JP2000510001A - 分断されたｎｐｙ ｙ１受容体遺伝子を有するトランスジェニック動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、相同組み換えにより処理された、ニューロペプチドＹのＹ１受容体を産生しないトランスジェニック動物に関する。さらに、本発明は、トランスジェニック動物を得るために用いるＤＮＡ構築物および胚性幹細胞、ならびに当該動物または当該動物由来組織のいずれかを用いるアッセイも包含する。

Description

【発明の詳細な説明】 分断されたＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子を有するトランスジェニック動物 発明の分野 本発明は、相同組み換えにより処理された、ニューロペプチドＹのＹ１受容体 を産生しないトランスジェニック動物に関する。さらに、本発明は、トランスジ ェニック動物を得るために用いるＤＮＡ構築物および胚性幹細胞、ならびに当該 動物または当該動物由来組織のいずれかを用いるアッセイも包含する。 発明の背景 Ａ．ニューロペプチドＹの生理学 ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）は３６個のアミノ酸のペプチドであり、ＮＰＹ 、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）および膵臓ポリペプチド（ＰＰ）からなる神経内分泌 ペプチドのファミリーに属する。当該ペプチドは哺乳動物の中枢および末梢神経 系に広く分布している（Grundemar，et al.，Gen．Pharmacol．24:785(1993);Mc Dermott，et al.，Cardiovasc．Res．27：893(1993)）。脳において、ＮＰＹは 視床下部、辺縁系および皮質に特に豊富に存在する(Dimaggio，et al.，Neurosc i．15:1149(1985))。末梢において、当該ペプチドは、血管および他の平滑筋組 織を囲む交感神経線維中に局在化している。 ＮＰＹは潜在的に治療上有効な非常に広範な生理学的効果を発揮する。ＮＰＹ は、単独で投与された場合には血管収縮を誘導し、ＫＣｌ、ＡＴＰ、アンギオテ ンシンＩＩおよびヒスタミンのごとき他の血管収縮剤とともに投与された場合に は相乗的に作用する（Wahlestedt，et al.，Ann．NY Acad．Sci．611:7(1990);L undberg，et al.，Ann．NY Acad．Sci．611:166(1990)；Wahlestedt，et al.，A m．J．Physiol．258:R736(1990)；Oshita，et al.，Gen．Pharmacol．20:363(19 89)）。冠状動脈に作用する場合、ＮＰＹの血管収縮作用は狭心症を引き起こす 可能性がある（Clarke，et al.，Lancet 1(8541):1057(1987)）。さらに、 ＮＰＹは、血管作用性物質に複数回曝露してからの脱感作後またはエンドトキシ ンショック後において、血管収縮剤に対する応答を回復させることが見出されて いる（Hauser，et al.，Am．J．Physiol．265:H1416(1993)）。 またＮＰＹは、動脈および静脈平滑筋組織に対してマイトジェン的効果を及ぼ し、高血圧における心臓血管系亢進に関与しうる。最近のデータは、当該ペプチ ドが塩基性線維芽細胞増殖因子と同様に効果的に血管形成を促進しうることを示 唆している（Zukowska-Grojec，et al.，Peptides 14:263(1993)）。 ＮＰＹの第３の生理学的作用は、視床下部による体温、エネルギーバランスお よび代謝の調節におけるものである。視床下部領域に注射した場合、ＮＰＹが食 物摂取を誘導するということを示す証拠が存在する（Clark，et al.，Endocrino l.115:427(1984);Stanley，et al.，Life Sci．35:2635(1984)；Levine，et al. ，peptides 5:1025(1984)）。最近の報告は、当該ペプチドが、ＯＢ／レプチン( 中枢神経系に作用して食物消費を減少させる蛋白)の作用についての主要インジ ケーターであり（Stephens，et al.，Nature 377:530(1995)）、さらに当該ペプ チドが脂肪細胞に対する直接的抗脂質分解効果を有すること（Castan，et al.， Am．J．Physiol．265:E74(1993)）を示唆している。 他の結果は、ＮＰＹがいくつかの形態のＩＩ型糖尿病の治療において重要であ りうることを示唆している（Skoglund，et al.，Diabetes 40:660(1991);Opara ，et al.，Regul．Peptides 34：225(1991)）。当該ペプチドの脳室内注射は、 自律的制御による膵臓の島からのインスリン分泌を促進するが、末梢においては ＮＰＹは膵臓インスリン放出に対して直接的な阻害効果を有する。 ＮＰＹに関して報告されたさらにもう１つの生理学的効果はゴナドトロピン分 泌の調節におけるものである。当該ペプチドが卵胞成熟および排卵において役割 を果たしている可能性も示されている(Watanobe，et al.，Biochem．Biophys．R es．Comm．200:1111(1994)；Karla，et al.，Ann．NY．Acad．Sci．611:273(199 0);Jorgensen，et al.，Neuropep．30:293(1996))。ラットにおいて性機能の減 退に伴ってＮＰＹレベルが上昇し、当該ペプチドの腹腔投与は性行為を減少させ ることが見出されている。さらに、性ステロイドがＮＰＹレベルのフィードバッ ク を行っているといういくつかの証拠もある（Sahu，et al.，Endocrinol．130:33 31(1992);Urban，et al.，Endocrinol．132:139(1993)）。 動物のうつ病のモデルにおいて皮質におけるＮＰＹ濃度の低下が観察されてお り、抗うつ剤がＮＰＹ産生を促進することが見出されている（Wiederlov，et al .，Clin．Neuropharmacol．９(Suppl．4):572(1986)）。動物の不安症のモデル においてＮＰＹは不安寛解効果を生じることが報告されている（Heilig，et al. ，Psycopharmacol．98:524(1989)）。さらに、大部分のうつ病または重症の不安 症の患者のＣＳＦならびに幾人かの自殺者の脳組織においてＮＰＹ濃度が低下し ている（Wiederlov，et al.，in NPY，V．Mutt et al．ed.，pp．331 Raven Pre ss，NY(1989);Wahlstedt，et al.，Annu．Rev．Pharmacol．Toxocol．32:309(19 93)）。 ＮＰＹの他の効果は、マウスにおいて観察されたような記憶保持の向上(Nakaj ima，et al.，J．Pharmacol．Exp．Ther．268:1010(1994)）；動物の痛みのモデ ルにおける無痛（Broqua，et al.，Brain Res．724:25(1996)）；興奮性アミノ 酸グルタミン酸の阻害（てんかんにおける正の役割を示唆）（Greber，et al.， Br．J．Pharmacol．113:737(1994)）；ならびに鼻の血管拡張、鼻漏および気管 支分泌の転調（アレルギー性鼻炎およびのう胞性繊維症の治療において重要であ る可能性を示唆）（Lacroix，et al.，Br．J．Pharmacol．118:2079(1996);Mert en，et al.，Am．J．Physiol．266:L513(1994)）を包含する。 Ｂ．ニューロペプチドＹ１受容体 少なくとも６つの異なるＮＰＹ受容体のサブタイプが記載されており、４つの サブタイプがクローン化されている。Ｙ１、Ｙ２等と命名された受容体サブタイ プは、最初はそれらのＮＰＹ、ＰＰＹおよびＰＰに対する選択性ならびにそれら のＮＰＹアナログおよびＣ末端フラグメントへの結合に基づいて分類されていた （表１；Wahlestedt，et al.，Regul．Pept．13:307(1986)参照）。 表１：ＮＰＹ受容体サブタイプの特徴 Ｙ１はＮＰＹ受容体のうち最もよく特徴が調べられており、マウス(Eva，et a l.，FEBS Lett．314:285(1992))、ラット（Eva，et al.，FEBS Lett．271:80(19 90)）、およびヒト（Larhanlmar，et al.，Ｊ．Biol．Chem．267:10935(1992)） からクローン化されている。当該受容体はシナプス後部にあり、末梢におけるＮ ＰＹの作用の大部分を伝達すると考えられている。末梢におけるＮＰＹのＹ１へ の結合は血管収縮および動脈血圧の上昇を引き起こすと考えられている(Larhamm ar,et al.，J．Biol．Chem．267:10935(1992);Larharnmar,et al.，J．Biol．Ch em．267:10935(1992);Westfall，et al.，Ann.NY Acad．Sci．611:145(1990))。 中枢神経系におけるＹ１受容体は、当該ペプチドの不安寛解作用および自発的歩 行活動の低下を包含するＮＰＹの種々の効果と関連がある(Wahlestedt，et al. ，Science 259：528(1993))。 すべてのＮＰＹ受容体サブタイブについてあてはまることだが、Ｙ１はＧ蛋白 結合受容体ファミリーに属する。異なる種からのＹ１のクローニング、配列決定 および発現により、Ｇ蛋白結合受容体の特徴である７つの膜貫通ドメインの存在 が確認され、Ｙ１受容体遺伝子は小さなイントロンにより分割された２つのコー ディングエキソン（エキソン２およびエキソン３）の周辺に組織化されているこ とが明らかとなった（Herzog，et al.， J．Biol．Chem．268:6703(1993);米国 特許第５５７１６９５号）。 Ｃ．相同組み換えを用いる遺伝子標的 遺伝子標的化は、外来ＤＮＡ配列を宿主細胞のゲノム中の特定部位に導入する 手順である。典型的には、目的遺伝子に対して相捕的な配列(標的化配列(target ing sequence))が非相同的エレメントに隣接するように使用されているＤＮＡ構 築物を集める。エレクトロポレーションを包含する種々の手法によりこれらの構 築物を細胞に導入する。ついで、構築物は細胞の核中に入り、そこでそれらはゲ ノムＤＮＡにアニーリングする。十分に理解されていない種々の因子のため、「 クロスオーバー」が時々起こり、アニールした相同的ＤＮＡ配列が宿主ゲノム中 の対応配列と置き換わる。このことが起こった場合、組み換え構築物中に存在す る非相同的ＤＮＡが運搬され、宿主ゲノムの一部となる。非相同的ＤＮＡの導入 を用いて選択遣伝子を修飾して、それがもはや正常な生成物を発現できないよう にすることができる。 相同組み換えにより構築物ＤＮＡが宿主ゲノム中の特定部位に導入される可能 性があるが、より典型的には、ＤＮＡ配列は不適切な部位に導入される。相同組 み換えをランダムなゲノム挿入と区別するために、所望遺伝子座において組み換 えが起こった細胞の集団を豊富化させる「陽性／陰性選択」といわれる方法が開 発された（Mansour，et al.，Nature 336:348(1988)）。抗生物質耐性遺伝子（ 宿主細胞ゲノム中に組み込まれた場合、細胞を選択可能にする（陽性選択))を含 むように標的化ベクターを処理することにより、これを行う。ベクターはさらに 、相同的標的化配列に隣接した単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−チミジンキナ ーゼ（ＴＫ）遺伝子を含む。機能的にゲノム中に組み込まれた場合、ＨＳＶ−Ｔ Ｋは細胞を薬剤ガンシクロビル感受性とする。構築物ＤＮＡが正しい遺伝子座に 組み込まれ、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子がゲノムに移行されないようにベクターを設計 する。対照的に、組み込みがランダムに起こる場合には、機能的ＨＳＶ−ＴＫ遺 伝子がゲノムＤＮＡに取り込まれる。よって、ガンシクロビル存在下で組み換え 体をインキュベーションすることにより、ランダムに組み換えが起こった細胞を 選択する。 最近、相同組み換えにより生じたゲノム変異体をマウスの生殖細胞中に導入す るための手法が開発された（説明のため、Capeccっhi，TIG 5:70(1989)参照）。 胚盤胞の段階の発達中のマウス胚から胚性幹（ＥＳ）細胞を単離し、相同組み換 えにより新たな配列をゲノムＤＮＡ中に導入できるＤＮＡ構築物のための宿主と して使用する。修飾ＥＳ細胞が胚盤胞中に再導入される場合、それらは生じるキ メラ動物のすべての組織（生殖系列を包含）の形成に貢献する（Bradley，et al .，Nature 309：255(1984)）。キメラ動物およびそれらのヘテロ接合子孫を交雑 させることにより、変異に関してホモ接合であるマウスを得ることができる。か くして、特定の遺伝子産物を完全に欠損したマウスを得ることが可能である。 Ｄ．ＮＰＹ受容体サブタイプに結合する治療薬としての作用剤 上記のごとく、ＮＰＹは非常に多くの生理学的事象を伝達するペプチドであり 、その事象の多くは治療上重要なものである。しかしながら、ＮＰＹ作用の多様 性は、ペプチド自体が患者の治療において有用である可能性をなくしている。そ のかわり、高い特異性を有する新たな作用剤の開発が必要であり、このことは、 ＮＰＹ受容体の各サブタイプにより伝達される個々の作用を理解することを要す るであろう。 本発明者らは、相同組み換えを用いて、Ｙ１受容体の発現を欠損させる変異を 含んでいる細胞およびトランスジェニック動物を開発した。受容体欠損トランス ジェニック動物由来の受容体欠損細胞および組織をそれらの正常対応細胞および 組織と一緒に結合アッセイに使用して、種々のＮＰＹアナログおよび誘導体のＹ １受容体サブタイプに対する特異性を評価してもよい。同様に、薬剤をトランス ジェニック動物に直接投与して、それらの効果がＹ１結合に依存しているかどう かを決定してもよい。よって、本発明は、ＮＰＹ Ｙ１受容体結合についての治 療薬としてのアゴニストおよびアンタゴニストを開発する手段を提供する。 発明の概要 本発明は、ニューロペプチドＹのＹ１受容体への結合を転調させることにより 作用する薬剤の評価に使用できる動物モデルの開発に基づく。本発明は、トラン スジェニック動物自体のみならず、これらの動物の開発に用いる種々の材料、そ れらを得るための方法、ならびにそれらを用いるアッセイを包含する。 Ａ．ＤＮＡ構築物 第１の態様において、本発明は、ＮＰＹ Ｙ１受容体の産生を欠損したトラン スジェニック動物の開発に使用できるＤＮＡ構築物に指向される。該構築物は、 宿主細胞のゲノム中の内在性Ｙ１受容体遺伝子のヌクレオチド配列を必須として 含む標的化セグメント（targeting segment）を含んでいなければならない。標 的化セグメントの一部は、内在性Ｙ１受容体遺伝子には通常存在しないマーカー 配列で中断または置換されていなければならない。宿主細胞中に導入された場合 、標的化セグメントはゲノム中の内在性Ｙ１受容体遺伝子部位に組み込まれる可 能性のあるものでなくてはならない。このことが起こる場合、十分に機能的なＹ １受容体を合成できない変異ＮＰＹ Ｙ１受容体対立遺伝子が生じる。 さらに説明するに値する上記ＤＮＡ構築物のいくつかの特徴がある。第１に、 構築物の標的化セグメントの必須の特徴は、それが内在性ＮＰＹ Ｙ１受容体遺 伝子配列に対して十分に相同性を有し、当該遺伝子座において相同組み換えを受 けるものでなくてはならないということである。Ｙ１受容体を通常的に発現する いずれの細胞タイプを用いてもよいが、マウス細胞が好ましい。 標的化セグメントの一部を中断または置換するのに使用されるマーカー配列は 、十分に分断されてもはや十分には機能的でない蛋白を生じる組み換えＮＰＹ Ｙ１配列を生じさせるものでなければならない。例えば、マーカーがＮＰＹ Ｙ １受容体遺伝子の正常な読み枠を分断して、ニューロペプチドＹに全く結合でき ない蛋白を生じさせるものであってもよい。好ましくは、マーカー配列は宿主細 胞において発現され、相同組み換えを受けた細胞の選択を助けるために使用でき る生成物を生じる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして使用して もよい。 マーカーヌクレオチド配列は、配列中に挿入された場合、ＮＰＹ Ｙ１受容体 遺伝子を「分断」し、その結果、もとのＮＰＹ Ｙ１ヌクレオチドはまだすべて 存在 しているが、マーカー配列により分離される。もとのＮＰＹ Ｙ１配列の一部が 欠失され、マーカー配列がそれに取って代わる場合には置換が起こる。 用語「十分に機能的でないＮＰＹ Ｙ１受容体」は、ニューロペプチドＹに対 する実質的に低下したアフィニティーを有する受容体をいう。たいていの場合、 受容体が生成されないか、あるいはニューロペプチドＹに対する結合能を完全に 失った受容体が生成されるかのいずれかであると考えられ、そのことが一般的に 好ましい。 「マーカー」配列のほかに、ＤＮＡ構築物はさらに、ＮＰＹ Ｙ１遺伝子座に おいて組み換えが起こっている細胞と、ゲノム中の他の部位において組み換えが 起こっている細胞とを区別するのに用いることのできる「選択配列」を含んでい てもよい。最も好ましい選択配列はＨＳＶ−チミジンキナーゼを含むものである 。 最後に、本発明は、ＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子の特定部分に由来するＤＮＡ構 築物に限定されるのでなく、また、マーカーによる遺伝子の中断または置換が特 定部位において生じる必要もない。有効であることが示された１のＤＮＡ構築物 はＮＰＹ Ｙ１受容体のエキソン２およびエキソン３を含むものであり、エキソ ン２の大部分およびエキソン２と３との間のイントロンの大部分を置換するよう にネオマイシン耐性遺伝子が使用されているものである。好ましい具体例におい て、この構築物は選択配列としてＨＳＶ−チミジンキナーゼ遺伝子を含む。 Ｂ．ＤＮＡ構築物で形質転換された宿主細胞 上記ＤＮＡ構築物のほかに、本発明は、これらの構築物を含む宿主細胞を包含 する。ＮＰＹ Ｙ１受容体を通常発現するいずれの細胞タイプを宿主として役立 ててもよいが、最も好ましくは、宿主はマウス胚性幹細胞であろう。 Ｃ．ＮＰＹ Ｙ１受容体欠損トランスジェニックマウスの製造方法 もう１つの態様において、本発明は、ＮＰＹ Ｙ１受容体が実質的に存在しな いことにより特徴づけられる表現型を有するトランスジェニックマウスの製造方 法に指向される。この方法の第１工程は、上記手順によるＤＮＡ構築物の製造を 包 含する。構築物は、マウスＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子のヌクレオチド配列を必須 として含む標的化セグメントを含む。標的化フラグメント（targeting fragment ）の一部は、通常にはＹ１中に見出されないマーカー配列を組み込むこと、ある いはかかるマーカー配列と置換することにより修飾される。マウスＥＳ細胞のゲ ノムの内在性ＮＰＹ Ｙ１遺伝子部位に組み込まれることができ、そのように組 み込まれた場合に、十分に機能的な受容体を合成することのできない変異ＮＰＹ Ｙ１対立遺伝子を生じるように、フラグメントを構築する。 本発明方法における次の工程は、該フラグメントをマウスのゲノムのＮＰＹＹ １受容体遺伝子座中に組み込むことを目的として、構築物をマウス胚性幹細胞中 に導入することを包含する。そのようにして製造された組み換え幹細胞を選択し 、ついで、マウス胚盤胞中に導入してキメラ胚を得る。これを偽妊娠マウス中に 移植し、発達させて生きた子孫とする。 上記手順を用いて得られた子孫をスクリーニングして、変異ＮＰＹ Ｙ１受容 体対立遺伝子を含むヘテロ接合マウスを同定する。ついで、これらのマウスを交 雑させて、十分に機能的なＮＰＹ Ｙ１受容体が実質的に存在しないことにより 特徴づけられる表現型を有するホモ接合トランスジェニックマウスを得る。 上記方法に使用するＤＮＡ構築物を構築する際に、マーカー配列がネオマイシ ン耐性遺伝子を含み、構築物がさらにＨＳＶ−チミジンキナーゼ遺伝子を含むこ とが好ましい。機能的でない遺伝子産物を生じるＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子配列 のいずれの位置にマーカーを挿入してもよいが、ネオマイシン耐性遺伝子を用い てエキソン２の部分を置換することが好ましい。 上記方法のほかに、本発明は、上記方法により製造されるトランスジェニック マウスにも指向される。典型的には、これらのマウスは機能的なＮＰＹ Ｙ１受 容体を全く有していない。しかしながら、本発明は、受容体数が実質的に減少し ているか、あるいは受容体がニューロペプチドＹに対するアフィニティーを大幅 に低下させているマウスも包含する。 Ｄ．トランスジェニック動物 もう１つの態様において、本発明は、トランスジェニック動物に指向され、該 トランスジェニック動物はＮＰＹ Ｙ１受容体の実質的不存在（トランスジェニ ック動物でない場合には本来的に存在する）により特徴づけられる表現型を有す る。好ましくは、上記方法を用いてトランスジェニック動物を得るのであるが、 該動物はマウスであり、体細胞および生殖細胞の両方におけるＮＰＹ Ｙ１受容 体遺伝子座に存在する導入遺伝子を含む。さらに、本発明は、トランスジェニッ ク動物から得られ、細胞、組織または細胞系からなる生物学的材料を包含する。 これらの細胞、組織および細胞系は、ＮＰＹ Ｙ１受容体が実質的に存在しない （その正常対応物中には本来的に存在する）ことにより特徴づけられる。 Ｅ．トランスジェニック動物およびトランスジェニック動物由来の組織を用い るアッセイ方法 また本発明は、ＮＰＹ Ｙ１受容体の産生を欠損するように処理されたトラン スジェニック動物を用いてアッセイを行う方法にも指向される。１のアッセイは 、薬剤がＮＰＹ Ｙ１受容体の不存在下で生理学的応答を生じるかどうかを調べ ることを目的として薬剤を評価するために設計される。薬剤を上記トランスジェ ニック動物に投与し、ついで、特定の応答に関して動物をアッセイすることによ り、これを行う。生理学的パラメーターをこのアッセイにおいて測定できるが、 好ましい応答は以下のものである：血圧変化；新生血管形成；痛覚消失；摂食行 動の変化；体重変化；体温変化；インスリン分泌；ゴナドトロピン分泌；鼻およ び気管支の分泌；血管収縮；記憶喪失；不安；痛みまたはストレス応答。 トランスジェニック動物由来の組織を受容体結合アッセイに使用して、試験化 合物がＮＰＹ Ｙ１受容体に結合するかどうかを決定してもよい。ＮＰＹ Ｙ１受 容体の産生を欠損するように処理されたトランスジェニック動物から第１の受容 体調合物を得て、ニューロペプチドＹに結合することが知られている源から第２ の受容体調合物を得ることにより、これらのアッセイを行うことができる。一般 的には、第１および第２の受容体調合物は、起源を除いてはすべての点において 類似したものである。例えば、トランスジェニック動物の脳組織をアッセイに使 用する場合、正常マウス由来の比較可能な脳組織を用いることが考えられる。受 容体調合物を得た後、試験化合物不存在下または存在下において、ニューロペプ チドＹ受容体に結合することが知られているリガンドとともにそれらをインキュ ベーションしてもよい。好ましくは、試験化合物をいくつかの異なる濃度として 試験する。 リガンド結合が試験化合物により置換される程度を、第１および第２の受容体 調合物について調べるべきである。トランスジェニックマウス由来の組織をアッ セイに直接使用してもよく、あるいは膜または膜蛋白を単離するために設計され た種々の手順を組織に対して行ってもよい。好ましいトランスジェニック動物は マウスであり、好ましいリガンドは検出可能に標識されたニューロペプチドＹで ある。結合アッセイに適合するいずれの手段を用いてリガンドを標識してもよい 。これには放射活性標識、酵素標識または化学発光標識が包含されるが、これら に限らない。 Ｆ．Ｙ１受容体サブタイプに特異的に結合するＮＰＹアンタゴニストを投与す ることによる食物摂取の減少 上記トランスジェニック動物の開発は、Ｙ１受容体の特別な作用に応答して食 物摂取が変化しうるという知見を導いた。よって、本発明は、ＮＰＹ Ｙ１受容 体サブタイプの作用をブロックすることによる、食物摂取を制限する必要のある 対象における食物摂取を減少させる方法にも指向される。ＮＰＹの作用に拮抗し 、Ｙ１に特異的に結合する作用剤を投与することにより、これを行ってもよい。 対象は、ヒトまたは通常にはＮＰＹを産生する動物であってよい。「ＮＰＹの 作用に拮抗する」作用剤は、ＮＰＹの投与により動物において通常に誘導される 生理学的応答を抑制する化合物を包含する。一般的には、ＮＰＹ受容体に結合す るが、結合に応答したアデニルシクラーゼ作用を促進しない化合物はアンタゴニ ストであろう。「Ｙ１に特異的に結合」なる語句は、他のＮＰＹ受容体サブタイ プを排してＹ１受容体サブタイプに結合する作用剤についていう。よって、特異 的結合物質は、Ｙ２、Ｙ３等に対するよりもＹ１に対して少なくとも数百倍高い アフィニティーを有すると考えられる。ＮＰＹアンタゴニスト不存在下で消費さ れた食物量に対する減少量を測定し、一定期間（例えば１週間）の食物摂取量の 有意（ｐ≦０．０５）な減少および／または体重の有意な減少により確証しても よい。これらの方法の１つにおいて反映される食物消費を減少させるに十分な量 および期間、ＮＰＹのＹ１に特異的なアンタゴニストを投与すべきである。 図面の簡単な説明 図１：図１は、相同組み換えに使用したマウスＮＰＹ Ｙ１受容体対立遺伝子 ならびに該対立遺伝子を分断するために使用した標的化セグメントを示す。２つ のＥｃｏＲＩ部位間の標的化セグメント中にネオマイシン耐性遺伝子をマーカー として組み込んだ。第１のＥｃｏＲＩ部位はエキソン２中にあり、第２のＥｃｏ ＲＩ部位はその次のイントロン中にある。さらに標的化ベクターは、エキソン３ のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入されたＨＳＶ−チミジンキナーゼ遺伝子を含む。標 的化ベクターと野生型対立遺伝子との間の相同組み換えにより得られた組み換え 対立遺伝子も図中に示す。最後に、引き続き行った実験においてＤＮＡフラグメ ントの同定に使用したプローブの位置を示す。 図２：図２は、野生型マウス（ＷＴ）またはＮＰＹ Ｙ１受容体変異に関して ホモ接合であるマウス（ＫＯ）に由来する脳組織膜調合物を用いた競合アッセイ の結果を示す。一定量の放射性標識ＮＰＹの結合を、未標識ＮＰＹまたは未標識 ＢＩＢＰ（ＮＰ１のＹ１特異的アナログ）のいずれかの濃度を上昇させながら測 定した。未標識ＮＰＹは、野生型およびＫＯマウス双方の膜に結合していた標識 ＮＰＹを排除してこれに置き換わった。このことは予想できる。なぜなら、未標 識ＮＰＹは、膜に存在するすべてのタイプのＮＰＹ受容体への結合に関して競合 できるからである。対照的に、未標識ＢＩＢＰはＹ１受容体サブタイプを求めて 競合できるだけであり、結果として、野生型動物の膜から標識ＮＰＹを排除して これに置き換わる能力の低下を示す。未標識ＢＩＢＰは、ＫＯマウス由来の膜に おける標識ＮＰＹとの有意な置換を示さず、ＮＰＹ Ｙ１受容体の不存在が示さ れた。 図３：図３は、野生型マウス（白）、ＮＰＹ Ｙ１変異に関してヘテロ接合で あ るマウス（斜線）、およびＮＰＹ Ｙ１受容体変異に関してホモ接合であるマウ ス（黒）における血圧に対するＮＰＹ投与の効果を示す。マウスの頸動脈に挿入 され、圧力変換器に接続されたカテーテルを用いることにより血圧変化を調べた 。ＮＰＹを０．２４μｇ／Ｋｇ、１．２μｇ／Ｋｇ、６μｇ／Ｋｇおよび３０μ ｇ／Ｋｇの濃度としてマウスの頸静脈に挿入した別個のカテーテルを用いて投与 した。結果により、ＮＰＹ投与による血圧の生理学的上昇は、Ｙ１受容体サブタ イプへのＮＰＹの結合のためであることが示唆される。 図４：ＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子の一部分のヌクレオチド配列を示す。実施例 １記載のように、Ｙ１含有ファージを求めてマウスゲノムＤＮＡライブラリーを スクリーニングする際にこの配列をプローブとして使用した。示した配列を配列 番号：１とする。 図５：図は、図１に示したＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩプローブのヌクレオチド 配列を示す。このプローブは実施例２記載の実験に使用したものであり、配列番 号：２とする。 図６：図６は、飢餓状態の野生型マウス（白、（＋／＋））および飢餓状態の ＮＰＹ Ｙ１受容体欠損マウス（黒、（−／−））において食物消費を比較した 研究の結果を示す。動物を２４時間絶食させ、ついで、あらかじめ秤量しておい た量のエサを与えた。それから９０分後、エサを再秤量して消費量を測定した。 結果を、９０分の試験期間に消費されたエサの量（体重に対して正規化）として 示す。 発明の詳細な説明 本発明は、内在性ＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子を分断するために使用できるＤＮ Ａ構築物；組み換え細胞、詳細にはＤＮＡ構築物を取り込ませることにより製造 される組み換え胚性幹細胞；ならびに組み換え細胞の製造方法に指向される。分 断されたＹ１受容体対立遺伝子を含むように処理された胚性幹細胞を発達中の胚 中に取り込ませ、最終的には、ＮＰＹ Ｙ１受容体を欠損したトランスジェニッ クマウスの製造に使用することができる。ニューロペプチドＹの結合により媒介 され る症状の治療において潜在的に有用な薬剤を評価する目的で、かかるマウスを用 いるアッセイを行ってもよい。トランスジェニックマウス自体およびそれらを用 いるアッセイはともに本発明の一部である。 Ａ．ＤＮＡ構築物 本発明ＤＮＡ構築物は、正常な場合には活性のある遺伝子の分断に使用される ので、文献中でしばしば「ノックアウト」構築物と呼ばれる。典型的には、それ らは、宿主中の内在性遺伝子に対して非常に相同的でありかつ非相同的マーカー 配列により分断された配列を有する比較的長い（＞１Ｋｂ）標的化セメントを含 む。構築物中に用いる標的化セグメントを、当該分野においてよく知られた標準 的方法によりゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子から得てもよい(Sambrook，et al .，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)参照)。例えば、既知配列に基づくＰＣＲ 増幅により、または本明細書実施例記載のようにゲノムライブラリーを適当なプ ローブを用いてスクリーニングすることにより、ＮＰＹ Ｙ１受容体の一部分を 単離してもよい。別法として、化学合成法を用いて構築物中の標的化セグメント を製造してもよい。 マーカー配列を取り込ませるために、特定部位で切断するように選択された１ またはそれ以上の制限酵素で標的化セグメントを消化することができる。相同組 み換え後にＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子を分断して機能的遺伝子産物を消失させる いずれの位置であっても十分である。よって、ＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子の受容 体の構造配列中または調節エレメント、例えばプロモーターにおいて分断が生じ てもよい。 構築物中に使用されるマーカー配列は、典型的には、抗生物質耐性遺伝子また は発現を容易に検出でき、通常には宿主中に存在しない他の遺伝子であろう。構 築物中のプロモーターに作動可能に連結された結果として、あるいは相同組み換 えの結果として本来のＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子プロモーターの制御下に置くこ とにより、マーカー遺伝子を宿主中で発現させてもよい。プロモーターが構築物 の 一部である場合、相同組み換えを受けている特定の宿主細胞中で高い活性を有す ることに基づいてプロモーターを選択すべきである。マウス細胞中での使用に適 したプロモーターの典型例はホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のプロモーター である（実施例１の構築物中のネオマイシン耐性遺伝子の発現を誘導するために 使用される）。マーカーとして使用される最も好ましい遺伝子はネオマイシン耐 性遺伝子（Ｎｅｏ）である。ゲノム中にＮｅｏを組み込まれ、この遺伝子を発現 する細胞はＧ４１８耐性である。よって、簡単な手段が組み換え細胞の選択に用 いられる。プロモーターのほかに、典型的には、マーカー遺伝子はその３’末端 に結合したポリＡ配列を有する。 ＮＰＹ Ｙ１受容体を分断するために、そして相同組み換えを受けた細胞を同 定するために使用されるマーカー遺伝子のほかに、典型的には、本発明構築物は 、組み換えがＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子座で起こった細胞とゲノム中のいずれか の位置で組み換えが起こった細胞との間の区別のために使用できる遺伝子を含む 。好ましくは、この「選択配列」は適当なプロモーターの制御下にあるＨＳＶ− チミジンキナーゼ遺伝子であろう。相同組み換えが起こったすべての細胞を選択 するためのマーカー配列ならびにランダム組み換えと特異的組み換えとを区別す るための選択配列の組み合わせは「陽性−陰性選択」と呼ばれ、両配列の詳細、 その手順ならびに当該手順に適した構築物の製造は当該分野においてよく知られ ている（Capecchi，M．TIG 5:70(1989);Mansour，et al.，Nature 336:348(1988 );Thomas，et al.，Cell 51：503(1987);およびDeotschman，et al.，Nature 33 0:576(1987)参照）。 ＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子分断用ＤＮＡ構築物を適当な宿主中に直接トランス フェクションしてもよく、あるいはまず増幅用ベクター中に入れてからトランス フェクションしてもよい。好ましいベクターは、細菌細胞中で迅速に増幅される ものであり、例えば、pBluescript IISKベクター(Stratagene，San Diego，Cali f.)またはpGEM ７（Promega Corp.，Madison，Wis.）がある。 ＤＮＡ構築物は環状または直鎖状であってよい。しかしながら、宿主細胞中へ のトランスフェクション前に環状構築物を直鎖状にすることが一般的には好まし い。ＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子をＤＮＡ構築物の製造に使用してもよいが、一般 的にはマウス由来の受容体遺伝子に対して相同的な配列が好ましい。 Ｂ．ＤＮＡ構築物を含む宿主細胞の製造 本発明は、上記ＤＮＡ構築物を用いて遺伝子操作された細胞を包含する。通常 にＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子を発現するいずれのタイプの細胞を宿主として使用 してもよい。このような細胞としては、ヒト、ラット、ハムスター、マウス等由 来の細胞があるが、これらに限らない。さらに以下に説明するように、最も好ま しい宿主細胞はマウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。 ＮＰＹ Ｙ１受容体欠損トランスジェニックマウスを製造することが好ましい 場合には、発達中の胚の生殖細胞系に取り込まれ、その一部となる能力に基づい てＥＳ細胞を選択すべきである。この特性を有するＥＳ細胞系はいずれも使用可 能であり、例えば、ネズミ細胞系Ｄ３（ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockvill e，Md，カタログ番号ＣＲＬ１９３４）がある。適当な宿主細胞を選択した後、 それらを培養し、当該分野でよく知られた方法を用いてＤＮＡ挿入用に調製する （例えば、Robertson，In Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell:A Pract ical Approach ,E．J．Robertson，ed，IRL Press，Washington，DC(1987);Bradl ey，et al.，Current Topics in Devel．Biol．20:357-371(1986);およびHogan ，et al.，Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N．Y．(1986)参照）。 宿主細胞へのＮＰＹ Ｙ１構築物の導入を、エレクトロポレーション、マイク ロインジェクションまたはリン酸カルシウム処理のごとき種々の方法を用いて行 うことができる。胚性幹細胞の場合、好ましい挿入方法はエレクトロポレーショ ンである。ＤＮＡ構築物をベクター中に挿入する場合、トランスフェクション前 にＤＮＡを直鎖状にするのが好ましい。ＮＰＹ Ｙ１構築物の配列の外側を切断 するように選択された制限エンドヌクレアーゼを用いてＤＮＡベクターを消化す ることにより直鎖状にする。 トランスフェクションされた細胞のスクリーニングを、いくつかの異なる方法 を用いて行うことができる。抗生物質耐性遺伝子をマーカーとして用いる場合、 抗生物質存在下で細胞を培養して組み換え体を同定することができる。他のタイ プのマーカーを用いる場合、マーカー配列に特異的な標識プローブを用いてサザ ンハイブリダイゼーションを行ってもよい。最後に、マーカー遺伝子が、活性を 検出できる酵素（例えば、ベーターガラクトシダーゼ）をコードしている場合、 酵素のアッセイを行ってもよい。 組み換えが起こっている細胞を同定するのみならず、特定の組み換え、すなわ ちＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子座での組み込みをゲノムの他の位置で起こっている ランダムな組み換えから区別することが、通常には望ましいであろう。正しい組 み換えが起こっている細胞を同定するために、標準的方法を用いて染色体ＤＮＡ を細胞から抽出し、構築物由来のＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションする ように設計されたプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行うことが できる。別法として、受容体遺伝子座において相同組み換えが起こっている細胞 においてのみ作動するプライマーあるいはかかる細胞から産生される既知のもの とは異なる産物を生じるプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うこともできる。 Ｙ１受容体遺伝子座において修飾された組み換え体に関して調合物を豊富化さ せる１の方法は、構築物中の標的化セグメントに隣接した位置にＨＳＶ−チミジ ンキナーゼ遺伝子を組み込むことである。Ｙ１受容体遺伝子部位において組み換 えが起こった場合にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子だけが宿主細胞ゲノム中に移行されるよ うに構築物を設計する。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は細胞を薬剤ガンシクロビルに対し て感受性にするので、組み換え体をこの薬剤に曝露することにより、ランダムな 組み換えが起こっている細胞がネガティブに選択されるであろう(Mansour，et a l.，Nature 336:348(1988))。 相同組み換えは、両方の対立遺伝子の分断よりもずっと高頻度で１のＹ１受容 体対立遺伝子の分断を引き起こすことが理解されよう。それゆえ、ＮＰＹ Ｙ１ 遺伝子が完全に欠損した細胞を得ることが望ましい場合、１の対立遺伝子が分断 されているものとしてすでに選択されている細胞に対して第２ラウンドの相同組 み換えを行うことが必要である。第２ラウンドのトランスフェクションにおいて 、 最初の組み換え体の製造に使用したものとは異なるマーカーを使用すべきである 。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いて１の分断された対立遺伝子を有する 細胞を得る場合、第２の構築物においてベーターガラクトシダーゼをマーカーと して用いてもよい。Ｙ１受容体部位に組み込まれたＤＮＡを有する細胞のスクリ ーニングを上記のごとく行ってもよい。最終的には、ＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子 の両対立遺伝子の分断は、細胞膜への標識ニューロペプチドＹの結合消失に反映 されるはずである。 Ｃ.十分に機能的なＮＰＹ Ｙ１受容体の実質的不存在により特徴づけられるト ランスジェニック動物の開発 変異ＮＰＹ Ｙ１対立遺伝子を含むように処理された、上記相同組み換えによ り製造される胚性幹細胞を用いて、トランスジェニック動物が機能的なＹ１受容 体を実質的に有しないようにしてもよい。これらの動物は、Ｙ１に特異的なリガ ンドへの結合能喪失および／またはＹ１遺伝子座からの発現の消失により特徴づ けられる。好ましくは、動物はＹ１受容体を全く産生しない。かかる動物の製造 に必要な方法論を、ハムスター、ラット、または好ましくはマウスのごとき非ヒ ト動物に適用することができる。 トランスジェニック動物製造の第１工程は、変異ＮＰＹ Ｙ１受容体対立遺伝 子を含むように相同組み換えにより修飾されたＥＳ細胞を得ることである。上記 手順を用いてこの工程を行ってもよい。 次の工程は、変異胚性幹細胞を胚に取り込ませることである。この工程を行う ための好ましい方法は、発達における胚盤胞期の胚にマイクロインジェクション することによる。マウスにおいて、妊娠動物の子宮を潅流することにより発達約 ３．５日目の胚盤胞を得てもよい(Bradley，in Teratocarcinomas and Embryoni c Stem Cells:A Practical Approach，Robertson，E．D.，IRLP Press，Washing ton，DC(1987))。好ましい胚盤胞は雄性であり、毛の色または幹細胞遺伝子によ りコードされる対応マーカーとは異なる他の表現型マーカーをコードする遺伝子 を有するものである。このようにして、変異ＮＰＹ Ｙ１受容体対立遺伝子の存 在に関し て容易にスクリーニングできる子孫を得る。例えば、ＥＳ細胞系が白色の毛に関 する遺伝子を担持する場合、選択される胚は、好ましくは、黒または褐色の毛に 関する遺伝子を担持するものであり、変異Ｙ１対立遺伝子を担持する子孫はモザ イク状の毛色を有するはずである。 胚性幹細胞を胚盤胞に取り込ませた後、キメラ胚を偽妊娠動物の子宮に移植す る。メスを同じ種の精管切除したオスと交雑させることによりかかる動物を得て もよい。メスの偽妊娠の段階は移植の成功にとり重要であり、種により様々であ る。マウスについては、典型的には偽妊娠２〜３日目のメスを用いるべきである 。 キメラ胚を偽妊娠動物に移植した後、それらを発達させ、ついで、変異ＮＰＹ Ｙ１受容体対立遺伝子の存在について子孫をスクリーニングする。表現型選択 法を用いる場合、例えば上記の毛色による場合、モザイク状の毛色または他の容 易に識別できるマーカーについて動物を簡単に検査することにより最初のスクリ ーニングを行ってもよい。さらに、あるいは別法として、染色体ＤＮＡを子孫の 組織から、例えばマウスの尾の組織から得て、サザンブロットおよび／またはＰ ＣＲ増幅を用いてＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子座における修飾ヌクレオチド配列の 存在についてスクリーニングしてもよい。 ＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子変異を担持する子孫が同定されたならば、それらを 交雑させて、機能的ＮＰＹ Ｙ１受容体合成の減損により特徴づけられるホモ接 合動物を得ることができる。上記のごとくサザンブロットまたはＰＣＲ増幅を用 いてヘテロ接合体を同定してもよい。交差したヘテロ接合体の子孫から、ヘテロ 接合体自体から、そして野生型動物から得た等量のゲノムＤＮＡをサザンブロッ トすることによりホモ接合体を同定してもよい。すべての動物に存在するＮＰＹ Ｙ１遺伝子の一部に結合するようにプローブを設計すべきであり、オートラジ オグラフのバンドの相対位置により変異対立遺伝子の存在を調べることができる 。別法として、ＰＣＲ増幅生成物の相対サイズに基づいて、あるいは通常にはＮ ＰＹ Ｙ１受容体を発現することが知られている組織を用いて結合アッセイを行 うことにより分析を行ってもよい。 トランスジェニック動物を同定し特徴づけるための他の手段も利用可能である 。 例えば、子孫動物の組織から得られたｍＲＮＡを、ノーザンブロットを用いてプ ローブし、ＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子、マーカー遺伝子、あるいはそれら両方を コードする転写物の存在または不存在を調べることができる。さらに、ウェスタ ンブロットを用いて、受容体特異的抗体でプローブすることによりＮＰＹ Ｙ１ 受容体発現を評価してもよい。 ホモ接合トランスジェニック動物が同定されたならば、それらを交雑させて、 機能的なＮＰＹ Ｙ１受容体の存在に依存する病気の同定および下記アッセイに おける薬剤の評価に使用できる動物を連続的に供給してもよい。さらに、これら の動物は、十分に機能的なＮＰＹ Ｙ１受容体の不存在により正常動物由来の対 応細胞、組織および細胞系とは異なっている細胞、組織および細胞系の源を提供 することもできる。 Ｄ．トランスジェニック動物およびトランスジェニック動物由来の生物学的材 料を用いるアッセイ方法 ＮＰＹ Ｙ１受容体サブタイプ欠損トランスジェニック動物は、何通りかの新 たな治療薬の開発における助けとなりうる。第１に、動物を用いて特定症状の治 療に必要な受容体サブタイプを同定することができる。例えば、ニューロペプチ ドＹアナログまたは誘導体が正常動物の体重を増加させ、かつ血圧を上昇させる ことが見出されたとする。ＮＰＹ Ｙ１受容体欠損動物に薬剤を投与することに より、これらの生理学的効果がＮＰＹ Ｙ１受容体への結合に依存するものであ るかどうかを決定することができる。望ましくない特性、例えば血圧上昇がＮＰ Ｙ Ｙ１受容体結合に関連して見出された場合、薬剤開発のための合理的方法は 、さらに薬剤を修飾してＹ１受容体結合をなくすようにするか、あるいはＹ１受 容体に特異的なアンタゴニストとともに薬剤を同時投与することであろう。 典型的には、薬剤の生理学的効果を評価し、受容体特異性に基づく薬剤開発法 に到達するように設計されたアッセイは、種々の実験群に分割された正常動物お よび受容体欠損動物の両方を使用することを包含するであろう。例えば、正常お よび受容体欠損双方の動物を処理群および対照群に置いてもよい。薬剤処理群に は試験化合物を与え、対照群には試験化合物を与えない。 試験すべき特定の１またはそれ以上の生理学的特性選択し、所望薬剤を処理群 および対照群に投与し、ついで、観察結果を評価することにより、アッセイ自体 を行ってもよい。一般的には、各群において十分な数の動物使用して統計学的に 有意な結果を得ることができるようにすることが望ましい。試験されうる種々の 生物学的特性としては：血圧（高血圧および心臓血管系の疾病の治療の評価に有 用）；新生血管形成および血管新生（傷の治癒を促進しあるいは腫瘍増殖を抑制 する薬剤の評価に有用）；痛みに対する感度（痛覚消失剤または麻酔剤の開発に 有用）；摂食行動（拒食症、貧食症、肥満またはＩＩ型糖尿病の治療薬の開発に 有用）；体温、エネルギーバランスおよび代謝の変化（異常なホルモン分泌に関 連した症状の治療薬の開発に有用）；インスリン分泌（糖尿病のための薬剤の開 発に有用）；ゴナドトロピン分泌（不妊または性機能不全のための薬剤の開発に 有用）；気管支分泌（のう胞性線維症のための薬剤の評価に有用）；鼻の血管拡 張および鼻漏（アレルギー性鼻炎のための薬剤の開発に有用）；記億喪失（アル ツハイマー病のための薬剤の開発に有用）；不安およびストレス（抗うつ薬の開 発に有用）；ならびに血管収縮（心臓血管系作用剤の開発に有用）が挙られる。 変更してもよいパラメーターとしては、薬剤投与期間、用量、投与経路または剤 形が挙られる。作用剤の組み合わせを調べること、および種々の年齢または生理 学的状態の動物、例えば体重過剰動物を調べることが望ましいかもしれない。 正常およびＮＰＹ Ｙ１受容体欠損動物における試験のために、しばしば薬剤 を結合特性に基づいて選択する。例えば、インビボでの結合アッセイにおいて、 ニューロペプチドＹ受容体に薬剤はトランスジェニック動物の試験に関して良好 な候補であろう（好ましいＮＰＹ Ｙ１結合アッセイの説明についてはMartel，e t al.，Mol．Pharmacol．38:494(1990)参照）。結合アッセイを行うための多く の方法が当該分野において記載されている（例えば、Chard，"An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques，"in:Laboratory Techniques i n Biochemistry and Molecular Biology，North Holland Publishing Company， N.Y.(1978);Radioimmune Assay Method，Kirkham，et al.，ED.，E&S Livingsto ne， Edinburgh(1970);Wang，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:10230-10234( 1993);and Rudolf，et al.，Eur．J．Pharmacol．271:R11(1994)参照）。典型的 には、ニューロペプチドＹ受容体に特異的なリガンドおよび試験化合物調合物と ともに受容体調合物をインキュベーションする。結合完了後、例えば、濾過によ りリガンドおよび試験化合物を含有する溶液から受容体を分離し、生じた結合量 を測定する。 好ましくは、結合アッセイに用いるリガンドは放射性同位元素で検出可能に標 識されたニューロペプチドＹである。しかしながら、蛍光、酵素、または化学発 光標識も同様に使用できる。最も通常に使用される蛍光標識化合物としてはフル オレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシア ニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレサミンが挙ら れる。有用な化学発光化合物は、ルミノール、イソルミノール、セロマチックア クリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エス テルを包含する。最も通常に使用される同位元素は放射性ヨウ素である。 大過剰の未標識リガンドの存在下で結合反応を行うことにより非特異的結合を 調べてもよい。例えば、千倍過剰の未標識ニューロペプチドＹの存在下で標識ニ ューロペプチドＹを受容体および試験化合物とともにインキュベーションしても よい。非特異的結合を全結合、すなわち未標識リガンド不存在下での結合から差 し引いて各試験試料の特異的結合を求めるべきである。必要に応じて洗浄、撹拌 、振盪、濾過等のごとき他の工程をアッセイに含ませてもよい。典型的には、溶 液中に残っているリガンドからの受容体−リガンド複合体の分離後であって、例 えば放射性同位元素のカウンティングによるリガンド結合量の定量前に、洗浄工 程を行う。好ましくは数種の濃度の試験化合物の存在下で得られた特異的結合を 、標識リガンドのみの存在下で得られた特異的結合と比較して、試験化合物がど の程度リガントと入れ替わったかを調べる。結合アッセイを行う際に、実際には 結合が何らかの他の機構により阻害されている場合に、試験化合物が受容体また はニューロペプチドＹと相互作用しているように思わせる人工物を避けるように 注意しなくてはならない。例えば、それ自体実質的に受容体へのリガンドの結合 を阻害しな いバッファー中に試験化合物を置くべきである。また、試験化合物調合物を蛋白 分解活性に関して試験すべきであり、さらに抗プロテアーゼ剤をアッセイに含ま せることが望ましい。最後に、受容体へのリガンドの結合に置き換わるものとし て同定された化合物を、結果についてスキャッチャード（Scatchard）分析を行 うに十分な一定範囲の濃度として再試験することが望ましい。このタイプの分析 は当該分野においてよく知られており、受容体に対する試験化合物のアフィニテ ィーを調べるために使用できる（例えば、Ausubel，et al.，Current Protocols in Molecular Biology，11.2.1-11.2.19(1993);Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology ，Work，et al.，ED.，M.Y．(1978)等 を参照）。コンピュータープログラムを用いて結果の分析を促進してもよい（例 えば、Manson，Methods Enzymol．92:543-577(1983);McPherson，"Kinetic，EBD A Ligand Lowry-A Collection of Radioligand Binding Analysis Progr ams，"Elsevier-Biosoft，U.K．(1985)参照）。 第２のメッセンジャー、例えば細胞内カルシウム濃度またはアデニルシクラー ゼ活性の変化を調べるためのアッセイを、ＮＰＹ Ｙ１受容体への結合能の結果 として同定された化合物を用いて行ってもよい。これらの両方のタイプのアッセ イは当該分野においてよく知られている（Serradeil-Le Gal，et al.，FEBS Let t．362:192(1995);Nakamura，et al.，Biochem．Bjophys．Acta 1284:134(1996) ）。 ＮＰＹ Ｙ１受容体を発現しないように処理された細胞、組織または細胞系を 用いて得られた結果を、非トランスジェニック細胞または組織と比較することに より、特定のリガンドが特異的にＹ１受容体サブタイプに結合するかどうかを調 べることができる。例えば、正常細胞の受容体調合物に対する特異的結合が、Ｎ ＰＹ Ｙ１欠損細胞への結合と同程度に特異的であることが観察される場合、こ のことは、観察された特異的結合においてＹ１受容体は重要な役割を果たしてい ないことを示唆する。対照的に、正常調合物と比較して、処理された調合物にお いて結合が大幅に減少するか、あるいは存在しない場合には、このことは観察さ れた特異的結合においてＹ１受容体が重要な役割を果たしていることを示唆する 。Ｙ１受容体に対して完全に特異的なリガンドは、Ｙ１欠損調合物への有意な特 異 的結合を全く示さないはずである。 また、Ｙ１受容体サブタイプの発現を欠損した動物、ならびにこれらの動物由 来の細胞、組織および細胞系のごとき生物学的材料は、他のタイプのＮＰＹ受容 体サブタイプ（Ｙ２、Ｙ３等）に結合する化合物のスクリーニングにおいて特に 有用である。例えば、Ｙ２受容体に特異的な薬剤を開発しようとする場合、Ｙ１ 受容体欠損トランスジェニックマウスを用いて、薬剤がＹ１に結合せずにその効 果を発揮しうることを確認することができる。動物由来の細胞または組織を結合 アッセイに使用して、薬剤がＹ１に結合する程度を直接調べることもできる。 Ｅ．Ｙ１受容体サブタイプに特異的に結合する作用剤を投与することによる食 物摂取の調節 ＮＰＹ Ｙ１受容体サブタイプの発現を欠損したトランスジェニックマウスの 製造および食物摂取に対するＹ１の効果を調べるためのアッセイ（実施例７参照 ）におけるかかるマウスの使用は、対象における食物摂取を減少させる方法の開 発を導いた。ＮＰＹの作用に拮抗し、Ｙ１受容体サブタイプに特異的に結合する 作用剤を投与することにより、この方法を行う。上記結合アッセイを用いてＹ１ 受容体サブタイプに対する特異性を調べることができる。Ｙ１に特異的な化合物 は、標識ＮＰＹの正常細胞への結合を有意にブロックするが、受容体欠損変異動 物由来の同種の細胞への結合には影響を及ぼさないと考えられる。作用剤自体が 標識されている場合、正常細胞に特異的に結合するが、変異細胞に対する特異的 結合をほとんど示さないか、あるいは示さないと考えられる。 この点において、ＮＰＹのアンタゴニストとは、ＮＰＹに特異的な受容体を求 めて競合することによりＮＰＹの生物学的効果をブロックするが、通常には受容 体占領の結果として生じる生物学的応答を誘導しない作用剤を意味する。Ｙ１受 容体に結合する作用剤がアンタゴニスト様式で作用するがどうかを調べる１の方 法は、受容体結合がアデニルシクラーゼ活性の上昇を伴うかどうかを調べること である（上記説明参照）。別法として、Ｙ１に特異的に結合する物質の生理学的 効果を、作用剤をマウスに投与してその食物摂取に対する効果を調べることによ り、直接調べることもできる。 対象に投与されるＹ１特異的ＮＰＹアンタゴニストの１日の全用量は、少なく とも食物摂取を有意に減少させるに必要な量とすべきである。はじめは比較的低 用量の作用剤を与え、ついで、対象が治療に耐えられるかぎり増量していっても よい。１回または複数回の投与規則により投与を行ってよい。最適な１日の用量 は当該分野でよく知られた方法に決定され、対象の年齢および健康状態のごとき 種々の要因により影響されるであろう。 本発明方法は特定の剤形または投与経路に限るものではない。一般的には、経 口投与した場合作用剤がＹ１受容体への特異的結合能を維持できる場合には経口 投与が最も便利であり、好ましい。 本発明について説明したが、本発明を説明するが本発明の範囲を限定しない下 記実施例を参照すればさらに容易に本発明を理解できよう。 実施例 実施例１：マウスＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子の分断に適したＤＮＡ構築物の、 相同組み換えによる製造 ラットＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子の第２エキソンを含むプローブ(配列番号：１ 参照)を用いるハイブリダイゼーションによりマウスのゲノムＤＮＡライブラリ ーをスクリーニングして、マウスＮＰＹ Ｙ１遺伝子を含むファージベクターを 同定した。種々の制限酵素とのインキュベーション、ついで、ファージＤＮＡの サザンブロット分析により、第２および第３エキソンの領域におけるマウスＮＰ Ｙ Ｙ１受容体遺伝子の部分的制限地図を作成することができた。標的化ベクタ ーを作成するために、５ＫｂのＨｉnｄＩＩＩフラグメントをpBluescriptIIプラ スミドベクター（ｐＢＳ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位中にサブクローンした。コーデ ィング領域の配列決定により、該フラグメントがＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子を含 むことが確認された。 約０．８Ｋｂ離れた２つのＥｃｏＲＩ部位が５ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメ ント中に存在し、１つはエキソン２中に、もう１つはそれに続くイントロン中に あ る。またｐＢＳベクターはＥｃｏＲＩ部位をその多重クローニング部位中に含ん でいる。Ｙ１遺伝子に存在する２つのＥｃｏＲＩ部位間へのネオマイシン耐性遺 伝子の挿入を容易ならしめるために、ｐＢＳベクターのＥｃｏＲＩ部位を点突然 変異により不活性化させた。ついで、ＥｃｏＲＩ消化後に第２エキソンの大部分 を除去し、ネオマィシン耐性遺伝子を平滑末端連結により挿入した。 ＨｉｎｄＩＩＩ消化後、ネオマイシン耐性遺伝子を含む完全なＨｉｎｄＩＩＩ フラグメントをｐＢＳベクターから切り取り、ＨＳＶ−チミジンキナーゼ遺伝子 を含むｐＩＣ１９Ｒ／ＭＣ１−ＴＫプラスミド（ｐＩＣ）の唯一のＨｉｎｄＩＩ Ｉ部位に挿入した。５’相同領域を伸長させるために、上記５ＫｂのＨｉｎｄＩ ＩＩフラグメントと重複し隣接するＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子の５’領域を含む ５．３ＫｂのＡｐａＩフラグメントをｐＢＳのＡｐａＩ部位にサブクローンした 。クロラムフェニコール耐性を付与する細菌選択カセットを、このベクターのＣ ｌａＩ部位に挿入した。ついで、ＨｉｄＩＩＩ消化後、クロラムフェニコール耐 性遺伝子およびマウスＹ１遺伝子領域（５ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの ５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位から次のＡｐａＩ部位、すなわち、ＨｉｎｄＩＩＩ部位 の約４Ｋｂ上流まで伸長している）を含むフラグメントを単離した。このフラグ メントを、変異した５ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの上流の、ｐＩＣベク ターのＳａｌＩ部位に挿入した。 完全なベクターはクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むので、連結されたベ クターを担持する細菌の同定は、クロラムフェニコール存在下での選択によって 大幅に容易なものとなった。得られた標的化ベクターを図１に示す。この図は、 相同組み換え後に得られたマウスＮＰＹ Ｙ１遺伝子ならびに組み換え対立遺伝 子の対応部分も示す。 実施例２：相同組み換えにより作成された修飾ＮＰＹ Ｙ１受容体を有するＥ Ｓ細胞 ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩを一緒に使用して実施例１記載の標的化ベクターを 直鎖状にし、ついで、エレクトロポレーションによりＨＭ−１マウスのＥＳ細胞 （Selfridge et al.，Som．Cell Molec．Genet．18:325(1992)）に導入した。つ いで、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ）およびガンシクロビル（２μＭ）を含有す る培地で細胞を増殖させて、内在性ＮＰＹ Ｙ１受容体対立遺伝子中に組み込ま れたネオマイシン耐性遺伝子を有する形質転換体を豊富化させた。 Ｇ４１８／ＧＡＮＣ^r細胞コロニーからＤＮＡを単離し、制限酵素ＮｃｏＩと ともにインキュベーションし、消化生成物をアガロースゲルで分離した。バンド をゲルからニトロセルロース膜に移し、ついで、図１に示す放射性標識プローブ （配列番号：２参照）とのハイブリダイゼーションを行った。野生型ＮＰＹ Ｙ １受容体に対応するＤＮＡは電気泳動の７Ｋｂのバンドとして出現したが、組み 換え受容体に対応するＤＮＡは５Ｋｂのバンドとして出現した。よって、野生型 ＮＰＹ Ｙ１受容体対立遺伝子のみを有するＥＳ細胞から単離されたＤＮＡから は１本の７Ｋｂのバンドが生じ、ＮＰＹ Ｙ受容体変異に対してヘテロ接合であ るＥＳ細胞由来のＤＮＡからは２本のバンド（５ｋｂのバンドが１本、７ｋｂの バンドが１本）が生じたことが、ブロットにより示された。得られた結果により 、細胞中の組み換え対立遺伝子の存在が示され、全コロニーの１５％が組み換え 対立遺伝子を含んでいたことが示唆された。 実施例３：ＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子の発現を欠損したトランスジェニックマ ウス 組み換え対立遺伝子を担持するＥＳ細胞をＣ５７／Ｂ１６マウスの胚盤胞（３ ．５ｐ．ｃ．）中にマイクロインジェクションし、これらの胚盤胞を偽妊娠マウ スに移植することによりオスのキメラマウスを得た（Bradley，et al.，Nature 309:255(1984)参照）。１匹のオスは、ＥＳ細胞由来のオオテンジクネズミの毛 色をその子孫に１００％の頻度で伝えることがわかった。尾のＤＮＡをこれらの 子孫から単離し、上記のごときＮｃｏＩ制限酵素とともにインキュベーションし た後サザンブロットにより分析した。キメラマウスから調製した消化物は５Ｋｂ および７Ｋｂの両バンドを生じたが、ＮＰＹ Ｙ１変異に関してホモ接合である 子孫マウスからの消化物は５Ｋｂのバンドのみを示した。結果は、形質転換ＥＳ 細 胞中のＮＰＹ Ｙ１受容体対立遺伝子を変化させる変異がマウスゲノム中に伝え られたことを示すものであった。キメラなオスのマウスおよびそのヘテロ接合子 孫（＋／−）の交雑により、変異（−／−）に関してホモ接合であるマウスが得 られることがわかった。 実施例４：両方のＮＰＹ Ｙ１受容体対立遺伝子において変異したトランスジ ェニックマウスにおける受容体発現の分析 正常マウスまたは変異ＮＰＹ Ｙ１受容体対立遺伝子に関してホモ接合である マウスのいずれかから得た異なる組織から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを逆転写 し、ついで、ＰＣＲにより増幅して調合物中のＹ１受容体ＲＮＡの存在を検出し た。ＧＡＰＤＨ ＲＮＡも同様に増幅し、これらの実験の陽性対照として使用し た。ＮＰＹ Ｙ１受容体およびＧＡＰＤＨ ＲＮＡの増幅に使用したプライマーの 配列は以下のとおり： NPY Y1受容体プライマー： GAPDH プライマー： 結果は、すべての調合物における対照遺伝子の矛盾のない増幅を示した。しか しながら、野生型動物由来の組織のみがＹ１受容体の発現を示した。これらの動 物において、発現は脳、腎臓および脾臓に起こったことがわかった。心臓、肝臓 または肺においては発現の証拠がみられなかった。 実施例５：ＮＰＹ Ｙ１受容体発現を欠損したトランスジェニックマウス由来 の 組織を用いる競合結合アッセイ 野生型（ＷＴ）またはＮＰＹ Ｙ１受容体欠損マウス（ＫＯ）のいずれかから 脳膜を調製した（脳膜の調製に使用した手順の説明についてはMartel et al.，M ol．Pharmacol．38:494(1990)参照）。一定量の放射性標識ＮＰＹの存在下で、 非常に選択的なＹ１アンタゴニストであるＢＩＢＰ(Rudolf，et al.，Eur．J．P harmacol．271:R11(1994))濃度を増加させていきながら脳膜をインキュベーショ ンした。３時間インキュベーション後、膜を洗浄し、結合放射活性をガンマカウ ンターを用いて測定した。非特異的結合を全結合から差し引いた。図２に示すデ ータは、ＢＩＢＰがＮＰＹ Ｙ１受容体変異動物の膜からＮＰＹを排除してこれ に置き換わることができなかったことを示し、Ｙ１結合部位の不存在が示唆され る。 実施例６：Ｙ１受容体欠損トランスジェニック動物における薬剤投与に対する 応答のアッセイ（高血圧応答の欠如） ＮＰＹ投与に応答した血圧変化を、野生型マウス（＋／＋）、ＮＰＹ Ｙ１受 容体遺伝子に影響する変異に関してヘテロ接合であるマウス（＋／−）およびホ モ接合ＮＰＹ Ｙ１受容体変異マウス（−／−）において調べた（血圧測定アッ セイの説明についてはFluckiger，et al.，J．Appl．Physiol．167:250(1989) 、Wieselet al.，Hypertension,印刷中(1997)参照）。 頸動脈に血圧測定用ポリエチレンチューブ片を、頸静脈に薬剤輸液用ポリエチ レンチューブ片を挿入することによりマウスにカテーテルを挿入した。動脈内ラ インを圧力変換器に接続した。ついで、種々の濃度の薬剤を静脈ラインから輸液 し、血圧変化を調べた。図３に示す結果は、ホモ接合変異動物において正常な血 圧応答がないことを示す。 実施例７：Ｙ１欠損トランスジェニック動物における食物摂取の減少 野生型（＋／＋）およびホモ接合ＮＰＹ Ｙ１受容体欠損マウス（−／−）に よる食物摂取を調べた(アッセイの説明についてはCampfield，et al.，Science 269:546(1995)参照)。マウスを個々のケージで飼育し、午後６時から翌日の午後 ６ 時まで２４時間エサを断った。この間、水を好きなだけ与えた。 ついで、あらかじめ秤量したエサを動物に与え、残存したエサを秤量すること により９０分間の摂取量を測定した。図６の結果は、飢餓時においてＮＰＹ Ｙ １受容体欠損マウスは対照よりも食物摂取が少ないことを示す。９０分で消費し たエサの量（体重に対して正規化）として結果として示す。 本明細書で引用したすべての文献を参照により本明細書に記載されているもの とみなす。本発明の精神または範囲あるいはその具体例に範囲内において、広範 かつ均等な条件、パラメーター等の範囲内で本発明を実施しうることが当業者に より理解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １.宿主細胞のゲノム中に見出される内在性ＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子のヌクレ オチド配列を必須として含む標的化セグメントを含むＤＮＡ構築物であって、 （ａ）該標的化配列のヌクレオチド配列が、通常には該内在性ＮＰＹ Ｙ１ 受容体遺伝子中に存在しないマーカーヌクレオチド配列で中断または置換されて おり； （ｂ）該構築物が該宿主細胞中に導入された場合、該標的化セグメントが、 該宿主細胞のゲノムの該内在性ＮＰＹ Ｙ１遺伝子部位中に組み込まれることが でき；さらに （ｃ）該標的化セグメントが該内在性ＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子部位に組み 込まれた場合、十分に機能的なＮＰＹ Ｙ１受容体を合成できない変異ＮＰＹ Ｙ １受容体対立遺伝子が生成されるものである、ＤＮＡ構築物。 ２．該宿主細胞がマウス由来である請求項１のＤＮＡ構築物。 ３．該マーカー配列が該宿主細胞において発現され、相同組み換えを受けた細 胞の選択に使用できる生成物を生じるものである請求項１のＤＮＡ構築物。 ４．該マーカー配列がネオマイシン耐性遺伝子配列を含む請求項３のＤＮＡ構 築物。 ５.ラットＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子のエキソン２の一部を置換するために該ネ オマイシン耐性遺伝子配列が使用されている、請求項４のＤＮＡ構築物。 ６．さらにＨＳＶ−チミジンキナーゼ遺伝子を含む請求項５のＤＮＡ構築物。 ７.組み換えがＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子部位で起こっている組み換え細胞と、 組み換えがゲノムの他の位置で起こっている組み換え細胞とを区別するために使 用できる選択配列をさらに含む、請求項１のＤＮＡ構築物。 ８．該選択配列がＨＳＶ−チミジンキナーゼ遺伝子を含む請求項７のＤＮＡ構 築物。 ９．請求項１のＤＮＡ構築物を含む宿主細胞。 １０．該宿主細胞がマウス胚性幹細胞である請求項９の宿主細胞。 １１.ＮＰＹ Ｙ１受容体の実質的不存在により特徴づけられる表現型を有する トランスジェニックマウスの製造方法であって、 （ａ）マウスＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子のヌクレオチド配列を必須として含む 標的化セグメントを含むＤＮＡ構築物を作成し、ここに （ｉ）該標的化配列のヌクレオチド配列が、通常には該内在性ＮＰＹ Ｙ１ 受容体遺伝子中に存在しないマーカーヌクレオチド配列で中断または置換されて おり； （ｉｉ）該構築物が該マウス胚性幹（ＥＳ）細胞中に導入された場合、該標 的化セグメントが、該ＥＳ細胞のゲノムの該内在性ＮＰＹ Ｙ１遺伝子部位中に 組み込まれることができ；さらに （ｉｉｉ）該標的化セグメントが該内在性ＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子部位に 組み込まれた場合、十分に機能的なＮＰＹ Ｙ１受容体を合成できない変異ＮＰ Ｙ Ｙ１受容体対立遺伝子が生成されるものであり； （ｂ）該構築物をマウスＥＳ細胞中に導入し； （ｃ）ゲノムＤＮＡのＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子座に組み込まれた該標的化セ グメントによる変異ＮＰＹ Ｙ１対立遺伝子を有するＥＳ細胞を選択し； （ｄ）工程ｃにおいて選択されたＥＳ細胞をマウス胚盤胞に取り込ませてキメ ラ胚を形成させ； （ｅ）該キメラ胚を偽妊娠マウス中に移植し； （ｆ）該キメラ胚を発達させて生きた子孫とし； （ｇ）子孫をスクリーニングして、該変異ＮＰＹ Ｙ１受容体対立遺伝子を含 むヘテロ接合マウスを同定し；ついで （ｈ）該ヘテロ接合マウスを交雑させて、該表現型を有するホモ接合トランス ジェニックマウスを得る ことを含む方法。 １２．該マーカー配列がネオマイシン耐性遺伝子を含む請求項１１の方法。 １３．該ＤＮＡ構築物がさらにＨＳＶ−チミジンキナーゼ遺伝子を含む請求項 １２の方法。 １４.該ＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子配列のエキソン２の一部を置換するために該 ネオマイシン耐性遺伝子が用いられる請求項１２の方法。 １５．請求項１１の方法により製造されるトランスジェニックマウス。 １６．トランスジェニック動物であって、該動物中におけるＮＰＹ Ｙ１受容 体の実質的不存在（トランスジェニック動物でない場合には本来的に存在する） により特徴づけられる表現型を有するトランスジェニック動物。 １７．該動物がマウスである請求項１６のトランスジェニック動物。 １８．請求項１７のトランスジェニック動物であって、該動物の体細胞および 生殖細胞の両方におけるＮＰＹ Ｙ１受容体遺伝子座に存在する導入遺伝子によ り該表現型が付与されているトランスジェニック動物。 １９.該導入遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子を含む請求項１８のトランスジ ェニック動物。 ２０．請求項１６のトランスジェニック動物から得られる生物学的材料であっ て、 ａ）細胞、組織および細胞系からなる群より選択され； ｂ）該細胞、組織および細胞系が、それらにおけるＮＰＹ Ｙ１受容体の実質 的不存在（トランスジェニック動物でない場合には本来的に存在する）により特 徴づけられるものである、生物学的材料。 ２１.薬剤がＮＰＹ Ｙ１受容体の不存在下で生理学的応答を生じさせるかどう かを調べるために薬剤を評価する方法であって、 （ａ）該薬剤を請求項１６のトランスジェニック動物に投与し； （ｂ）該トランスジェニック動物を該生理学的応答についてアッセイする ことを含む方法。 ２２．該生理学的応答が、 （ａ）血圧変化； （ｂ）新生血管形成； （ｃ）痛覚消失； （ｄ）摂食行動； （ｅ）体重変化； （ｆ）体温； （ｇ）インスリン分泌； （ｈ）ゴナドトロピン分泌； （ｉ）不安； （ｊ）鼻の分泌； （ｋ）気管支の分泌； （ｌ）血管収縮； （ｍ）記憶喪失； （ｎ）ストレス からなる群より選択される請求項２１の方法。 ２３．該トランスジェニック動物がマウスである請求項２１の方法。 ２４.ＮＰＹ Ｙ１受容体への結合能について試験化合物をアッセイする方法で あって、 （ａ）請求項１６のトランスジェニック動物から第１の受容体調合物を得て； （ｂ）ニューロペプチドＹに結合することが知られている源から第２の受容体 調合物を得て； （ｃ）該第１および第２の受容体調合物を、 （ｉ）ニューロペプチドＹ受容体に結合することが知られているリガンド； （ｉｉ）該試験化合物 とともにインキュベーションし；ついで （ｄ）該リガンドの結合が該試験化合物により置換された程度を、該第１およ び第２の受容体調合物について調べる ことを含む方法。 ２５．該トランスジェニック動物がマウスである請求項２４の方法。 ２６．該リガンドが検出可能に標識されたニューロペプチドＹである請求項２ ５の方法。 ２７．食物摂取を制限する必要のある対象における食物消費を減少させる方法 であって、ＮＰＹ Ｙ１受容体に特異的に結合する作用剤を投与することを含み 、 ａ）該作用剤がＮＰＹの作用に拮抗し； ｂ）該作用剤を投与されない対象と比較して該食物消費を減少させるに十分な 量の該作用剤が十分な期間投与されるものである、方法。