宿主であるYarrowia lipolyticaによる発酵の後の、細胞外培養液において測定されたヒスタミンの力価を示す図である。(実施例2、Table 4(表9)も参照されたい。) 1ラウンド目の改変をされた宿主であるBacillus subtilisによる発酵の後の、細胞外培養液において測定されたヒスタミンの力価を示す図である。 宿主評価改変を発現するSaccharomyces cerevisiaeの発酵の後の、細胞外培養液において測定されたヒスタミン酸の力価を示す図である。 宿主評価改変を発現するCorynebacteria glutamicumの発酵の後の、細胞外培養液において測定されたヒスタミン酸の力価を示す図である。 3ラウンド目の改変をされた宿主であるSaccharomyces cerevisiaeによる発酵の後の、細胞外培養液において測定されたヒスタミンの力価を示す図である(改良ラウンド)。 Saccharomyces cerevisiae及びYarrowia lipolyticaへのプロモーター-遺伝子-ターミネーターの組み込みを示す図である。 Saccharomyces cerevisiae及びYarrowia lipolyticaにおけるプロモーターの置き換えを示す図である。 Saccharomyces cerevisiae及びYarrowia lipolyticaにおける標的遺伝子の欠失を示す図である。 Corynebacteria glutamicum及びBacillus subtilisへのプロモーター-遺伝子-ターミネーターの組み込みを示す図である。

本開示は、それぞれグルコース及び尿素等の単純な炭素源及び窒素源から微生物宿主による発酵を介して低分子であるヒスタミンを生産するための方法を記載する。この目的は、非天然の代謝経路を、大規模な化学的生成物の産業用発酵のための適切な微生物宿主に導入することによって達成され得る。例示的な宿主としては、Saccharomyces cerevisiae、Yarrowia lipolytica、Corynebacteria glutamicum、及びBacillus subtilisが含まれる。改変された代謝経路は、宿主の中心代謝を非天然の経路に連結して、ヒスタミンの生産を可能にする。このアプローチの最も単純な実施形態は、ヒスチジンを生産し得る微生物宿主株における、酵素、すなわち、非天然のヒスチジンデカルボキシラーゼ酵素の発現である。鍵となる上流経路酵素であるATPホスホリボシルトランスフェラーゼの過剰発現及び突然変異を介する微生物宿主の中心代謝の変更による代謝経路の更なる改変によって、505mg/Lのヒスタミン力価の達成が可能となった。

以下の開示は、単純な炭素源及び窒素源からヒスタミンの産業的に実現可能な力価を得るための必要な特徴を有する微生物を改変する方法を説明する。活性なヒスチジンデカルボキシラーゼが同定されており、フィードバックが緩和されたATPホスホリボシルトランスフェラーゼ、及び/又は天然のATPホスホリボシルトランスフェラーゼの構成的発現が、発酵によるヒスチジンの力価を向上させることが分かっている。

定義
特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、別段の特定がない限り、以下で示す通りに定義される。

用語「発酵」は、微生物細胞が何らかの化学変換工程を必要とすることなく1つ又は複数の生物学的変換工程によって1つ又は複数の基質を所望の生成物(ヒスタミン等)に変換するプロセスを指すために、本明細書において使用される。

用語「改変された(engineered)」は、細胞に関して、細胞が、改変された細胞を天然の細胞から区別する、人によって導入された少なくとも1つの標的化された遺伝子改変を含むことを示すために、本明細書において使用される。

用語「天然の(native)」は、特定の細胞内に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチド等の細胞成分を指すために、本明細書において使用される。天然のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、細胞に対して内因性である。

ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して使用する場合、用語「非天然の(non-native)」は、特定の細胞内に天然に存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。

遺伝子が発現する環境に関して使用される場合、用語「非天然の」は、遺伝子環境及び細胞環境以外の、遺伝子が天然に発現する任意の環境において発現する遺伝子を指す。非天然の様式で発現した遺伝子は、宿主細胞における対応する遺伝子と同一のヌクレオチド配列を有し得るが、ベクターから、又は天然の遺伝子の遺伝子座と異なるゲノム内の組み込み点から発現し得る。

用語「異種の」は、宿主細胞に導入されるポリヌクレオチド又はポリペプチドを記載するために、本明細書において使用される。この用語は、宿主細胞のものとは異なる生物、種、又は株にそれぞれ由来するポリヌクレオチド又はポリペプチドを包含する。このケースにおいて、異種ポリヌクレオチド又は異種ポリペプチドは、同一の宿主細胞で見られる任意の配列と異なる配列を有する。しかし、この用語はまた、宿主細胞で見られる配列と同一の配列を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドであって、天然の配列と異なる環境で存在する(例えば、異種ポリヌクレオチドは、異なるプロモーターに連結していてよく、また、天然の配列のものとは異なるゲノム位置に挿入されてよい)ポリヌクレオチド又はポリペプチドも包含する。「異種発現」は、したがって、宿主細胞にとって非天然の配列の発現、及び、非天然の環境における、宿主細胞にとって天然の配列の発現を包含する。

ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して使用される場合、用語「野生型」は、分子の由来源に関わらず、天然の生物に由来するポリヌクレオチド又はポリペプチド内に存在する、ヌクレオチド配列を有する任意のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドを指す。すなわち、用語「野生型」は、分子が天然の由来源から精製されているか、組換えによって発現し、その後精製されているか、又は合成されているかに関わらず、配列の特徴を指す。用語「野生型」は、天然の細胞を指すためにも使用される。

「コントロール細胞」は、試験対象の改変された細胞に別のところでは同一であるが、例えば、改変された細胞と同一の属及び種に属するが、改変された細胞において試験される特定の遺伝子修飾を欠いている、細胞である。

酵素は、本明細書において、それらが触媒する反応によって同定され、そして、別段の指示がない限り、同定される反応を触媒し得る任意のポリペプチドを指す。別段の指示がない限り、酵素は、任意の生物に由来し得、天然の又は突然変異したアミノ酸配列を有し得る。周知のように、酵素は、それが由来する元である由来源生物に時として応じて、複数の機能及び/又は複数の名称を有し得る。本明細書において使用される酵素名は、1つ又は複数の更なる機能又は異なる名称を有し得る酵素を含むオルソログを包含する。

用語「フィードバックが緩和された (feedback-deregulated)」は、特定の細胞における酵素経路の下流の生成物によって通常は負の調節をされる(すなわち、フィードバック阻害)酵素に関して、本明細書において使用される。この文脈において、「フィードバックが緩和された」酵素は、細胞に対して天然のネイティブ酵素よりもフィードバック阻害に対して感受性が低い酵素の形態である。フィードバックが緩和された酵素は、1つ又は複数の突然変異を天然の酵素に導入することによって生産することができる。或いは、フィードバックが緩和された酵素は、単純に、特定の微生物細胞に導入されると天然のネイティブ酵素ほどにはフィードバック阻害に対して感受性ではない、異種のネイティブ酵素であり得る。一部の実施形態において、フィードバックが緩和された酵素は、微生物細胞においてフィードバック阻害を示さない。

用語「ヒスタミン」は、2-(1I-イミダゾール-4-イル)エタンアミン(CAS# 51-45-6)を指す。

2つ以上のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の文脈における用語「配列同一性」は、配列比較アルゴリズムを使用して又は目視検査によって測定した場合に、同一であるか、又は、最大の対応となるように比較及びアラインされた場合に特定のパーセンテージの同一のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する、2つ以上の配列を指す。

ヌクレオチド又はアミノ酸配列の同一性のパーセントを判定するための配列の比較では、典型的には、一方の配列は「参照配列」として機能し、それに対して「試験」配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピューターにインプットし、部分配列座標を必要に応じて指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。配列比較アルゴリズムは次いで、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列の配列同一性パーセントを計算する。比較のための配列のアラインメントは、デフォルトパラメーターに設定されたBLASTを使用して行うことができる。

用語「力価」は、本明細書において使用される場合、微生物細胞の培養物によって生産された生成物(例えば、ヒスタミン)の質量を培養物の容積で割ったものを指す。

細胞培養物からのヒスタミンの回収に関して本明細書において使用される場合、「回収すること」は、ヒスタミンを細胞培養培地の少なくとも1つの他の成分から分離することを指す。

ヒスタミンを生産するための微生物の改変
ヒスタミンの生合成経路
ヒスタミンは、アミノ酸であるヒスチジンに典型的には由来する。ヒスタミン生合成経路を図1に示す。アミノ酸生合成経路の第1の酵素であるATPホスホリボシルトランスフェラーゼは、ヒスチジンによるフィードバック阻害を受ける。ヒスタミンの生産は、Saccharomyces cerevisiae宿主、Yarrowia lipolytica宿主、Corynebacteria glutamicum宿主、及びBacillus subtilis宿主において、ヒスチジンデカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.22)によって触媒される、単一の非天然の酵素工程を加えることによって可能となる。

微生物のヒスタミン生産の改変
改変される微生物細胞において活性な任意のヒスチジンデカルボキシラーゼを、典型的には、標準的な遺伝子改変技術を使用して酵素をコードする遺伝子を導入し、発現させることによって、細胞に導入することができる。適切なヒスチジンデカルボキシラーゼは、植物由来源、古細菌由来源、真菌由来源、グラム陽性細菌由来源、及びグラム陰性細菌由来源を含む、任意の由来源に由来し得る。典型的な由来源としては、限定はしないが、Aeromonas salmonicida subsp. pectinolytica 34mel、Acinetobacter baumannii(株AB0057)、Chromobacterium haemolyticum、Chromobacterium sp. LK1、Citrobacter pasteurii、Drosophila melanogaster、Lactobacillus aviarius DSM 20655、Lactobacillus fructivorans、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus sp.(株30a)、Methanosarcina barkeri(株Fusaro/DSM 804)、Methanosarcina barkeri str. Wiesmoor、Morganella psychrotolerans、Mus musculus、Oenococcus oeni(Leuconostoc oenos)、Pseudomonas putida(Arthrobacter siderocapsulatus)、Pseudomonas rhizosphaerae、Pseudomonas sp. bs2935、Solanum lycopersicum、Oryza sativa、Penicillium marneffei、Streptomyces hygroscopicus、Pseudomonas putida、Arabidopsis thaliana(シロイヌナズナ)、Glycine soja(野生ダイズ)、Solanum lycopersicum(トマト)(Lycopersicon esculentum)、Clostridium perfringens、Lactobacillus buchneri、Drosophila melanogaster(ミバエ)、Morganella morganii(Proteus morganii)、E. coli、Bos taurus(ウシ)、Raoultella planticola(Klebsiella planticola)、Acinetobacter baumannii、Acinetobacter haemolyticus、Photobacterium damselae、Tetragenococcus muriaticus、Moritella sp JT01、Streptococcus thermophilus、Enterobacter aerogenes、Citrobacter youngae、Raoultella omithinolytica、及びRaoultella planticolaが含まれる。

ヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子の1つ又は複数のコピーを、選択された微生物宿主細胞に導入することができる。遺伝子の2つ以上のコピーが導入される場合、これらのコピーは、同一の又は異なるヌクレオチド配列を有し得る。一部の実施形態において、異種遺伝子の一方又は両方が、強力な構成的プロモーターから発現される。一部の実施形態において、異種ヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子が、誘導性プロモーターから発現される。異種遺伝子は、場合によって、選択された微生物宿主細胞における発現を増強させるためにコドン最適化されてよい。実施例において使用する宿主についての例示的なコドン最適化の表は、以下の通りである:Bacillus subtilisの公益財団法人かずさDNA研究所コドン表:www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=1423&aa=1&style=N、Yarrowia lipolyticaの公益財団法人かずさDNA研究所コドン表:www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4952&aa=1&style=N、Corynebacteria glutamicumの公益財団法人かずさDNA研究所のコドン表:www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=340322&aa=1&style=N; Saccharomyces cerevisiaeの公益財団法人かずさDNA研究所のコドン表:http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4932&aa=1&style=N。以下で再現される、S. cerevisiae及びC. glutamicumのための、修正された、組み合わされたコドン使用頻度スキームも使用した。

上流酵素活性の増大
ヒスタミンの生産が可能な微生物細胞におけるヒスタミンの生産を増大させるための1つのアプローチは、ヒスタミンの生合成経路における1つ又は複数の上流酵素の活性を増大させることである。上流経路酵素は、原料から天然の最終代謝産物(以下の実施例において記載される例示的な微生物細胞においては、ヒスチジン)までの変換に関与する全ての酵素を含む。このような酵素としては、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリボシル-ATPピロホスファターゼ、ホスホリボシル-AMPシクロヒドロラーゼ、5'ProFARイソメラーゼ、イミダゾール-グリセロールリン酸シンターゼ、イミダゾール-グリセロールリン酸デヒドラターゼ、ヒスチジノール-リン酸アミノトランスフェラーゼ、ヒスチジノール-リン酸ホスファターゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、及びリボースリン酸ピロホスホキナーゼが含まれる。これらの酵素をコードする適切な上流経路遺伝子は、例えば、ヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子の由来源として上記で論じられたものを含む、任意の由来源に由来し得る。

一部の実施形態において、1つ又は複数の上流経路酵素の活性は、天然の酵素の発現又は活性を調節することによって増大する。例えば、このような酵素の発現又は活性の天然の調節因子は、適切な酵素の活性を増大させるために利用することができる。

或いは、又は更に、1つ又は複数のプロモーターを、例えば図12で示すもののような技術を使用して、天然のプロモーターについて置換することができる。ある特定の実施形態において、置き換えプロモーターは、天然のプロモーターよりも強力であり、及び/又は構成的プロモーターである。

一部の実施形態において、1つ又は複数の上流経路酵素の活性は、対応する遺伝子の1つ又は複数を、ヒスチジンデカルボキシラーゼを発現する微生物宿主細胞に導入することによって、補われる。導入された上流経路遺伝子は、宿主細胞の生物以外の生物に由来し得るか、又は単に天然の遺伝子の更なるコピーであり得る。一部の実施形態において、1つ又は複数のこのような遺伝子は、ヒスタミンの生産が可能な微生物宿主細胞に導入されており、強力な構成的プロモーターから発現され、及び/又は、場合によって、選択された微生物宿主細胞における発現を増強させるためにコドン最適化され得る。

実施例1は、Acinetobacter baumannii(配列番号1)由来の異種ヒスタミンデカルボキシラーゼを発現させるため、及び異種のC. glutamicum由来のイミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼ(配列番号2)を構成的に発現させるための、C. glutamicumの成功裏の改変を記載する。この株は、2ラウンドの遺伝子改変から生じ、培養培地1L当たり24mgの力価のヒスタミンを生産した。この力価は、Acinetobacter baumannii(株AB0057)由来のヒスタミンデカルボキシラーゼ(配列番号1)及びS. cerevisiae S288c由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(配列番号3)を発現するように改変されたC. glutamicum株において68mg/Lまで増大した。

実施例2は、Acinetobacter baumannii(株AB0057)由来のヒスチジンデカルボキシラーゼ(配列番号1)及びS. cerevisiae S288c由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(配列番号3)を発現させて、505mg/Lのヒスタミン力価を得るための、Y. lipolyticaの成功裏の改変を記載する。実施例2はまた、Lactobacillus sp.(株30a)由来のヒスタミンデカルボキシラーゼ(配列番号4)及びSalmonella typhimurium LT2由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(配列番号5)を発現させて、18mg/Lのヒスタミン力価を得るための、B. subtilisの改変を記載する。また、実施例2において、S. cerevisiaeを、Chromobacterium sp. LK1由来のヒスタミンデカルボキシラーゼ(配列番号6)及びS. cerevisiae S288c由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(配列番号3)を発現させて、111mg/Lのヒスタミン力価を得るように、改変した。

様々な実施形態において、1つ又は複数の上流経路酵素の活性を増大させるための、ヒスタミン生産微生物細胞の改変は、ヒスタミンの力価を、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、若しくは90パーセント、又は少なくとも2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、若しくは100倍増大させる。様々な実施形態において、ヒスタミンの力価の増大は、10パーセントから100倍、2倍から50倍、5倍から40倍、10倍から30倍の範囲、又は上記に列挙した値のいずれかを限界とする任意の範囲内にある(本明細書における範囲は、そのエンドポイントを含む)。これらの増大は、上流経路酵素の活性が全く増大していないヒスタミン生産微生物細胞において見られるヒスタミンの力価と比較して決定される。この参照細胞は、ヒスタミンの生産の増大を目的とした1つ又は複数の他の遺伝子改変を有し得、例えば、参照細胞は、フィードバックが緩和された酵素を発現し得る。

様々な実施形態において、1つ又は複数の上流経路遺伝子の活性の増大によって達成されるヒスタミンの力価は、少なくとも1、10、20、30、40、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900mg/L、又は少なくとも1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、若しくは10グラム/Lである。様々な実施形態において、力価は、10mg/Lから10グラム/L、20mg/Lから5グラム/L、50mg/Lから4グラム/L、100mg/Lから3グラム/L、500mg/Lから2グラム/Lの範囲、又は上記に列挙した値のいずれかを限界とする任意の範囲内にある。

フィードバックが緩和された酵素の導入
ヒスタミンの生合成はフィードバック阻害を受けるため、ヒスタミンを生産するように改変された微生物細胞におけるヒスタミンの生産を増大させるための別のアプローチは、フィードバック調節を通常は受ける1つ又は複数の酵素のフィードバックが緩和された形態を導入することである。このような酵素の例としては、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ及びATPホスホリボシルトランスフェラーゼが含まれる。フィードバックが緩和された形態は、特定の微生物宿主細胞における天然の酵素ほどにはフィードバック阻害に対して感受性ではない、異種の天然の酵素であり得る。或いは、フィードバックが緩和された形態は、その酵素を対応する天然の酵素ほどにはフィードバック阻害に対して感受性ではなくする1つ又は複数の突然変異又はトランケーションを有する、天然の酵素又は異種酵素のバリアントであり得る。このようなバリアントの例としては、アミノ酸置換N215K、L231F、及びT235Aを有するバリアントATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(C. glutamicum由来の)(配列番号7)、並びに、アミノ酸Q207及びE208の欠失を有するバリアントATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(Salmonella typhimurium由来の)(配列番号5)が含まれる。

様々な実施形態において、フィードバックが緩和された酵素を発現させるための、ヒスタミンを生産する微生物細胞の改変は、ヒスタミンの力価を、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、若しくは90パーセント、又は少なくとも2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、若しくは100倍増大させる。様々な実施形態において、ヒスタミンの力価の増大は、10パーセントから100倍、2倍から50倍、5倍から40倍、10倍から30倍の範囲、又は上記に列挙した値のいずれかを限界とする任意の範囲内にある。これらの増大は、フィードバックが緩和された酵素を発現しないヒスタミン生産微生物細胞において見られるヒスタミンの力価と比較して決定される。この参照細胞は、(必ずしも必要ではないが)ヒスタミンの生産を増大させることを目的とした他の遺伝子改変を有し得、すなわち、細胞は、フィードバック非感受性以外の一部の手段から生じる上流経路酵素の増大した活性を有し得る。

様々な実施形態において、ヒスタミン生合成経路を経るフラックスを増大させるための、フィードバックが緩和された酵素を使用することによって達成されるヒスタミンの力価は、少なくとも100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900μg/L、又は少なくとも1、10、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900mg/L、又は少なくとも1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50g/Lである。様々な実施形態において、力価は、50μg/Lから50g/L、75μg/Lから20g/L、100μg/Lから10g/L、200μg/Lから5g/L、500μg/Lから4g/L、1mg/Lから3g/L、500mg/Lから2g/Lの範囲、又は上記に列挙した値のいずれかを限界とする任意の範囲内にある。

1つ若しくは複数の天然の酵素の活性を補う及び/又は1つ若しくは複数のフィードバックが緩和された酵素を導入するアプローチを、ヒスタミンデカルボキシラーゼを発現する微生物細胞内で組み合わせて、更に高いヒスタミン生産レベルを達成することができる。例えば、385mg/Lのヒスタミン力価は、ヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子(Chromobacterium sp. LK1由来の)(配列番号6)、アミノ酸置換N215K、L231F、及びT235Aを有するATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(C. glutamicum由来の)(配列番号7)、並びにS. cerevisiae S288c由来の構成的に発現したATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(配列番号3)という3つの遺伝子の導入からの2ラウンドの改変において、S. cerevisiaeで達成された(実施例1)。

前駆体の消費の低減
ヒスタミンの生産が可能な微生物細胞におけるヒスタミンの生産を増大させるための別のアプローチは、1つ又は複数のヒスタミン経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素の活性を低下させることである。一部の実施形態において、1つ又は複数のこのような酵素の活性は、天然の酵素の発現又は活性を調節することによって低減する。このタイプの例示的な酵素としては、エノラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ペントースリン酸経路糖イソメラーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、リブロース-5-リン酸エピメラーゼ、及びリブロース-5-リン酸イソメラーゼが含まれる。このような酵素の活性は、例えば、対応する遺伝子の天然のプロモーターをあまり活性でない若しくは不活性なプロモーターで置換することによって、又は対応する遺伝子を欠失させることによって、低下させることができる。それぞれS. cerevisiae及びY. lipolyticaにおけるプロモーターの置き換え及び標的遺伝子の欠失についてのスキームの例としては、図12及び図13を参照されたい。

様々な実施形態において、1つ又は複数の副経路による前駆体の消費を低減させるためのヒスタミンを生産する微生物細胞の改変は、ヒスタミンの力価を、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、若しくは90パーセント、又は少なくとも2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、若しくは100倍増大させる。様々な実施形態において、ヒスタミンの力価の増大は、10パーセントから100倍、2倍から50倍、5倍から40倍、10倍から30倍の範囲、又は上記に列挙した値のいずれかを限界とする任意の範囲内にある。これらの増大は、前駆体の消費を低減させるための遺伝子改変を含まないヒスタミン生産微生物細胞において見られるヒスタミンの力価と比較して決定される。この参照細胞は、(必ずしも必要ではないが)ヒスタミンの生産を増大させることを目的とした他の遺伝子改変を有し、すなわち、細胞は、上流経路酵素の増大した活性を有し得る。

様々な実施形態において、1つ又は複数の副経路による前駆体の消費を低減させることによって達成されるヒスタミンの力価は、少なくとも100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900μg/L、又は少なくとも1、10、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900mg/L、又は少なくとも1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、10、20、50g/Lである。様々な実施形態において、力価は、50μg/Lから50g/L、75μg/Lから20g/L、100μg/Lから10g/L、200μg/Lから5g/L、500μg/Lから4g/L、1mg/Lから3g/L、500mg/Lから2g/Lの範囲、又は上記に列挙した値のいずれかを限界とする任意の範囲内にある。

1つ若しくは複数の天然の酵素の活性を増大させるアプローチ、及び/又は1つ若しくは複数のフィードバックが緩和された酵素を導入するアプローチ、及び/又は1つ若しくは複数の副経路による前駆体の消費を低減させるアプローチを組み合わせて、更に高いヒスタミンの生産レベルを達成することができる。

微生物宿主細胞
導入された遺伝子を発現させるために使用され得る任意の微生物を、上記のようなヒスタミンの発酵生産のために改変することができる。ある特定の実施形態において、微生物は、ヒスタミンの発酵生産が天然では不可能である微生物である。一部の実施形態において、微生物は、例えば、目的の化合物の発酵生産において宿主細胞として有用であることが知られている微生物等の、容易に培養される微生物である。グラム陽性細菌又はグラム陰性細菌を含む細菌細胞を、上記のように改変することができる。例としては、C. glutamicumの細胞に加えて、Bacillus subtilus、B. licheniformis、B. lentus、B. brevis、B. stearothermophilus、B. alkalophilus、B. amyloliquefaciens、B. clausii、B. halodurans、B. megaterium、B. coagulans、B. circulans、B. lautus、B. thuringiensis、S. albus、S. lividans、S. coelicolor、S. griseus、Pseudomonas sp.、P. alcaligenes、P. citrea、Lactobacilis spp.(L. lactis、L. plantarum等)、L. grayi、E. coli、E. faecium、E. gallinarum、E. casseliflavus、及び/又はE. faecalisの細胞が含まれる。

本明細書において記載される方法において微生物宿主細胞として使用することができる多くのタイプの嫌気性細胞が存在する。一部の実施形態において、微生物細胞は、偏性嫌気性細胞である。偏性嫌気性細菌は、酸素が存在する条件下では、典型的にはあまり良く成長しない。少量の酸素が存在し得ること、すなわち、偏性嫌気性細菌が低レベルの酸素に対してある程度のレベルの耐性レベルを有することが理解される。上記のように改変された偏性嫌気性細菌は、存在する酸素の量が嫌気性細菌の成長、維持、及び/又は発酵に対して無害であるほぼ無酸素の条件下で成長することができる。

或いは、本明細書において記載される方法において使用される微生物宿主細胞は、通性嫌気性細胞であり得る。通性嫌気性細菌は、酸素が存在すれば、好気性の呼吸(例えば、TCAサイクルの利用)によって細胞ATPを生成し得る。しかし、通性嫌気性細菌はまた、酸素の不存在下でも成長することができる。上記のように改変された通性嫌気性細菌は、存在する酸素の量が嫌気性細菌の成長、維持、及び/若しくは発酵に対して無害であるほぼ無酸素の条件下で成長することができ、又は、より多くの量の酸素の存在下で或いは成長することができる。

一部の実施形態において、本明細書において記載される方法において使用される微生物宿主細胞は、糸状真菌細胞である(例えば、Berka & Barnett、Biotechnology Advances、(1989)、7(2):127〜154を参照されたい)。例としては、Trichoderma longibrachiatum、T. viride、T. koningii、T. harzianum、Penicillium sp.、Humicola insolens、H. lanuginose、H. grisea、Chrysosporium sp.、C. lucknowense、Gliocladium sp.、Aspergillus sp.(A. Oryzae、A. niger、A. Sojae、A. japonicus、A. nidulans、又はA. awamori等)、Fusarium sp.(F. roseum、F. graminum、F. cerealis、F. oxysporuim、又はF. venenatum等)、Neurospora sp.(N. crassa又はHypocrea sp.等)、Mucor sp.(M. miehei等)、Rhizopus sp.、及びEmericella sp.の細胞が含まれる。特定の実施形態において、上記のように改変された真菌細胞は、A. nidulans、A. awamori、A. Oryzae、A. aculeatus、A. niger、A. japonicus、T. reesei、T. viride、F. oxysporum、又はF. solaniである。このような宿主と共に使用するための例示的なプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許出願公開第2011/0045563号において記載されているものが含まれる。

酵母もまた、本明細書において記載される方法において微生物宿主細胞として使用することができる。例としては、Saccharomyces sp.、Schizosaccharomyces sp.、Pichia sp.、Hansenula polymorpha、Pichia stipites、Kluyveromyces marxianus、Kluyveromyces sp.、Yarrowia lipolytica、及びCandida sp.が含まれる。一部の実施形態において、Saccharomyces sp.は、S. cerevisiaeである(例えば、Romanosら、Yeast、(1992)8(6):423〜488を参照されたい)。このような宿主と共に使用するための例示的なプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許第7,659,097号及び米国特許出願公開第2011/0045563号において記載されているものが含まれる。

一部の実施形態において、宿主細胞は、藻類細胞に由来するもの、例えば、緑藻類、紅藻類、灰色藻、クロララクニオン藻、ユーグレナ藻、クロミスタ、又は渦鞭毛藻に由来するものであり得る。(例えば、Saunders & Warmbrodt、「Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast」(1993)、National Agricultural Library、Beltsville、Md.を参照されたい)。藻類細胞において使用するための例示的なプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許出願公開第2011/0045563号において記載されているものが含まれる.

他の実施形態において、宿主細胞は、シアノバクテリウム、例えば、形態学に基づいて以下の群のいずれかに分類されるシアノバクテリウムである:Chlorococcales、Pleurocapsales、Oscillatoriales、Nostocales、Synechosystic、又はStigonematales(例えば、Lindbergら、MetaB. Eng.、(2010)12(1):70〜79を参照されたい)。シアノバクテリア細胞において使用するための例示的なプラスミド又はプラスミド成分としては、米国特許出願公開第2010/0297749号及び米国特許出願公開第2009/0282545号、並びに国際公開第WO2011/034863号において記載されているものが含まれる。

遺伝子改変の方法
微生物細胞は、当技術分野の技術の範囲内である、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、及び生化学の従来の技術を使用して、発酵によるヒスタミンの生産のために改変することができる。このような技術は文献において十分に説明されており、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第4版(Sambrookら、2012);「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait編、1984);「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications」(R. I. Freshney編、第6版、2010);「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.);「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら編、1987及び定期更新);「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullisら編、1994);Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology、第2版、J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)を参照されたい。

ベクターは、遺伝物質を細胞に導入するために使用されるポリヌクレオチド媒体である。本明細書において記載される方法において有用なベクターは、線状であっても環状であってもよい。ベクターは、宿主細胞の標的ゲノム内に組み込まれ得るか、又は宿主細胞内で独立して複製し得る。多くの適用で、安定な形質転換体を生産したベクターを組み込むことが好ましい。ベクターは、例えば、複製起点、マルチクローニングサイト(MCS)、及び/又は選択マーカーを含み得る。発現ベクターは、典型的には、特定の宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列(多くはコード配列)の発現を容易にする調節エレメントを含有する発現カセットを含む。ベクターとしては、限定はしないが、組み込みベクター、原核生物プラスミド、エピソーム、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体が含まれる。

発現カセットにおいて使用され得る例示的な調節エレメントとしては、プロモーター、エンハンサー、配列内リポソーム侵入部位(IRES)、及び他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリU配列等の転写終結シグナル)が含まれる。このような調節エレメントは、例えば、Goeddel、Gene Expression Technology: Methods In Enzymology 185、Academic Press、San Diego、Calif. (1990)において記載されている。

一部の実施形態において、ベクターは、CRISPR系等のゲノム編集を行い得る系を導入するために使用することができる。2014年3月6日に公開された米国特許出願公開第2014/0068797号を参照されたい。また、Jinek Mら、「A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity」、Science 337:816〜21、2012も参照されたい。II型のCRISPR-Cas9系において、Cas9は、部位特異的なエンドヌクレアーゼ、すなわち、2つの異なるエンドヌクレアーゼドメイン(HNHドメイン及びRuvC/RNase H様ドメイン)を使用して特定の標的配列のところでポリヌクレオチドを切断することを目的としているか又は切断することができる酵素である。Cas9はRNAによってその切断部位に向けられるため、Cas9は、任意の所望の部位でDNAを切断するように改変することができる。Cas9は、したがって、「RNA誘導型ヌクレアーゼ」とも記載される。更に具体的には、Cas9は、標的ポリヌクレオチド内の特異的配列へのRNA分子の少なくとも一部分のハイブリダイゼーションに基づいてCas9を特異的ポリヌクレオチド標的に誘導する1つ又は複数のRNA分子と結び付く。Ran, F. A.ら、(全ての追加されたデータを含む、「In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9」、Nature 520(7546):186〜91、2015年4月9日)は、8つのII型CRISPR-Cas9システムのcrRNA/tracrRNAの配列及び二次構造を提示している。Cas9様合成タンパク質もまた、当技術分野において知られている(2014年10月23日に公開された米国特許出願公開第2014-0315985号を参照されたい)。

実施例1は、ポリヌクレオチド及び他の遺伝子改変をC. glutamicum及びS. cerevisiae細胞のゲノムに導入するための例示的な組み込みアプローチを記載する。

ベクター又は他のポリヌクレオチドは、様々な標準的な方法、例えば、形質転換、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、トランスダクション、トランスフェクション(例えば、リポフェクションを介する若しくはDEAE-デキストリンを介するトランスフェクション、又は組換えファージウイルスを使用するトランスフェクション)、リン酸カルシウムDNA沈殿を伴うインキュベーション、DNAで被覆した微粒子銃での高速衝撃、及びプロトプラスト融合のいずれかによって、微生物細胞に導入することができる。形質転換体は、当技術分野において知られているあらゆる方法によって選択することができる。形質転換体を選択するための適切な方法は、米国特許出願公開第2009/0203102号、米国特許出願公開第2010/0048964号、及び米国特許出願公開第2010/0003716号、並びに国際公開第WO 2009/076676号、国際公開第WO 2010/003007号、及び国際公開第WO 2009/132220号において記載されている。

改変された微生物細胞
上記の方法を使用して、ヒスタミンを生産し、またある特定の実施形態においては過剰生産する、改変された微生物細胞を生産することができる。改変された微生物細胞は、天然の微生物細胞、例えば本明細書において記載される微生物宿主細胞のいずれかと比較して、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、又はそれを超える遺伝子改変、例えば30〜100個の改変を有し得る。以下の実施例において記載されている改変された微生物細胞は、1つ、2つ、又は3つの遺伝子改変を有するが、当業者は、本明細書において示されるガイダンスに従って、更なる改変を有する微生物細胞を改変することができる。一部の実施形態において、改変された微生物細胞は、天然の微生物細胞と比較して、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9つ、8つ、7つ、6つ、5つ、又は4つより多くの遺伝子改変は有さない。様々な実施形態において、ヒスタミンを生産するように改変された微生物細胞は、以下の例示的な範囲:1〜10、1〜9、1〜8、2〜7、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3、3〜7、3〜6、3〜5、3〜4等のいずれかの範囲内の、いくつかの遺伝子改変を有し得る。

一部の実施形態において、改変された微生物細胞は、例えば、ヒスタミンを天然に生産しない微生物宿主細胞のケースにおいて、少なくとも1つの異種ヒスタミンデカルボキシラーゼを発現する。様々な実施形態において、微生物細胞は、例えば、(1)単一の異種ヒスタミンデカルボキシラーゼ遺伝子、(2)同一であっても異なっていてもよい2つ以上の異種ヒスタミンデカルボキシラーゼ遺伝子(言い換えると、同一の異種ヒスタミンデカルボキシラーゼ遺伝子の複数のコピーを導入することができるか、若しくは複数の異なる異種ヒスタミンデカルボキシラーゼ遺伝子を導入することができる)、(3)細胞に対して天然ではない単一の異種ヒスタミンデカルボキシラーゼ遺伝子、及び天然のヒスタミンデカルボキシラーゼ遺伝子の1つ若しくは複数の更なるコピー、又は(4)同一であっても異なっていてもよい2つ以上の非天然のヒスタミンデカルボキシラーゼ遺伝子、及び天然のヒスタミンデカルボキシラーゼ遺伝子の1つ若しくは複数の更なるコピーを含み得、発現し得る。

この改変された宿主細胞は、ヒスチジン(ヒスタミンの直接前駆体)の生産をもたらす経路を経るフラックスを増大させる少なくとも1つの更なる遺伝子改変を含み得る。この経路におけるこれらの「上流」酵素としては、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリボシル-ATPピロホスファターゼ、ホスホリボシル-AMPシクロヒドロラーゼ、5'ProFARイソメラーゼ、イミダゾール-グリセロールリン酸シンターゼ、イミダゾール-グリセロールリン酸デヒドラターゼ、ヒスチジノール-リン酸アミノトランスフェラーゼ、ヒスチジノール-リン酸ホスファターゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、及びリボースリン酸ピロホスホキナーゼが含まれ、これらの酵素活性を有する任意のアイソフォーム、パラログ、又はオルソログも含まれる(当業者には容易に理解されるであろうが、これらは異なる名称で知られている場合もある)。少なくとも1つの更なる改変が、任意の利用可能な手段によって、例えば、(1)天然の酵素の発現若しくは活性の調節、(2)天然の酵素の遺伝子の1つ若しくは複数の更なるコピーの発現、及び/又は(3)1つ若しくは複数の非天然の酵素の遺伝子の1つ若しくは複数のコピーの発現によって、上流経路酵素の活性を増大させ得る。

一部の実施形態において、経路を経る増大したフラックスは、上述したように、フィードバックが緩和された酵素をコードする1つ又は複数の遺伝子を発現させることによって達成され得る。例えば、改変された宿主細胞は、1つ又は複数のフィードバックが緩和されたATPホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含み得、発現し得る。

改変された微生物細胞は、天然のヌクレオチド配列を有する導入遺伝子又は天然のものとは異なる導入遺伝子を含有し得る。例えば、天然のヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得る。これらの導入された遺伝子のいずれかによってコードされるアミノ酸配列は、天然のものであっても、天然のものと異なっていてもよい。様々な実施形態において、アミノ酸配列は、天然のアミノ酸配列と少なくとも60パーセント、70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント、又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する。

一部の実施形態において、ヒスタミンへの前駆体の増大した利用可能性は、エノラーゼ、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ、ペントースリン酸経路糖イソメラーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、リブロース-5-リン酸エピメラーゼ、及びリブロース-5-リン酸イソメラーゼ等の1つ又は複数のヒスタミン経路前駆体を消費する酵素の発現又は活性を低減させることによって、達成され得る。例えば、改変された宿主細胞は、これらの酵素のうちのいずれかの発現を下方調節する1つ若しくは複数のプロモータースワップを含み得るか、及び/又は、これらの酵素の遺伝子が欠失しておりその発現が完全になくなっていてよい。

本明細書において記載されるアプローチは、細菌細胞、すなわち、C. glutamicum及びB. subtilis(原核生物)、並びに、真菌細胞、すなわち、酵母であるS. cerevisiae及びY. lipolytica(真核生物)において行われている(実施例1及び実施例2を参照されたい)。

例示的な改変された酵母細胞
ある特定の実施形態において、改変された酵母(例えば、S. cerevisiae)細胞は、Chromobacterium sp. LK1由来のヒスタミンデカルボキシラーゼ(例えば、配列番号6)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント、又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する異種ヒスタミンデカルボキシラーゼを発現する。特定の実施形態において、Chromobacterium sp. LK1のヒスタミンデカルボキシラーゼは、配列番号6を含み得る。改変された酵母(例えば、S. cerevisiae)細胞はまた、S. cerevisiae由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(配列番号3)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント、又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する、異種ATPホスホリボシルトランスフェラーゼを発現し得る。特定の実施形態において、S. cerevisiaeのATPホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号3を含む。

ある特定の実施形態において、改変された酵母(例えば、Y. lipolytica)細胞は、Acinetobacter baumannii株AB0057由来のヒスタミンデカルボキシラーゼ(例えば、配列番号1)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント、又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する異種ヒスタミンデカルボキシラーゼを発現する。特定の実施形態において、Acinetobacter baumannii株AB0057のヒスタミンデカルボキシラーゼは、配列番号1を含み得る。改変された酵母(例えば、Y. lipolytica)細胞はまた、S. cerevisiae S288c由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(配列番号3)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント、又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する、異種ATPホスホリボシルトランスフェラーゼを発現し得る。特定の実施形態において、S. cerevisiae S288cのATPホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号3を含む。

これらは改変された酵母細胞の唯一の遺伝子改変であり得るか、又は酵母細胞は、上記でより一般的に論じたように、1つ又は複数の更なる遺伝子改変を含み得る。

例えば、特定の実施形態において、上記の改変された酵母であるS. cerevisiaeの細胞は、更に、アミノ酸置換N215K、L231F、及びT235Aを有するC. glutamicumのATPホスホリボシルトランスフェラーゼのバリアント(配列番号7)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、若しくは95パーセントのアミノ酸配列同一性を典型的に有する、C. glutamicumのATPホスホリボシルトランスフェラーゼのフィードバックが緩和されたバリアントを発現する。特定の実施形態において、C. glutamicumのATPホスホリボシルトランスフェラーゼのバリアントは、配列番号7を含み得る。

例示的な改変された細菌細胞
ある特定の実施形態において、改変された細菌(例えば、C. glutamicum)細胞は、Acinetobacter baumannii由来のヒスタミンデカルボキシラーゼ(例えば、配列番号1)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント、又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する異種ヒスタミンデカルボキシラーゼを発現する。特定の実施形態において、Acinetobacter baumanniiのヒスタミンデカルボキシラーゼは、配列番号1を含み得る。改変された細菌(例えば、C. glutamicum)細胞はまた、Saccharomyces cerevisiae S288c由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(配列番号3)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント、又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する異種ATPホスホリボシルトランスフェラーゼを発現し得る。特定の実施形態において、S. cerevisiae S288cのATPホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号3を含む。一部の実施形態において、改変された細菌(例えば、C. glutamicum)細胞は、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼの代わりに、C. glutamicum由来のイミダゾール-グリセロールリン酸デヒドラターゼ(配列番号2)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント、又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有するイミダゾール-グリセロールリン酸デヒドラターゼを発現する。特定の実施形態において、C. glutamicumのイミダゾール-グリセロールリン酸デヒドラターゼは、配列番号2を含む。

ある特定の実施形態において、改変された細菌(例えば、B. subtilis)細胞は、Lactobacillus sp.(株30a)由来のヒスタミンデカルボキシラーゼ(例えば、配列番号4)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント、又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する異種ヒスタミンデカルボキシラーゼを発現する。特定の実施形態において、Lactobacillus sp.(株30a)のヒスタミンデカルボキシラーゼは、配列番号4を含み得る。改変された細菌(例えば、B. subtilis)細胞は、Salmonella typhimurium LT2由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(配列番号5)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント、又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する異種ATPホスホリボシルトランスフェラーゼも発現し得る。特定の実施形態において、Salmonella typhimurium LT2のATPホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号5を含む。

改変された微生物細胞の培養
本明細書において記載される微生物細胞のいずれかを、例えば、維持、成長、及び/又はヒスタミンの生産のために培養することができる。

一部の実施形態において、培養物は、600nmで10〜500の光学密度、例えば50〜150の光学密度まで成長させられる。

様々な実施形態において、培養物は、少なくとも10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900μg/L、又は少なくとも1、10、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900mg/L、又は少なくとも1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、、10、20、50g/Lの力価の、生産されたヒスタミンを含む。様々な実施形態において、力価は、10μg/Lから10g/L、25μg/Lから20g/L、100μg/Lから10g/L、200μg/Lから5g/L、500μg/Lから4g/L、1mg/Lから3g/L、500mg/Lから2g/Lの範囲、又は上記に列挙した値のいずれかを限界とする任意の範囲内にある。

培養培地
微生物細胞は、限定はしないが、最少培地、すなわち、細胞の成長にとって可能な最少の栄養を含有する培地を含む、任意の適切な培地において培養することができる。最少培地は、典型的には、(1)微生物の成長のための炭素源、(2)特定の微生物細胞及び成長条件に応じ得る塩、並びに(3)水を含有する。適切な培地はまた、成長及び生成物の形成のための窒素源、成長のための硫黄源、成長のためのリン酸源、成長のための金属塩、成長のためのビタミン、並びに成長のための他の補因子の、任意の組み合わせも含み得る。

任意の適切な炭素源を、宿主細胞の培養に使用することができる。用語「炭素源」は、微生物細胞によって代謝され得る1つ又は複数の炭素含有化合物を指す。様々な実施形態において、炭素源は、糖質(単糖、二糖、オリゴ糖、若しくは多糖等)、又は転化糖(例えば、酵素処理されたショ糖シロップ)である。例示的な単糖としては、グルコース(デキストロース)、フルクトース(レブロース)、及びガラクトースが含まれる。例示的なオリゴ糖としてはデキストラン又はグルカンが含まれ、例示的な多糖としてはデンプン及びセルロースが含まれる。適切な糖としては、C6糖(例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、又はグルコース)及びC5糖(例えば、キシロース又はアラビノース)が含まれる。他の、あまり高価ではない炭素源としては、サトウキビ液、ビート液、モロコシ液、及びそれに類するものが含まれ、これらのいずれも、必ずしも必要ではないが、完全に又は部分的に脱イオン化されていてよい。

培養培地中の塩は一般に、細胞によるタンパク質及び核酸の合成を可能にするマグネシウム、窒素、リン、及び硫黄等の必須エレメントを提供する。

最少培地には、抗生物質等の1つ又は複数の選択剤を補充することができる。

ヒスタミンを生産するために、培養培地は、グルコース、及び/又は尿素、アンモニウム塩、アンモニア、若しくはこれらの任意の組み合わせ等の窒素源を含み得、及び/又は、培養の間に補充され得る。

培養条件
微生物細胞の維持及び成長に適した材料及び方法は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許出願公開第2009/0203102号、米国特許出願公開第2010/0003716号、及び米国特許出願公開第2010/0048964号、並びに国際公開第WO 2004/033646号、国際公開第WO 2009/076676号、国際公開第WO 2009/132220号、及び国際公開第WO 2010/003007号、Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardtら編、American Society for Microbiology、Washington、D.C. (1994)、又はBrock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology、第2版(1989) Sinauer Associates, Inc.、Sunderland、Massを参照されたい。

通常、細胞は、適切な温度、気体混合物、及びpH(例えば、約20℃から約37℃、約6%から約84%CO₂、及び約5から約9の間のpH)で成長させられ、維持される。一部の態様では、細胞は35℃で成長させられる。例えば好熱細菌を宿主細胞として使用する、ある特定の実施形態において、より高い温度(例えば、50℃〜75℃)を使用することができる。一部の態様において、発酵のためのpH範囲は、約pH5.0から約pH9.0(例えば、約pH6.0から約pH8.0、又は約6.5から約7.0)の間である。細胞は、特定の細胞の要求に応じて、好気性条件下で、無酸素条件下で、又は嫌気性条件下で成長させることができる。

使用され得る標準的な培養条件及び発酵の態様、例えば、バッチ発酵、フェドバッチ発酵、又は連続発酵は、米国特許出願公開第2009/0203102号、米国特許出願公開第2010/0003716号、及び米国特許出願公開第2010/0048964号、並びに国際公開第WO 2009/076676号、国際公開第WO 2009/132220号、及び国際公開第WO 2010/003007号において記載されている。バッチ発酵及びフェドバッチ発酵は一般的であり、当技術分野において周知であり、例は、Brock、Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology、第2版(1989) Sinauer Associates, Inc.において見ることができる。

一部の実施形態において、細胞は、限られた糖(例えば、グルコース)条件下で培養される。様々な実施形態において、添加される糖の量は、細胞によって消費され得る糖の量の約105%又はそれ未満(例えば、約100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、又は10%)である。特定の実施形態において、培養培地に添加される糖の量は、特定の時間の間に細胞によって消費される糖の量とほぼ同一である。一部の実施形態において、細胞の成長の速度は、添加する糖の量を制限して、細胞培地中の糖の量によってサポートされ得る速度で細胞が成長するようにすることによって、制御される。一部の実施形態において、糖は、細胞を培養する時間では溜まらない。様々な実施形態において、細胞は、限られた糖条件下で、約1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、若しくは70時間又はそれを超える時間、又は更には最大約5〜10日間にわたって培養される。様々な実施形態において、細胞は、制限された糖条件下で、細胞を培養する総時間の約5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、95、又は100%又はそれ超にわたり培養される。何らかの特定の理論に拘束されることは意図しないが、制限された糖条件によって、細胞のより好ましい調節が可能になり得ると考えられる。

一部の態様において、細胞は、バッチ培養で成長させられる。細胞はまた、フェドバッチ培養又は連続培養でも成長させることができる。更に、細胞は、限定はしないが上記の最少培地のいずれかを含む最少培地で培養することができる。最少培地には、1.0%(w/v)以下のグルコース(又は6つの炭素からなるあらゆる他の糖)を更に補充することができる。具体的には、最少培地には、1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)、又は0.1%(w/v)のグルコースを補充することができる。一部の培養において、非常に高いレベルの、例えば、少なくとも10%(w/v)、20%(w/v)、30%(w/v)、40%(w/v)、50%(w/v)、60%(w/v)、70%(w/v)の、又は培地中での糖の溶解限界までの糖(例えば、グルコース)が使用される。一部の実施形態において、糖レベルは、上記の値の任意の2つからなる範囲内、例えば、0.1〜10%(w/v)、10〜20%(w/v)、10〜70%(w/v)、20-60%(w/v)、又は30-50%(w/v)の間にある。更に、異なる糖レベルを異なる培養相に使用することができる。フェドバッチ培養(例えば、S. cerevisiae又はC. glutamicumの)では、糖レベルは、バッチ相では約100〜200g/L(10〜20%(w/v))であり、次いで約500〜700g/L(フィードの50〜70%)まで上げることができる。

更に、最少培地には、0.1%(w/v)以下の酵母抽出物を補充することができる。具体的には、最少培地には、0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)、又は0.01%(w/v)の酵母抽出物を補充することができる。或いは、最少培地には、1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)、又は0.1%(w/v)のグルコース、及び0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、又は0.02%(w/v)の酵母抽出物を補充することができる。一部の培養において、非常に高いレベルの、例えば、少なくとも1.5%(w/v)、2.0%(w/v)、2.5%(w/v)、又は3%(w/v)の酵母抽出物を使用することができる。一部の培養において(例えば、S. cerevisiae又はC. glutamicumの)、酵母抽出物レベルは、上記の値の任意の2つからなる範囲内、例えば、0.5〜3.0%(w/v)、10〜2.5%(w/v)、又は1.5〜2.0%(w/v)の間にある。

本明細書において記載される改変された微生物細胞の維持及び成長に適した例示的な材料及び方法は、以下の実施例1において見ることができる。

ヒスタミンの生産及び回収
本明細書において記載される方法のいずれかは、ヒスタミンを回収する工程を更に含み得る。一部の実施形態において、いわゆる採取物流に含有される生産されたヒスタミンは、生産管から回収/採取される。採取物流は、例えば、生産管内の休止細胞による生産基質の変換の結果生じるヒスタミンを含有する、生産管から来る無細胞の又は細胞を含有する水溶液を含み得る。採取物流中に依然として存在する細胞は、当技術分野において知られている任意の操作、例えば、濾過、遠心分離、デカンテーション、膜クロスフロー限外濾過若しくは膜クロスフロー精密濾過、タンジェンシャルフロー限外濾過若しくはタンジェンシャルフロー精密濾過、又はデッドエンド濾過によって、ヒスタミンから分離することができる。この細胞分離操作の後、採取物流は基本的に細胞を有さない。

生産されたヒスタミンを採取物流に含有される他の成分から分離及び/又は精製する更なる工程、すなわち、いわゆる、下流のプロセシング工程を、場合によって行うことができる。これらの工程は、当業者に知られている任意の手段、例えば、濃縮、抽出、結晶化、沈殿、吸着、イオン交換、及び/又はクロマトグラフィーを含み得る。これらの手順のいずれかを単独で又は組み合わせて使用して、ヒスタミンを精製することができる。更なる精製工程は、例えば、濃縮、結晶化、沈殿、洗浄、及び乾燥、活性炭での処理、イオン交換、ナノ濾過、並びに/又は再結晶化の1つ又は複数を含み得る。適切な精製プロトコルの設計は、細胞、培養培地、培養物のサイズ、生産管等に依存し得、当技術分野における技術のレベルの範囲内である。

以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を説明する目的で記載されており、本開示をいかなる形でも限定するものではない。特許請求の範囲によって規定される、本開示の趣旨に包含される、実施例における変更及び他の使用は、当業者に識別可能である。

ヒスタミンを生産するように改変されたCorynebacteria glutamicum及びSaccharomyces cerevisiaeの株の構築及び選択
プラスミド/DNAの改変
この作業で試験される全ての株を、専売のソフトウェアを使用して設計されたプラスミドDNAで形質転換した。プラスミドの設計は、この作業において設計された宿主生物の各々に対して特異的であった。プラスミドDNAを、標準的なDNAアセンブリ方法によって物理的に構築した。このプラスミドDNAを次いで、それぞれ以下に記載される2つの宿主特異的な方法の一方によって代謝経路インサートを組み込むために使用した。

C. glutamicum経路の組み込み
「ループイン、シングルクロスオーバー」ゲノム組み込み戦略が、C. glutamicum株を改変するために開発されている。図14は、ループインのみの構築物及びループイン/ループアウト構築物のゲノム組み込み、並びに、コロニーPCRを介する正確な組み込みの検証を説明する。ループインのみの構築物(「ループイン」という見出しの下に示されている)は、単一の2kbのホモロジーアーム(「組み込み遺伝子座」と示されている)、正の選択マーカー(「マーカー」と示されている)、及び目的の遺伝子(「プロモーター-遺伝子-ターミネーター」と示されている)を有していた。シングルクロスオーバー事象によって、プラスミドがC. glutamicumの染色体に組み込まれた。組み込み事象は、抗生物質(25μg/mlのカナマイシン)の存在下で成長させることによって、ゲノム内に安定的に維持される。ループイン組み込みによって派生する、コロニーにおける正確なゲノム組み込みを、UF/IR及びDR/IF PCRプライマーを用いるコロニーPCRによって確認した。

ループイン、ループアウト構築物(「ループイン、ループアウト」という見出しの下に示されている)は、2つの2kbのホモロジーアーム(5'アーム及び3'アーム)、目的の遺伝子(矢印)、正の選択マーカー(「マーカー」と示されている)、及びカウンター選択マーカーを有していた。「ループイン」のみの構築物と同様に、シングルクロスオーバー事象によって、プラスミドがC. glutamicumの染色体に組み込まれた。注記:2つの考えられる組み込みのうちの一方のみがここでは示されている。正確なゲノム組み込みをコロニーPCRによって確認し、カウンター選択を、プラスミド骨格及びカウンター選択マーカーが切除され得るように適用した。これは、野生型への逆戻り(左下のボックス)又は所望の経路組み込み(右下のボックス)という2つの可能性のうちの一方をもたらす。再び、正確なゲノムループアウトを、コロニーPCRによって確認する。(略記:プライマー:UF=上流フォワード、DR=下流リバース、IR=内部リバース、IF=内部フォワード)。

S. cerevisiae経路の組み込み
「スプリットマーカー、ダブルクロスオーバー」ゲノム組み込み戦略が、S. cerevisiae株を改変するために開発されている。図11は、S. cerevisiaeにおける、相補的なスプリットマーカープラスミドのゲノム組み込み、及びコロニーPCRを介する正確なゲノム組み込みの検証を説明している。相補的な5'及び3'のホモロジーアーム並びにURA3選択マーカーのオーバーラップしている半分(斜線の入ったバーによって示される定方向反復)を有する2つのプラスミドを、メガヌクレアーゼで消化し、線状断片として形質転換した。トリプルクロスオーバー事象によって、所望の異種遺伝子を標的遺伝子座に組み込み、完全なURA3遺伝子を再構築した。この組み込み事象から派生するコロニーを、2つの3プライマー反応を使用してアッセイして、5'での結合及び3'での結合の両方について確認した(UF/IF/wt-R及びDR/IF/wt-F)。更なる改変が望ましい株では、株を5-FOAプレート上に播種して、元の定方向反復の小さな単一のコピーを残してURA3を除去することを選択することができる。このゲノム組み込み戦略は、同一のワークフローにおける遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、及びプロモータータイトレーションに使用することができる。

細胞培養
S. cerevisiaeのために確立されたワークフローは、株をプレート全体にランダム化する自動ワークフローを使用して、成功裏に構築された株を定着させる、ヒットピッキング工程を伴うものであった。成功裏に構築された各株で、異なるコロニーからの最大4つの複製物を試験して、コロニー間の変動、及び他のプロセス間の変動を試験した。得られたコロニーが4つに満たない場合には、それぞれの所望の遺伝子型から少なくとも4つのウェルが試験されるように、既存のコロニーを複製した。

コロニーを、選択培地(S. cerevisiaeのためのSD-ura)を有する96ウェルプレートに定着させ、飽和するまで2日間培養し、次いで、16.6%グリセロールと共に-80℃で保存のために凍結した。凍結されたグリセロールストックを次いで使用して、成長及び凍結からの回復を助けるために、最少培地中の播種ステージに低レベルのアミノ酸を接種した。播種プレートを30℃で1〜2日間成長させた。播種プレートを次いで使用して、メインの培養プレートに最少培地を接種し、48〜88時間成長させた。プレートを所望の時点で取り出し、細胞密度(OD600)、生存能力、及びグルコースについて試験し、上清サンプルを、目的の生成物のLC-MS分析のために保存した。

細胞密度
各ウェルの600nmでの吸光度を検出する分光光度アッセイを使用して、細胞密度を測定した。ロボット工学を使用して、一定量の培養物を各培養プレートからアッセイプレートに移し、その後、175mMのリン酸ナトリウム(pH7.0)と混合して、10倍希釈物を得た。Tecan M1000分光光度計を使用してアッセイプレートを測定し、アッセイデータをLIMSデータベースにアップロードした。接種なしのコントロールを使用して、バックグラウンド吸光度を差し引いた。各ステージで複数のプレートに接種することによって細胞の成長をモニタリングし、次いで、各時点でプレート全体を処分した。

数多くのプレートを扱いながらも(これは、測定の間に典型的ではないサンプルを生じさせ得る)細胞の沈降を最小にするために、各プレートを読み取る前に、それぞれを10〜15秒間振盪した。プレート内の細胞密度が幅広いバリエーションであることで、検出の線形範囲から外れた吸光度測定値が得られ、その結果、ODが高めの培養物が過小評価される。通常、試験対象の株は、これまでのところ、このことが懸案事項になるほどまでには著しく多様ではない。

液体-固体の分離
LC-MSによる分析のために細胞外サンプルを採取するために、液相及び固相を、遠心分離を介して分離した。培養プレートを2000rpmで4分間遠心分離し、上清を、ロボット工学を使用して、デスティネーションプレートに移した。75μLの上清を各プレートに移し、1つは4℃で保存し、2つ目は長期保存のために80℃で保存した。

Corynebacteria glutamicum及びSaccharomyces cerevisiaeにおける1ラウンド目の遺伝子改変の結果
ライブラリーアプローチを行って、異種経路酵素をスクリーニングして、ヒスタミン経路を確立した。ヒスチジンデカルボキシラーゼについて、Table 1(表2)に列挙する細菌由来源、古細菌由来源、緑色植物亜界由来源、脊椎動物由来源、後生動物由来源、及び節足動物由来源から18の異種配列を試験した。ヒスチジンデカルボキシラーゼをコドン最適化し、Saccharomyces cerevisiae宿主及びCorynebacteria glutamicum宿主の両方において発現させた。

ヒスチジン生合成にフィードバック阻害をかけ、したがってフィードバックが緩和されたATPホスホリボシルトランスフェラーゼを、ヒスチジンデカルボキシラーゼで試験して、ヒスチジンデカルボキシラーゼの基質であるヒスチジンの生産を向上させた。試験対象のATPホスホリボシルトランスフェラーゼは、それらをフィードバック阻害に対して耐性にする既知の欠失及び点突然変異を有するSalmonella typhimurium及びCorynebacteria glutamicumに由来するものであった。

1ラウンド目の遺伝子改変の結果をTable 1(表2)及び図2(C. glutamicum)並びに図3(S. cerevisiae)に示す。

Corynebacteria glutamicum及びSaccharomyces cerevisiaeにおける2ラウンド目の遺伝子改変の結果
ライブラリーアプローチを行って、各上流経路酵素を構成的プロモーターで別個に発現させることによってヒスタミン生産を向上させて、速度制限工程のためのスクリーニングを行った。スクリーニングしたヒスチジン経路酵素をTable 2(表3)に示す。更に、Table 2(表3)の酵素において、株は、1ラウンド目の最良の酵素を有していた:Corynebacteria glutamicum宿主は、ヒスチジンデカルボキシラーゼ(UniProt ID B7I459)(配列番号1)、及び欠失Q207〜E208を有するATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(UniProt ID P00499)(配列番号5)を含有しており、Saccharomyces cerevisiae宿主は、ヒスチジンデカルボキシラーゼ(UniProt ID J6KM89)(配列番号6)、並びにアミノ酸置換N215K、L231F、及びT235Aを有するATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(UniProt ID Q9Z472)(配列番号7)を有している。

2ラウンド目の遺伝子改変の結果を、Table 2(表3)並びに図4(C. glutamicum)及び図5(S. cerevisiae)に示す。

C. glutamicumにおいて、24mg/Lの力価が、Acinetobacter baumannii由来のヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子、及びC. glutamicum由来のイミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼの構成的発現という2つの遺伝子の組み込みからの2ラウンドの改変の後に達成された。

S. cerevisiaeにおいて、385mg/Lの力価が、Chromobacterium sp. LK1由来のヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子(配列番号6)、アミノ酸置換N215K、L231F、及びT235Aを有するC. glutamicum由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(配列番号7)、並びにS. cerevisiae由来の構成的に発現したATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(配列番号3)という3つの遺伝子の組み込みからの2ラウンドの改変において達成された。

Saccharomyces cerevisiaeにおける3ラウンド目の遺伝子改変の結果
ヒスタミン生産をS. cerevisiaeにおいて更に求め、本発明者らは、強力な構成的プロモーターによって発現している上流経路遺伝子の更なるコピーを組み込んで遺伝子の天然の調節を避けるように、プラスミドを設計した(Table 3(表5))。拡張した研究を行って、活性であると最初に同定された酵素と類似の配列を有する更なるヒスチジンデカルボキシラーゼを試験した(Table 3(表5))。

並行して、本発明者らは、天然の遺伝子の発現を調節して、ヒスタミン生産を更に向上させることを求めた。本発明者らの改変アプローチは、2ラウンド目から最良のS. cerevisiae株を得、天然のプロモーターの代わりとして、強力な又は弱い構成的プロモーターのいずれかを試験することであった。プロモーターの変化のための遺伝子標的は、フラックスサプライ前駆体をヒスチジンに再び向けるように選択した。試験対象の株改変としては、非天然のフィードバックが緩和されたグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(zwf)を発現させることによってペントースリン酸経路のフラックスを増大させ、糖イソメラーゼ酵素を介する「下流の」ペントースリン酸経路のフラックスを減少させるための改変が含まれる。

必須であると思われる(すなわち、欠失させることができない)がヒスタミン生産に利用可能な上流の糖分解代謝産物プールを増大させることが予想された遺伝子の発現を下げるためのプロモーターの置き換えは、1)下流の糖分解を介してフラックスを低減させるためのエノラーゼ(Eno2)、2)C3/C2ノードを経る下流のフラックスのためのピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ(PDH、Lpd1)、及び3)ヒスタミン代謝産物前駆体であるリボース-5-リン酸(Tal1)を使用するペントースリン酸経路糖イソメラーゼを標的化するものであった。S. cerevisiaeにおけるプロモータースワップ(「プロスワップ」)標的及び欠失(「ノックアウト」)標的の例示的なリストは、以下のものを含む。

プロモーターは、Leeら[7]の発現データに基づいて選択した。

S. cerevisiaeについての更なる遺伝子改変の結果を、Table 3(表5)及び図10に示す。Table 3(表5)に示す株改変のための親株(また、参照株ScHISMN_41)は、ヒスチジンデカルボキシラーゼ(UniProt ID J6KM89)、並びにアミノ酸置換N215K、L231F、及びT235Aを有するATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(UniProt ID Q9Z472)、並びにS. cerevisiae由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼを有していた。参照株は、131mg/Lのヒスタミン力価を有していた。

改良された力価が、強力な構成的プロモーターから以下の酵素のそれぞれを発現した株において見られた。

1.ペントースリン酸経路における糖の相互変換を触媒し、ヒスチジン生合成経路における最初の代謝産物であるPPRPの前駆体であるリボース-5-リン酸を生産する、トランスケトラーゼ(EC 2.2.1.1)(配列番号27)。

2.リボースリン酸ピロホスホキナーゼ(EC 2.7.6.1)(配列番号28)(最高力価:実験におけるコントロールでの131mg/Lに対し、191mg/L)。

3.ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(EC 2.4.2.17)(配列番号3)。

4.三官能性のヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.23)/ホスホリボシル-AMPシクロヒドロラーゼ(EC 3.5.4.19)/ホスホリボシル-ATPジホスファターゼ(EC 3.6.1.31)(配列番号29)。

5.ヒスチジノール-リン酸アミノトランスフェラーゼ(EC 2.6.1.9)(配列番号14)。

6.5'ProFARイソメラーゼ(EC 5.3.1.16)(配列番号31)。

7.イミダゾールグリセロールリン酸シンターゼ(EC 4.3.1.B2)(配列番号21)。

8.アミノ酸置換I170V(配列番号32)又はI170T[8]を有するトリオースリン酸イソメラーゼ(EC 5.3.1.1)。

9.アミノ酸置換A243Tを有するグルコース-6-リン酸1-デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.49)(配列番号26)。

10.様々なヒスチジンデカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.22):
a. UniProt ID A0A089YPE5(配列番号33)
b. UniProt ID A0A126S6G9(配列番号34)
c. UniProt ID A0A0A1R6V3(配列番号35)
d. UniProt ID A0A1W0CM88(配列番号36)
e. UniProt ID P00862(配列番号4)
f. UniProt ID A0A0K6GJ74(配列番号37)
g. UniProt ID T0QL99(配列番号38)
h. UniProt ID A0A1B8HLR1(配列番号39)

ヒスタミン生産についての宿主の評価
ヒスタミン生産を、最良のパフォーマンスをしたCorynebacterium glutamicum株及びSaccharomyces cerevisiae株由来の酵素を発現するように改変された2つの更なる宿主、Bacillus subtilis及びYarrowia lipolyticaにおいても試験した。

宿主評価改変を、1〜3個の酵素を発現するように選択し、各改変を、宿主生物C. glutamicum、S. cerevisiae、B. subtilis、及びY. lipolyticaに基づく4つの異なるコドン最適化で試験した。試験対象のコドン最適化は、各宿主について遺伝子のコドン最適化が表にされている公益財団法人かずさDNA研究所のコドン使用頻度表に基づくものであった(www.kazusa.or.jp/codon/)。

ヒスタミン生産は、Y. lipolytica(図6)及びB. subtilis(図7)において実証され、C. glutamicum(図9)及びS. cerevisiae(図8)において更に向上した。

Y. lipolytica(図6、以下のTable 4(表9))において、最良のパフォーマンスをした株は505mg/Lのヒスタミンを生産し、DNA配列がY. lipolyticaにコドン最適化されたAcinetobacter baumannii株AB0057由来のヒスチジンデカルボキシラーゼ(UniProt ID B7I459)、及びDNA配列がY. lipolyticaにコドン最適化されたS. cerevisiae S288c由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(UniProt ID P00498)を発現した。DNA配列がB. subtilis及びS. cerevisiaeにコドン最適化された同一の2つの遺伝子もまた試験し、得られた株はヒスタミン力価をもたらさなかった。

Y. lipolyticaにおける2番目に良いパフォーマンスをした株もまた、DNA配列がY. lipolyticaにコドン最適化された、Acinetobacter baumannii株AB0057由来のヒスチジンデカルボキシラーゼ(UniProt ID B7I459)、及びDNAがY. lipolyticaにコドン最適化された、Salmonella typhimurium LT2由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(UniProt ID P00499)を発現した。これらの2つの遺伝子の、DNA配列がB. subtilisにコドン最適化された(これは力価を生じさせなかった)バージョン、S. cerevisiaeにコドン最適化された(これは33マイクログラムのヒスタミンを生産した)バージョン、並びにS. cerevisiae及びC. glutamicumについての組み合わせコドン表を使用してコドン最適化された(97mg/Lのヒスタミンを生産した)バージョンもまた試験した。

Y. lipolyticaにおける3番目に良いパフォーマンスをした株は、258mg/Lのヒスタミンを生産し、DNA配列がY. lipolyticaにコドン最適化されたChromobacterium sp. LK1由来のヒスチジンデカルボキシラーゼ(UniProt ID A0A0J6KM89)、及び、DNA配列がY. lipolyticaにコドン最適化された(配列番号64)、アミノ酸置換N215K、L231F、T235Aを有する(配列番号7)C. glutamicum ATCC 13032由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(UniProt ID Q9Z472)を発現した。これらの2つの遺伝子の、DNA配列がS. cerevisiae(配列番号65、66)又はB. subtilis(配列番号67、68)にコドン最適化されたバージョンもまた試験し、これらのY. lipolytica株は、それぞれ1.8mg/L及び0.3mg/Lを生産した。したがって、遺伝子のコドン最適化は、Y. lipolyticaにおける発現に影響する。

B. subtilis(図7、以下のTable 5(表10))において、最良のパフォーマンスをした株は、18mg/Lのヒスタミンを生産し、Lactobacillus sp.(株30a)由来のヒスタミンデカルボキシラーゼ(UniProt ID P00862)(配列番号4)と、DNA配列がBacillus subtilis(配列番号69、59)にコドン最適化された、Salmonella typhimurium LT2由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(UniProt ID P00499)(配列番号5)とを発現した。DNA配列がS. cerevisiaeにコドン最適化された(配列番号70、60)、又はDNA配列がC. glutamicum及びS. cerevisiaeについての修正されたコドン使用頻度表であった(配列番号71、62)、同一の2つの遺伝子もまた試験し、これらの株は、それぞれ6.7mg/L又は0mg/Lのヒスタミンを生産した。

宿主評価改変をまた、S. cerevisiae及びC. glutamicumにおいて試験した。S. cerevisiae(図8、以下のTable 6(表11))において、最良のパフォーマンスをした株は111mg/Lのヒスタミンを生産し、Chromobacterium sp. LK1由来のヒスタミンデカルボキシラーゼ(UniProt ID A0A0J6KM89)(配列番号51)、及びDNA配列がY. lipolytica(配列番号63、53)にコドン最適化されたSaccharomyces cerevisiae S288c由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(UniProt ID P00498)(配列番号3)を発現した。DNA配列がS. cerevisiae(配列番号65、57)及びB. subtilis(配列番号67、55)にコドン最適化された同一の2つの遺伝子もまた試験し、それぞれ86mg/L及び101mg/Lを生産した。

C. glutamicumにおいて(図9、Table 7(表12))、最良のパフォーマンスをした株は68mg/Lのヒスタミンを生産し、Acinetobacter baumannii(株AB0057)由来のヒスタミンデカルボキシラーゼ(UniProt ID B7I459)(配列番号1)と、DNA配列がC. glutamicum及びS. cerevisiaeについての修正されたコドン使用頻度表を使用してコドン最適化された(配列番号72、73)、Saccharomyces cerevisiae S288c由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(UniProt ID P00498)(配列番号3)とを発現した。DNA配列がY. lipolytica(配列番号52、53)又はS. cerevisiae(配列番号56、57)にコドン最適化された同一の2つの遺伝子もまた試験し、これらの株は、それぞれ16mg/L及び18マイクログラム/Lのヒスタミンを生産した。

C. glutamicumにおける2番目に良いパフォーマンスをした株は、15mg/Lのヒスタミンを生産し、また、DNA配列がY. lipolyticaにコドン最適化された(配列番号52)、Acinetobacter baumannii株AB0057由来のヒスチジンデカルボキシラーゼ(UniProt ID B7I459)(配列番号1)、及びDNAがY. lipolyticaにコドン最適化された(配列番号58)、Salmonella typhimurium LT2由来のATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(UniProt ID P00499)(配列番号5)を発現した。DNA配列がB. subtilisにコドン最適化された(配列番号54、59)(これは8mg/Lのヒスタミンを生産した)、又はS. cerevisiaeにコドン最適化された(配列番号56、60)(これは9.3mg/Lのヒスタミンを生産した)、これらの同一の2つの遺伝子もまた試験した。

最良のパフォーマンスをした株は宿主Y. lipolyticaにあるため、更なる株の改良をこの宿主生物において求めることができる。Y. lipolyticaにおけるヒスタミン生産を更に増強させ得る改変としては、以下が含まれる。

1.ペントースリン酸経路における糖の相互変換を触媒し、ヒスチジン生合成経路における最初の代謝産物であるPPRPの前駆体であるリボース-5-リン酸を生産する、トランスケトラーゼ(EC 2.2.1.1)(配列番号27)。

2.リボースリン酸ピロホスホキナーゼ(EC 2.7.6.1)(配列番号28)。

3.ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(EC 2.4.2.17)(配列番号5)。

4.三官能性のヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.23)/ホスホリボシル-AMPシクロヒドロラーゼ(EC 3.5.4.19)/ホスホリボシル-ATPジホスファターゼ(EC 3.6.1.31)(配列番号20)。

5.ヒスチジノール-リン酸アミノトランスフェラーゼ(EC 2.6.1.9)(配列番号14)。

6. 5'ProFARイソメラーゼ(EC 5.3.1.16)(配列番号31)。

7.イミダゾールグリセロールリン酸シンターゼ(EC 4.3.1.B2)(配列番号21)。

8.アミノ酸置換I170Vを有するトリオースリン酸イソメラーゼ(EC 5.3.1.1)(配列番号32)。

9.アミノ酸置換A243Tを有するグルコース-6リン酸1-デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.49)(配列番号26)。

10.様々なヒスチジンデカルボキシラーゼ:
a. UniProt ID A0A089YPE5(配列番号33)
b. UniProt ID A0A126S6G9(配列番号34)
c. UniProt ID A0A0A1R6V3(配列番号35)
d. UniProt ID A0A1W0CM88(配列番号36)
e. UniProt ID P00862(配列番号4)
f. UniProt ID A0A0K6GJ74(配列番号37)
g. UniProt ID T0QL99(配列番号38)
h. UniProt ID A0A1B8HLR1(配列番号39)

ヒスタミンを生産するように改変されたYarrowia lipolyticaにおけるヒスタミン生産の向上
遺伝子改変の3つの改良ラウンドを、Yarrowia lipolyticaにおいて行った。

Yarrowia lipolyticaにおける第1の改良ラウンドの遺伝子改変
戦略:2つの酵素の過剰発現による、ヒスチジンへの、次いでヒスタミンへのフラックスの向上。

概要:ATPホスホリボシルトランスフェラーゼは、ヒスチジン生合成経路の第1の関与段階を触媒する。この酵素は、ヒスチジンによってアロステリックにフィードバック阻害され、AMP及びADPによって競合的に阻害される。結果は、P00498の活性及び/又は阻害を示さなかった。

Yarrowia lipolyticaにおける第2の改良ラウンドの遺伝子改変
戦略:1つの酵素の過剰発現。ヒスタミン生合成の最終工程を、タンパク質のフォールディングを向上させるために溶解タグを含むように修正された最良の1ラウンド目のヒスチジンデカルボキシラーゼを利用することによって増強した。

概要:遺伝子改変の2ラウンド目に使用したヒスチジンデカルボキシラーゼは、1ラウンド目のものと同一であったが、コドン最適化は異なっていた。更に、N末端溶解タグ(MQYKLALNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVT、配列番号142)を、2ラウンド目の酵素に含めた。

Yarrowia lipolyticaにおける第3の改良ラウンドの遺伝子改変
戦略:ホスホリボシルピロリン酸(PRPP)へのフラックスを向上させるための、ヒスチジン生合成の上流経路における2つの酵素の過剰発現。

概要:リボースリン酸ピロホスホキナーゼは、競合的に阻害されるADPである。酵素上のATP結合部位でのL135I突然変異は、ADP阻害を緩和する。この株は、培養培地1L当たり1.68gの力価でヒスタミンを発現した。

(参考文献)

Claims (15)

1. 非天然のヒスチジンデカルボキシラーゼを発現する改変された微生物細胞であって、ヒスタミンを生産する、改変された微生物細胞。
2. 改変された微生物細胞が、1つ又は複数の上流ヒスタミン経路酵素の増大した活性を含み、前記増大した活性が、コントロール細胞と比較して増大している、請求項1に記載の改変された微生物細胞。
3. 1つ又は複数の上流ヒスタミン経路酵素が、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ、ホスホリボシル-ATPピロホスファターゼ、ホスホリボシル-AMPシクロヒドロラーゼ、5'ProFARイソメラーゼ、イミダゾール-グリセロールリン酸シンターゼ、イミダゾール-グリセロールリン酸デヒドラターゼ、ヒスチジノール-リン酸アミノトランスフェラーゼ、ヒスチジノール-リン酸ホスファターゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、及びリボースリン酸ピロホスホキナーゼからなる群から選択される、請求項2に記載の改変された微生物細胞。
4. 改変された微生物細胞が、1つ又は複数のヒスタミン経路前駆体を消費する1つ又は複数の酵素の低減した活性を含み、前記低減した活性が、コントロール細胞と比較して低減している、請求項1に記載の改変された微生物細胞。
5. フィードバックが緩和されたグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ又はフィードバックが緩和されたATPホスホリボシルトランスフェラーゼを更に発現する、請求項1に記載の改変された微生物細胞。
6. 非天然のヒスチジンデカルボキシラーゼを発現させるための手段を含み、ヒスタミンを生産する、改変された微生物細胞。
7. グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ又はフィードバックが緩和されたATPホスホリボシルトランスフェラーゼを発現させるための手段を更に含む、請求項6に記載の改変された微生物細胞。
8. 真菌細胞を含む、請求項1に記載の改変された微生物細胞。
9. 非天然のヒスチジンデカルボキシラーゼが、Chromobacterium sp. LK1又はAcinetobacter baumannii株AB0057由来のヒスチジンデカルボキシラーゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するヒスチジンデカルボキシラーゼを含む、請求項1に記載の改変された微生物細胞。
10. 細菌細胞である、請求項1に記載の改変された微生物細胞。
11. 改変された微生物細胞が、1つ又は複数の上流ヒスタミン経路酵素の増大した活性を含み、前記増大した活性が、コントロール細胞と比較して増大しており、1つ又は複数の上流ヒスタミン経路酵素が、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ及びイミダゾール-グリセロールリン酸デヒドラターゼを含む、請求項1に記載の改変された微生物細胞。
12. 請求項1に記載の改変された微生物細胞の培養物。
13. 培養培地1L当たり少なくとも20mgのレベルでヒスタミンを含む、請求項12に記載の培養物。
14. 請求項1に記載の改変された微生物細胞を培養する方法であって、ヒスタミンを生産するために適した条件下で細胞を培養する工程を含む、方法。
15. ヒスタミンを生産するように改変された微生物細胞を使用してヒスタミンを調製するための方法であって、
    (a)非天然のヒスチジンデカルボキシラーゼを微生物細胞において発現させる工程、
    (b)微生物細胞を、適切な培養培地において、微生物細胞によるヒスタミンの生産を可能にする条件下で培養する工程であって、ヒスタミンが培養培地に放出される工程、及び
    (c)ヒスタミンを培養培地から単離する工程
    を含む、方法。

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