JP2001069871A - ヒスタミン欠如動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒスタミン合成酵素ＨＤＣの遺伝子に変異を
有する非ヒト哺乳動物と、この動物を用いた各種試験方
法を提供する。 【解決手段】 染色体のヒスチジン脱炭素酵素遺伝子が
その機能欠失型変異遺伝子に置換されている全能性細胞
を個体発生して得られる非ヒト動物およびその子孫動物
であって、ヒスタミン合成能を持たないことを特徴とす
るヒスタミン欠如動物と、この動物を用いてヒスタミン
関連疾患の治療薬剤をスクリーニングする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、ヒスタミ
ン欠如動物に関するものである。さらに詳しくは、この
出願の発明は、体細胞染色体のヒスタミン合成酵素遺伝
子がその機能欠失型変異遺伝子に置換された遺伝子ノッ
クアウト動物であって、体内においてヒスタミンを合成
する能力を持たないヒスタミン欠如動物と、この動物を
用いた各種試験方法に関するものである。これらの動物
および試験方法は、医薬品開発等の分野において有用で
ある。

【０００２】

【従来の技術とその課題】ヒスタミン（histamine）
は、生体内にて作用する生体内活性物質（オータコイ
ド：autacoids）の一種であり、生体内では皮膚、肺、
消化管等に多く分布し、アレルギーやアナフィラキシー
時に放出され、じんま疹や炎症等の発症、血液変化など
に関係している。また胃粘膜ではエンテロクロマフィン
細胞中に存在して胃液の分泌促進に重要な役割を果たし
ていることから、胃潰瘍の発症に関係していることも知
られている。

【０００３】このように、ヒスタミンはヒトの様々な疾
患や体調変化に関係しており、その作用メカニズムを解
明することは、ヒスタミン関連疾患等の治療法や治療薬
剤の開発に必須である。そしてそれらの疾患や体調変化
は、生体内の様々な組織、器官の相互作用によって顕在
化することから、モデル動物を用いたin vivo系におけ
るヒスタミン作用の検討が不可欠である。

【０００４】従来、動物個体を用いてヒスタミンの作用
を検討するためには、例えば、ヒスタミンの作用する受
容体の阻害剤やヒスタミン合成酵素阻害剤等を動物に投
与する方法が用いられてきた。しかしながら、これらの
薬剤は抗ヒスタミン作用が不十分であり、しかも副作用
があるため、純粋にヒスタミンの作用を判定することが
困難であるといった問題を有していた。

【０００５】このため、ヒスタミンの作用を正確に判定
することのできるモデル動物系の開発が強く望まれてい
た。またこのようなモデル動物は、ヒスタミンが関係す
る各種疾患に対する治療薬剤等の開発のための強力なツ
ールとなるものと期待されていた。

【０００６】この出願は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであって、体内においてヒスタミンを合成
する能力を持たないヒスタミン欠如動物を提供すること
を課題としている。

【０００７】また、この出願は、このヒスタミン欠如動
物を用いた各種の試験方法と、この試験方法を実施する
のに必要な動物飼育用飼料を提供することを課題として
もいる。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決するための発明として、以下の(1)〜(6)の発明を
提供する。 (1) 染色体のヒスチジン脱炭素酵素遺伝子がその機能欠
失型変異遺伝子に置換されている全能性細胞を個体発生
して得られる非ヒト動物およびその子孫動物であって、
ヒスタミン合成能を持たないことを特徴とするヒスタミ
ン欠如動物。 (2) 非ヒト動物が、マウスである前記(1)のヒスタミン
欠如動物。 (3) ヒスタミン関連疾患におけるヒスタミンの作用を試
験する方法であって、ヒスタミン低含量飼料により飼育
した前記(1)または(2)の動物に疾患原因を提示し、動物
の症状の変化を指標としてヒスタミンの作用を試験する
ことを特徴とする方法。 (4) ヒスタミン関連疾患に対する治療薬剤をスクリーニ
ングする方法であって、ヒスタミン低含量飼料により飼
育した前記(1)または(2)の動物にヒスタミンを投与する
と共に疾患原因を提示し、さらにこの提示前または提示
後もしくは提示前後に候補薬剤を動物に投与し、動物の
症状の変化を指標として治療薬剤の効果を判定すること
を特徴とする方法。 (5) ヒスタミン低含量飼料が、ヒスタミン含量0.5〜2.0
nmol/gの動物用飼料である前記(4)または(5)の方法。 (6) ヒスタミン含量が0.5〜2.0 nmol/gである動物用飼
料。

【０００９】以下、上記の各発明について実施の形態を
詳しく説明する。

【００１０】

【発明の実施の形態】この出願によって提供される前記
発明(1)のヒスタミン欠如動物は、ヒスタミン合成酵素
であるヒスチジン脱炭素酵素（L-Histidine decarboxyl
ase：ＨＤＣ）遺伝子がその機能欠失型変異遺伝子に置
換されている全能性細胞を個体発生して得られる遺伝子
ノックアウト非ヒト動物である。さらに詳しくは、この
発明(1)のヒスタミン欠如動物は、体細胞染色体のＨＤ
Ｃ遺伝子がその変異配列に置換されているヘテロ接合体
あるいはホモ接合体子孫動物同士の交配によって得られ
るＨＤＣ遺伝子変異ホモ接合体動物として提供される。

【００１１】この発明(1)のヒスタミン欠如動物は、公
知の標的遺伝子組換え法（ジーンターゲティング法：Sc
ience 244:1288-1292, 1989）により作製することがで
きる。この標的遺伝子組換え法では、分化全能性細胞と
してＥＳ（embryonic stem）細胞等を使用する。ES細胞
は、マウス（Nature 292:154-156, 1981）、ラット（De
v. Biol. 163(1):288-292, 1994）、サル（Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 92(17):7844-7848, 1995）、ウサ
ギ（Mol. Reprod. Dev. 45(4):439-443, 1996）で確立
している。また、ブタについてはＥＧ（embryonic ger
m）細胞が確立している（Biol. Reprod 57(5):1089-109
5, 1997）。従ってこの発明(1)のヒスタミン欠如動物
は、これらの動物種を対象に作製することができるが、
特に遺伝子ノックアウト動物の作製に関して技術が整っ
ているマウスが最適である。作製の具体的手続を、前記
発明(2)のマウスを例にとって説明すれば以下のとおり
である。

【００１２】先ず、ＨＤＣ遺伝子のゲノムＤＮＡ断片を
単離し、そのＤＮＡ断片を試験管内にて遺伝子操作し、
ＨＤＣ遺伝子の開始コドンを含むＤＮＡ断片に対して改
変を施すなどの、ＨＤＣ遺伝子の機能を欠失させるよう
な変異ＤＮＡ断片を作製する。ＨＤＣゲノムＤＮＡの単
離は、例えば、公知のマウスＨＤＣのcＤＮＡ配列（FEB
S Lett. 276:214-218, 1990）に基づいて合成されたオ
リゴヌクレオチドプローブを用いてマウスゲノムＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングすることにより得られ
る。また、このマウスＨＤＣcＤＮＡの一部または両端
に相当する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとする
ＰＣＲ法によっても目的とするゲノムＤＮＡを得ること
ができる。なお、マウス以外の動物を対象とする場合に
も、マウスＨＤＣcＤＮＡ配列に基づいて合成されたオ
リゴヌクレオチドをプローブまたはプライマーとする前
記の方法により、各動物のＨＤＣ遺伝子を単離すること
ができる。また、ラットについてはそのｃＤＮＡ配列が
報告されている（Pro. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 87:733
-737, 1990）ので、これを用いることができる。

【００１３】上記のとおりの方法によって得られたマウ
スＨＤＣ遺伝子のゲノムＤＮＡの一部を改変し、全能性
細胞（ＥＳ細胞）のＨＤＣ遺伝子に変異を導入するため
のターゲティングベクターを、公知の方法（例えば、Sc
ience 244:1288-1292, 1989）に準じて作製する。例え
ば、ＨＤＣ遺伝子のゲノムＤＮＡの一部をＧ４１８等の
細胞毒に対する耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性
遺伝子）に置換することにより、もしくは細胞毒に対す
る耐性遺伝子をＨＤＣ遺伝子のゲノムＤＮＡの一部に挿
入することで、ＨＤＣゲノムＤＮＡと相同な配列を両端
に有する変異遺伝子を保有する組換えプラスミドＤＮ
Ａ、すなわちターゲティングベクターを作製する。な
お、細胞毒に対する耐性遺伝子には、その発現を制御す
るためのＰＧＫ１プロモーター等の配列およびＰＧＫ１
ポリアデニレーションシグナル等を連結することもでき
る。また、細胞毒に対する耐性遺伝子により置換、また
は挿入されるＨＤＣ遺伝子のゲノムＤＮＡ部位は、開始
コドンを含んだエクソン領域を含むゲノムＤＮＡ領域で
あることが好ましい。

【００１４】上記ＨＤＣ遺伝子のゲノムＤＮＡの一部に
変異を導入するためのターゲティングベクターには、Ｈ
ＤＣゲノムＤＮＡに相同な配列を有すること以外には特
に制限はなく、他の薬剤耐性遺伝子や、細胞選択用遺伝
子（例えば、ジフテリア毒素Ａ遺伝子やヘルペスウイル
スのサイミジンキナーゼ遺伝子）、プロモーター、エン
ハンサー等の配列を適宜に組み合わせて使用することが
できる。

【００１５】次に、このターゲティングベクターを、公
知の方法に準じてマウスＥＳ細胞に導入する。このよう
な遺伝子導入法としては、公知の電気パルス法、リポソ
ーム法、リン酸カルシウム法等も利用できるが、導入遺
伝子の相同遺伝子組換え効率を勘案した場合、ＥＳ細胞
への電気パルス法が好ましい。

【００１６】遺伝子導入された各ＥＳ細胞のＤＮＡを抽
出し、サザンブロット分析やＰＣＲアッセイ等により、
染色体上に存在する野生型ＨＤＣ遺伝子と導入したＨＤ
Ｃ変異遺伝子断片の間で正しく相同遺伝子組換えが起こ
り、染色体上のＨＤＣ遺伝子に変異が移った細胞を選択
する。

【００１７】こうして得た変異遺伝子を持つＥＳ細胞を
野生型マウスのブラストシストに注入し、つづいてこの
キメラ胚を仮親の子宮に移植する。出生した動物を里親
につけて飼育させた後、ＨＤＣ変異遺伝子が生殖系細胞
に入ったキメラ動物を選別する。選別は毛色の違い、ま
たは体の一部（例えば尾部先端）からＤＮＡを抽出し、
サザンブロット分析やＰＣＲアッセイ等により行う。Ｈ
ＤＣ変異遺伝子が生殖系細胞に入ったキメラ動物と野生
型動物の交配により得られる子孫について、さらに体の
一部（例えば尾部先端）からの抽出ＤＮＡを材料とし
た、サザンブロット分析やＰＣＲアッセイ等を行い、Ｈ
ＤＣ変異遺伝子が導入されたヘテロ接合体を同定する。
さらにヘテロ接合体同士の交配により、ＨＤＣ変異遺伝
子に関してホモ接合体となった個体動物を得る。作出さ
れたＨＤＣ変異遺伝子を保有するヘテロ接合体、あるい
はホモ接合体は生殖細胞および体細胞のすべてに安定的
にＨＤＣ遺伝子変異を保有しており、交配等により、効
率よくその変異を子孫動物に伝達することができる。

【００１８】このようにして作製されたＨＤＣ遺伝子に
変異を有する動物は、例えばＨＤＣ遺伝子産物を全く持
たないホモ接合体（ＨＤＣ null mutant：−／−）の場
合、自らは体内でヒスタミンをほとんど合成することが
できないため、ヒスタミンが関連する各種疾患の発症メ
カニズムの解明や、疾患治療薬剤スクリーニングのため
の最適のモデル動物となる。

【００１９】この出願の前記発明(3)は、発明(1)のヒス
タミン欠如動物を用いて、各種ヒスタミン関連疾患おけ
るヒスタミン作用を試験する方法である。また、前記発
明(4)は、発明(1)の動物を用いて、ヒスタミン関連疾患
に対する治療薬剤をスクリーニングする方法である。こ
れらの方法においては、先ず第１に、ヒスタミン欠如動
物を「ヒスタミン低含量飼料」によって飼育することを
特徴としている。すなわち、発明の(1)のヒスタミン欠
如動物は、前記のとおり自らは体内でヒスタミンを合成
する能力を持たないが、通常の実験動物飼料は蛋白源と
して魚粉が多く含まれており、この魚粉は大量のヒスタ
ミンを含有しているために、ヒスタミン欠如の効果を判
定することができないからである。

【００２０】ヒスタミン低含量飼料としては、発明(6)
のよって提供される「ヒスタミン含量が0.5〜2.0 nmol/
gである動物用飼料」を用いることができる。このよう
な動物用飼料は、蛋白源として植物性のタンパク質を配
合することによって調製することができる。

【００２１】さらに、発明(3)および(4)の方法において
は、ヒスタミン低含量飼料によって飼育したヒスタミン
欠如動物に対して、ヒスタミン関連疾患の原因を提示す
る。このような原因提示は、例えばアレルギー反応の場
合には各種アレルゲンの投与等であり、あるいは胃潰瘍
の場合には毒物投与やストレス条件下への暴露等であ
る。そして、発明(3)の場合には、これらの疾患原因の
提示後、ヒスタミンの有無による症状の変化を観察する
ことによって、各種疾患に対するヒスタミン作用を判定
することができる。また。発明(4)の方法では、ヒスタ
ミンの投与とともに原因提示を行い、さらに治療薬剤の
候補物質を投与して症状の変化を観察することにより、
より有効な治療薬剤を特定することができる。

【００２２】以下、実施例を示してこの発明についてさ
らに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例
に限定されるものではない。

【００２３】

【実施例】実施例１：ヒスタミン欠如マウスの作成 公知の方法により、マウスｃＤＮＡライブラリーより得
られるＨＤＣcＤＮＡ断片をプローブとして、マウスの
ゲノムＤＮＡライブラリー（129／Ｐ１ファージミッド
ライブラリー）をスクリーニングし、ＨＤＣ遺伝子の翻
訳開始コドンを含む約24kbのゲノムＤＮＡ断片を得た。
得られたＤＮＡ断片のエキソン、イントロン境界部およ
びＨＤＣ翻訳開始コドンを含む複数のエキソン領域のＤ
ＮＡ塩基配列を解析して、ＨＤＣ遺伝子のゲノム構造を
決定した（図１）。試験管内遺伝子組換えにより、エク
ソン６から８の領域をネオマイシン耐性遺伝子を含むカ
セットで置換し、ターゲティングベクターを構築した。
詳しくは、このターゲティングベクターは、ネオマイシ
ン耐性遺伝子カセットの両端に、相同領域として２つの
ＨＤＣゲノムＤＮＡ断片10kbおよび５kbを有し、さらに
相同組換えを起こしたＥＳ細胞を濃縮するため、ヘルペ
スウイルスのサイミジンカイネース遺伝子を末端に付加
した（図２）。線状化したターゲティングベクターを、
公知のマウス129／Ｊ１ＥＳ細胞（Nature 379:168-171,
1996）に電気パルス法にて導入した後、Ｇ４１８の培
地添加により、遺伝子導入されたＥＳ細胞を選別、単離
した。単離された約300のクローンのうち、６クローン
について各ゲノムＤＮＡを抽出しサザンブロット分析を
行い、染色体上に存在する野生型ＨＤＣ遺伝子と、導入
した変異ＨＤＣ遺伝子断片の間で正しく相同遺伝子組換
えが起こり、染色体上のＨＤＣ遺伝子に変異が移った細
胞を３クローン選択した。

【００２４】こうして得た変異遺伝子を持つＥＳ細胞を
野生型マウスのブラストシストに注入し、つづいてこの
キメラ胚を定法に従って仮親の子宮に移植し、個体へと
発生させ、出生させた。出生した動物を里親につけて飼
育させた後、ＨＤＣ変異遺伝子が生殖系細胞に入ったキ
メラ動物を選別した。選別は毛色の違い、および尾部先
端からＤＮＡを抽出し、サザンブロット分析およびＰＣ
Ｒアッセイにより行った。ＨＤＣ変異遺伝子が生殖系細
胞に入った雌のキメラ動物と野生型マウス雄ＩＣＲの交
配によりヘテロ接合体マウスを含む子孫マウスを得た。

【００２５】得られたマウス個体の尾部先端からＤＮＡ
を抽出し、サザンブロット分析およびＰＣＲアッセイを
行い、ＨＤＣ変異遺伝子が導入されたヘテロ接合体を選
別した。

【００２６】このようにして、ＨＤＣ変異遺伝子に関す
るヘテロ接合体が得られ、さらに、Ｃ５７ＢＬ／６への
戻し交配により、生殖細胞および体細胞染色体に安定的
にＨＤＣ遺伝子変異を保有するマウス系統が作成され
た。ＨＤＣ変異遺伝子に関してホモ接合体となった個体
動物は、ヘテロ接合体同士の交配により得られ、その遺
伝子型の同定は上記と同様にして行った。 実施例２：ヒスタミン低含量飼料の作成 以下の組成からなる動物用飼料を調製した。

【００２７】 トウモロコシ 8.0％ 小麦 29.1％ 小麦粉 15.0％ 大豆粕 25.0％ ミルク 12.0％ 大豆外皮 4.5％ 動物性油脂 3.0％ 食塩 0.25％ 炭酸カルシウム 0.9％ リン酸カルシウム 1.65％ 塩化コリン 0.1％ ビタミン混合 0.25％ ミネラル混合 0.25％ この飼料のヒスタミン含量は、0.9 nmol/g〜1.2 nmol/g
であった。 実施例３：ＨＤＣ遺伝子変異マウスのヒスタミン量の検
討 実施例１で作成したＨＤＣ遺伝子変異マウスを、実施例
２で作成したヒスタミン低含量飼料により１週間飼育し
たのち、各種臓器におけるヒスタミン量と、ＨＤＣ活性
を測定した。

【００２８】ヒスタミン量の測定は、高速液体クロマト
グラフィーと蛍光測定法を組み合わせた公知の方法（J.
Chromatogr. 344:115-123, 1985）に準拠して行った。
すなわち、各組織をホモジェナイザーで破砕後、過塩素
酸で処理し、遠心分離した後、その上清の一部を高速液
体クロマトグラフィーで分離し、アルカリ条件下で蛍光
色素o-phthalaldehydeを加えて反応させ、反応物の蛍光
強度を指標としてヒスタミン量を測定した。

【００２９】またＨＤＣ活性は、公知の方法（J. Bioch
em. 107:834-839, 1990）に基づき、ヒスチジンを基質
としたヒスタミンの合成反応により測定した。すなわ
ち、各臓器をＨＤＣ反応用の緩衝液内で超音波処理によ
り破砕し、この破砕物を遠心処理後、上清を分離し、Ｈ
ＤＣ反応用の緩衝液で一晩透析した。透析後、Ｌ−ヒス
チジンを基質として加え、２時間、37℃で反応させて生
成されたヒスタミンを上記の方法により測定し、ＨＤＣ
活性量とした。

【００３０】結果は表１に示したとおりである。測定し
た全ての臓器において、ヒスタミン量およびＨＤＣ活性
とも、野生型マウス（＋／＋）、ヘテロ接合型マウス
（＋／−）、ホモ接合型マウス（−／−）の順で低下し
た。この結果から、実施例１で作成したＨＤＣ遺伝子変
異マウスが、ヒスタミン欠如マウスであることが確認さ
れた。また、実施例２で作成した飼料が、ヒスタミン低
含有飼料として有効であることが確認された。

【００３１】なお、ホモ接合型マウスの場合であって
も、ヒスタミンを添加した飼料によって飼育することに
より、野生型マウスと同定度のヒスタミン量を獲得する
ことが確認された。ただし、ヒスタミン添加飼料によっ
てもＨＤＣ活性はほとんど存在しなかった。

【００３２】

【表１】

【００３３】実施例３：皮膚アレルギーに対する感受性
の確認 ヒスタミン低含量飼料によって飼育した野生型マウス
（＋／＋）およびホモ接合型マウス（−／−）に肥満細
胞脱顆粒剤Compound 48/80を投与し、皮膚アレルギー
（背部皮膚血液漏洩反応）を観察した。Compound 48/80
は、肥満細胞から顆粒を放出させ、これによってヒスタ
ミン等が血管内に進入し、血液を漏出させる作用を有す
る。

【００３４】結果は図３の写真図に示したとおりであ
る。野生型マウスもホモ接合型マウスも、ヒスタミンを
投与した場合には同程度に血液漏出反応を生じさせる
が、Compound 48/80を投与した場合、ホモ接合マウスで
は肥満細胞からのヒスタミン放出がないため、血液漏出
が全く観察されなかった。

【００３５】また、受動感作皮膚反応ＰＣＡ（Passive
Cutaneous Anaphylaxis）より野生型マウスおよびホモ
接合型マウスの耳介皮膚血液漏出反応も試験した。結果
は図４に示したとおりであり、野生型マウスではＰＣＡ
により血液漏出が観察されたのに対し、ヒスタミンを欠
如したホモ接合型マウスでは血液漏出は全く観察されな
かった。

【００３６】以上の結果から、この発明のヒスタミン欠
如マウスがアレルギー等の各種ヒスタミン関連疾患につ
いて研究するための有効なモデル動物となりうることが
確認された。

【００３７】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、ＨＤＣ遺伝子に機能的欠損を有するヒスタミン
欠如動物が提供される。これらの動物によって、ヒトの
各種ヒスタミン関連疾患の病因および病態解析、並びに
その治療技術、治療薬等の開発が促進される。

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスＨＤＣ遺伝子の構造を示した模式図であ
る。

【図２】マウスＨＤＣ遺伝子の構造（上段）と、ターゲ
ティング・ベクターの構造（中段）、並びにターゲティ
ング・ベクターによる相同組換え後の遺伝子構造（下段
を示した模式図である。

【図３】野生型およびホモ接合型マウスにおけるヒスタ
ミン投与およびCompound 48/80投与による血液漏出反応
の状態を示した写真図である。

【図４】野生型およびホモ接合型マウスにおけるＰＣＡ
反応後の血管外への色素漏出量を示したグラフである。
左側の棒グラフは抗体処理していないコントロールであ
り、右側は抗ＤＮＰ抗体で処理したマウスの結果であ
る。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 染色体のヒスチジン脱炭素酵素遺伝子が
   その機能欠失型変異遺伝子に置換されている全能性細胞
   を個体発生して得られる非ヒト動物およびその子孫動物
   であって、ヒスタミン合成能を持たないことを特徴とす
   るヒスタミン欠如動物。
2. 【請求項２】 非ヒト動物が、マウスである請求項１の
   ヒスタミン欠如動物。
3. 【請求項３】 ヒスタミン関連疾患におけるヒスタミン
   の作用を試験する方法であって、ヒスタミン低含量飼料
   により飼育した請求項１または２の動物に疾患原因を提
   示し、動物の症状の変化を指標としてヒスタミンの作用
   を試験することを特徴とする方法。
4. 【請求項４】 ヒスタミン関連疾患に対する治療薬剤を
   スクリーニングする方法であって、ヒスタミン低含量飼
   料により飼育した請求項１または２の動物にヒスタミン
   を投与すると共に疾患原因を提示し、さらにこの提示前
   または提示後もしくは提示前後に候補薬剤を動物に投与
   し、動物の症状の変化を指標として治療薬剤の効果を判
   定することを特徴とする方法。
5. 【請求項５】 ヒスタミン低含量飼料が、ヒスタミン含
   量0.5〜2.0 nmol/gの動物用飼料である請求項４または
   ５の方法。
6. 【請求項６】 ヒスタミン含量が0.5〜2.0 nmol/gであ
   る動物用飼料。