JPH0851890A - プロテオリピド蛋白質が欠損しているトランスジエニツク動物およびそのような動物の作製方法 - Google Patents
プロテオリピド蛋白質が欠損しているトランスジエニツク動物およびそのような動物の作製方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 プロテオリピド蛋白質およびそのイソ蛋白質
ＤＭ２０、すなわちＰＬＰ遺伝子の２つのスプライス産
物はＣＮＳミエリンの２つの主要膜蛋白質である。 【効果】 ＰＬＰはＣＮＳの軸索の高度に整列している
ミエリン鞘の原因となる主要な膜構成成分であるとして
特定され、利用可能になった。
ＤＭ２０、すなわちＰＬＰ遺伝子の２つのスプライス産
物はＣＮＳミエリンの２つの主要膜蛋白質である。 【効果】 ＰＬＰはＣＮＳの軸索の高度に整列している
ミエリン鞘の原因となる主要な膜構成成分であるとして
特定され、利用可能になった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】ＣＮＳの軸索のミエリン鞘は、絶
縁化、エネルギー保存、および圧密化に役立ち、そして
跳躍性コンダクタンスによる迅速な情報伝達を可能にす
るものである。プロテオリピド蛋白質（ＰＬＰ；３０ｋ
Ｄ）およびそのイソ型ＤＭ２０（２６ｋＤ）は、中枢神
経系のミエリン内の最も豊富な内在性膜蛋白質構成成分
である。ＰＬＰは、齧歯類の生後１０日と３０日との間
にオリゴデンドロサイトがそれらのＯ２Ａ前駆細胞から
分化した直後にそのオリゴデンドロサイト内で発現さ
れ、ミエリン合成のピークがそれと同時に生じる。ＰＬ
Ｐとは異なり、ＤＭ２０転写物は胎生１０日目という初
期にＰＣＲにより検出されている。ミエリンの脂質二分
子層内でのこれらの極端な疎水性蛋白質のトポロジーに
ついては生化学的な評定が行われている。そのシステイ
ンチオールの内の６つのものは翻訳後のアシル化により
修飾されており、このことがこの蛋白質の疎水性をより
一層強いものにしている。これらのシステイン残基の機
能状態により、ＰＬＰの４つの貫膜ヘリックスモデルが
強く示唆されており、これはまた論理的考察にも基づい
ている。ＰＬＰアミノ酸配列［ＳｔｏｆｆｅｌおよびＨ
ｉｌｌｅｎ、（１９８３）、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅ
ｒ’ｓ Ｚｅｉｔｓｃｈｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．３６４］はそのクローン化済みｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列により立証されており、かつその遺伝子体制お
よびＸ−染色体上での位置が解明されている。ＰＬＰ遺
伝子はその転写開始部位から約５ｋｂ分５’上流側にあ
る調節配列を含むポリアデニル化シグナルまでの１７，
４００ｂｐ分に広がっている。ＰＬＰのコーディング配
列は７つのエキソンにまたがって分散している。ＰＬＰ
およびＤＭ２０は同一遺伝子によりコード化されてお
り、ＤＭ２０はエキソンＩＩＩ内の潜在スプライス部位
の利用によるＰＬＰ一次転写物の代用スプライス産物で
ある。成熟ＤＭ２０転写物では、ＰＬＰのエキソンＩＩ
Ｉの３’端の１０５塩基が欠損している。
縁化、エネルギー保存、および圧密化に役立ち、そして
跳躍性コンダクタンスによる迅速な情報伝達を可能にす
るものである。プロテオリピド蛋白質（ＰＬＰ；３０ｋ
Ｄ）およびそのイソ型ＤＭ２０（２６ｋＤ）は、中枢神
経系のミエリン内の最も豊富な内在性膜蛋白質構成成分
である。ＰＬＰは、齧歯類の生後１０日と３０日との間
にオリゴデンドロサイトがそれらのＯ２Ａ前駆細胞から
分化した直後にそのオリゴデンドロサイト内で発現さ
れ、ミエリン合成のピークがそれと同時に生じる。ＰＬ
Ｐとは異なり、ＤＭ２０転写物は胎生１０日目という初
期にＰＣＲにより検出されている。ミエリンの脂質二分
子層内でのこれらの極端な疎水性蛋白質のトポロジーに
ついては生化学的な評定が行われている。そのシステイ
ンチオールの内の６つのものは翻訳後のアシル化により
修飾されており、このことがこの蛋白質の疎水性をより
一層強いものにしている。これらのシステイン残基の機
能状態により、ＰＬＰの４つの貫膜ヘリックスモデルが
強く示唆されており、これはまた論理的考察にも基づい
ている。ＰＬＰアミノ酸配列［ＳｔｏｆｆｅｌおよびＨ
ｉｌｌｅｎ、（１９８３）、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅ
ｒ’ｓ Ｚｅｉｔｓｃｈｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．３６４］はそのクローン化済みｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列により立証されており、かつその遺伝子体制お
よびＸ−染色体上での位置が解明されている。ＰＬＰ遺
伝子はその転写開始部位から約５ｋｂ分５’上流側にあ
る調節配列を含むポリアデニル化シグナルまでの１７，
４００ｂｐ分に広がっている。ＰＬＰのコーディング配
列は７つのエキソンにまたがって分散している。ＰＬＰ
およびＤＭ２０は同一遺伝子によりコード化されてお
り、ＤＭ２０はエキソンＩＩＩ内の潜在スプライス部位
の利用によるＰＬＰ一次転写物の代用スプライス産物で
ある。成熟ＤＭ２０転写物では、ＰＬＰのエキソンＩＩ
Ｉの３’端の１０５塩基が欠損している。
【０００２】ＰＬＰ構造は進化の間を通じて非常によく
保存されている。哺乳類種の間では９９−１００％のア
ミノ酸相同性を見いだすことができる。低級な種類（鳥
類および両生類）とヒトとの間のＣＮＳ内ＰＬＰの一次
構造の比較により、システインおよび荷電しているアミ
ノ酸残基が同一位置に残存していながらも多数の保存置
換が示されている。このことにより、それらのアミノ酸
残基は三次構造の類似位置に存在し、そしてミエリン膜
中のＰＬＰの機能が相同であることが示唆される。高度
に保存されているＰＬＰ構造により突然変異耐性が低い
ことが説明できる。
保存されている。哺乳類種の間では９９−１００％のア
ミノ酸相同性を見いだすことができる。低級な種類（鳥
類および両生類）とヒトとの間のＣＮＳ内ＰＬＰの一次
構造の比較により、システインおよび荷電しているアミ
ノ酸残基が同一位置に残存していながらも多数の保存置
換が示されている。このことにより、それらのアミノ酸
残基は三次構造の類似位置に存在し、そしてミエリン膜
中のＰＬＰの機能が相同であることが示唆される。高度
に保存されているＰＬＰ構造により突然変異耐性が低い
ことが説明できる。
【０００３】ＰＬＰの点突然変異が原因でマウス、ラッ
ト、イヌ、およびヒトの致命的ミエリン鞘発育不全が生
じる。ジンピー（ｊｉｍｐｙ）マウスでは、イントロン
ＩＶのスプライスアクセプター部位内でのＡからＧへの
変化が原因でＯＲＦのフレームシフトに伴うエキソンＶ
の欠損が生じる［Ｍｏｒｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．、（１
９８６）ＥＭＢＯ Ｊ． ５、３４８９−３４９３；Ｎ
ａｖｅ ｅｔ ａｌ．、（１９８７）、Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍ． ４９、１８７３−１８７７］。ミエリン−欠損
（ｍｄ）ラットにおいては、第二貫膜のα−ヘリックス
内でＴｈｒ75がＰｒｏに突然変異している［Ｂｏｉｓｏ
ｎおよびＳｔｏｆｆｅｌ、（１９８９）、ＥＭＢＯ
Ｊ． ８、３２９５−３３０２］。更に別の点突然変異
が、ジンピーmsd（ｊｉｍｐｙmsd）マウス、ランプシェ
ーカー（ｒｕｍｐｓｈａｋｅｒ）マウス、シェーキング
パップ（ｓｈａｋｉｎｇ ｐｕｐ）（イヌ）、およびヒ
トの遺伝的形態のペリツェウス−メルツバッヒャー（Ｐ
ｅｌｉｚａｅｕｓ−Ｍｅｒｚｂａｃｈｅｒ）型のスダン
性白質萎縮症の数々の事例において記載されている。多
形質発現性である表現型はオリゴデンドロサイトの総合
的アポトーシスに起因しており、このアポトーシスによ
りランプシェーカーの場合を除くこれら全ての事例にお
いてミエリン形成終了期までに罹患個体の成熟前の死が
もたらされる。後者の突然変異体はオリゴデンドロサイ
トの成熟前の死を伴わないミエリン形成減少症を示す。
ト、イヌ、およびヒトの致命的ミエリン鞘発育不全が生
じる。ジンピー（ｊｉｍｐｙ）マウスでは、イントロン
ＩＶのスプライスアクセプター部位内でのＡからＧへの
変化が原因でＯＲＦのフレームシフトに伴うエキソンＶ
の欠損が生じる［Ｍｏｒｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．、（１
９８６）ＥＭＢＯ Ｊ． ５、３４８９−３４９３；Ｎ
ａｖｅ ｅｔ ａｌ．、（１９８７）、Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍ． ４９、１８７３−１８７７］。ミエリン−欠損
（ｍｄ）ラットにおいては、第二貫膜のα−ヘリックス
内でＴｈｒ75がＰｒｏに突然変異している［Ｂｏｉｓｏ
ｎおよびＳｔｏｆｆｅｌ、（１９８９）、ＥＭＢＯ
Ｊ． ８、３２９５−３３０２］。更に別の点突然変異
が、ジンピーmsd（ｊｉｍｐｙmsd）マウス、ランプシェ
ーカー（ｒｕｍｐｓｈａｋｅｒ）マウス、シェーキング
パップ（ｓｈａｋｉｎｇ ｐｕｐ）（イヌ）、およびヒ
トの遺伝的形態のペリツェウス−メルツバッヒャー（Ｐ
ｅｌｉｚａｅｕｓ−Ｍｅｒｚｂａｃｈｅｒ）型のスダン
性白質萎縮症の数々の事例において記載されている。多
形質発現性である表現型はオリゴデンドロサイトの総合
的アポトーシスに起因しており、このアポトーシスによ
りランプシェーカーの場合を除くこれら全ての事例にお
いてミエリン形成終了期までに罹患個体の成熟前の死が
もたらされる。後者の突然変異体はオリゴデンドロサイ
トの成熟前の死を伴わないミエリン形成減少症を示す。
【０００４】今日では、これらの致死的な点突然変異に
起因するオリゴデンドロサイトの死についての分子的な
理解は未だに達成されていない。
起因するオリゴデンドロサイトの死についての分子的な
理解は未だに達成されていない。
【０００５】ＣＮＳミエリン膜の主要構造構成成分であ
る以外にも、ＰＬＰおよびＤＭ２０には他の機能が割り
当てられており、ＰＬＰにはチャンネル形成性蛋白質も
しくは吸着孔としての機能があり、そして胎生期に一次
的に発現されるＤＭ２０には分化因子としての機能があ
る。
る以外にも、ＰＬＰおよびＤＭ２０には他の機能が割り
当てられており、ＰＬＰにはチャンネル形成性蛋白質も
しくは吸着孔としての機能があり、そして胎生期に一次
的に発現されるＤＭ２０には分化因子としての機能があ
る。
【０００６】最近プロテオリピド遺伝子一族についての
記載がなされており、ＤＭというその一族の一員はニコ
チン性アセチルコリンレセプターおよびグルタミン酸レ
セプターのチャンネル形成性セグメントに対する類似性
を有する領域を含んでいる。その上、ＰＬＰ／ＤＭ２０
のパルミトレート化サイトゾルセグメントは、ロドプシ
ンおよびＧ−蛋白質と結合しているβ２−アドレナリン
性レセプター（Ｏ’Ｄｏｗｄ ｅｔ ａｌ．、１９８
９）を例とする貫膜蛋白質のパルミトレート化セグメン
トと高度の相同性を示す。
記載がなされており、ＤＭというその一族の一員はニコ
チン性アセチルコリンレセプターおよびグルタミン酸レ
セプターのチャンネル形成性セグメントに対する類似性
を有する領域を含んでいる。その上、ＰＬＰ／ＤＭ２０
のパルミトレート化サイトゾルセグメントは、ロドプシ
ンおよびＧ−蛋白質と結合しているβ２−アドレナリン
性レセプター（Ｏ’Ｄｏｗｄ ｅｔ ａｌ．、１９８
９）を例とする貫膜蛋白質のパルミトレート化セグメン
トと高度の相同性を示す。
【０００７】マスウの胚幹細胞の遺伝子標的挿入法（Ｍ
ａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．、１９８８）は、特異的蛋
白質のインビボ機能を決定するための［我々の場合には
ＤＭ２０−機能（一つもしくは複数）からのＰＬＰ−機
能（一つもしくは複数）の分離を行う］有力な方法であ
る。ＰＬＰの位置はこの種の機能分離には好適であり、
それはＰＬＰ発現が主に、生後分化するオリゴデンドロ
サイトというある特別な細胞の種類に限定されているた
めである。Ｘ−染色体の位置により雄のＥＳ細胞中での
置換現象の調査が容易になる。我々は胚幹細胞の相同組
換えを用いてＸ−染色体上の内因性ＰＬＰ遺伝子を、イ
ントロンＩＩＩでアンチセンスの向きのネオマイシン耐
性遺伝子を保持する特異的ＰＬＰおよびＤＭ２０構造と
入れ替えた。本発明では、我々はホモ接合性およびヘテ
ロ接合性であるマウスがこの遺伝子置換のために中枢ミ
エリン形成において著しい異常を示すことを証明する。
ａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．、１９８８）は、特異的蛋
白質のインビボ機能を決定するための［我々の場合には
ＤＭ２０−機能（一つもしくは複数）からのＰＬＰ−機
能（一つもしくは複数）の分離を行う］有力な方法であ
る。ＰＬＰの位置はこの種の機能分離には好適であり、
それはＰＬＰ発現が主に、生後分化するオリゴデンドロ
サイトというある特別な細胞の種類に限定されているた
めである。Ｘ−染色体の位置により雄のＥＳ細胞中での
置換現象の調査が容易になる。我々は胚幹細胞の相同組
換えを用いてＸ−染色体上の内因性ＰＬＰ遺伝子を、イ
ントロンＩＩＩでアンチセンスの向きのネオマイシン耐
性遺伝子を保持する特異的ＰＬＰおよびＤＭ２０構造と
入れ替えた。本発明では、我々はホモ接合性およびヘテ
ロ接合性であるマウスがこの遺伝子置換のために中枢ミ
エリン形成において著しい異常を示すことを証明する。
【０００８】今日でも多発性硬化症の病状を模倣する有
効なモデルを利用することはできない。このことによ
り、この疾患用の薬を簡便な方法で開発することが阻止
されてしまっている。
効なモデルを利用することはできない。このことによ
り、この疾患用の薬を簡便な方法で開発することが阻止
されてしまっている。
【０００９】
【発明の構成】本発明は、ミエリン形成過程が欠損して
いる「すばらしい」トランスジェニックマウスを提供す
る。ミエリンを有する線維の形態学的変化は各神経組織
の組織学的調査をして初めて明らかにされる。このトラ
ンスジェニックマウスは、多発性硬化症の動物モデルを
目的とする方向での新しい手法を意味する。この方法は
神経のミエリン形成不全、ならびにそれに随伴する動物
生理学上および行動学上の効果の調査に適する道具を提
供する見込みが強い。恐らく類似現象がアルツハイマー
性疾患および他の神経変質性病状の形態学的特性および
分子変化の特性に関与している可能性があり、そしてそ
のため同一の動物モデルがこれらにも役立つことが考え
られる。その上、この「すばらしい」マウスは神経コン
ダクタンス速度の減少およびＣＮＳ代謝への影響を伴う
疾患の調査に適することが考えられる。
いる「すばらしい」トランスジェニックマウスを提供す
る。ミエリンを有する線維の形態学的変化は各神経組織
の組織学的調査をして初めて明らかにされる。このトラ
ンスジェニックマウスは、多発性硬化症の動物モデルを
目的とする方向での新しい手法を意味する。この方法は
神経のミエリン形成不全、ならびにそれに随伴する動物
生理学上および行動学上の効果の調査に適する道具を提
供する見込みが強い。恐らく類似現象がアルツハイマー
性疾患および他の神経変質性病状の形態学的特性および
分子変化の特性に関与している可能性があり、そしてそ
のため同一の動物モデルがこれらにも役立つことが考え
られる。その上、この「すばらしい」マウスは神経コン
ダクタンス速度の減少およびＣＮＳ代謝への影響を伴う
疾患の調査に適することが考えられる。
【００１０】このトランスジェニックマウスは、薬剤発
見プログラムで新規の物質をスクリーニングするため、
および動態薬理学、生理学、および組織学から得られる
種々のパラメータを検査するための治療学的に関連する
新しい標的を発見するための独特な道具を提供する。
見プログラムで新規の物質をスクリーニングするため、
および動態薬理学、生理学、および組織学から得られる
種々のパラメータを検査するための治療学的に関連する
新しい標的を発見するための独特な道具を提供する。
【００１１】Ｘ−染色体上のＰＬＰの位置の突然変異誘
発 高度に整列し、かつ圧密化されたＣＮＳの多分子層膜中
の構造構成成分、あるいは胚形成およびミエリン形成の
際の仮定的な調節蛋白質のいずれかとしてのＰＬＰおよ
びＤＭ２０の機能を特定するための有望な方法は、胚幹
細胞中のホモ接合性組換えにより作製されるトランスジ
ェニックマウス中でＰＬＰとＤＭ２０とを別々にインビ
ボ発現させることである。ＰＬＰ遺伝子のエキソンＩＩ
Ｉ中の１０５ｂｐの欠損が、大きなサイトゾルループ内
に含まれる３５アミノ酸を欠く代用スプライス産物ＤＭ
２０内に含まれている（図１）。これが原因で、ＰＬＰ
中に存在する６つのチオアシル化部位の内の２つのもの
が欠損している。図１は、ミエリン脂質二分子層内のＰ
ＬＰとＤＭ２０との仮定的なトポロジーを示しており、
そしてＤＭ２０内の配列欠損を表している。
発 高度に整列し、かつ圧密化されたＣＮＳの多分子層膜中
の構造構成成分、あるいは胚形成およびミエリン形成の
際の仮定的な調節蛋白質のいずれかとしてのＰＬＰおよ
びＤＭ２０の機能を特定するための有望な方法は、胚幹
細胞中のホモ接合性組換えにより作製されるトランスジ
ェニックマウス中でＰＬＰとＤＭ２０とを別々にインビ
ボ発現させることである。ＰＬＰ遺伝子のエキソンＩＩ
Ｉ中の１０５ｂｐの欠損が、大きなサイトゾルループ内
に含まれる３５アミノ酸を欠く代用スプライス産物ＤＭ
２０内に含まれている（図１）。これが原因で、ＰＬＰ
中に存在する６つのチオアシル化部位の内の２つのもの
が欠損している。図１は、ミエリン脂質二分子層内のＰ
ＬＰとＤＭ２０との仮定的なトポロジーを示しており、
そしてＤＭ２０内の配列欠損を表している。
【００１２】我々はＰＬＰ遺伝子の位置に微細突然変化
を導入したが、それらはすなわちＤＭ２０を独占的に発
現させる原因となるエキソンＩＩＩでの１０５ｂｐの欠
損、およびＤＭ２０転写物のスプライシングを禁止し
（表１）かつＰＬＰの独占的発現の原因となるエキソン
ＩＩＩの潜在スプライス部位内での２の塩基対置換であ
る。
を導入したが、それらはすなわちＤＭ２０を独占的に発
現させる原因となるエキソンＩＩＩでの１０５ｂｐの欠
損、およびＤＭ２０転写物のスプライシングを禁止し
（表１）かつＰＬＰの独占的発現の原因となるエキソン
ＩＩＩの潜在スプライス部位内での２の塩基対置換であ
る。
【００１３】ホモ接合性組換えを介するＥＳ細胞内への
小微細非選択的突然変異の導入については３つの方法が
記載されており、それらは、ＤＮＡのマイクロインジェ
クション（ＺｉｍｍｅｒおよびＧｒｕｓｓ、Ｐ．（１９
８９）、Ｎａｔｕｒｅ ３３８、１５０−１５３）、同
時電気穿孔法（Ｄａｖｉｓ、Ａ．Ｃ．、Ｗｉｍｓ、
Ｍ．、およびＢｒａｄｌｅｙ、Ａ．（１９９２）、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２、２７６９−２７７
６）、およびヒットアンドラン（ｈｉｔ ａｎｄ ｒｕ
ｎ）法（Ｈａｓｔｙ、Ｐ．Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉ
ｓ、Ｒ．、Ｋｒｕｍｌａｕｆ、Ｒ．、およびＢｒａｄｌ
ｅｙ、Ａ．（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ ３５０、２４
３−２４６；Ｖａｌａｎｃｉｕｓ、Ｖ．、およびＳｍｉ
ｔｈｉｅｓ、Ｏ．（１９９１）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１１、１４０２−１４０８）である。
小微細非選択的突然変異の導入については３つの方法が
記載されており、それらは、ＤＮＡのマイクロインジェ
クション（ＺｉｍｍｅｒおよびＧｒｕｓｓ、Ｐ．（１９
８９）、Ｎａｔｕｒｅ ３３８、１５０−１５３）、同
時電気穿孔法（Ｄａｖｉｓ、Ａ．Ｃ．、Ｗｉｍｓ、
Ｍ．、およびＢｒａｄｌｅｙ、Ａ．（１９９２）、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２、２７６９−２７７
６）、およびヒットアンドラン（ｈｉｔ ａｎｄ ｒｕ
ｎ）法（Ｈａｓｔｙ、Ｐ．Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉ
ｓ、Ｒ．、Ｋｒｕｍｌａｕｆ、Ｒ．、およびＢｒａｄｌ
ｅｙ、Ａ．（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ ３５０、２４
３−２４６；Ｖａｌａｎｃｉｕｓ、Ｖ．、およびＳｍｉ
ｔｈｉｅｓ、Ｏ．（１９９１）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１１、１４０２−１４０８）である。
【００１４】我々は微細突然変異を導入するための異な
る手法を適用した。我々の仮説は、ｎｅｏカセットを標
的挿入すべく遺伝子のイントロン内にアンチセンスの向
きで選択マーカーとして導入する場合、このｎｅｏカセ
ットはＲＮＡのプロセッシングの際にイントロンと一緒
にスプライスされ、そのため我々の事例では所望の突然
変異のみを含むＤＭ２０とＰＬＰの各々のプロセシング
済み転写物が残るというものであった。図２はマウス胚
幹細胞内のＰＬＰの位置に標的挿入するための我々の手
法を示す。
る手法を適用した。我々の仮説は、ｎｅｏカセットを標
的挿入すべく遺伝子のイントロン内にアンチセンスの向
きで選択マーカーとして導入する場合、このｎｅｏカセ
ットはＲＮＡのプロセッシングの際にイントロンと一緒
にスプライスされ、そのため我々の事例では所望の突然
変異のみを含むＤＭ２０とＰＬＰの各々のプロセシング
済み転写物が残るというものであった。図２はマウス胚
幹細胞内のＰＬＰの位置に標的挿入するための我々の手
法を示す。
【００１５】我々は相同組換えによる遺伝子標的挿入
（Ｍａｎｓｏｕｒ、ｅｔ ａｌ．、（１９８８））のた
めの置換ベクターｐＰＬＰＭｕｔ２５hａｓｎｅｏｔ
ｋ、ｐＰＬＰＤｅｌ２５hａｓｎｅｏｔｋ、およびｐＰ
ＬＰｗｔ２５hａｓｎｅｏｔｋの作製のために、６．７
ｋｂであるイントロンＩからエキソンＶまでのＰＬＰ遺
伝子の全長部分を含むｂａｌｂ／ｃマウスのゲノムライ
ブラリーから得られるＰＬＰクローンを用いた。表１に
はエキソンＩＩＩの各々の配列を列挙してある。エキソ
ンＩＩＩの２つの突然変異形態およびｗｔ−エキソンＩ
ＩＩを用いて更に別の標的挿入用ベクターを作製した。
単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子お
よび細菌のネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）からなる
転写に有効なカセットを陽性−陰性選択（Ｍａｎｓｏｕ
ｒ Ｓ．、ｅｔ ａｌ．、（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ
３３６、３４８−３５２）のために導入した。ＰＬＰ
遺伝子に対してアンチセンスの向きになっているイント
ロンＩＩＩ中のｎｅｏ−カセットの位置はスプライスド
ナーからは約５５０ｂｐ離れており、かつアクセプター
部位から３５０ｂｐのところにある。最終標的挿入用構
築物を図２に示す。これらは標的挿入用の位置に対する
総計６．７ｋｂの相同配列を含み、そしてＰＬＰ遺伝子
と１００％相同性である３’平滑末端を有する。標的挿
入用構築物のクローニング手法は「実験方法」に記載し
てある。直線状置換ベクターｐＰＬＰＭｕｔ２５hａｓ
ｎｅｏｔｋ、ｐＰＬＰＤｅｌ２５hａｓｎｅｏｔｋ、お
よびｐＰＬＰｗｔ２５hａｓｎｅｏｔｋを電気穿孔法に
より受容体であるＥ１４−ＥＳ細胞内に導入した。ＥＳ
細胞クローンについては、ネオマイシン−耐性マウス胚
繊維芽細胞単分子層上での二重選択培地中で増殖させた
後に標的挿入現象についての分析を行った。電気穿孔を
施した１０7の細胞当たり約２０００の耐性クローンが
Ｇ４１８選択で生き延びてきた。ＧＡＮＣを用いる二重
選択によって我々は３−５倍の濃縮を行った。
（Ｍａｎｓｏｕｒ、ｅｔ ａｌ．、（１９８８））のた
めの置換ベクターｐＰＬＰＭｕｔ２５hａｓｎｅｏｔ
ｋ、ｐＰＬＰＤｅｌ２５hａｓｎｅｏｔｋ、およびｐＰ
ＬＰｗｔ２５hａｓｎｅｏｔｋの作製のために、６．７
ｋｂであるイントロンＩからエキソンＶまでのＰＬＰ遺
伝子の全長部分を含むｂａｌｂ／ｃマウスのゲノムライ
ブラリーから得られるＰＬＰクローンを用いた。表１に
はエキソンＩＩＩの各々の配列を列挙してある。エキソ
ンＩＩＩの２つの突然変異形態およびｗｔ−エキソンＩ
ＩＩを用いて更に別の標的挿入用ベクターを作製した。
単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子お
よび細菌のネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）からなる
転写に有効なカセットを陽性−陰性選択（Ｍａｎｓｏｕ
ｒ Ｓ．、ｅｔ ａｌ．、（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ
３３６、３４８−３５２）のために導入した。ＰＬＰ
遺伝子に対してアンチセンスの向きになっているイント
ロンＩＩＩ中のｎｅｏ−カセットの位置はスプライスド
ナーからは約５５０ｂｐ離れており、かつアクセプター
部位から３５０ｂｐのところにある。最終標的挿入用構
築物を図２に示す。これらは標的挿入用の位置に対する
総計６．７ｋｂの相同配列を含み、そしてＰＬＰ遺伝子
と１００％相同性である３’平滑末端を有する。標的挿
入用構築物のクローニング手法は「実験方法」に記載し
てある。直線状置換ベクターｐＰＬＰＭｕｔ２５hａｓ
ｎｅｏｔｋ、ｐＰＬＰＤｅｌ２５hａｓｎｅｏｔｋ、お
よびｐＰＬＰｗｔ２５hａｓｎｅｏｔｋを電気穿孔法に
より受容体であるＥ１４−ＥＳ細胞内に導入した。ＥＳ
細胞クローンについては、ネオマイシン−耐性マウス胚
繊維芽細胞単分子層上での二重選択培地中で増殖させた
後に標的挿入現象についての分析を行った。電気穿孔を
施した１０7の細胞当たり約２０００の耐性クローンが
Ｇ４１８選択で生き延びてきた。ＧＡＮＣを用いる二重
選択によって我々は３−５倍の濃縮を行った。
【００１６】ＥＳ細胞および標的挿入済みかつ置換済み
のＰｌｐ−対立遺伝子についてホモ接合性であるマウス
の遺伝子型決定 標的挿入済みＥＳ細胞クローンを、サザン分析およびポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイによりホモ接合
性およびヘテロ接合性組換え現象について分析した。
のＰｌｐ−対立遺伝子についてホモ接合性であるマウス
の遺伝子型決定 標的挿入済みＥＳ細胞クローンを、サザン分析およびポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイによりホモ接合
性およびヘテロ接合性組換え現象について分析した。
【００１７】組換え現象の分析のためには、単一のＥＳ
細胞クローンのプールＤＮＡ（プール当たり３クロー
ン）をＥｃｏＲＩで制限消化し、そして標的用構築物の
３’端の下流にある配列の位置に存在するｐｌｐ５６お
よびｐｌｐ６７外部プローブとハイブリダイズさせた
（図３）。星印をつけたプールクローンのＤＮＡは標的
挿入を行っていない細胞およびマウス胚繊維芽細胞のＰ
ＬＰ遺伝子から得られる７．０ｋｂの野生型ＥｃｏＲＩ
断片に加えて４．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を生じ、この
ことにより追加的なＥｃｏＲＩ部位を含む置換ベクター
がｎｅｏ−カセット内に正しく組み込まれていることが
示された。陽性プールからの個々のクローンをハイブリ
ッド形成分析による同じ方法で分析したところ、３つの
クローンからなる一つのプールの内の一つのクローンに
ついて正しい標的挿入が行われていることが判明した。
その上、突然変異を生じているエキソンＩＩＩの正しい
構造については、ｐｌｐ-／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏクロ
ーンの場合には、ＢｇｌＩＩ制限酵素を使用してＤＭ２
０欠損部分の５’および３’端を切断することによりＤ
Ｍ２０欠損部分の存在についての照査を行った（図
３）。７００ｂｐのＰＬＰ−特異的断片に対して６００
ｂｐの予想されるＤＭ２０−特異的断片を、内部エキソ
ンＩＩＩプローブ（ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片、
エキソンＩＩＩを含む）とハイブリッド形成させること
により可視化させた。陽性クローンについては、ｎｅｏ
−ボックスの相同組込みのために１．４ｋｂとして示さ
れる長さ部分の検出用プライマーｎｅｏＡＴＧ（ｎｅｏ
−ボックス特異的）およびＨＲＡ（標的挿入用構築物の
外部に存在する）を、そしてＤＭ２０欠損部分のいずれ
かの側に存在するプライマーＥｘＩＩＳ／ＳａｕＡを用
いるＰＣＲによっても分析を行い、そしてこのＰＣＲに
よってはＰＬＰおよびＤＭ２０について各々１．２およ
び１．１ｋｂの増幅産物を生じた。ＳａｕＡもしくはＥ
ｘＩＶＡと対形成している対立遺伝子特異的ＰＣＲプラ
イマーＤＭ+およびＤＭ-を用いて，ｐＰＬＰＭｕｔ２５
hｎｅｏｔｋ由来のクローンのエキソンＩＩＩ内にあっ
て突然変異を生じている代理スプライス部位の存在につ
いての探索を行った（データ未公開）。この手法を追及
していって、我々はｐｌｐ+／ｄｍ２０+ａｓｎｅｏ対照
クローンの他に、総計５つのｐｌｐ+／ｄｍ２０-ａｓｎ
ｅｏクローンおよび唯一のｐｌｐ-／ｄｍ２０+ａｓｎｅ
ｏクローン（これは相同組換えの際のかなりの度合いの
ミスマッチ修復に起因する）を取得した。
細胞クローンのプールＤＮＡ（プール当たり３クロー
ン）をＥｃｏＲＩで制限消化し、そして標的用構築物の
３’端の下流にある配列の位置に存在するｐｌｐ５６お
よびｐｌｐ６７外部プローブとハイブリダイズさせた
（図３）。星印をつけたプールクローンのＤＮＡは標的
挿入を行っていない細胞およびマウス胚繊維芽細胞のＰ
ＬＰ遺伝子から得られる７．０ｋｂの野生型ＥｃｏＲＩ
断片に加えて４．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を生じ、この
ことにより追加的なＥｃｏＲＩ部位を含む置換ベクター
がｎｅｏ−カセット内に正しく組み込まれていることが
示された。陽性プールからの個々のクローンをハイブリ
ッド形成分析による同じ方法で分析したところ、３つの
クローンからなる一つのプールの内の一つのクローンに
ついて正しい標的挿入が行われていることが判明した。
その上、突然変異を生じているエキソンＩＩＩの正しい
構造については、ｐｌｐ-／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏクロ
ーンの場合には、ＢｇｌＩＩ制限酵素を使用してＤＭ２
０欠損部分の５’および３’端を切断することによりＤ
Ｍ２０欠損部分の存在についての照査を行った（図
３）。７００ｂｐのＰＬＰ−特異的断片に対して６００
ｂｐの予想されるＤＭ２０−特異的断片を、内部エキソ
ンＩＩＩプローブ（ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片、
エキソンＩＩＩを含む）とハイブリッド形成させること
により可視化させた。陽性クローンについては、ｎｅｏ
−ボックスの相同組込みのために１．４ｋｂとして示さ
れる長さ部分の検出用プライマーｎｅｏＡＴＧ（ｎｅｏ
−ボックス特異的）およびＨＲＡ（標的挿入用構築物の
外部に存在する）を、そしてＤＭ２０欠損部分のいずれ
かの側に存在するプライマーＥｘＩＩＳ／ＳａｕＡを用
いるＰＣＲによっても分析を行い、そしてこのＰＣＲに
よってはＰＬＰおよびＤＭ２０について各々１．２およ
び１．１ｋｂの増幅産物を生じた。ＳａｕＡもしくはＥ
ｘＩＶＡと対形成している対立遺伝子特異的ＰＣＲプラ
イマーＤＭ+およびＤＭ-を用いて，ｐＰＬＰＭｕｔ２５
hｎｅｏｔｋ由来のクローンのエキソンＩＩＩ内にあっ
て突然変異を生じている代理スプライス部位の存在につ
いての探索を行った（データ未公開）。この手法を追及
していって、我々はｐｌｐ+／ｄｍ２０+ａｓｎｅｏ対照
クローンの他に、総計５つのｐｌｐ+／ｄｍ２０-ａｓｎ
ｅｏクローンおよび唯一のｐｌｐ-／ｄｍ２０+ａｓｎｅ
ｏクローン（これは相同組換えの際のかなりの度合いの
ミスマッチ修復に起因する）を取得した。
【００１８】正しく標的挿入されているＥＳ細胞クロー
ンをＣ５７Ｂｌ／６ＪもしくはＣＤ−１のいずれかの雌
マウスからの未分化胚芽細胞内に注入することにより標
的挿入済みのｐｌｐ対立遺伝子についてホモ接合性であ
るマウスを作製して生殖系列キメラを作製した。体毛色
にキメラ性を示す雄マウスは、ＤＮＡレベルでの所望の
対立遺伝子の存在について、尾のＤＮＡ分析、およびＥ
ｃｏＲＩ消化物のサザンブロット、およびｐｌｐ５６お
よびｐｌｐ６７外部プローブとのハイブリッド形成によ
り検査した。大半の体毛色キメラはＤＮＡレベルでも高
いキメラ性を示すことが判明した。これらの動物をＣ５
７Ｂｌ／６ＪもしくはＣＤ１のいずれかの雌マウスとの
テスト繁殖に用いてＥＳ細胞が生殖系列に寄与している
か否かを決定した。こうして２つのトランスジェニック
株を樹立し、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊに由来する株６１ではｐ
ｌｐの位置がｐＰＬＰＤｅｌ２５hａｓｎｅｏｔｋのＤ
Ｍ２０構築物により置換されており、そしてＣＤ−１に
由来する株７５はイントロンＩＩＩ内のアンチセンスの
向きのｎｅｏ−ボックスと共にｐｌｐ+／ｄｍ２０+対立
遺伝子を含む。突然変異が遺伝しているヘテロ接合性の
子孫を野生型の雄と交雑させて遺伝的影響を受けている
雄をもうけ、これをヘテロ接合性の雌と交配させて、ｐ
ｌｐ２０-／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏおよびｐｌｐ+／ｄ
ｍ２０+／ａｓｎｅｏマウスのホモ接合性突然変異株を
樹立した。図４〜５は株６１（ｐｌｐ−／ｄｍ２０＋／
ａｓｎｅｏ）のＦ２世代の子孫の分析を例を挙げて示し
ているが、この分析では、ＨｉｎｄＩＩＩ消化でｎｅｏ
−ボックスの相同組込みについての探索をサザンブロッ
トにおいて行い（図４）、そしてその突然変異のいずれ
かの側に存在するＰＣＲ−プライマーＥｘＩＩＩＳ／Ｓ
ａｕＡを用いてＤＭ２０欠損部分についての探索を行っ
た（図５）。
ンをＣ５７Ｂｌ／６ＪもしくはＣＤ−１のいずれかの雌
マウスからの未分化胚芽細胞内に注入することにより標
的挿入済みのｐｌｐ対立遺伝子についてホモ接合性であ
るマウスを作製して生殖系列キメラを作製した。体毛色
にキメラ性を示す雄マウスは、ＤＮＡレベルでの所望の
対立遺伝子の存在について、尾のＤＮＡ分析、およびＥ
ｃｏＲＩ消化物のサザンブロット、およびｐｌｐ５６お
よびｐｌｐ６７外部プローブとのハイブリッド形成によ
り検査した。大半の体毛色キメラはＤＮＡレベルでも高
いキメラ性を示すことが判明した。これらの動物をＣ５
７Ｂｌ／６ＪもしくはＣＤ１のいずれかの雌マウスとの
テスト繁殖に用いてＥＳ細胞が生殖系列に寄与している
か否かを決定した。こうして２つのトランスジェニック
株を樹立し、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊに由来する株６１ではｐ
ｌｐの位置がｐＰＬＰＤｅｌ２５hａｓｎｅｏｔｋのＤ
Ｍ２０構築物により置換されており、そしてＣＤ−１に
由来する株７５はイントロンＩＩＩ内のアンチセンスの
向きのｎｅｏ−ボックスと共にｐｌｐ+／ｄｍ２０+対立
遺伝子を含む。突然変異が遺伝しているヘテロ接合性の
子孫を野生型の雄と交雑させて遺伝的影響を受けている
雄をもうけ、これをヘテロ接合性の雌と交配させて、ｐ
ｌｐ２０-／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏおよびｐｌｐ+／ｄ
ｍ２０+／ａｓｎｅｏマウスのホモ接合性突然変異株を
樹立した。図４〜５は株６１（ｐｌｐ−／ｄｍ２０＋／
ａｓｎｅｏ）のＦ２世代の子孫の分析を例を挙げて示し
ているが、この分析では、ＨｉｎｄＩＩＩ消化でｎｅｏ
−ボックスの相同組込みについての探索をサザンブロッ
トにおいて行い（図４）、そしてその突然変異のいずれ
かの側に存在するＰＣＲ−プライマーＥｘＩＩＩＳ／Ｓ
ａｕＡを用いてＤＭ２０欠損部分についての探索を行っ
た（図５）。
【００１９】ｐｌｐ−／ｄｍ２０＋／ａｓｎｅｏおよび
ｐｌｐ+／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏトランスジェニックマ
ウスのＣＮＳ ｍＲＮＡ、ならびにミエリン蛋白質およ
び脂質の分析 ＰＬＰの位置におけるｐｌｐ+／ｄｍ２０＋／ａｓｎｅ
ｏおよびｐｌｐ-／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏ置換物の正し
いＤＮＡ構造を基にして、我々はノザンブロット分析に
おいてスプライシングを受けたＰＬＰおよびＤＭ２０の
ｍＲＮＡが検出されることを期待していた。図６は、Ｐ
ＬＰのｃＤＮＡ（−７４から２９８まで）プローブとハ
イブリダイズさせた、１５−２０日令の野生型、株７５
（ｐｌｐ+／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏ）および株６１（ｐ
ｌｐ−／ｄｍ２０＋／ａｓｎｅｏ）のヘテロ接合性およ
びホモ接合性突然変異体同産児兄弟の脳の全ＲＮＡのノ
ザンブロットを示す。ホモ接合性突然変異体マウス（＊
ＸＹ）のＲＮＡは、１．６、２．４、および３．２ｋｂ
という３つの典型的なＰＬＰ ｍＲＮＡを完全に欠損し
ている。３つのポリアデニル化シグナル（Ｓｃｈａｉｃ
ｈ ｅｔ ａｌ．、１９８６）の使用により３つの異な
る転写物がもたらされている。しかしながら、ホモ接合
性（＊ＸＹ）およびヘテロ接合性（＊ＸＸ）突然変異マ
ウスからの全ＲＮＡは＞５ｋｂの範囲の弱いシグナルを
生じており（図７）、このことにより、ｎｅｏ−カセッ
トの８００ｂｐのＰｓｔＩ断片で探索した際、ならびに
イントロンＩＩおよびＩＩＩ含有性のゲノムＰＬＰプロ
ーブで探索した際（図７）にスプライシングを受けてい
ない前駆体ＲＮＡの存在が示される。最近我々はこれら
転写物の厳密な性格、すなわちそれらはＰＬＰプロモー
タにより作製されるスプライシングを受けていないセン
ス転写物であるか、あるいはそれらはｔｋ−プロモータ
ーにより命令されるｎｅｏ遺伝子およびそのポリアデニ
ル化シグナルのリードスルーのアンチセンス転写物であ
るかどうかを調査中である。野生型、ヘテロおよびホモ
接合性突然変異マウスの全脳、精製したミエリン、およ
びミエリンのクロロホルム−メタノール抽出物をＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、そし
てウシのミエリンと比較した。ノザンブロット分析から
予想されたように、株６１のホモ接合性トランスジェニ
ック動物の試料ではＰＬＰおよびＤＭ２０のバンドが存
在していなかった。
ｐｌｐ+／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏトランスジェニックマ
ウスのＣＮＳ ｍＲＮＡ、ならびにミエリン蛋白質およ
び脂質の分析 ＰＬＰの位置におけるｐｌｐ+／ｄｍ２０＋／ａｓｎｅ
ｏおよびｐｌｐ-／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏ置換物の正し
いＤＮＡ構造を基にして、我々はノザンブロット分析に
おいてスプライシングを受けたＰＬＰおよびＤＭ２０の
ｍＲＮＡが検出されることを期待していた。図６は、Ｐ
ＬＰのｃＤＮＡ（−７４から２９８まで）プローブとハ
イブリダイズさせた、１５−２０日令の野生型、株７５
（ｐｌｐ+／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏ）および株６１（ｐ
ｌｐ−／ｄｍ２０＋／ａｓｎｅｏ）のヘテロ接合性およ
びホモ接合性突然変異体同産児兄弟の脳の全ＲＮＡのノ
ザンブロットを示す。ホモ接合性突然変異体マウス（＊
ＸＹ）のＲＮＡは、１．６、２．４、および３．２ｋｂ
という３つの典型的なＰＬＰ ｍＲＮＡを完全に欠損し
ている。３つのポリアデニル化シグナル（Ｓｃｈａｉｃ
ｈ ｅｔ ａｌ．、１９８６）の使用により３つの異な
る転写物がもたらされている。しかしながら、ホモ接合
性（＊ＸＹ）およびヘテロ接合性（＊ＸＸ）突然変異マ
ウスからの全ＲＮＡは＞５ｋｂの範囲の弱いシグナルを
生じており（図７）、このことにより、ｎｅｏ−カセッ
トの８００ｂｐのＰｓｔＩ断片で探索した際、ならびに
イントロンＩＩおよびＩＩＩ含有性のゲノムＰＬＰプロ
ーブで探索した際（図７）にスプライシングを受けてい
ない前駆体ＲＮＡの存在が示される。最近我々はこれら
転写物の厳密な性格、すなわちそれらはＰＬＰプロモー
タにより作製されるスプライシングを受けていないセン
ス転写物であるか、あるいはそれらはｔｋ−プロモータ
ーにより命令されるｎｅｏ遺伝子およびそのポリアデニ
ル化シグナルのリードスルーのアンチセンス転写物であ
るかどうかを調査中である。野生型、ヘテロおよびホモ
接合性突然変異マウスの全脳、精製したミエリン、およ
びミエリンのクロロホルム−メタノール抽出物をＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、そし
てウシのミエリンと比較した。ノザンブロット分析から
予想されたように、株６１のホモ接合性トランスジェニ
ック動物の試料ではＰＬＰおよびＤＭ２０のバンドが存
在していなかった。
【００２０】対照株７５を用いた結果は同じものであっ
た。エピトープである、ＰＬＰのＡｒｇ97−Ｌｅ
ｕ112、Ｇｌｙ119−Ｇｌｙ127、およびＴｈｒ261−Ｐｈ
ｅ276を探索するＰＬＰ−特異的ペプチド抗体を用いる
ウエスタンブロット分析によっては、突然変異マウス中
にはＰＬＰもしくはＤＭ２０−特異的シグナルは全く検
出されなかった。
た。エピトープである、ＰＬＰのＡｒｇ97−Ｌｅ
ｕ112、Ｇｌｙ119−Ｇｌｙ127、およびＴｈｒ261−Ｐｈ
ｅ276を探索するＰＬＰ−特異的ペプチド抗体を用いる
ウエスタンブロット分析によっては、突然変異マウス中
にはＰＬＰもしくはＤＭ２０−特異的シグナルは全く検
出されなかった。
【００２１】ＣＮＳミエリン中のリン脂質およびグリコ
スフィンゴリピドの組成を薄層クロマトグラフィーによ
り分析した。リン脂質もしくはグリコスフィンゴリピド
のいずれのパターンも突然変異によっては見たところの
影響を受けていなかった（図９）。
スフィンゴリピドの組成を薄層クロマトグラフィーによ
り分析した。リン脂質もしくはグリコスフィンゴリピド
のいずれのパターンも突然変異によっては見たところの
影響を受けていなかった（図９）。
【００２２】電子顕微鏡 主な内在性膜蛋白質ＰＬＰおよびＤＭ２０を欠損するミ
エリン膜の巻き込みおよび圧密化についての形態学的結
果を評価するために、我々は電子顕微鏡により２０日令
の野生型、ヘテロ接合性およびホモ接合性突然変異体ｐ
ｌｐ−／ｄｍ２０＋／ａｓｎｅｏマウスの視神経を調査
した（図１０Ａ−Ｂ、図１１）。結果はすばらしいもの
であり、ホモ接合性突然変異体においてはミエリンが完
全に不整列になっており、オリゴデンドロサイトの原型
質膜突起は大きめの軸索を緩く巻き込んでいるに過ぎ
ず、一方で小さめの軸索にはミエリン形成が生じていな
いままであった。圧密化が緩いミエリンには、通常は原
形質外膜表面の圧密化により形成される内周期密集線
（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｏｄ ｄｅｎｓｅ ｌｉｎｅ）が
全く存在していないことが示されている（図１１）。
エリン膜の巻き込みおよび圧密化についての形態学的結
果を評価するために、我々は電子顕微鏡により２０日令
の野生型、ヘテロ接合性およびホモ接合性突然変異体ｐ
ｌｐ−／ｄｍ２０＋／ａｓｎｅｏマウスの視神経を調査
した（図１０Ａ−Ｂ、図１１）。結果はすばらしいもの
であり、ホモ接合性突然変異体においてはミエリンが完
全に不整列になっており、オリゴデンドロサイトの原型
質膜突起は大きめの軸索を緩く巻き込んでいるに過ぎ
ず、一方で小さめの軸索にはミエリン形成が生じていな
いままであった。圧密化が緩いミエリンには、通常は原
形質外膜表面の圧密化により形成される内周期密集線
（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｏｄ ｄｅｎｓｅ ｌｉｎｅ）が
全く存在していないことが示されている（図１１）。
【００２３】ヘテロ接合性の雌は細胞のモザイク性を示
し、これはバール小体形成の際のランダムなＸ−不活性
化に起因している。我々は緩く巻き込まれている軸索の
近傍に圧密化された内周期密集線のある正常なミエリン
形成を生じている軸索を発見している。ＰＬＰはミエリ
ン形成を生じているオリゴデンドロサイトに特異的であ
るため、我々は末梢神経内には正常なミエリンの超微細
構造が存在することを予期していた。期待されたよう
に、ホモ接合性マウスの末梢神経の軸索のミエリン鞘は
野生型マウスにおいて観察されるものと区別することが
できなかった。
し、これはバール小体形成の際のランダムなＸ−不活性
化に起因している。我々は緩く巻き込まれている軸索の
近傍に圧密化された内周期密集線のある正常なミエリン
形成を生じている軸索を発見している。ＰＬＰはミエリ
ン形成を生じているオリゴデンドロサイトに特異的であ
るため、我々は末梢神経内には正常なミエリンの超微細
構造が存在することを予期していた。期待されたよう
に、ホモ接合性マウスの末梢神経の軸索のミエリン鞘は
野生型マウスにおいて観察されるものと区別することが
できなかった。
【００２４】電気生理学的データおよび行動 ミエリン圧密化の数々の構造的影響にもかかわらず、ト
ランスジェニックマウスは大きな神経学的欠陥および行
動上での異常を全く示していない。これらの動物は正常
な繁殖力を有するため、この突然変異体を繁殖させてホ
モ接合性とすることが可能である。今日までに最も年齢
の進んだ突然変異体動物は７カ月という年齢に達してお
り、かつ健康を保っている。電気的神経コンダクタンス
に生じる可能性のある変化を究明するために、我々は、
野生型、ヘテロ接合性およびホモ接合性突然変異体マウ
スから新しく調製してきた視神経でコンダクタンスの速
度を測定した。我々は、野生型対照と比較した際に、ホ
モ接合性突然変異体においては半分にまで、そしてヘテ
ロ接合性突然変異体においては３分の１にまでコンダク
タンス速度が低下していることを見いだした。
ランスジェニックマウスは大きな神経学的欠陥および行
動上での異常を全く示していない。これらの動物は正常
な繁殖力を有するため、この突然変異体を繁殖させてホ
モ接合性とすることが可能である。今日までに最も年齢
の進んだ突然変異体動物は７カ月という年齢に達してお
り、かつ健康を保っている。電気的神経コンダクタンス
に生じる可能性のある変化を究明するために、我々は、
野生型、ヘテロ接合性およびホモ接合性突然変異体マウ
スから新しく調製してきた視神経でコンダクタンスの速
度を測定した。我々は、野生型対照と比較した際に、ホ
モ接合性突然変異体においては半分にまで、そしてヘテ
ロ接合性突然変異体においては３分の１にまでコンダク
タンス速度が低下していることを見いだした。
【００２５】実験方法 標的挿入用ベクターの作製 ＰＬＰ遺伝子に標的挿入するためのベクターを作製する
ために、我々は最初にＢａｌｂ／ｃマウスのゲノムライ
ブラリーから得られるエキソンＩからＶまでを含む６．
７ｋｂのＤＮＡをｐＵＣ１９ベクターのポリクローニン
グ部位にサブクローン化した。ＰＬＰ遺伝子のエキソン
ＩＩＩ内に特異的な突然変異を導入するために、ＰＣＲ
を重複させることによる突然変異誘発を実施した。エキ
ソンＩＩＩ内に１０５ｂｐのＤＭ２０欠損部分を導入す
るためには、エキソンＩＩの５’端に位置するセンスプ
ライマーであるプライマーＥｘＩＩＳ ５’−ＧＴＴＴ
ＧＴＴＡＧＡＧＴＧＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧ
ＧＴ−３’、およびＤＭ２０欠損部分を含むアンチセン
スプライマーであるプライマーＤＥＬＡ ５’−ａａｔ
ｃｃｔｇａｇｇａｔｇａｔｃａｃＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣ
ＡＧＧＣＣＣＴＴ−３’を初回の５’増幅に用いて１．
３ｋｂのセグメントを取得した。エキソン４の５’端に
位置するアンチセンスプライマーであるプライマーＥｘ
ＩＶＡ ５’−ＧＣＣＡＴＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＧＧＧ
ＣＡＴＡＧＧＴＧＡＴＧＣ−３’、およびＤＭ２０欠損
部分を含むセンスプライマーであるプライマーＤＥＬＳ
５’−ＡＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧｇｔｇ
ａｔｃａｔｃｃｔｃａｇｇａｔｔ−３’を初回の３’増
幅に用いて１．１ｋｂのセグメントを取得した。これら
２つのゲル精製済み断片を重複ＰＣＲ反応のために連結
させたが、この重複ＰＣＲ反応では２．４ｋｂの重複産
物の増幅のためにプライマーＥｘＩＩＳおよびＥｘＩＶ
Ａを用いた。最終産物をゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＢａｍＨＩで消化して周辺のイントロン領域と共に
エキソンＩＩＩをｐＵＣ１９にクローン化した。Ｔ７配
列決定用キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で配列決定す
ることによりこの配列の照査を行った。
ために、我々は最初にＢａｌｂ／ｃマウスのゲノムライ
ブラリーから得られるエキソンＩからＶまでを含む６．
７ｋｂのＤＮＡをｐＵＣ１９ベクターのポリクローニン
グ部位にサブクローン化した。ＰＬＰ遺伝子のエキソン
ＩＩＩ内に特異的な突然変異を導入するために、ＰＣＲ
を重複させることによる突然変異誘発を実施した。エキ
ソンＩＩＩ内に１０５ｂｐのＤＭ２０欠損部分を導入す
るためには、エキソンＩＩの５’端に位置するセンスプ
ライマーであるプライマーＥｘＩＩＳ ５’−ＧＴＴＴ
ＧＴＴＡＧＡＧＴＧＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧ
ＧＴ−３’、およびＤＭ２０欠損部分を含むアンチセン
スプライマーであるプライマーＤＥＬＡ ５’−ａａｔ
ｃｃｔｇａｇｇａｔｇａｔｃａｃＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣ
ＡＧＧＣＣＣＴＴ−３’を初回の５’増幅に用いて１．
３ｋｂのセグメントを取得した。エキソン４の５’端に
位置するアンチセンスプライマーであるプライマーＥｘ
ＩＶＡ ５’−ＧＣＣＡＴＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＧＧＧ
ＣＡＴＡＧＧＴＧＡＴＧＣ−３’、およびＤＭ２０欠損
部分を含むセンスプライマーであるプライマーＤＥＬＳ
５’−ＡＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧｇｔｇ
ａｔｃａｔｃｃｔｃａｇｇａｔｔ−３’を初回の３’増
幅に用いて１．１ｋｂのセグメントを取得した。これら
２つのゲル精製済み断片を重複ＰＣＲ反応のために連結
させたが、この重複ＰＣＲ反応では２．４ｋｂの重複産
物の増幅のためにプライマーＥｘＩＩＳおよびＥｘＩＶ
Ａを用いた。最終産物をゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＢａｍＨＩで消化して周辺のイントロン領域と共に
エキソンＩＩＩをｐＵＣ１９にクローン化した。Ｔ７配
列決定用キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で配列決定す
ることによりこの配列の照査を行った。
【００２６】同一の手法に従って他のエキソンＩＩＩ突
然変異体をサブクローン化した。エキソンＩＩＩ内の代
用スプライスシグナルの共通配列内に２塩基置換が生じ
ていて、そのためＤＭ２０転写物の形成が禁止されてい
るＰＬＰ+／ＤＭ２０-突然変異体を、突然変異誘発プラ
イマーＭＵＴＳ ５’−ＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣ
ＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＧＣＣＡＧＡ−３’、およびＭＵ
ＴＡ ５’−ＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＴＧＡＣＧＧＴ
ＴＧＣＧＣＴＣＡＧＧＣ−３’の利用により作製した。
然変異体をサブクローン化した。エキソンＩＩＩ内の代
用スプライスシグナルの共通配列内に２塩基置換が生じ
ていて、そのためＤＭ２０転写物の形成が禁止されてい
るＰＬＰ+／ＤＭ２０-突然変異体を、突然変異誘発プラ
イマーＭＵＴＳ ５’−ＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣ
ＧＴＣＡＣＡＧＧＧＧＧＣＣＡＧＡ−３’、およびＭＵ
ＴＡ ５’−ＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＴＧＡＣＧＧＴ
ＴＧＣＧＣＴＣＡＧＧＣ−３’の利用により作製した。
【００２７】ＰＣＲ周期は、最終容量１００μｌ中で１
００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１００ｐモルの各プライマー、
２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇ
Ｃｌ2、０．１ｍｇ／ｍｌのゼラチン、および１．５Ｕ
のＴａｑポリメラーゼ（ＢＲＬ社）を用いて、９３℃で
１．５分、６８℃で２分、および７２℃で２分を１５周
期分行った。
００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１００ｐモルの各プライマー、
２００μＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇ
Ｃｌ2、０．１ｍｇ／ｍｌのゼラチン、および１．５Ｕ
のＴａｑポリメラーゼ（ＢＲＬ社）を用いて、９３℃で
１．５分、６８℃で２分、および７２℃で２分を１５周
期分行った。
【００２８】増幅産物を電気泳動にかけ、そして臭化エ
チジウム染色により１％のアガロースゲル上で可視化さ
せ、そしてキアエックス ゲル エキストラクション
キット（Ｑｕｉａｅｘ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔ）（Ｑｕｉａｇｅｎ社）を用いて溶出させた。
チジウム染色により１％のアガロースゲル上で可視化さ
せ、そしてキアエックス ゲル エキストラクション
キット（Ｑｕｉａｅｘ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
Ｋｉｔ）（Ｑｕｉａｇｅｎ社）を用いて溶出させた。
【００２９】最終遺伝子標的挿入用構築物を５段階でク
ローン化した。最初に非反復のＨｐａＩ開裂部位を５’
配列が相同であるＨｐａＩ−特異的オリゴヌクレオチド
リンカー ５’−ＣＡＴＧＧＡＡＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴ
ＧＧＣＡＡＧＧＴＴＡＡＣ−３’および ５’−ＣＡＴ
ＧＧＴＴＡＡＣＣＴＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴ
Ｃ−３’の利用によりエキソンＶのＮｃｏＩ部位に導入
し、これを１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−断片含有性エキソ
ンＩＶおよびＶとしてファゲミドｐＥＭＢＬ１９にサブ
クローン化した。この方法でＨｐａＩ開裂を行って標的
挿入用構築物の平滑３’末端を作製したが、この３’末
端はＰＬＰ配列と１００％相同であった。この産物ｐＥ
ＭＢＬｐｌｐ１．８ｐａＩをＢａｍＨＩで切断し、１．
８ｋｂのＰＬＰ断片を溶出させ、そして連結後にＢａｍ
ＨＩ部位をなくすために開裂末端充填反応（ｆｉｌｌ−
ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ．、１９８２）を行い、その後にセンスの向きでｔ
ｋ−カッセット含有性ベクターのＢａｍＨＩ部位に挿入
させた上でクローン化を行った。得られる構築物ｐＰＬ
Ｐ４５hｔｋをＳａｌＩで切断し、そしてイントロンＩ
ＩＩ内にアンチセンスの向きでｐＭＣＩ ｎｅｏｐＡ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）からのＳａｌＩ−ＸｈｏＩ
ｎｅｏ−カセットを挿入することで遺伝子拡張を行い、
ベクターｐＰＬＰ４５hａｓｎｅｏｔｋを取得した。こ
のベクターを、エキソンＩＩＩの２つの突然変異形態お
よび対照としてのｗｔ−エキソンＩＩＩを含む３つの異
なる１．２ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片によ
って遺伝子拡張するべく基本構築物として用いた。得ら
れるベクターｐＰＬＰＸ３５hａｓｎｅｏｔｋ（Ｘは、
ｗｔ、Ｄｅｌ、もしくはＭｕｔのいずれかを表す）を非
反復ＨｉｎｄＩＩＩ部位で直線状にし、そしてエキソン
ＩＩ−含有性ＨｉｎｄＩＩＩ断片を添加した。最終産物
であるｐＰＬＰＸ２５hａｓｎｅｏｔｋは、挿入ベクタ
ーとして用いるためにはＨｐａＩのみで、置換ベクター
として用いるためにはＨｐａＩ／ＣｌａＩで、そしてＰ
ＣＲ模造構築物として用いるためにはＳｍａＩで直線状
にすることができる。
ローン化した。最初に非反復のＨｐａＩ開裂部位を５’
配列が相同であるＨｐａＩ−特異的オリゴヌクレオチド
リンカー ５’−ＣＡＴＧＧＡＡＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴ
ＧＧＣＡＡＧＧＴＴＡＡＣ−３’および ５’−ＣＡＴ
ＧＧＴＴＡＡＣＣＴＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＡＴＴ
Ｃ−３’の利用によりエキソンＶのＮｃｏＩ部位に導入
し、これを１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−断片含有性エキソ
ンＩＶおよびＶとしてファゲミドｐＥＭＢＬ１９にサブ
クローン化した。この方法でＨｐａＩ開裂を行って標的
挿入用構築物の平滑３’末端を作製したが、この３’末
端はＰＬＰ配列と１００％相同であった。この産物ｐＥ
ＭＢＬｐｌｐ１．８ｐａＩをＢａｍＨＩで切断し、１．
８ｋｂのＰＬＰ断片を溶出させ、そして連結後にＢａｍ
ＨＩ部位をなくすために開裂末端充填反応（ｆｉｌｌ−
ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ．、１９８２）を行い、その後にセンスの向きでｔ
ｋ−カッセット含有性ベクターのＢａｍＨＩ部位に挿入
させた上でクローン化を行った。得られる構築物ｐＰＬ
Ｐ４５hｔｋをＳａｌＩで切断し、そしてイントロンＩ
ＩＩ内にアンチセンスの向きでｐＭＣＩ ｎｅｏｐＡ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）からのＳａｌＩ−ＸｈｏＩ
ｎｅｏ−カセットを挿入することで遺伝子拡張を行い、
ベクターｐＰＬＰ４５hａｓｎｅｏｔｋを取得した。こ
のベクターを、エキソンＩＩＩの２つの突然変異形態お
よび対照としてのｗｔ−エキソンＩＩＩを含む３つの異
なる１．２ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片によ
って遺伝子拡張するべく基本構築物として用いた。得ら
れるベクターｐＰＬＰＸ３５hａｓｎｅｏｔｋ（Ｘは、
ｗｔ、Ｄｅｌ、もしくはＭｕｔのいずれかを表す）を非
反復ＨｉｎｄＩＩＩ部位で直線状にし、そしてエキソン
ＩＩ−含有性ＨｉｎｄＩＩＩ断片を添加した。最終産物
であるｐＰＬＰＸ２５hａｓｎｅｏｔｋは、挿入ベクタ
ーとして用いるためにはＨｐａＩのみで、置換ベクター
として用いるためにはＨｐａＩ／ＣｌａＩで、そしてＰ
ＣＲ模造構築物として用いるためにはＳｍａＩで直線状
にすることができる。
【００３０】ＥＳ細胞内での遺伝子標的挿入 Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＣＤ１マウスをＪａｃｋｓｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社およびＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉ
ｖｅｒ社（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）から取得した。Ｅ１４
ＥＳ細胞（第１０−１５継代）を、１５％のウシ胎児血
清、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、およびｍ
ｌあたり５００ＵのＬＩＦ（Ｅｓｇｒｏ社）を含むダル
ベッコー修正イーグル（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地で、マイトマイシン
Ｃ処理済みＧ４１８耐性マウス胚繊維芽細胞の支持細胞
層（Ｒｏｖｅｒｔｓｏｎ、１９８７）上、３７℃、５％
ＣＯ2下で９０％密集状態になるまで増殖させた。総計
で１１回の電気穿孔法を、２２０Ｖ、５００μＦ下、Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社の遺伝子パルサーセット（ｇｅｎｅｐｕ
ｌｓｅｒ ｓｅｔ）の０．４ｃｍキュベット内で、実験
当たり０．８ｍｌのリン酸緩衝化食塩水中の１０7の細
胞、および２０μｇのＨｐａＩ／ＣｌａＩ−直線化済み
置換ベクターＤＮＡを用いて実施した。その後、各キュ
ベットからの細胞を６枚の１０ｍｍ支持細胞プレート上
に均等に分散させた。４枚のプレートには２４時間後に
二重選択のためのＧ４１８（２５０μｇの有効濃度、Ｓ
ｉｇｍａ社）およびガンシクロビル（２μＭ）を添加し
た。一枚の対照プレートはＧ４１８のみで選択を行い、
他の対照プレートは通常の培養培地で飼育した。８−１
０日後に耐性クローンを拾い上げ、マウス胚繊維芽細胞
の支持細胞層でコートしてある２４マイクロタイタープ
レート内に移動させた。増殖後に各クローンを２つのウ
エルに分け入れた。これらの試料のうちの一つは凍結
し、一方で他の一つはＤＮＡ分析用にゲラチン処理して
あるウエルで増殖させた。Ｇ４１８−耐性コロニーの内
の平均２０％−３３％はガンシクロビルに対しても耐性
を示し、そしてこれらの内の２％−３％のものが相同組
換え体であった。ＰＬＰ-／ＤＭ２０+標的挿入用実験
（欠損部分）においては、６つのクローンの内の５つが
所望の突然変異と相同組込みされたｎｅｏ−ボックスと
の同時変換を生じており、一方でＰＬＰ+／ＤＭ２０
-（２つの誤対合を含む）標的挿入用実験では、その比
率は７つの相同組換えクローンの内のわずか一つのみの
同時変換となっていた。標的挿入済みクローンは細胞注
入前に、ＥＣＭＡ７およびＴＲＯＭＡ１免疫蛍光染色、
ならびにそれらの核型について検査した。
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社およびＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉ
ｖｅｒ社（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）から取得した。Ｅ１４
ＥＳ細胞（第１０−１５継代）を、１５％のウシ胎児血
清、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、およびｍ
ｌあたり５００ＵのＬＩＦ（Ｅｓｇｒｏ社）を含むダル
ベッコー修正イーグル（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地で、マイトマイシン
Ｃ処理済みＧ４１８耐性マウス胚繊維芽細胞の支持細胞
層（Ｒｏｖｅｒｔｓｏｎ、１９８７）上、３７℃、５％
ＣＯ2下で９０％密集状態になるまで増殖させた。総計
で１１回の電気穿孔法を、２２０Ｖ、５００μＦ下、Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社の遺伝子パルサーセット（ｇｅｎｅｐｕ
ｌｓｅｒ ｓｅｔ）の０．４ｃｍキュベット内で、実験
当たり０．８ｍｌのリン酸緩衝化食塩水中の１０7の細
胞、および２０μｇのＨｐａＩ／ＣｌａＩ−直線化済み
置換ベクターＤＮＡを用いて実施した。その後、各キュ
ベットからの細胞を６枚の１０ｍｍ支持細胞プレート上
に均等に分散させた。４枚のプレートには２４時間後に
二重選択のためのＧ４１８（２５０μｇの有効濃度、Ｓ
ｉｇｍａ社）およびガンシクロビル（２μＭ）を添加し
た。一枚の対照プレートはＧ４１８のみで選択を行い、
他の対照プレートは通常の培養培地で飼育した。８−１
０日後に耐性クローンを拾い上げ、マウス胚繊維芽細胞
の支持細胞層でコートしてある２４マイクロタイタープ
レート内に移動させた。増殖後に各クローンを２つのウ
エルに分け入れた。これらの試料のうちの一つは凍結
し、一方で他の一つはＤＮＡ分析用にゲラチン処理して
あるウエルで増殖させた。Ｇ４１８−耐性コロニーの内
の平均２０％−３３％はガンシクロビルに対しても耐性
を示し、そしてこれらの内の２％−３％のものが相同組
換え体であった。ＰＬＰ-／ＤＭ２０+標的挿入用実験
（欠損部分）においては、６つのクローンの内の５つが
所望の突然変異と相同組込みされたｎｅｏ−ボックスと
の同時変換を生じており、一方でＰＬＰ+／ＤＭ２０
-（２つの誤対合を含む）標的挿入用実験では、その比
率は７つの相同組換えクローンの内のわずか一つのみの
同時変換となっていた。標的挿入済みクローンは細胞注
入前に、ＥＣＭＡ７およびＴＲＯＭＡ１免疫蛍光染色、
ならびにそれらの核型について検査した。
【００３１】ＥＳ細胞のＤＮＡ分析 ７５％密度に達した後に、細胞をリン酸緩衝化食塩水で
洗浄し、そして５００μｌの溶菌緩衝液（５０ｍＭのト
リス−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１００ｍＭのＮａＣｌ、
５０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ、および４００μｇ
／ｍｌのプロテイナーゼＫ）を各ウエルに添加した。こ
のプレートを３７℃で一晩インキュベートした。この溶
菌液を１．５ｍｌのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ）管に移し、そして５００μｌのイソプロパノールの
添加後に沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで一
回洗浄し、乾燥させ、そして５０μｌのＴＥ中、震盪台
（ｒｏｃｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で３７℃下で
一晩再懸濁させた。ＥｃｏＲＩ消化を用いるサザンブロ
ット分析のために３つのクローンのＤＮＡ収率の３分の
１をプールしたが、この酵素消化によっては、７ｋｂ
（標的挿入していない）およびｎｅｏ−ボックス内に含
まれる追加的ＥｃｏＲＩ部位から得られる４．５ｋｂ
（標的挿入済み）の表示される断片を生じる。32Ｐ−ラ
ベル化ＰＬＰ外部プローブｐｌｐ５６およびｐｌｐ６７
（ベクター内に含まれていない）をハイブリッド形成用
に用いた。各消化物を０．７％アガロースゲル上で分画
化し、そして製造業者の指示に従ってＧｅｎｅＳｃｒｅ
ｅｎＰｌｕｓ（商標）上に転移させた。陽性プールは、
個々のクローンのＥｃｏＲＩ制限パターンについて分析
した。陽性クローンをＤＭ２０欠損部分の存在について
ＢｇｌＩＩ制限消化およびエキソンＩＩＩプローブハイ
ブリッド形成により検査した。追加的クローンを、相同
組換え現象に特異的な、プライマーｎｅｏＡＴＧ（ｎｅ
ｏ遺伝子のＡＴＧ開始コドン上に存在するｎｅｏ−特異
的アンチセンスプライマー） ５’−ＡＡＴＣＣＡＴＣ
ＴＴＧＴＴＣＡＡＴＧＧＣＣＧＡＴＣＣＣＡＴ−３’お
よびＨＲＡ（標的挿入用構築物の３’端の下流にあるゲ
ノムＤＮＡ上に存在するＰＬＰアンチセンスプライマ
ー） ５’−ＴＣＡＧＣＴＧＴＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧ
ＡＣＡＧＡＡＧＧＴＴＧＧ−３’を用いるＰＣＲにより
検査した。ＰＣＲは、６７ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ
８．３、１６．６７ｍＭのＮＨ4ＳＯ4、０．１７ｍｇ／
ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、
１ｍＭのＭｇＣｌ2、５％のＤＭＳＯ中で、５ピコモル
の各プライマー、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、および１．５
ＵのＴａｑポリメラーゼ（ＢＲＬ社）を用いて、９２℃
で１分、５０℃で１分、および７２℃で３分３０秒の周
期を総計３５周期分実施した。特異的突然変異の存在
を、エキソンＩＩＩを増幅するためのプライマーＥｘＩ
ＩＳおよびＳａｕＡ ５’−ＧＡＧＧＡＣＣＣＡＡＣＣ
ＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＴＣＡＧＧＣＴ−３’での同一
条件を用いて検査したところ、ＰＬＰの場合には１．２
ｋｂバンドを、そしてＤＭ２０欠損部分の場合には１．
１ｋｂバンドを取得した。ＰＬＰ+／ＤＭ２０-スプライ
ス部位突然変異は、ＥｘＩＶＡもしくはＳａｕＡと共に
対立遺伝子特異的プライマー ＤＭ−５’−ＡＴＣＴＧ
ＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＴＣ−
３’を用いて検査した。この方法で、５つの正しいｐｌ
ｐ-／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏクローンおよび一つのｐｌ
ｐ+／ｄｍ２０-／ａｓｎｅｏクローンを対照クローンｐ
ｌｐ+／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏ以外にも同定することが
できた。
洗浄し、そして５００μｌの溶菌緩衝液（５０ｍＭのト
リス−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１００ｍＭのＮａＣｌ、
５０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ、および４００μｇ
／ｍｌのプロテイナーゼＫ）を各ウエルに添加した。こ
のプレートを３７℃で一晩インキュベートした。この溶
菌液を１．５ｍｌのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒ
ｆ）管に移し、そして５００μｌのイソプロパノールの
添加後に沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで一
回洗浄し、乾燥させ、そして５０μｌのＴＥ中、震盪台
（ｒｏｃｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で３７℃下で
一晩再懸濁させた。ＥｃｏＲＩ消化を用いるサザンブロ
ット分析のために３つのクローンのＤＮＡ収率の３分の
１をプールしたが、この酵素消化によっては、７ｋｂ
（標的挿入していない）およびｎｅｏ−ボックス内に含
まれる追加的ＥｃｏＲＩ部位から得られる４．５ｋｂ
（標的挿入済み）の表示される断片を生じる。32Ｐ−ラ
ベル化ＰＬＰ外部プローブｐｌｐ５６およびｐｌｐ６７
（ベクター内に含まれていない）をハイブリッド形成用
に用いた。各消化物を０．７％アガロースゲル上で分画
化し、そして製造業者の指示に従ってＧｅｎｅＳｃｒｅ
ｅｎＰｌｕｓ（商標）上に転移させた。陽性プールは、
個々のクローンのＥｃｏＲＩ制限パターンについて分析
した。陽性クローンをＤＭ２０欠損部分の存在について
ＢｇｌＩＩ制限消化およびエキソンＩＩＩプローブハイ
ブリッド形成により検査した。追加的クローンを、相同
組換え現象に特異的な、プライマーｎｅｏＡＴＧ（ｎｅ
ｏ遺伝子のＡＴＧ開始コドン上に存在するｎｅｏ−特異
的アンチセンスプライマー） ５’−ＡＡＴＣＣＡＴＣ
ＴＴＧＴＴＣＡＡＴＧＧＣＣＧＡＴＣＣＣＡＴ−３’お
よびＨＲＡ（標的挿入用構築物の３’端の下流にあるゲ
ノムＤＮＡ上に存在するＰＬＰアンチセンスプライマ
ー） ５’−ＴＣＡＧＣＴＧＴＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧ
ＡＣＡＧＡＡＧＧＴＴＧＧ−３’を用いるＰＣＲにより
検査した。ＰＣＲは、６７ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ
８．３、１６．６７ｍＭのＮＨ4ＳＯ4、０．１７ｍｇ／
ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、
１ｍＭのＭｇＣｌ2、５％のＤＭＳＯ中で、５ピコモル
の各プライマー、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、および１．５
ＵのＴａｑポリメラーゼ（ＢＲＬ社）を用いて、９２℃
で１分、５０℃で１分、および７２℃で３分３０秒の周
期を総計３５周期分実施した。特異的突然変異の存在
を、エキソンＩＩＩを増幅するためのプライマーＥｘＩ
ＩＳおよびＳａｕＡ ５’−ＧＡＧＧＡＣＣＣＡＡＣＣ
ＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＴＣＡＧＧＣＴ−３’での同一
条件を用いて検査したところ、ＰＬＰの場合には１．２
ｋｂバンドを、そしてＤＭ２０欠損部分の場合には１．
１ｋｂバンドを取得した。ＰＬＰ+／ＤＭ２０-スプライ
ス部位突然変異は、ＥｘＩＶＡもしくはＳａｕＡと共に
対立遺伝子特異的プライマー ＤＭ−５’−ＡＴＣＴＧ
ＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＴＣ−
３’を用いて検査した。この方法で、５つの正しいｐｌ
ｐ-／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏクローンおよび一つのｐｌ
ｐ+／ｄｍ２０-／ａｓｎｅｏクローンを対照クローンｐ
ｌｐ+／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏ以外にも同定することが
できた。
【００３２】未分化胚芽細胞の注入 過剰排卵させたＣ５７Ｂｌ／６ＪおよびＣＤ１雌マウス
の子宮角からの未分化胚芽細胞を性交後３．５日に、１
０％のウシ胎児血清および５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む
ダルベッコー修飾イーグル培地内でフラッシュして細胞
をほぐした。標的挿入済みクローンの１０−２０細胞を
各胞胚腔内に注入し、そして５−１４の未分化胚芽細胞
の群を、記載されるように（Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａ
ｌ．、１９８４）偽妊娠雌マウス内に移した。２つの注
入クローンにより各一つづつの生殖系列キメラを生じ
た。
の子宮角からの未分化胚芽細胞を性交後３．５日に、１
０％のウシ胎児血清および５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む
ダルベッコー修飾イーグル培地内でフラッシュして細胞
をほぐした。標的挿入済みクローンの１０−２０細胞を
各胞胚腔内に注入し、そして５−１４の未分化胚芽細胞
の群を、記載されるように（Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａ
ｌ．、１９８４）偽妊娠雌マウス内に移した。２つの注
入クローンにより各一つづつの生殖系列キメラを生じ
た。
【００３３】遺伝子型決定 サザン分析およびＰＣＲによる動物の遺伝子型決定を行
うために、記載されるように（Ｈｏｇａｎ、１９８６）
２週令のマウスの尾先端からＤＮＡを調製した。我々は
プローブとして、標的挿入用構築物の３’端の下流に存
在するゲノム断片ｐｌｐ５６およびｐｌｐ６７、ならび
にエキソンＩＩＩに特定的な１．２ｋｂのＢａｍＨＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ断片を用いた。我々はＰＣＲプライマー
として、ＮｅｏＡＴＧとＨＲＡ、およびＥｘＩＩＳとＳ
ａｕＡとの組み合わせ物を用いた（図２）。遺伝子型決
定の後、マウスを特異的に交雑させてホモ接合性トラン
スジェニック株を取得した。
うために、記載されるように（Ｈｏｇａｎ、１９８６）
２週令のマウスの尾先端からＤＮＡを調製した。我々は
プローブとして、標的挿入用構築物の３’端の下流に存
在するゲノム断片ｐｌｐ５６およびｐｌｐ６７、ならび
にエキソンＩＩＩに特定的な１．２ｋｂのＢａｍＨＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ断片を用いた。我々はＰＣＲプライマー
として、ＮｅｏＡＴＧとＨＲＡ、およびＥｘＩＩＳとＳ
ａｕＡとの組み合わせ物を用いた（図２）。遺伝子型決
定の後、マウスを特異的に交雑させてホモ接合性トラン
スジェニック株を取得した。
【００３４】発現分析 ＲＮＡ分析 １５−２０日令のマウスの脳の全ＲＮＡは、記載される
ように（ＣｈｏｍｅｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈ
ｉ、１９８７）抽出した。１５μｇのＲＮＡを１．５％
のアガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分離させ、そ
して２０×ＳＳＣを用いてニトロセルロース（Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）上にブロットさせ
た。この膜は、８０℃で２時間加熱した後に、５０ｍＭ
のリン酸緩衝液、ｐＨ６．８、５×ＳＳＣ、１×デンハ
ート溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）、５０％のホルムア
ルデヒド、および１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ
中、４２℃下で４時間予備ハイブリッド形成させた。こ
の時間が経過した後、この膜を、１０％の硫酸デキスト
ラン、および２×１０5ｃｐｍ／ｍｌの32Ｐ−ラベル化
プローブを含む新鮮な緩衝液中で４２℃において一晩ハ
イブリッド形成させた。この膜を、２×ＳＳＣ、０．１
％のＳＤＳで室温において５分間、４回洗浄し、そして
０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで５０℃において１
５分間、２回洗浄した。
ように（ＣｈｏｍｅｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈ
ｉ、１９８７）抽出した。１５μｇのＲＮＡを１．５％
のアガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分離させ、そ
して２０×ＳＳＣを用いてニトロセルロース（Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）上にブロットさせ
た。この膜は、８０℃で２時間加熱した後に、５０ｍＭ
のリン酸緩衝液、ｐＨ６．８、５×ＳＳＣ、１×デンハ
ート溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）、５０％のホルムア
ルデヒド、および１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ
中、４２℃下で４時間予備ハイブリッド形成させた。こ
の時間が経過した後、この膜を、１０％の硫酸デキスト
ラン、および２×１０5ｃｐｍ／ｍｌの32Ｐ−ラベル化
プローブを含む新鮮な緩衝液中で４２℃において一晩ハ
イブリッド形成させた。この膜を、２×ＳＳＣ、０．１
％のＳＤＳで室温において５分間、４回洗浄し、そして
０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで５０℃において１
５分間、２回洗浄した。
【００３５】蛋白質分析 全脳抽出物、全脳ミエリン、およびミエリンのクロロホ
ルム／メタノール（１：１ ｖｏｌ／ｖｏｌ）抽出物
（Ｎｏｒｔｏｎ、１９７３）を、１５％のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ上で分離させ、そしてクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓ
ｉｅ）あるいは銀染色のいずれかでの染色を行った。
ルム／メタノール（１：１ ｖｏｌ／ｖｏｌ）抽出物
（Ｎｏｒｔｏｎ、１９７３）を、１５％のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ上で分離させ、そしてクーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓ
ｉｅ）あるいは銀染色のいずれかでの染色を行った。
【００３６】脂質分析 全脳のクロロホルム−メタノール（２：１ ｖｏｌ／ｖ
ｏｌ）抽出物もしくは密度勾配精製済みのミエリンを、
ＨＰＴＬＣプレコーテッドプレート（ＨＰＴＬＣ Ｐｒ
ｅｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ）［シリカゲル（Ｓｉｌ
ｉｃａ Ｇｅｌ）（Ｍｅｒｃｋ社、Ｄａｒｍｓｔａｄ
ｔ）］上での薄層クロマトグラフィー（溶媒系：クロロ
ホルム：メタノール：水 ６０：２５：４）により分離
した。リン脂質をジンザッツェ（Ｚｉｎｚａｄｚｅ）試
薬（ＤｉｔｔｍｅｒおよびＬｅｓｔｅｒ、１９６４）で
染色し、そしてグリコスフィンゴリピドはメタノール−
水（１：１、ｖ／ｖ）中のα−ナフトール−Ｈ2ＳＯ4で
可視化させた。
ｏｌ）抽出物もしくは密度勾配精製済みのミエリンを、
ＨＰＴＬＣプレコーテッドプレート（ＨＰＴＬＣ Ｐｒ
ｅｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ）［シリカゲル（Ｓｉｌ
ｉｃａ Ｇｅｌ）（Ｍｅｒｃｋ社、Ｄａｒｍｓｔａｄ
ｔ）］上での薄層クロマトグラフィー（溶媒系：クロロ
ホルム：メタノール：水 ６０：２５：４）により分離
した。リン脂質をジンザッツェ（Ｚｉｎｚａｄｚｅ）試
薬（ＤｉｔｔｍｅｒおよびＬｅｓｔｅｒ、１９６４）で
染色し、そしてグリコスフィンゴリピドはメタノール−
水（１：１、ｖ／ｖ）中のα−ナフトール−Ｈ2ＳＯ4で
可視化させた。
【００３７】形態学的分析 電子顕微鏡 マウスについては、ネンブタール（Ｎｅｍｂｕｔａｌ）
での麻酔を施し、そして左心室を介する６％グルタール
アルデヒドでの灌流を行った。眼球と眼窩裂との間で視
神経を除去し、０．１Ｍスクロース注の１％リン酸緩衝
化ＯｓＯ4中で後固定を行い、そしてＥｐｏｎ８１２に
包埋した。視神経の超薄切片は、酢酸ウラニルおよびク
エン酸鉛でコントラストをつけ、そして調査した。
での麻酔を施し、そして左心室を介する６％グルタール
アルデヒドでの灌流を行った。眼球と眼窩裂との間で視
神経を除去し、０．１Ｍスクロース注の１％リン酸緩衝
化ＯｓＯ4中で後固定を行い、そしてＥｐｏｎ８１２に
包埋した。視神経の超薄切片は、酢酸ウラニルおよびク
エン酸鉛でコントラストをつけ、そして調査した。
【００３８】本発明の主な特徴または態様は以下のとお
りである。
りである。
【００３９】１． 中枢神経系でのミエリン圧密化のた
めのプロテオリピド蛋白質を形成することができないト
ランスジェニック非ヒト哺乳類。
めのプロテオリピド蛋白質を形成することができないト
ランスジェニック非ヒト哺乳類。
【００４０】２． プロテオリピド蛋白質の形成がアン
チセンスＲＮＡの存在により抑制されている、項目１に
記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類。
チセンスＲＮＡの存在により抑制されている、項目１に
記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類。
【００４１】
【表１】
【００４２】
【表２】
【００４３】
【表３】
【００４４】
【表４】
【００４５】
【表５】
【００４６】
【表６】
【図１】ＣＮＳミエリン膜の脂質二分子層中でのＰＬＰ
およびＤＭ２０のトポロジーを示す図である。代用スプ
ライシングが原因で、細胞質ゾル裂片の方を向いている
アミノ酸残基１１５−１５０がＤＭ２０中で失われてい
る。２つのアシル化部位を含むこのドメインに黒色で印
をつけた。ＰＬＰドメインは７つのＰＬＰエキソンに割
り振られている。
およびＤＭ２０のトポロジーを示す図である。代用スプ
ライシングが原因で、細胞質ゾル裂片の方を向いている
アミノ酸残基１１５−１５０がＤＭ２０中で失われてい
る。２つのアシル化部位を含むこのドメインに黒色で印
をつけた。ＰＬＰドメインは７つのＰＬＰエキソンに割
り振られている。
【図２】ＰＬＰ遺伝子、標的挿入用構築物、およびＰＬ
Ｐ遺伝子の相同組換え現象を示す図である。 （Ａ）ＰＬＰ遺伝子の制限地図を示す図である。数値を
付したボックスはエキソンを示し、イントロン配列を実
線で示す。Ｅ、Ｈ、およびＢは、各々ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ、およびＢｇｌＩＩからの開裂部位を示す。 （Ｂ）ＰＬＰ標的挿入用構築物ｐＰＬＰＸ２５hａｓｎ
ｅｏｔｋのマップを示す図である。突然変異を生じてい
るエキソンンＩＩＩを実線のボックスで示し、そしてｔ
ｋおよびｎｅｏ−遺伝子を各々の向きに矢印を付して示
してある。ｎｅｏ−カセットがＰＬＰ遺伝子のイントロ
ンＩＩＩ内でアンチセンスの向きに挿入されていること
に留意せよ。 （Ｃ）予想および観察される置換現象を示す図である。
分析上の制限多型およびＰＣＲ産物を、サザンブロット
分析用の外部および内部プローブ（太線）の位置、なら
びにそれぞれの増幅産物を付記してある分析上のＰＣＲ
プライマー（矢印）の位置と共に示す。
Ｐ遺伝子の相同組換え現象を示す図である。 （Ａ）ＰＬＰ遺伝子の制限地図を示す図である。数値を
付したボックスはエキソンを示し、イントロン配列を実
線で示す。Ｅ、Ｈ、およびＢは、各々ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ、およびＢｇｌＩＩからの開裂部位を示す。 （Ｂ）ＰＬＰ標的挿入用構築物ｐＰＬＰＸ２５hａｓｎ
ｅｏｔｋのマップを示す図である。突然変異を生じてい
るエキソンンＩＩＩを実線のボックスで示し、そしてｔ
ｋおよびｎｅｏ−遺伝子を各々の向きに矢印を付して示
してある。ｎｅｏ−カセットがＰＬＰ遺伝子のイントロ
ンＩＩＩ内でアンチセンスの向きに挿入されていること
に留意せよ。 （Ｃ）予想および観察される置換現象を示す図である。
分析上の制限多型およびＰＣＲ産物を、サザンブロット
分析用の外部および内部プローブ（太線）の位置、なら
びにそれぞれの増幅産物を付記してある分析上のＰＣＲ
プライマー（矢印）の位置と共に示す。
【図３】ＥＳ細胞プールおよび個々のクローンのサザン
ブロット分析の結果を示す電気泳動図に代わる写真であ
る。個々のクローンおよびエキソンＩＩＩプローブのＢ
ｇｌＩＩ制限消化を示す図である。このプローブは、異
型クローンおよびｗｔＥＳ細胞中に存在する７００ｂｐ
のｗｔ−断片と比較した場合に６００ｂｐのＢｇｌＩＩ
断片として相同組換えの際に生じるＰＬＰ-／ＤＭ２０+
置換現象の内の１０５ｂｐの欠損部分を示す。
ブロット分析の結果を示す電気泳動図に代わる写真であ
る。個々のクローンおよびエキソンＩＩＩプローブのＢ
ｇｌＩＩ制限消化を示す図である。このプローブは、異
型クローンおよびｗｔＥＳ細胞中に存在する７００ｂｐ
のｗｔ−断片と比較した場合に６００ｂｐのＢｇｌＩＩ
断片として相同組換えの際に生じるＰＬＰ-／ＤＭ２０+
置換現象の内の１０５ｂｐの欠損部分を示す。
【図４】トランスジェニック株６１（ｐｌｐ-／ｄｍ２
０+／ｎｅｏ）のＦ２−世代の子孫の分析を示す電気泳
動図に代わる写真であり、２週令の幼仔マウスの尾先端
から取得したＨｉｎｄＩＩＩ−消化済みＤＮＡのサザン
ハイブリッド形成を示す図である。外部プローブｐｌｐ
５６およびｐｌｐ６７を、ｗｔ ＸＸとＸＹ、およびヘ
テロ接合性の＊ＸＸ雌マウス中に存在する６ｋｂのＨｉ
ｎｄＩＩＩ断片、ならびにヘテロ接合性＊ＸＸおよびホ
モ接合性の突然変異体＊ＸＹマウス中に存在する７ｋｂ
の断片（１．１ｋｂのｎｅｏ−カセットの添加）を検出
するためのプローブとして用いた。
０+／ｎｅｏ）のＦ２−世代の子孫の分析を示す電気泳
動図に代わる写真であり、２週令の幼仔マウスの尾先端
から取得したＨｉｎｄＩＩＩ−消化済みＤＮＡのサザン
ハイブリッド形成を示す図である。外部プローブｐｌｐ
５６およびｐｌｐ６７を、ｗｔ ＸＸとＸＹ、およびヘ
テロ接合性の＊ＸＸ雌マウス中に存在する６ｋｂのＨｉ
ｎｄＩＩＩ断片、ならびにヘテロ接合性＊ＸＸおよびホ
モ接合性の突然変異体＊ＸＹマウス中に存在する７ｋｂ
の断片（１．１ｋｂのｎｅｏ−カセットの添加）を検出
するためのプローブとして用いた。
【図５】トランスジェニック株６１（ｐｌｐ-／ｄｍ２
０+／ｎｅｏ）のＦ２−世代の子孫の分析を示す電気泳
動図に代わる写真であり、ＤＭ２０欠損部分のいずれか
の側に位置するプライマーＥｘＩＩＳ／ＳａｕＡを用い
るＰＣＲ分析を示す図であり、ＸＹ、ＸＸ、および＊Ｘ
Ｘマウス中に存在するｗｔ−対立遺伝子についての１．
２ｋｂのバンド、ならびにヘテロ接合性の＊ＸＸおよび
ホモ接合性の突然変異体＊ＸＹマウス中に存在する１．
１ｋｂのバンドを生じている。
０+／ｎｅｏ）のＦ２−世代の子孫の分析を示す電気泳
動図に代わる写真であり、ＤＭ２０欠損部分のいずれか
の側に位置するプライマーＥｘＩＩＳ／ＳａｕＡを用い
るＰＣＲ分析を示す図であり、ＸＹ、ＸＸ、および＊Ｘ
Ｘマウス中に存在するｗｔ−対立遺伝子についての１．
２ｋｂのバンド、ならびにヘテロ接合性の＊ＸＸおよび
ホモ接合性の突然変異体＊ＸＹマウス中に存在する１．
１ｋｂのバンドを生じている。
【図６】マウスの脳の全ＲＮＡのノザンブロット分析結
果を示す電気泳動図に代わる写真である。各々の対立遺
伝子についてヘテロ接合性およびホモ接合性であるｐｌ
ｐ+／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏマウス（＃７５．１、２、
４、７）およびｐｌｐ-／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏマウス
（＃６１．７、８、１０、１２、１３、１６）からの全
ＲＮＡを示す図であり、この場合１．５％のアガロース
−ホルムアルデヒドゲルを通してサイズ分画を行い、ニ
トロセルロース膜への毛管ブロットを行い、そして32Ｐ
−ラベル化ラットＰＬＰ ｃＤＮＡプローブ（−７４か
ら２４８ｂｐまで）にハイブリッド形成させた。フィル
ムは、増感度スクリーンを用いて７０℃下で２４時間露
出させた。これらのブロットについて、各レーン内のＲ
ＮＡ量のための対照としてα−チューブリンをプローブ
としての再探索を行った（下部）。屠殺したマウスの日
令数は生後１５日、１８日、および２０日について、Ｐ
１５、Ｐ１８、およびＰ２０として示す。
果を示す電気泳動図に代わる写真である。各々の対立遺
伝子についてヘテロ接合性およびホモ接合性であるｐｌ
ｐ+／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏマウス（＃７５．１、２、
４、７）およびｐｌｐ-／ｄｍ２０+／ａｓｎｅｏマウス
（＃６１．７、８、１０、１２、１３、１６）からの全
ＲＮＡを示す図であり、この場合１．５％のアガロース
−ホルムアルデヒドゲルを通してサイズ分画を行い、ニ
トロセルロース膜への毛管ブロットを行い、そして32Ｐ
−ラベル化ラットＰＬＰ ｃＤＮＡプローブ（−７４か
ら２４８ｂｐまで）にハイブリッド形成させた。フィル
ムは、増感度スクリーンを用いて７０℃下で２４時間露
出させた。これらのブロットについて、各レーン内のＲ
ＮＡ量のための対照としてα−チューブリンをプローブ
としての再探索を行った（下部）。屠殺したマウスの日
令数は生後１５日、１８日、および２０日について、Ｐ
１５、Ｐ１８、およびＰ２０として示す。
【図７】マウスの脳の全ＲＮＡのノザンブロット分析結
果を示す電気泳動図に代わる写真である。ＲＮＡは、ゲ
ノムイントロンＩＩ／ＩＩＩプローブ（左側）もしくは
ｎｅｏ−カセット−プローブ（右側）で探索する。オー
トラジオグラフィー露出時間を長くすると（７２時
間）、突然変異を生じているＸ−染色体（ゲノムのイン
トロン配列含む）を含むマウスに存在する＞５ｋｂのス
プライシングを受けていない追加的な転写物および転写
されたｎｅｏカセットをが出現し、このことによりこれ
らのマウスでのスプライシングの欠陥が示される。野生
型およびヘテロ接合性突然変異マウスは、普通スプライ
シングを受けた３．２、２．４、および１．６ｋｂのＰ
ＬＰ転写物を示す。これらのブロットについて、各レー
ンに適用させたＲＮＡ量の定量のために、α−チューブ
リンをプローブとしての再探索を行った。
果を示す電気泳動図に代わる写真である。ＲＮＡは、ゲ
ノムイントロンＩＩ／ＩＩＩプローブ（左側）もしくは
ｎｅｏ−カセット−プローブ（右側）で探索する。オー
トラジオグラフィー露出時間を長くすると（７２時
間）、突然変異を生じているＸ−染色体（ゲノムのイン
トロン配列含む）を含むマウスに存在する＞５ｋｂのス
プライシングを受けていない追加的な転写物および転写
されたｎｅｏカセットをが出現し、このことによりこれ
らのマウスでのスプライシングの欠陥が示される。野生
型およびヘテロ接合性突然変異マウスは、普通スプライ
シングを受けた３．２、２．４、および１．６ｋｂのＰ
ＬＰ転写物を示す。これらのブロットについて、各レー
ンに適用させたＲＮＡ量の定量のために、α−チューブ
リンをプローブとしての再探索を行った。
【図８】野生型およびトランスジェニックＰＬＰ／ＤＭ
２０欠損マウスの蛋白質分析結果を示す電気泳動図に代
わる写真である。野生型のＣ５７Ｂｌ／６およびＣＤ
１、ならびにホモ接合性突然変異体ｄｍ２０／ｎｅｏお
よびｐｌｐ／ｄｍ２０／ｎｅｏ（ｗｔ／ｎｅｏ）からの
ＣＮＳミエリン蛋白質の銀染色済みＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（１５％）分析を示す図である。単離したミエリンは、
ホモ接合性ＰＬＰ／ＤＭ２０欠損突然変異体（ｄｍ２０
／ｎｅｏおよびｐｌｐ／ｄｍ２０／ｎｅｏ（ｗｔ／ｎｅ
ｏ））においてはＰＬＰおよびＤＭ２０を完全に欠損し
ている。屠殺した動物の日令数を生後日数で示す。
２０欠損マウスの蛋白質分析結果を示す電気泳動図に代
わる写真である。野生型のＣ５７Ｂｌ／６およびＣＤ
１、ならびにホモ接合性突然変異体ｄｍ２０／ｎｅｏお
よびｐｌｐ／ｄｍ２０／ｎｅｏ（ｗｔ／ｎｅｏ）からの
ＣＮＳミエリン蛋白質の銀染色済みＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（１５％）分析を示す図である。単離したミエリンは、
ホモ接合性ＰＬＰ／ＤＭ２０欠損突然変異体（ｄｍ２０
／ｎｅｏおよびｐｌｐ／ｄｍ２０／ｎｅｏ（ｗｔ／ｎｅ
ｏ））においてはＰＬＰおよびＤＭ２０を完全に欠損し
ている。屠殺した動物の日令数を生後日数で示す。
【図９】野生型およびトランスジェニックＰＬＰ−欠損
マウスの脂質分析、結果を示すクロマトグラムに代わる
写真である。クロロホルム／メタノール／水 ６５／２
５／４で分離した、成体の野生型およびＰＬＰ−欠損マ
ウス株６１（ｐｌｐ−／ｄｍ２０＋／ａｓｎｅｏ）から
のＣＮＳミエリンのリン脂質およびグリコリピドの薄層
クロマトグラフィーを示す図である。 （Ａ）ジンザッツェ（Ｚｉｎｚａｄｚｅ）試薬でのリン
脂質染色（ＤｉｔｔｍｅｒおよびＬａｓｔｅｒ、１９６
４）を示す図である。ＸＸ野生型、＊ＸＸヘテロ接合性
および＊ＸＹホモ接合性突然変異体は、ＰＥ（ホスファ
チジルエタノールアミン）、ＰＣ（ホスファチジルコリ
ン）、ＰＩ（ホスファチジルイノシトール）、およびＳ
ＰＭ（スフィンゴミエリン）の相同パターンを示す。 （Ｂ）アントロン−Ｈ２ＳＯ４で染色したグリコスフィ
ンゴリピドのパターンを示す図である。ウシの脳からの
セレブロシドおよびスルファチドを標準として添加す
る。
マウスの脂質分析、結果を示すクロマトグラムに代わる
写真である。クロロホルム／メタノール／水 ６５／２
５／４で分離した、成体の野生型およびＰＬＰ−欠損マ
ウス株６１（ｐｌｐ−／ｄｍ２０＋／ａｓｎｅｏ）から
のＣＮＳミエリンのリン脂質およびグリコリピドの薄層
クロマトグラフィーを示す図である。 （Ａ）ジンザッツェ（Ｚｉｎｚａｄｚｅ）試薬でのリン
脂質染色（ＤｉｔｔｍｅｒおよびＬａｓｔｅｒ、１９６
４）を示す図である。ＸＸ野生型、＊ＸＸヘテロ接合性
および＊ＸＹホモ接合性突然変異体は、ＰＥ（ホスファ
チジルエタノールアミン）、ＰＣ（ホスファチジルコリ
ン）、ＰＩ（ホスファチジルイノシトール）、およびＳ
ＰＭ（スフィンゴミエリン）の相同パターンを示す。 （Ｂ）アントロン−Ｈ２ＳＯ４で染色したグリコスフィ
ンゴリピドのパターンを示す図である。ウシの脳からの
セレブロシドおよびスルファチドを標準として添加す
る。
【図１０】ｐｌｐ−／ｄｍ２０＋／ａｓｎｅｏマウス
（２９日令）の視神経切片の電子顕微鏡像を示す図に代
わる写真である。 （Ａ）野生型（ＸＹ）：この顕微鏡像ではミエリン形成
を生じている軸索のみが見えている。主要な内周期密集
線として見える規則的な圧密状態を示すミエリン鞘が総
体的に密集した様相を呈することに留意せよ（１：１６
０００）。 （Ｂ）ヘテロ接合性突然変異体（＊ＸＸ）：ランダムな
Ｘ−不活性化が原因となって普通のミエリン形成を生じ
ながらも緩く巻き込んでいるオリゴデンドロサイトのモ
ザイク性を示す図である（１：１６ ０００）。
（２９日令）の視神経切片の電子顕微鏡像を示す図に代
わる写真である。 （Ａ）野生型（ＸＹ）：この顕微鏡像ではミエリン形成
を生じている軸索のみが見えている。主要な内周期密集
線として見える規則的な圧密状態を示すミエリン鞘が総
体的に密集した様相を呈することに留意せよ（１：１６
０００）。 （Ｂ）ヘテロ接合性突然変異体（＊ＸＸ）：ランダムな
Ｘ−不活性化が原因となって普通のミエリン形成を生じ
ながらも緩く巻き込んでいるオリゴデンドロサイトのモ
ザイク性を示す図である（１：１６ ０００）。
【図１１】ｐｌｐ−／ｄｍ２０＋／ａｓｎｅｏマウス
（２９日令）の視神経切片の電子顕微鏡像を示す図に代
わる写真であり、ホモ接合性突然変異体（＊ＸＹ）：大
きな直径の軸索の周囲にある圧密化していないミエリン
鞘を示す図である。内周期密集線が存在していないこと
に留意せよ。小さな直径の軸索はミエリン形成が生じて
いないままである（１：１６ ０００）。
（２９日令）の視神経切片の電子顕微鏡像を示す図に代
わる写真であり、ホモ接合性突然変異体（＊ＸＹ）：大
きな直径の軸索の周囲にある圧密化していないミエリン
鞘を示す図である。内周期密集線が存在していないこと
に留意せよ。小さな直径の軸索はミエリン形成が生じて
いないままである（１：１６ ０００）。
Claims (1)
- 【請求項１】 中枢神経系でのミエリン圧密化のための
プロテオリピド蛋白質を形成することができないトラン
スジェニック非ヒト哺乳類。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94108193A EP0685558A1 (en) | 1994-05-27 | 1994-05-27 | Transgenic animals lacking proteolipid protein and method of making such animals |
| DE94108193.7 | 1994-05-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0851890A true JPH0851890A (ja) | 1996-02-27 |
Family
ID=8215967
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7146903A Pending JPH0851890A (ja) | 1994-05-27 | 1995-05-23 | プロテオリピド蛋白質が欠損しているトランスジエニツク動物およびそのような動物の作製方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0685558A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0851890A (ja) |
| CA (1) | CA2150092A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2745974B1 (fr) * | 1996-03-14 | 1998-04-17 | Animal modifie, utilisations et procede pour mesurer l'efficacite d'un procede therapeutique | |
| WO1999021982A1 (en) * | 1997-10-27 | 1999-05-06 | Hunan Medical University | Human m6b1 gene |
| AU2003251709A1 (en) * | 2002-08-19 | 2004-03-11 | Evotec Neurosciences Gmbh | Diagnostic and therapeutic use of proteolipid protein for alzheimer's disease |
| WO2004060910A2 (en) * | 2002-12-16 | 2004-07-22 | Wayne State University | Bioactive peptides and unique ires elements from myelin proteolipid protein plp/dm20 |
-
1994
- 1994-05-27 EP EP94108193A patent/EP0685558A1/en not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-05-16 EP EP95107423A patent/EP0684310A1/en not_active Withdrawn
- 1995-05-23 JP JP7146903A patent/JPH0851890A/ja active Pending
- 1995-05-24 CA CA 2150092 patent/CA2150092A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0684310A1 (en) | 1995-11-29 |
| CA2150092A1 (en) | 1995-11-28 |
| EP0685558A1 (en) | 1995-12-06 |
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