JP2002142610A - Ａｌｓモデルラット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ALS の病態及び／又は発症機構などの解明、
さらにはALS 予防及び／又は治療薬の開発に有用な病体
モデルラットを提供する。 【解決手段】 外来の変異Cu/Zn SOD 遺伝子を組み込ん
だDNA を導入したトランスジェニックラットは、筋萎縮
を伴う筋力低下症状などの典型的なALS 症状を発症す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、筋萎縮性側索硬化
症(amyotrophic lateral sclerosis; ALS)あるいはそれ
と実質的に同等な症状を発症することのできる、ALS モ
デルラットに関する。また、本発明は、外来の変異Cu/Z
n SOD 遺伝子を組み込んだDNA を有することを特徴とす
るラットまたは該DNA を有するその子孫に関する。特に
は、本発明は、ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子配列を有する
ことを特徴とするトランスジェニックラットまたは当該
遺伝子配列を有するその子孫に関する。さらに、本発明
は、該ALS モデルラットを使用する、ALS 予防及び／又
は治療薬の開発、ALS 病態及び／又は発症機構などの解
明に関する。

【０００２】

【従来の技術】筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic later
al sclerosis; ALS) は主として中年期以降に手または
足の脱力、あるいは球麻痺症状で発症し、数年の経過で
四肢の脱力および筋萎縮が進行し、呼吸筋の麻痺により
死に至る神経変性疾患である。ALS においては上位およ
び下位運動ニューロンが選択的に障害され、通常は感覚
障害や痴呆などは伴わない。病理学的には脊髄前角およ
び前根の萎縮、脊髄や脳幹運動核の運動ニューロンの変
性消失、および運動皮質の大型錐体細胞の脱落が認めら
れる。これまでにその運動ニューロン変性機序として
は、(1) フリーラジカルによる酸化ストレス (Beckman,
J.S., Carson, M., Smith, C.D., et al., Nature, 36
4, 584 (1993); Beckman, J.S., Chen, J., Crow,J.P.,
et al., Prog. Brain. Res., 103, 371-380 (1994); W
iedau-Pazos, M.,Goto, J.J., Rabizadeh, S., et al.,
Science, 271, 515-518 (1996))、(2) グルタミン酸神
経毒性 (Rothstein, J.D., Martin, L.J.Kuncl, R.W.,
N.Engl. J. Med., 326, 1464-1468 (1992); Lin, C.L.,
Bristol, L.A., Jin, L., et al., Neuron, 20, 589-6
02 (1998)) 、(3) 軸索輸送の障害 (Carpenter, S., Ne
urology, 18, 841-851 (1968); Toyoshima, I., Yamamo
to, A., Masamune, O., et al., J. Neurol. Sci., 89,
269-277 (1989); Williamson, T.L., Cleveland, D.
W., Nat. Neurosci., 2, 50-56(1999))などの仮説が推
定されてきたが、いずれも病態の解明には至っていな
い。また、運動ニューロンが選択的に障害される機序に
ついても不明である。

【０００３】ALS 発症者の大半は孤発性であるが 5〜10
% は家族性でその多くは常染色体優性遺伝形式をとるこ
とが知られており (Mulder, D.W., Kurland, L.T., Off
ord,K.P., et al., Neurology, 36, 511-517 (1986))
、家族性ALS (familial ALS;FALS)と呼ばれている。19
91年に一部のFALS家系が第21染色体長腕上に連鎖するこ
とが明らかとなり (Siddique, T., Figlewicz, D.A., P
ericak-Vance, M.A.,et al., N. Engl. J. Med., 324,
1381-1384 (1991))、さらに1993年に銅・亜鉛スーパー
オキシドジスムターゼ(copper/zinc superoxide dismut
ase; Cu/Zn SOD）遺伝子がその原因遺伝子として同定さ
れた (Rosen, D.R., Siddique, T., Patterson, D., et
al., Nature, 362, 59-62 (1993))。Cu/Zn SOD 遺伝子
は全長11.5 kb で5 つのエクソンから成る (Levanon,
D., Lieman-Hurwitz, J., Dafni, N., et al., Embo
J., 4, 77-84 (1985)) 。Cu/ZnSOD 蛋白は 153アミノ酸
で約16 kDaの構成蛋白の２つから成る約32 kDaのダイマ
ーである。各構成ユニットにはそれぞれ一つずつの銅イ
オンと亜鉛イオンを含んでおり (Briggs, R.G., Fee,
J.A., Biochim. Biophys. Acta., 537, 86-99 (197
8))、フリーラジカルの一つであるスーパーオキシドを
不均化し、過酸化水素とする反応を媒介する酵素である
(Fridovich, I., Adv. Enzymol. Relat. AreasMol. Bi
ol., 58, 61-97 (1986)) 。

【０００４】Cu/Zn SOD の遺伝子異常はFALS患者の約20
% で認められ、現在まで約60種の遺伝子変異が報告され
ているが (Orrell, R.W., Neuromuscul. Disord., 10,
63-68 (2000)) 、その大半は点突然変異である。変異の
種類によって発症年齢、罹病期間が異なることがこれま
での報告より分かってきており (Cudkowicz, M.E., McK
enna-Yasek, D., Sapp, P.E., et al., Ann. Neurol.,
41, 210-221 (1997))、例えば日本人家系で報告されたC
u/Zn SOD の46番目のアミノ酸がヒスチジンからアルギ
ニンへの変異 (H46R変異) を持つFALSの罹病者は、罹病
期間が平均16.8年と非常に長いことが特徴である (Aok
i, M., Ogasawara, M., Matsubara, Y.,et al., Nat. G
enet., 5, 323-324 (1993)) 。当初はCu/Zn SOD のフリ
ーラジカルスカベンジャーとしての性質から、遺伝子変
異により酵素活性が低下したことで細胞内のフリーラジ
カルが増加し、神経細胞を変性させることが病態と考え
られた (loss of function)(Deng, H.X., Hentati, A.,
Tainer, J.A., et al., Science, 261, 1047-1051 (19
93))。しかし、発症年齢や症状の進行の程度が発症者の
Cu/Zn SOD 酵素活性と相関しないこと (Radunovic, A.L
eigh, P.N., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 61,
565-572(1996)) 、ヒト正常Cu/Zn SOD 遺伝子を導入し
たTgマウス (Epstein, C.J., Avraham, K.B., Lovett,
M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 804
4-8048 (1987))は臨床症状の変化がないが変異Cu/Zn SO
D を導入したトランスジェニックマウス(Tg マウス) が
四肢の筋萎縮と筋脱力というALS 様の症状を発症するこ
と (Gurney, M.E., Pu, H., Chiu, A.Y., et al., Scie
nce, 264, 1772-1775 (1994)) 、逆にCu/Zn SOD ノック
アウトマウスがALS 様の症状を示さないことから (Reau
me, A.G., Elliott, J.L., Hoffman, E.K., et al., Na
t. Genet., 13, 43-47 (1996))、現在では変異したCu/Z
n SOD 蛋白が新たに獲得した神経毒性が病態と考えられ
ている (gain of function) 。

【０００５】変異したCu/Zn SOD 蛋白が神経を変性させ
る機序として現在想定されているものは、(1) 変異Cu/Z
n SOD が、構造的に変化するか、あるいは銅を放出する
ため、ヒドロキシラジカルの産生を触媒する酵素活性が
高くなることにより、細胞傷害を引き起こす (Wiedau-P
azos, M., Goto, J.J., Rabizadeh, S., et al., Scien
ce, 271, 515-518 (1996); Yim, M.B., Kang, J.H., Yi
m, H.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 9
3, 5709-5714 (1996); Lyons, T.J., Gralla, E.B.Vale
ntine, J.S., Met. Ions. Biol. Syst., 36, 125-177
(1999)) 、(2) 変異Cu/Zn SOD がラジカルであるペルオ
キシナイトライトの生成を促進し、細胞を傷害する (Be
ckman, J.S., Carson, M., Smith, C.D., et al., Natu
re, 364, 584 (1993); Beckman, J.S., Chen, J., Cro
w, J.P., et al., Prog. Brain. Res., 103, 371-380
(1994); Estevez, A.G., Crow, J.P., Sampson, J.B.,
et al., Science, 286, 2498-2500 (1999); Crow, J.
P., Ye, Y.Z., Strong,M., et al., J. Neurochem., 6
9, 1945-1953 (1997))、(3) 変異Cu/Zn SOD が凝集し、
これが細胞を傷害する (Durham, H.D., Roy, J., Dong,
L., et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 56, 523
-530 (1997); Stieber, A., Gonatas, J.O.Gonatas, N.
K., J. Neurol. Sci., 173, 53-62 (2000); Bruijn, L.
I., Houseweart, M.K., Kato, S., et al., Science, 2
81, 1851-1854 (1998)) 、等である。これまでヒト変異
Cu/Zn SOD 遺伝子を導入したTg マウスは3 系統作製さ
れており、これらのマウスは症状の変化、病理などが異
なるものの、ALS 様の症状を発症することが分かってい
る (Gurney, M.E., Pu, H., Chiu, A.Y., etal., Scien
ce, 264, 1772-1775 (1994); Bruijn, L.I., Becher,
M.W., Lee, M.K., et al., Neuron, 18, 327-338 (199
7); Wong, P.C., Pardo, C.A., Borchelt, D.R., et a
l., Neuron, 14, 1105-1116 (1995); Dal Canto, M.C.G
urney, M.E., Brain Res., 676, 25-40 (1995)) 。ALS
の病因については上記の様にいろいろな仮説があるが、
一次的な病因として確立されているものはCu/Zn SOD 遺
伝子の変異のみである。

【０００６】東北大学神経内科ではFALS患者のCu/Zn SO
D 遺伝子を検索し、新しい変異を報告してきた (Aoki,
M., Ogasawara, M., Matsubara, Y., et al., Nat. Gen
et.,5, 323-324 (1993); Ikeda, M., Abe, K., Aoki,
M., et al., Neurology, 45,2038-2042 (1995); Ikeda,
M., Abe, K., Aoki, M., et al., Hum. Mol. Genet.,
4, 491-492 (1995); Aoki, M., Abe, K., Houi, K., et
al., Ann. Neurol.,37, 676-679 (1995); Morita, M.,
Aoki, M., Abe, K., et al., Neurosci. Lett., 205,
79-82 (1996)) が、この中でも、46番目のヒスチジンは
Cu/Zn SOD の銅イオンが結合する活性中心にあり、この
場所に遺伝子変異があるとCu/Zn SOD酵素活性がほとん
ど認められない (Carri, M.T., Battistoni, A., Poliz
io, F., et al., FEBS Lett., 356, 314-316 (1994); R
atovitski, T., Corson, L.B.,Strain, J., et al., Hu
m. Mol. Genet., 8, 1451-1460 (1999)) 。また正常のC
u/Zn SOD と比較して、H46R変異は、銅イオンの分画が
異なっており (Ogawa, Y., Kosaka, H., Nakanishi,
T., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 241, 2
51-257 (1997))、神経変性に関与する銅イオンの役割を
考える上で良いモデルとなる。さらには臨床的にはH46R
変異を持つ家系の発症者は、症状にばらつきなく罹病期
間が非常に長いという特徴を持つため (Aoki, M., Ogas
awara, M., Matsubara, Y., et al., Nat. Genet., 5,
323-324 (1993)) 、すでにこの変異を導入した、新たな
Tg マウスを作製してきた。これまでにプロモーターの
異なる2 種の Tg マウスを作製しているが、一つは、全
身にCu/Zn SOD を強く発現させるという目的で、chicke
nb-actinプロモーターを使用した発現ベクターpCXN (Ni
wa, H., Yamamura, K.Miyazaki, J., Gene, 108, 193-1
99 (1991))を使い、もう一つは既存の Tg マウスと比較
する目的で、既存のTgマウスと同じくヒトCu/ZnSOD の
プロモーターを使用した。これまでの検討で、新しく作
製したヒトH46R変異導入Tgマウスは、Cu/Zn SOD の脊髄
での発現が多く認められた系統では運動ニューロン障害
を引き起こすことが分かってきている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】Tg マウスの作製によ
って、変異Cu/Zn SOD が獲得した性質により運動ニュー
ロンが変性することが推測されたが、そのメカニズムは
未だ不明である。 Tg マウスによる運動ニューロン変性
機序の解明を妨げる要因の一つに、マウスの大きさが小
さいため病態の主座である脊髄から蛋白質やmRNAなどを
充分量抽出することが難しいことが挙げられる。また、
ALS の病因の一つにグルタミン酸毒性が提唱されてお
り、ALS 患者髄液中のグルタミン酸濃度については議論
のあるところである (Rothstein, J.D., Tsai, G., Kun
cl, R.W., et al., Ann. Neurol., 28, 18-25 (1990);
Perry, T.L., Krieger, C., Hansen, S., et al., Ann.
Neurol., 28, 12-17 (1990)) 。ところが、Tgマウスで
は髄液の採取が困難で、グルタミン酸濃度などの生化学
的解析を行うことができない。こうした問題点を解決す
るには、ALS モデル動物として Tg ラットなどのALSモ
デルラットを開発することが求められている。例えば、
Tg ラットであればマウスの10〜20倍の大きさであるた
め、病態の主座である脊髄から蛋白質やmRNAなどを充分
量抽出することが難しいなどという欠点は解消され、フ
リーラジカルや銅の測定など生化学的分析が十分可能な
蛋白量を得ることができる。また、Tgラットを利用する
ことにより髄液の採取が可能であるため、髄液中のグル
タミン酸濃度などの生化学的解析が可能で、しかも発症
前からのデータを経時的に解析することが出来る。さら
に、ラットは、髄腔がマウスと比較して広いためチュー
ブの挿入が比較的容易で、治療実験において髄注が可能
になるなど、Tgラットとしての利点は多い。このように
ALS モデルラットの開発は、ALS の研究に不可欠であ
り、当該分野の最重要課題である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、抗ALS
薬の探索または評価のためのモデル動物として有用な、
新規トランスジェニックラットおよびその使用方法を提
供することにある。本発明者らは、上記のような問題点
を克服し、外来の変異Cu/Zn SOD 遺伝子をコードするDN
A を使用して、該変異Cu/Zn SOD を発現するような遺伝
子操作をラットに施すことにより、ALS に典型的な症状
を呈することを特徴とする、新規トランスジェニックラ
ットの作出に成功し、本発明を完成させた。すなわち、
本発明は、 〔１〕 筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral scle
rosis; ALS)あるいはそれと実質的に同等な症状を発症
することのできることを特徴とするトランスジェニック
ラットまたはその子孫； 〔２〕 運動ニューロン病を示していることを特徴とす
る、上記〔１〕記載のトランスジェニックラットまたは
その子孫； 〔３〕 四肢のいずれかに筋萎縮を伴う筋力低下症状を
発症することを特徴とする、上記〔１〕又は〔２〕記載
のトランスジェニックラットまたはその子孫； 〔４〕 病理所見が、次のいずれかの少なくとも一を有
することを特徴とする、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか
一記載のトランスジェニックラットまたはその子孫： (1) 病態の主座が脊髄前角にあり、大型の運動ニューロ
ンの変性がみられること、(2) 残存する前角運動ニュー
ロンに細胞内封入体が認められ、抗ユビキチン抗体に陽
性であること、(3) 腫大した軸索がみられ、抗リン酸化
ニューロフィラメント抗体及び／又は抗ユビキチン抗体
に陽性であること； 〔５〕 ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子配列を有することを
特徴とするトランスジェニックラットまたは当該遺伝子
配列を有するその子孫； 〔６〕 胚形成初期において導入されたヒト変異Cu/Zn
SOD 遺伝子配列を、生殖細胞または体細胞に有する上記
〔１〕〜〔５〕のいずれか一記載のラットまたはその子
孫；

【０００９】〔７〕 外来の変異Cu/Zn SOD 遺伝子を組
み込んだDNA を有することを特徴とするラットまたは該
DNA を有するその子孫； 〔８〕 ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子を含むトランスジェ
ニック動物作製用組換え遺伝子を全能性細胞に導入し、
当該全能性細胞を仮親動物に移植し、前記仮親動物を飼
育出産させて所望の形質が発現された仔動物である始祖
動物を得る工程を含むことを特徴とする上記〔１〕〜
〔７〕のいずれか一記載のトランスジェニックラットの
作製方法。

〔９〕 ラットで発現するタンパク質遺伝子由来のプロ
モーター領域と、ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子とを含むト
ランスジェニック動物作製用組換え遺伝子を全能性細胞
に導入することを特徴とする上記〔８〕記載の方法。 〔10〕 ラットで発現するタンパク質遺伝子由来のプロ
モーター領域と、ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子とを含むト
ランスジェニックラット作製用組換え遺伝子； 〔11〕 上記〔１〕〜〔７〕のいずれか一記載のラット
またはその子孫を用いることを特徴とするALS の予防及
び／又は治療薬のスクリーニング方法； 〔12〕 上記〔11〕記載のスクリーニング方法を用いて
得られるALS の予防及び／又は治療活性を有する化合物
またはその塩； 〔13〕 ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子配列を有することを
特徴とするラット胚幹細胞；及び 〔14〕 上記〔１〕〜〔７〕のいずれか一記載のラット
またはその子孫に由来することを特徴とするラット胚幹
細胞を提供する。

【００１０】別の態様では、本発明は、 〔15〕 H46R変異を持つヒトCu/Zn SOD 遺伝子配列を有
することを特徴とするトランスジェニックラットまたは
当該遺伝子配列を有するその子孫； 〔16〕 胚形成初期において導入されたH46R変異を持つ
ヒトCu/Zn SOD 遺伝子配列を、生殖細胞または体細胞に
有する上記〔１〕〜〔５〕及び〔15〕のいずれか一記載
のラットまたはその子孫； 〔17〕 外来のH46R変異Cu/Zn SOD 遺伝子を組み込んだ
DNA を有することを特徴とするラットまたは該DNA を有
するその子孫； 〔18〕 ラットで発現するタンパク質遺伝子由来のプロ
モーター領域と、H46R変異を持つヒトCu/Zn SOD 遺伝子
とを含むトランスジェニック動物作製用組換え遺伝子を
全能性細胞に挿入し、当該全能性細胞を仮親動物に移植
し、前記仮親動物を飼育出産させて所望の形質が発現さ
れた仔動物である始祖動物を得る工程を含む上記〔１〕
〜〔７〕及び〔15〕〜〔17〕のいずれか一記載のトラン
スジェニックラットの作製方法；

【００１１】〔19〕 ラットで発現するタンパク質遺伝
子由来のプロモーター領域と、H46R変異を持つヒトCu/Z
n SOD 遺伝子とを含むトランスジェニックラット作製用
組換え遺伝子； 〔20〕 上記〔15〕〜〔17〕のいずれか一記載のラット
またはその子孫を用いることを特徴とするALS の予防及
び／又は治療薬のスクリーニング方法； 〔21〕 ALS の予防及び／又は治療薬の候補化合物を上
記〔１〕〜〔７〕及び〔15〕〜〔17〕のいずれか一記載
のラットまたはその子孫に投与し、該ラットまたはその
子孫に現れる変化を検出、測定及び／又は評価すること
を特徴とする上記〔11〕又は〔20〕記載のスクリーニン
グ方法； 〔22〕 上記〔20〕又は〔21〕記載のスクリーニング方
法を用いて得られるALS の予防及び／又は治療活性を有
する化合物またはその塩； 〔23〕 H46R変異のヒトCu/Zn SOD 遺伝子配列を有する
ことを特徴とするラット胚幹細胞；及び 〔24〕 上記〔15〕〜〔17〕のいずれか一記載のラット
またはその子孫に由来することを特徴とするラット胚幹
細胞を提供する。 本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観
点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。
しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載
を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示
すものであり、説明のためにのみ示されているものであ
ることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意
図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは
修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他
の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであ
ろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参
考文献は、説明の目的で引用されているもので、それら
は本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈さ
れるべきものである。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明は、ALS あるいはそれと実
質的に同等な症状を発症することのできるALS モデルラ
ットを提供する。また、本発明は、外来の変異Cu/Zn SO
D 遺伝子を組み込んだDNA を有するラットまたは該DNA
を有するその子孫を提供する。特には、本発明は、ヒト
変異Cu/Zn SOD 遺伝子配列を有するトランスジェニック
ラットまたは当該遺伝子配列を有するその子孫を提供す
る。さらに、本発明は、該ALSモデルラットを使用す
る、ALS 予防及び／又は治療薬の開発、ALS 病態及び／
又は発症機構などの解明などに関する。本明細書中、
「遺伝子」、「DNA 配列」または「遺伝子配列」との用
語は、同義であり、天然の状態で該DNA に付随するイン
トロンまたはエクソンを全て含むようなDNA をもそこに
包含する意味で使用されている。本明細書中、遺伝子の
一つの例としては、ヒト変異Cu/Zn SOD DNA 配列及び該
DNA 配列に付随する非翻訳介在配列をコードするDNA が
挙げられる。また、遺伝子配列が「発現」される又は
「形質発現」されるとは、遺伝子がRNA に転写され、RN
A が蛋白質に翻訳される場合のことを意味する。

【００１３】本明細書中、用語「cDNA」は、mRNAの逆転
写によって実際に調製されたDNA 分子のみならず、コー
ド領域が中断されずにタンパク質をコードする任意のDN
A 分子、すなわち、タンパク質をコードする連続したオ
ープンリーディングフレーム(ORF) を有するDNA 分子を
も包含する。従って、本明細書のcDNAは、タンパク質を
コードしている領域がイントロン配列（またはタンパク
質をコードしない任意の他の配列）によっては中断され
ていないDNA 分子であって、タンパク質をコードするDN
A 分子を指す意味でも使用されている。本明細書中、
「発現ベクター(expression vector) 」は、DNA （通常
は二本鎖である）の断片(piece) をいい、該 DNAは、そ
の中に外来のDNA の断片を挿入せしめることができる。
外来のDNA は、異種DNA (heterologous DNA)として定義
され、このものは、対象宿主細胞においては天然では見
出されないDNA である。ベクターは、外来のDNA または
異種DNA を適切な宿主細胞に運ぶために使用される。一
旦、宿主細胞中に入ると、ベクターは、宿主染色体DNA
とは独立に複製することが可能であり、そしてベクター
およびその挿入された（外来の）DNA のいくつかのコピ
ーが生成され得るものであってよい。さらに、ベクター
は外来のDNAのポリペプチドへの翻訳を可能にするのに
不可欠なエレメントを含む。従って、外来のDNA によっ
てコードされるポリペプチドの多くの分子が迅速に合成
されることができる。

【００１４】用語「ベクター（vector）」は、適切な宿
主中で DNA配列を発現するように、適切な制御配列(con
trol sequence)とそれが機能するように(operably)連結
せしめられた DNA配列を含有する DNAコンストラクト(D
NA construct) を意味している。そうした制御配列とし
ては、転写(transcription) させるためのプロモータ
ー、そうした転写を制御するための任意のオペレーター
配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードしている
配列、そして転写や翻訳(translation) の終了を制御す
る配列が挙げられる。該ベクターは、プラスミド、ファ
ージ粒子、あるいは単純にゲノムの挿入体(genomic ins
ert)であってよい。一旦、適切な宿主の中に形質転換で
導入せしめられると、該ベクターは宿主のゲノムとは独
立して複製されたり、それが機能するものであってよ
い。また該ベクターは、ゲノムの中に組み込まれるもの
であってよい。

【００１５】本明細書中、「プラスミド(plasmid) 」及
び「ベクター(vector)」という語は、互いに交換可能な
意味の語として使用されている。プラスミドは、ベクタ
ーのうち最も一般的に使用される形態のものであるが、
本発明においてはそれと同等な機能を示すものであれ
ば、その他の形態のベクターも包含され、公知のものあ
るいは当該分野で知られるようになったものも包含せし
められる。「発現制御配列(expression control sequen
ce) 」とは、ある特定の宿主生物体においてそれが機能
可能に結合されているコード配列を発現するのに必要と
される DNA配列を指すものである。原核細胞に適した制
御配列としては、プロモーター、場合によりオペレータ
ー配列、そしてリボソーム結合部位が挙げられる。ま
た、真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナ
ル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸が別の核酸配列と機能的な関係を有しながら配置さ
れている場合、その核酸は「機能可能に結合されている
(operably linked) 」と言われる。これは、適当な分子
（例えば、転写活性化タンパク(translational activat
or protein) など）を調節配列(regulatory sequence)
に結合せしめた場合に、遺伝子の発現を可能ならしめる
ような形態で遺伝子と調節配列とが結合していることを
指している。例えば、あるポリペプチドを前駆タンパク
質として分泌せしめられるように発現する場合、プロペ
プチド配列あるいは分泌用リーダー配列などのDNA は、
そのポリペプチド用DNA に機能可能に結合せしめられ
る。DNA 配列の転写をなすためには、コード配列にプロ
モーターやエンハンサーが機能可能に結合せしめられ、
さらにDNA 配列の転写あるいはアミノ酸への翻訳をなす
ためには、コード配列にリボソーム結合部位が機能可能
に結合せしめられる。

【００１６】一般的にいって、「機能可能に結合」とは
その結合しているDNA 配列が、隣接して配置されている
こと（特に分泌用リーダー配列の場合では、隣接し、リ
ーディングフレームに配置されている）を意味するが、
エンハンサーの場合は、隣接して配置されてはいない。
結合は、慣用の制限酵素部位のところで連結(ligation)
して行われる。もしそのような制限酵素部位がない時
は、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカ
ーを当該分野で知られた方法で使用して行われる。本明
細書中、「タンパク質」あるいは「ポリペプチド」は、
互いに交換可能な意味をもつ語として使用している。こ
こにおいて使用されるように、「ポリペプチド」は、２
個以上、一般的には約10個以上のアミノ酸を有するペプ
チド及びタンパク質を指す。

【００１７】本明細書中、ラットとしてはいかなるもの
でもよいが、なかでも、病体動物モデル系の作成の面か
ら個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁
殖が容易なもの及び/ 又は維持が容易なものが挙げら
れ、そして、純系あるいは交雑系のものが挙げられ、例
えば、Wistar, SDなどが特に好ましい。本明細書中、Cu
/Zn SOD 遺伝子としては、動物から単離、抽出されたゲ
ノム由来のCu/Zn SOD 遺伝子であってもよく、あるい
は、遺伝子工学的手法を用いてクローニングされたCu/Z
n SOD cDNAであってもよい。また、ヒト変異Cu/Zn SOD
遺伝子は、該単離、抽出されたゲノム由来の遺伝子であ
ってもよく、あるいは、遺伝子工学的手法を用いてクロ
ーニングされたcDNAであってもよいし、人為的に変異を
加えることにより得られたものであってよい。該遺伝子
に人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子
工学的手法により該遺伝子配列の一部の削除（欠失）、
他の核酸塩基又は塩基配列による置換、他の遺伝子、核
酸塩基又は塩基配列の挿入、あるいはそれらの組み合わ
せが挙げられる。例えば、オリジナルの核酸に存在して
おり且つ対象のアミノ酸残基をコードする少なくとも一
つのコドンに関連して、挿入、欠失または置換がなさ
れ、それにより変異が生成する。通常は、オリジナルの
アミノ酸残基をコードするコドンを、導入されるべきア
ミノ酸残基をコードするコドンに置き換えることにより
なされる。具体的な変異Cu/Zn SOD 遺伝子としては、Or
rell, R.W., Neuromuscul. Disord., 10, 63-68 (200
0); Andersen PM, Morita M and Brown RH Jr., "Genet
icsof amyotrophic lateral sclerosis: an overview,
Amyotrophic lateral sclerosis" (Ed by Brown RH Jr,
Meininger V and Swash M), pp 223-250, Martin Duni
tz Ltd, UK, 2000 などに記載された変異遺伝子が挙げ
られるが、本発明でより好適に使用されるものとして
は、例えば46番目のアミノ酸がヒスチジンからアルギニ
ンへ変異 (HIS46ARG (H46R) 変異) しているヒト変異Cu
/Zn SOD 遺伝子が挙げられる。なお、Cu/Zn SOD につい
ては、インターネットホームページアドレスhttp://ww
w.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/dispomim.cgi?id=14745
0 を参照することができ、そこに記載された内容及びそ
こで引用された文献のうちの記載あるいはそれらと実質
的に同様な記載はそれをすべて参照され、またそれらの
中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開
示に含められる。代表的なCu/Zn SOD バリアントとして
は、例えば、GLY37ARG, LEU38VAL, GLY41SER, GLY41AS
P, HIS43ARG, GLY85ARG, GLY93CYS, GLY93ALA, GLU100G
LY, LEU106VAL, ILE113THR, ALA4VAL, HIS46ARG, ALA4T
HR, ASP90ALA, ILE104THE, LEU144SER, ALA145THR, CYS
6PHE, THR151ILE, GLU21LYS, SER134ASN, LEU84VAL, GL
Y16SER, LEU126TER, GLY72SERなどの他、[IVS4AS, T-G,
-10, 9-BP INS], [IVS4AS, A-G, -11]などが挙げられ
る。

【００１８】この様な様式で、DNA を遺伝子的に修飾す
る技術は、M. J. Mcpherson (Ed.),Mutagenesis: a Pra
ctical Approach, IRL Press, Oxford, UK (1991)にお
ける総説において示されており、例えば、位置指定変異
導入法（部位特異的変異導入法）、カセット変異誘発法
及びポリメラーゼチェインリアクション(PCR) 変異生成
法を含む。オリゴヌクレオチド−仲介変異誘発法は、ポ
リペプチドをコードするDNA の置換変異体調製のために
好ましい方法である。この技術は、Adelman etal., DN
A, 2: 183 (1983)により記述されているようにこの分野
で周知である。該方法では、普通、ヒトSOD の所定の部
分の未改変または天然のDNA 配列を含むプラスミドまた
はバクテリオファージの単鎖形態のDNA テンプレート
に、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイ
ブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションの後に、DNA
ポリメラーゼを使用して、ヒトSOD DNA において該オリ
ゴヌクレオチドプライマーを取り込んでおり且つ選択さ
れた改変をコードするであろうテンプレートの相補鎖全
体を合成することにより、該ポリペプチドは改変され
る。カセット変異誘発法は、Well et al., Gene 34: 31
5 (1985)などに記載されている。PCR 変異生成法も、ポ
リペプチドDNA の変異体を作成するために好適である。

【００１９】本明細書中、Cu/Zn SOD 遺伝子の変異遺伝
子（変異Cu/Zn SOD 遺伝子）としては、元のCu/Zn SOD
遺伝子の塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生
じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基へ
の置換などが生じたものなどが挙げられる。該変異Cu/Z
n SOD 遺伝子としては、変異したCu/Zn SOD を発現させ
る遺伝子を意味し、例えば、正常なCu/Zn SOD の機能に
影響を及ぼす（例えば、正常なCu/Zn SOD の機能を抑制
するなど）ようなものを発現せしめる遺伝子などが挙げ
られる。本発明において所望の変異Cu/Zn SOD をコード
するDNA は、慣用の方法を使用して容易に単離すること
ができるし、さらにその配列決定をすることができる。
cDNAライブラリーから、文献記載の配列に基づいてハイ
ブリダイゼーションにより、あるいはポリメラーゼチェ
インリアクション(PCR) 技術（逆転写酵素ポリメラーゼ
チェインリアクション（RT-PCR) 技術を含む) により単
離されうる。

【００２０】PCR (RT-PCR を含む) は、当該分野で公知
の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法によ
り行うことができるが、例えば R. Saiki, et al., Sci
ence, 230: 1350, 1985; R. Saiki, et al., Science,
239: 487, 1988 ; H. A. Erlich ed., PCR Technology,
Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed.,"D
NA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Appro
ach Series), IRL Press, Oxford University Press (1
995) ; M. J. McPherson, P. Quirke and G.R. Taylor
(Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxfor
d (1991); M.A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky
and T. J. White (Ed.), "PCR Protocols: a guide to
methods and applications", Academic Press, New Yo
rk (1990)); M. A. Innis, D. H. Gelfand and J. J. S
ninsky (Ed.), "PCR Strategies", Academic Press, Ne
w York (1995)); M. A. Innis, D. H. Gelfand and J.
J. Sninsky (Ed.), "PCR Applications: Protocols for
Functional Genomics", Academic Press, New York (1
999)); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 85, 8998-9002 (1988)などに記載された方法あ
るいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うこ
とができる。また、該PCR 法は、それに適した市販のキ
ットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいは
キット販売業者により明らかにされているプロトコルに
従って実施することもできる。

【００２１】ハイブリダイゼーションについてはL. Gro
ssman et al. (ed.), "Methods inEnzymology", Vol. 2
9 (Nucleic Acids and Protein Synthesis, Part E), A
cademic Press, New York (1974) などを参考にするこ
とができる。DNA など核酸の配列決定は、例えばSanger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467
(1977)などを参考にすることができる。また一般的な組
換えDNA 技術は、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Ma
niatis (ed.), "Molecular Cloning: A Laboratory Man
ual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)及び D.
M. Glover et al. (ed.), "DNA Cloning", 2nd ed., Vo
l. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Pr
ess, Oxford University Press (1995) などを参考にで
きる。「オリゴヌクレオチド」は、短い長さの、一本鎖
または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドであり、これ
は、公知の方法（例えば、EP 266,032に記載されるよう
な固相技術を使用する、ホスホトリエステル法、ホスフ
ァイト法、またはホスホルアミダイト法、またはFroehl
er et al., Nucl. Acids Res. 14, 5399 (1986）によっ
て記載されるような方法など）によって化学的に合成さ
れる。次いでこれらは、ポリアクリルアミドゲル上で精
製される。

【００２２】ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子を組み込んだDN
A としては、ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子を含有するDNA
であれば如何なるものであってもよく、cDNAまたは cDN
A/ゲノムDNA ハイブリッドであってもよい。ヒト変異Cu
/Zn SOD 遺伝子を対象動物に導入させるにあたっては、
該変異Cu/Zn SOD 遺伝子を動物細胞で発現させうるプロ
モーターの下流に結合したDNA コンストラクトとして用
いるのが一般に有利である。例えば、ヒト変異Cu/Zn SO
D 遺伝子を導入させる場合、これと相同性が高く、ラッ
ト由来のCu/Zn SOD 遺伝子を発現させうる各種プロモー
ターの下流に、該ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子を結合した
DNA コンストラクト（例、ベクターなど）を対象動物の
受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクシ
ョンすることによって該遺伝子を高発現する遺伝子導入
動物を作出することができる。また、普通、該ポリペプ
チドをコードする核酸（例えば、cDNAまたはゲノムDNA)
は、更なるクローニング（DNA の増幅）または発現の為
に複製可能なベクターに挿入される。多くのベクターが
利用可能である。ベクターの成分は、限定されるもので
はないが、普通、次の１種以上のエレメントを含んでい
てよい：シグナル配列、複製のオリジン、１種以上のマ
ーカー遺伝子、エンハンサー、プロモーター、及びmRNA
の転写を終結する配列（ターミネーター）。

【００２３】上記ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子発現に用い
られるプロモーターとしては、例えば、ウィルスに由来
するプロモーター、各種動物（例えば、ヒト、ラット、
モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ハムスター、マウス
など）および鳥類（例えば、ニワトリ、ウズラなど）由
来のものが挙げられる。該ウィルス由来のプロモーター
としては、例えばシミアンウィルス（例えば、Southern
& Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1: 327-341 (1982)な
ど) 、サイトメガロウィルス、モロニー白血病ウィル
ス、ラウス肉腫ウィルス、JCウィルス、乳癌ウィルス、
ポリオウィルスなどから誘導されたものが挙げられる。
また、該動物および鳥類由来のプロモーターとしては、
例えば、ヒトCu/Zn SOD (Ceballos-Picot et al., Brai
n Res., 552: 198-214 (1991) など) 、アルブミン、イ
ンシュリンII、ウロプラキンII、エラスターゼ、筋クレ
アチンキナーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、
酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、RNA ポリメラ
ーゼ (例えば、Palmer et al., Nucleic Acid Res., 2
1, 3451-3457 (1993); Ahearn et al., J. Biol. Che
m., 262, 10695-10705 (1987)など) 、内皮レセプター
チロシンキナーゼ(Tie2)、ナトリウムカリウムアデノシ
ン3-リン酸化酵素(Na, K-ATPase)、ドーパミンβ−水酸
化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ(TPO) 、サイクリック
AMP 依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、血小板
由来成長因子β (例えば、Sasahara et al.,Cell, 64:
217-227 (1991) など) 、ケラチンK1, K10 及びK14 、
コラーゲンＩ型およびII型、ジストロフィン、心房ナト
リウム利尿性因子、ニューロフィラメント軽鎖、メタロ
チオネイン（例えば、メタロチオネインＩ、メタロチオ
ネインIII など: 例えば、Brinster et al., Nature, 2
96: 39-42 (1982)など) 、メタロプロティナーゼ１組織
インヒビター、 MHCクラスＩ抗原(H-2L)、H-ras 、ポリ
ペプチド鎖延長因子 1α (EF-1α)(例えば、Mizushima
and Nagata, Nucleic Acids Res., 18, 5322 (1990) な
ど) 、グリア線維性酸性タンパク質 (glial fibrillary
acidic protein; GFAP)、βアクチン（例えば、Niwa e
t al., Gene, 108, 193-200 (1991)など) 、平滑筋αア
クチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１およ
び２、チログロブリン、Thy-1 、免疫グロブリン、Ｈ鎖
可変部(VNP) 、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオ
グロビン、トロポニンＣ、レニン、エリスロポエチン、
エンドセリン、オステオカルシン、プレプロエンケファ
リンＡ、バソプレシンなどの遺伝子のプロモーターなど
が挙げられる。

【００２４】該ヒト変異Cu/Zn SOD 発現用ベクターとし
ては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミ
ド、酵母由来のプラスミド、ウイルス由来のベクター、
またはその誘導体などが用いられる。該発現用ベクター
としては、例えば、pBR322,pBR325, pBR329, pUC 系ベ
クター（例えば、 pUC12, pUC13 など), pUB110, pTB5,
pC194, pSH19, pSH15, λファージなどのバクテリオフ
ァージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイル
ス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、バキュロウ
イルス、ウシ乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス群から
のウイルス、エプスタイン・バー・ウイルスなどの動物
ウイルスなどに由来するもの、あるいはそれらの誘導体
などである。また、該ベクターとしては、例えば、pMNT
1 （特開平7-67500 号公報）、pA1-11、pXT1、pRc/CMV
、pRc/RSV 、pcDNAI/Neoなども挙げられる。

【００２５】上記ベクターは、ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝
子導入動物において目的mRNAの転写を終結する配列（タ
ーミネーター）を有していることが好ましい。該ターミ
ネーターとしては、例えば、ウィルス由来、各種哺乳動
物および鳥類由来のものが挙げられ、当該分野で様々な
ものが知られており、該公知のものから選択して使用す
ることができ、好ましくは、シミアンウィルス由来のも
の、例えばSV40ターミネーターなどが用いられる。その
他、目的ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子をさらに高発現させ
る目的で遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサ
ー領域、真核細胞の遺伝子のイントロンの一部などを、
プロモーター領域の5'上流、プロモーター領域と翻訳領
域間あるいは翻訳領域の3'下流に連結することも目的に
より可能である。

【００２６】該ベクターは、選別するためには、選択可
能マーカーとも称される選択遺伝子を含んでいることが
必要とされることは、理解されよう。選択遺伝子として
は、当該分野で様々なものが知られており、該公知のも
のから選択して使用することができる。典型的な選択遺
伝子は、(a) 例えばアンピシリン、ネオマイシン、メト
トレキセートまたはテトラサイクリン等の抗生物質また
はその他のトキシンに対する耐性を付与するタンパク質
をコードするもの、(b) 栄養要求性欠損を補うタンパク
質をコードするもの、または(c) 例えば、バチルスのD-
アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のように、複合
培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質
をコードするものなどが挙げられる。選択スキームの一
例は、宿主細胞の成長を阻止する薬剤を使用する。異種
的遺伝子により成功裏に形質転換されたそれらの細胞
は、薬剤耐性を与えるタンパク質を産生し、従って、選
択培養において生き延びる。この様な優勢選択の例は、
ネオマイシン（Southern etal., J. Molec. Appl. Gene
t. 1: 327 (1982))、マイコフェノール酸（Mulliganet
al., Science 209: 1422 (1980))またはハイグロマイシ
ン（Sugden et al.,Hol. Cell. Biol. 5: 410-413 (198
5))等の薬剤を使用するものである。上記の３種の例
は、適切な薬剤、G418またはネオマイシン（ゲネチシ
ン）、xgpt (マイコフェノール酸）またはハイグロマイ
シンに対する耐性を与えるために、それぞれ真核性の制
御下において細菌性遺伝子が使用されているものであ
る。また、該ベクターは、必要に応じて、エンハンサー
を含んでいてよい。該エンハンサーとしては、当該分野
で様々なものが知られており、該公知のものから選択し
て使用することができ、例えばサイトメガロウイルスエ
ンハンサー、イムノグロブリンκ3'- エンハンサー、λ
エンハンサー、IgH 3'- エンハンサー、Ｔ細胞レセプタ
ーαエンハンサー、αHS-26 エンハンサー、αHS-40 エ
ンハンサー、ラットのインスリンII遺伝子エンハンサー
などから選択することができる。

【００２７】正常なヒトCu/Zn SOD の翻訳領域は、脳、
肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来DNA および市
販の各種ゲノムライブラリーよりゲノム遺伝子の全てあ
るいは一部として、または脳、肝臓、腎臓、甲状腺細
胞、線維芽細胞由来RNA より公知の方法により調製され
た相補Cu/Zn SOD 遺伝子を原料として取得することが出
来る（例えば、R. E. Farrell, Jr., "RNA Methodologi
es: A Laboratory Guidefor Isolation and Characteri
zation", Academic Press, New York (1998); S. Weiss
man (Ed.), "Methods in Enzymology, Vol. 303: cDNA
Preparation andCharacterization", Academic Press,
New York (1999) など) 。変異Cu/Zn SOD 遺伝子は、上
記の細胞または組織より得られた正常Cu/Zn SODの翻訳
領域を部位特異的変異誘発法により変異させることによ
り作製することができる。該翻訳領域は導入動物におい
て発現しうるDNA コンストラクトとして、前記のプロモ
ーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連
結させる通常の遺伝子工学的手法により作製することが
できる（例えば、J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Man
iatis (Ed.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al(2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess, Cold Spring Harbor,New York (1989); D. M. Glo
ver et al. (Ed.), "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 t
o 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, O
xford UniversityPress (1995); J. C. Glorioso and
M. C. Schmidt (Ed.), "Methods in Enzymology, Vol.
306: Expression of Recombinant Genes in Eukaryotic
Cells", Academic Press, New York (1999) などに記
載された方法あるいはそこで引用された文献記載の方法
あるいはそれらと実質的に同様な方法やそれらの改変法
により行うことができる、またそれらの中にある記載は
それを参照することにより本明細書の開示に含められ
る) 。

【００２８】受精卵細胞段階におけるヒト変異Cu/Zn SO
D 遺伝子の導入は、対象動物の生殖細胞および体細胞の
すべてに存在するように確保される。ヒト変異Cu/Zn SO
D 遺伝子導入後の作出動物の生殖細胞において、当該導
入遺伝子が存在することは、作出動物の後代がすべて、
そしてその生殖細胞および体細胞のすべてにおいて当該
導入遺伝子を保持することを意味する。ヒト変異Cu/Zn
SOD 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその生殖
細胞および体細胞のすべてに当該導入遺伝子を有する。
外来のヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子を導入せしめたラット
は、交配によりヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子を安定に保持
することを確認して、該遺伝子保有動物として通常の飼
育環境で継代飼育することが出来る。本発明の Tg ラッ
トは、外来の変異Cu/Zn SOD 遺伝子のヘテロ接合体、お
よびホモ接合体（ホモザイゴート）を包含するものであ
る。導入ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子を相同染色体の両方
に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を
交配することによりすべての子孫が該ヒト変異Cu/Zn SO
D 遺伝子を有するように繁殖継代することができる。こ
のようにして得られた子孫も本発明の動物に含まれる。
本発明のトランスジェニックラット(Tg ラット) とは、
ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子配列を有することを特徴とす
るが、また、ALS あるいはそれと臨床的に実質上同等な
症状を発症することのできるものを指し、例えば、遺伝
子工学的に作出されたラットの細胞、胎児（胚子を含
む) 、分化あるいは成長せしめられた個体、あるいはそ
れから採取された組織など、さらにはそれらの子孫を包
含するものである。

【００２９】本明細書中、用語「F1」は、ラットの第１
代の子孫（すなわち、その「子」)を指し、用語「F2」
は、ラットの第２代の子孫（すなわち、その「孫」）を
指す。該Tgラットとしては、例えば、該ヒト変異Cu/Zn
SOD 遺伝子配列をその生殖細胞（未受精卵、受精卵、精
子およびその始原細胞を含む）および体細胞に（例え
ば、動物の発生における胚形成初期の段階、さらに好ま
しくは、単細胞または受精卵細胞の段階で、かつ一般に
８細胞期以前）導入され、作出されたものである。該配
列の導入は、例えば、該ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子配列
を保有するターゲッティングベクターを、ラット全能性
細胞、例えばラット胚幹細胞（Embryonicstem cell: ES
細胞）、あるいはラット卵細胞などに、自体公知の方
法（例えば、エレクトロポレーション法、マイクロイン
ジェクション法、パーティクルガン法、リン酸カルシウ
ム法、リポフェクション法、凝集法、DEAE- デキストラ
ン法など）によって導入して行われる。これら技術につ
いては、例えば E. J. Robertson (Ed.), Teratocarcin
omas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approac
h, IRL Press, Washington D.C., 1987; Nature, 342:
435-438 (1989); Sience, 246: 799-803 (1989); Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 81: 7161 (1984); Hogan et a
l., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Ma
nual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring H
arbor, N.Y., 1986; Palmiter et al.,Nature, 300: 61
1 (1982); The Qiagenologist, Application Protocol
s, 3rd edition, published by Qiagen, Inc., Chatswo
rth, CA.; J. Sambrook et al.,Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; P. Was
sarman and M. L. DePamphilis (Ed,), "Methods in En
zymology, Vol. 225: Guide to Techniques in Mouse D
evelopment", Academic Press, New York (1993); J.
C. Glorioso and M. C. Schmidt (Ed.), "Methods in E
nzymology, Vol. 306: Expression of Recombinant Gen
es in Eukaryotic Cells", Academic Press, New York
(1999) などに記載があり、そこに記載の方法あるいは
そこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質
的に同様な方法やそれらの改変法によりトランスジェニ
ック動物の作成や該配列の導入を行うことができ、また
それらの中にある記載はそれを参照することにより本明
細書の開示に含められる。さらに、例えば、リポフェク
ションは、市販のキット、例えばDOTAP (Boehringer-Ma
nnheim) または lipofectin (BRL) において提供されて
いる試薬を用いて行うことができる。好ましい導入法と
しては、ES細胞に導入する場合にはエレクトロポレーシ
ョン法、卵細胞に導入する場合にはマイクロインジェク
ション法などが挙げられる。本発明に係るトランスジェ
ニック動物の作製方法に用いる組換え遺伝子は受精卵の
胚発生期に挿入することが望ましい。

【００３０】本明細書中、「全能性細胞」とは、潜在的
に全ての細胞に分化する能力を有する細胞をいう。全能
性細胞としては、例えば受精卵や初期胚のほか、多分化
能を有するES細胞のような培養細胞などを挙げることが
できる。本明細書において、用語「細胞(cell)」、「細
胞株 (cell line)」、および「細胞培養物(cell cultur
e)」は互いに交換可能に使用され、そして全てのこのよ
うな呼称は、その子孫を含む。全ての子孫は、故意また
は偶然の変異によって、DNA 含有物について正確には同
一でなくても良いことが理解されよう。そこには、元の
形質転換細胞においてスクリーニングされたのと同じ機
能または生物学的特性を有する変異体子孫が含まれる。
また、該ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子導入方法により、体
細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の
外来の変異Cu/Zn SOD 遺伝子を導入し、細胞培養、組織
培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を
上述の生殖細胞と自体公知の細胞融合法により融合させ
ることにより本発明のヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子導入ラ
ットを作出することもできる。

【００３１】例えば、DNA を注入した細胞を仮親動物に
移植し（例えば、偽妊娠処置を施した同種の雌動物卵管
に移植し）、該仮親動物を飼育出産させて所望の形質が
発現された仔動物である目的のトランスジェニック動物
（始祖トランスジェニック動物）を得る。そして、当該
動物中における所望の形質の発現を確認するには、当該
動物の体の一部（例えば尾部先端）を切断し、体細胞中
のDNA を抽出して、PCR 法やサザンブロット法などによ
り導入遺伝子の存在を確認する。分離されたDNA を分析
するには、例えば、ジデオキシ・チェイン・ターミネー
ション塩基配列決定法 (F. Sanger et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA., 74: 5463 (1977)など) 、PCR seq
uence specific oligonucleotide 法、変異点などを認
識する適当な制限酵素で分離されたDNA を切断し、電気
泳動をすることによって該当する制限酵素で切断された
かどうかを確認する方法、single-strand conformation
polymorphism (SSCP)法、 RNase protection 法などを
使用することができる (例えば、W. Ream and K. G. Fi
els (Ed.), "Molecular Biology Techniques: An Inten
sive Laboratory Course", Academic Press, New York
(1998); M. D. Adams,C. Fields and J. C. Venter (e
d.), "Automated DNA Sequencing and Analysis", Acad
emic Press, New York (1998) などに記載の方法あるい
はそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実
質的に同様な方法やそれらの改変法、またそれらの中に
ある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に
含められる) 。さらに、始祖トランスジェニック動物と
正常動物とを交配させてF1動物（子孫動物）を得て、当
該F1動物のうち形質が発現されたトランスジェニック動
物を交配させて同型集合体F2動物（子孫動物）を得る工
程を更に含むことにより、本発明に係るトランスジェニ
ック動物の子孫動物を作製することができる。

【００３２】本発明のヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子導入ラ
ットは、ALS あるいはそれと臨床的に実質上同等な症状
を発症することのできるものであり、ALS あるいはそれ
と関連した疾患の臨床症状を調べることができ、また、
該疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見
が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患に
よる二次的疾患の研究および治療に貢献することができ
る。本発明のTgラットは、該疾病などの予防・治療用の
医薬候補化合物をスクリーニングすることに用いること
ができる。該スクリーニングでは、Tgラットに医薬候補
化合物を投与して、現れる変化を検出、測定及び／又は
評価することにより行うことができる。本発明のTgラッ
トは、該疾病・疾患あるいはそれらの合併症を評価する
ことが可能であり、その病態評価モデル動物として利用
することができる。例えば、本発明のTgラットを用い
て、これらの病態回復および重篤程度を判定し、この疾
患の治療方法の検討を行うことが可能である。特には、
本発明のTgラットでは、脊髄から蛋白質やmRNAなどを充
分な量抽出することが可能で、症状パラメーターや病態
の把握が容易に行うことが可能となる。また、本発明の
Tgラットでは、髄液の採取が可能であるため、髄液中の
グルタミン酸濃度などの生化学的解析が可能で、しかも
発症前からのデータを経時的に解析することが出来る。
さらに、また、本発明のTgラットは、髄腔中にチューブ
の挿入が比較的容易にでき、治療実験において髄注が可
能で、ALS 疾患の予防・治療用の医薬候補化合物のスク
リーニングが容易である。また、本発明のTgラットから
各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク
質分解酵素を使用するなどし、細胞を取得し、その培養
またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能であ
る。さらに、ALS 発症に関係する細胞の特定化、分化あ
るいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル
伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどがで
き、ALS 発症解明のための有効な研究材料となる。ま
た、ALS 関連疾患の治療薬の開発を行なうために、上述
の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾
患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能とな
る。ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子導入ラットまたは外来の
変異Cu/Zn SOD 遺伝子発現ベクターを用いて、ALS 関連
疾患の遺伝子治療法を検討、開発することが可能であ
る。遺伝子治療法を検討する際には、例えば、レトロウ
イルスベクター、アデノウイルスベクター、AAV ベクタ
ー、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベ
クター、ポリオウイルスベクター、シンビスウイルスベ
クター、ヘルペスウイルスベクターなどのウイルスベク
ターを利用した遺伝子導入方法、あるいは、例えば、膜
融合リポソーム法などの非ウイルス性の遺伝子導入方法
が用いられる（日経サイエンス、1994年４月号, 20-45
頁; 実験医学: 増刊12（15）(1994); 実験医学: 別冊
「遺伝子治療の基礎技術」, 羊土社(1996)）。

【００３３】上記スクリーニング法の試験化合物として
は、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合
物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出
液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合
物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であ
ってもよい。本発明のTgラットに試験化合物を投与する
方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、脊髄注
射、脳内注射などが用いられる。また、試験化合物の投
与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適
宜選択することができる。本発明のスクリーニング方法
を用いて得られる物質は、上記した試験化合物から選ば
れた化合物であり、ALS 及びそれに関連した疾患に対し
て予防・治療効果を有するので、該疾患に対する安全で
低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することが
できる。さらに、上記スクリーニングで得られた物質か
ら誘導される化合物も同様に用いることができる。該ス
クリーニング方法で得られた物質は塩を形成していても
よい。更に、本発明のALS モデルラットは、例えば、
(1) 組織培養のための細胞源としての使用、(2) ALS モ
デルラットの組織中のヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子もしく
はRNA を直接分析したり、あるいはヒト変異Cu/Zn SOD
遺伝子高発現組織又はALS 症状を典型的に発症している
組織や細胞を分析することによる、変異Cu/Zn SOD によ
り、特異的に発現あるいは活性化するタンパク質につい
ての解析並びにそれらとの関連性、(3) ヒト変異Cu/Zn
SOD 遺伝子を有する組織の細胞を標準組織培養技術によ
り培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織か
らの細胞の機能の研究、(4) 本発明のALS モデルラット
由来の細胞あるいは組織を用いることによる細胞あるい
は組織の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、お
よび(5) 変異Cu/Zn SOD の発現に伴い、特異的に発現あ
るいは活性化するタンパク質について、その単離精製お
よびそれに対する抗体作製などに利用可能と考えられ
る。

【００３４】特に、本発明においては、ALS の病態解明
のために、FALS患者で報告されたCu/Zn SOD 遺伝子異常
を導入してあるTgラットが作製されている。例えば、PA
C ライブラリーからプロモーター領域を含むヒトCu/Zn
SOD 遺伝子の全長をクローニングし、Oligonucleotide-
directed Dual Amber 法で、46番目のアミノ酸がヒスチ
ジン(CAT) からアルギニン(CGT) に変わる点突然変異
（H46R）を導入し、これをSDラット受精卵にマイクロイ
ンジェクションすることにより、Tgラットが作製され
る。生まれたラットの尾からDNA を抽出し、PCR 法およ
びサザンブロッティングにて導入遺伝子を確認できる。
ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子の導入が確認できたTgラット
ではその臓器を摘出し、ウェスタンブロッティングでヒ
ト変異Cu/ZnSOD 蛋白の発現量を検討し、また脊髄にお
けるCu/Zn SOD 活性を検討する。さらには発症からの臨
床経過および発症Tgラットの病理を検討できる。

【００３５】Tgラットは5 系統が得られ、これまでに導
入遺伝子のコピー数が多く、ヒト変異Cu/Zn SOD 蛋白の
発現量が多く認められたTgラットのラインでは、進行性
の筋脱力と筋萎縮という運動ニューロンの選択的な障害
が見られ、約１ヶ月の経過で死に至った。H46R変異は銅
との結合部位に存在するため、脊髄におけるCu/Zn SOD
活性は導入蛋白の多いTgラットほど低下していた。神経
病理では、主に脊髄前角が障害され、特に腰髄における
前角の運動ニューロンの変性消失、アストロサイトとミ
クログリアの著しい増生が認められた。変性した運動ニ
ューロンにはエオジン好性の円形の硝子様封入体がみら
れ、抗ユビキチン抗体で染色された。また、腫大し蛇行
した軸索がみられた。これらの所見はALS 患者の病理所
見で認められる細胞内封入体や軸索の肥大化と類似した
所見である。

【００３６】ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子を導入したTgラ
ットは、ヒトのALS の症状および病理像をよく再現して
いた。本発明では、Cu/Zn SOD 遺伝子の変異の中で、Cu
/ZnSOD の活性中心に位置し、また発症者の罹病期間が
著しく長いという特徴を持つH46R変異を選び、この変異
ヒトCu/Zn SOD 遺伝子を導入することで、ALS の症状お
よび病理像をよく再現しているTgラットを初めて作製し
た。かくして、本発明で初めてラットでALS のモデル動
物が作製され、それにより従来の問題点（例えば、ALS
のモデル動物Tgマウスでは、病態の主座である脊髄が小
さく病理学的な検索や蛋白質などの解析が充分にできな
いなど）が解消され、さらに髄液の解析や治療実験とし
て神経栄養因子などの髄腔内投与が可能になり今後のAL
S の病態解明に有用なモデルを入手できたのである。本
明細書に記載のDNA, RNAなどの核酸、ポリペプチド、タ
ンパク質などは、いずれも必要に応じて、当該分野で広
く知られた方法を適用して化学合成することも可能であ
る。本明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Bioc
hemical Nomenclature による略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものである。

【００３７】

【実施例】以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明
するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具
体的な態様の参考のために提供されているものである。
これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明する
ためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定
したり、あるいは制限することを表すものではない。本
発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可
能であることは理解されるべきである。全ての実施例
は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用
いて実施したもの、又は実施することのできるものであ
り、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。以
下の実施例における通常慣用される分子生物学的技術と
しては、標準的な実験マニュアル、例えば J. Sambroo
k, E. F. Fritsch & T. Maniatis (ed.), "Molecular C
loning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold S
pring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor,
New York (1989); D. M. Glover et al. (ed.), "DNA C
loning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Appr
oach Series), IRL Press, Oxford University Press
(1995); R. Saiki et al., Science, 230: 1350, 1985;
R. Saiki et al., Science, 239: 487, 1988; H. A. E
rlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press, 1989
; M. A. Innis et al. (ed.), "PCR Protocols: a gui
de to methods and applications", Academic Press, N
ew York (1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G.
R. Taylor (ed.),PCR: a practical approach, IRL Pr
ess, Oxford (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)などに記載
されるように実施できるし、またそれらに記載の方法あ
るいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれら
と実質的に同様な方法や改変法により行っている (それ
らの中にある記載はそれを参照することにより本明細書
の開示に含められる) 。また市販の試薬あるいはキット
を用いている場合はそれらに添付の指示書(protocols)
や添付の薬品等を使用している。

【００３８】実施例１ (1) Cu/Zn SOD 遺伝子のクローニング 千葉県ガンセンター生化学部のヒト全ゲノムを含む P1-
derived artificial chromosome (PAC) ライブラリー
(Ioannou, P.A., Amemiya, C.T., Garnes, J.,et al.,
Nat. Genet., 6, 84-89 (1994)) からpolymerase chain
reaction (PCR) スクリーニング法（熱変性 94 ℃、１
分; アニーリング 55 ℃、1 分; 伸長反応 72 ℃、1
分; 30サイクル）によりCu/Zn SOD 遺伝子を含む大腸菌
クローンを取得する。PCR のプライマーはCu/Zn SOD 遺
伝子のエクソン5 をはさむように設計され、5'側がイン
トロン4 内で、 5F (5'-TTGGGAGGAGGTAGTGATTA) 〔配列番号：１〕 3'側がイントロン5 内で、 5R (5'- AGCTAGCAGGATAACAGATGA) 〔配列番号：２〕 であった。

【００３９】この大腸菌株よりアルカリ- SDS 法を用い
てDNA を抽出後、サザンブロッティング法によりCu/Zn
SOD 遺伝子の全長が含まれていることを確認する。Cu/Z
n SOD 遺伝子地図 (Levanon, D., Lieman-Hurwitz, J.,
Dafni, N., et al., Embo J., 4, 77-84 (1985); Elro
y-Stein, O., Bernstein, Y.Groner, Y., Embo J., 5,
615-622 (1986)) に基づいて、2 種の制限酵素EcoRI, B
amHI (Takara, Otsu)と1 種の制限酵素PstI (Takara)
で切断し、それぞれDNA 量として0.1 μg, 0.01 μg を
アガロースゲル電気泳動し、ニトロセルロースメンブレ
ンに転写した。Megaprime^TM DNA labelling system kit
(Amersham, Buckinghamshire, England)を使って³²P
でラベルしたDNA プローブを用い、メンブレンにハイブ
リダイゼイションした。

【００４０】プローブは、ヒト白血球より抽出したRNA
からreverse transcription (RT)-PCR法にてCu/Zn SOD
cDNAを以下のように作製して用いた。5 μg のRNA を、
reverse transcription kit (Stratagene, La Jolla, C
A, USA) を用いてRT反応を行い、得られたcDNAにCu/Zn
SOD cDNA (Hallewell, R.A.,Masiarz, F.R., Najarian,
R.C., et al., Nucleic Acids Res., 13, 2017-2034
(1985)) を含むように設計したプライマー、 sod1F: 5'-GTCGTAGTCTCCTGCAGCG 〔配列番号：３〕 sod1R: 5'-GAGTTAAGGGGCCTCAGAC 〔配列番号：４〕 を用い、熱変性 94 ℃、１分、アニーリング 55 ℃、1
分、伸長反応 72℃、1分、30サイクルの条件でPCR 法
により増幅し(591 bp)、アガロースゲル電気泳動後切り
出して精製し、塩基配列を確認した。シークエンスは、
プライマーにsod1F および sod1R、 ABI Prism Dye Ter
minator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perki
n-Elmer, Foster City, CA, USA)を用い、ABI 310 DNA
Sequencer(Applied Biosystems, Foster City, CA, US
A)で行った。

【００４１】この結果、PAC library をPCR 法によりス
クリーニングし、クローンdJ1001A14 番を単離した。得
られたクローンdJ1001A14 から DNAを抽出し、0.1, 0.0
1 μg をそれぞれ EcoRIとBamHI で切断し（図１) 、Cu
/Zn SOD cDNAをプローブとしてサザンブロッティングし
た結果、11.5 kb のバンドが得られ（図２, レーンE1,
E2）、Cu/Zn SOD 遺伝子の全長がクローン内に含まれる
ことが確認された。また同じDNA をPstIで切断してサザ
ンブロッティングすると、2.5 kb、3.5 kb、および5.5
kbのバンドが得られ（図２, レーンP1, P2）、Cu/Zn SO
D 遺伝子内のPstIサイト（図１) から推定されるフラグ
メントの長さに一致した。EcoRI, BamHIで切り出したフ
ラグメントは発現に十分なプロモーター領域とCu/Zn SO
D 遺伝子全長（図１）が含まれることがin vitroの実験
で明らかであった(Elroy-Stein, O., Bernstein, Y.Gro
ner, Y., Embo J., 5, 615-622 (1986))ので、これをプ
ラスミドpBR322 (Toyobo, Tokyo)にクローニングした
(pBR-Cu/Zn SOD)。

【００４２】実施例２ (2) H46R変異の導入 pBR-Cu/Zn SOD を制限酵素XbaI (Takara) で切断しエク
ソン2 を含む5 kbのフラグメントをプラスミド pBluesc
ript^TM II KS+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) にサ
ブクローニングした (pBlue-XbaI) 。さらにこのpBlue-
XbaIを2 種の制限酵素NdeI (Takara) とXbaIで切断し、
エクソン2 を含む約1 kbのフラグメントを得た。このフ
ラグメントにMutan-Express Km (Takara) を使用し、H4
6R変異 (CAT →CGT) の導入を行った（図３）。簡単に
は、このフラグメントをカナマイシン耐性の配列に変異
を持つプラスミドpKF 18にサブクローニングし(pKF-ex
2)、変異導入用プライマー； 5'- CTCATGAACACGGAATCCATGC 〔配列番号：５〕 とプラスミドのカナマイシン耐性を復帰させる配列が組
み込まれたセレクションプライマーを同時にハイブリダ
イズさせる。

【００４３】カナマイシン入り培地において、カナマイ
シン耐性株を拾うことで効率よく変異が導入されたクロ
ーンを得ることができる（Oligonucleotide-directed D
ualAmber 法 (Hashimoto-Gotoh, T., Yasojima, K.Tsuj
imura, A., Gene, 167, 333-334 (1995))) 。フラグメ
ント全長をシークエンスし、H46R変異が導入されたこと
を確認後、制限酵素NdeIとSalI (Takara) で切断し、同
じくNdeIとSalIで切断したpBlue-XbaIにライゲーション
した(pBlue-XbaI-H46R) 。シークエンスは M13PrimerM
4, M13Primer RV-N (Takara) の各プライマー、ABI Pri
sm Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction
Kitを用い、ABI 310 DNA Sequencer を使用した。H46R
変異を含む5 kbのフラグメントをXbaIで切断し、XbaIで
切断したpBR-Cu/Zn SOD にライゲーションした (pBR-Cu
/Zn SOD-H46R) 。この結果、Oligonucleotide-directed
Dual Amber 法により遺伝子変異を導入したクローン
（pBR-Cu/Zn SOD-H46R) をシークエンスし、Cu/Zn SOD
遺伝子のエクソン2 内にある、46番アミノ酸部位の塩基
配列に、CAT からCGT の変異（アミノ酸ではヒスチジン
からアルギニンへの変異）が導入できたことを確認した
（図３）。また、ライゲーションを行った部位の周辺の
塩基配列に、変異のないことをシークエンスにより確認
した。

【００４４】実施例３ (3) トランスジェニックラット(Tg ラット）の作製 pBR-Cu/Zn SOD-H46Rを EcoRI, BamHI で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動後、プロモーター領域を含むH46R変異
Cu/Zn SOD 遺伝子の全長11.5 kb (Elroy-Stein, O., Be
rnstein, Y.Groner, Y., Embo J., 5, 615-622 (1986))
を精製した。DNA は10 mM Tris, 0.2 mM ethylenediami
netetraacetic acid (EDTA) に溶解し、4 ng/ μl に調
整した。ラット受精卵へのマイクロインジェクションは
Hochi らの方法 (Hochi, S., Ninomiya, T., Honma,
M., et al., Animal Biotech., 1,175-184 (1990)) に
従って以下のように行った。

【００４５】メスSprague Dawley (SD) ラット(Japan S
LC, Inc., Hamamatsu) に150 U/kgの gonadotropin fro
m pregnant mare serum（Nihon Zenyaku Kogyo, Kohriy
ama) 、48時間後、75 U/kg のhuman chorionic gonadot
ropin (Sankyo Yell Yakuhin Co.,Ltd., Tokyo)を腹腔
内投与し、オスSDラットと交配した。32時間後に受精卵
を摘出し、Krebs-Ringer bicarbonate buffer (Toyoda,
Y.Chang, M.C., J. Reprod. Fertil., 36, 9-22 (197
4))培地に入れ、ヒアルロニダーゼ処理した後に20% ウ
シ胎児血清を添加したリン酸バッファー中に置き換え、
ノマルスキー微分干渉装置付き倒立顕微鏡 (Nikon, Tok
yo) 下でDNA を受精卵の前核にマイクロマニピュレータ
ーおよびマイクロインジェクター (Narishige, Iowa, I
A, USA) を用いてマイクロインジェクションした。37
℃、5% CO₂インキュベーター中に置き、翌日に偽妊娠メ
スWisterラット (Charles River Japan, Inc., Yokoham
a)の卵管に移植した。

【００４６】生まれたラットから約1cm の尾を切断し、
lysis buffer (50 mM Tris pH 8.0,0.1M NaCl, 20 mM E
DTA, 1% SDS, 150 μg /ml Proteinase K, 1mg/ml Pron
aseE) に入れ、50℃で一晩置いて蛋白分解後、フェノー
ル処理をしエタノール沈殿を行ってDNA を抽出した。プ
ライマー；5F, 5Rを用いてPCR 法（熱変性 94 ℃、１
分、アニーリング 55 ℃、1 分、伸長反応 72℃、1
分、30サイクル）で導入遺伝子の有無を確認後、サザン
ブロッティングにより導入遺伝子のコピー数を同定し
た。2 種の制限酵素EcoRI とBamHI で切断し、アガロー
スゲル電気泳動後にニトロセルロースメンブレンに転写
し、³²P でラベルしたCu/Zn SOD cDNAプローブを用いて
メンブレンにハイブリダイゼイションした。得られたTg
ラットにSDラットを交配し、ヘテロのF1ラットを得た。
生まれたF1ラットは尾からDNA を抽出し、PCR 法によ
り、ヒトCu/Zn SOD 遺伝子が導入されたTgラットを選択
した。

【００４７】この結果、H46R変異を持つヒトCu/Zn SOD
のプロモータ領域を含む全長11.5 kb を精製し、ラット
の受精卵にマイクロインジェクションしてTgラットを作
製できた。すなわち、SDラットの受精卵244 個を使用し
て、24匹のラットが生まれ、このうちPCR 法（図４）
およびサザンブロッティング（図５） によって遺伝子
の導入が確認できたファウンダーラットは５匹（オス１
匹、メス４匹）であった。これらに SD ラットを交配し
て、R2, R4, R10, R13, R19 の５種類のTgラットを得た
（表１）。サザンブロッティングで同定されたヒト変異
Cu/Zn SOD 遺伝子のコピー数は、最も多いR4で約25コピ
ーと推測された（図５）。導入遺伝子の最も多いR4と次
に多いR13 のF1ラットを観察対象とした。R4のF1は 158
±6.3 日(n=9、オス４匹、メス５匹) で片側の下肢に脱
力が出現し、徐々に痙性対麻痺から四肢麻痺（図６）
へと進行し、23.2±5.9 日(n=9) の経過で死亡した。ヒ
ト変異Cu/Zn SOD 遺伝子の発現が少ないR13 では、9 ヶ
月の観察期間で発症は見られていない。

【００４８】

【表１】

【００４９】実施例４ (4) SDS-PAGE とウェスタンブロッティング 得られた５種類のF1ラットをジエチルエーテルで深麻酔
死後に脊髄を取り出し、10 mM Tris (pH 7.6) 、100 mM
NaCl 、1 mM EDTA 、1 mM phenylmethylsalfonyl fluo
ride、1 μg/ml pepstatin A (Sigma, St. Louis, MO,
USA)を含むバッファーでホモジェナイズした。15000rp
m, 10min 遠心後に上清を取り、蛋白濃度を測定して4
μg に調整し、2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.1
% bromophenol blue (BPB), 10% glycerol, 100mM dith
iothreitol (DTT) のloading bufferを加え、15% ポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動した（SDS-PAGE）。マ
ーカーには Rainbow^TM coloured protein molecular we
ight marker (Amersham)を用いた。このゲルをpolyviny
lidene difluoride (PVDF)メンブレン(Micron Separati
ons Inc., Westboro, MA, USA)に転写し、内因性のラッ
トCu/Zn SOD および導入したヒト変異Cu/Zn SOD を共に
認識する抗ヒトCu/Zn SOD 抗体（Calbiochem,San Dieg
o, CA, USA) で免疫染色を行った。2 次抗体にはホース
ラディッシュペルオキシダーゼ (HRP)標識された抗ヒツ
ジ IgG抗体 (Southern BiothechnologyAssociates, In
c., Birmingham, AL, USA ) を用い、Enhanced chemilu
minescence kit (Amersham) で発色を行った。同様にR4
については、大脳、小脳、脊髄、腎臓、肝臓、心臓、
肺、骨格筋の各臓器を取り出して、SDS-PAGEを行い、PV
DFメンブレンに転写後、抗ヒトCu/Zn SOD 抗体を用い
て、ウェスタンブロッティングを行った。

【００５０】その結果、抗ヒトCu/Zn SOD 抗体によるウ
ェスタンブロッティングでは、21.5kDaのマーカー付近
に2 本のバンドとして認識され、泳動度の違いにより、
分子量の大きい方が導入したヒト変異Cu/Zn SOD 蛋白、
分子量の小さい方がラット内因性Cu/Zn SOD 蛋白であっ
た（図７) 。得られた５種類のトランスジェニックラッ
トの脊髄におけるヒトCu/Zn SOD 蛋白の発現量を内因性
のラットCu/Zn SOD 蛋白の発現量との比によって比較す
ると、導入されたヒト変異Cu/Zn SOD のコピー数に比例
してR4でもっとも高く、6.0 倍であり、次いでR13 が3.
0 倍、R10 が2.6 倍、R2が1.6 倍、R19 が0.8 倍であっ
た（図７) 。R4系統の大脳、小脳、脊髄、腎臓、肝臓、
心臓、肺、骨格筋の各臓器において導入したヒト変異Cu
/Zn SODの発現を検討したが、発現はすべての臓器にお
いて認められた（図８) 。各臓器におけるヒト変異Cu/Z
n SOD 蛋白の発現量を内因性のラットCu/Zn SOD 蛋白の
発現量との比によって比較すると、中枢神経系、特に脊
髄で高かった。

【００５１】実施例５ (5) Cu/Zn SOD 酵素活性 24週令Tgラット(R4, R13) および正常の24週令SDラット
の脊髄Cu/Zn SOD 酵素活性を、ニトロブルーテトラゾリ
ウム(nitroblue tetrazolium; NBT) 還元法 (Beaucham
p, C.Fridovich, I., Anal. Biochem., 44, 276-287 (1
971)) により計測した。脊髄は20 mM Tris (pH 7.2) 、
0.5 mM EDTA 、1% Triton X を含むバッファーでホモジ
ェナイズ後、15000 回転, 10分遠心し、上清を試料とし
た。蛋白濃度を測定後、40μg の試料を8M 尿素を含む
7.5%アクリルアミドゲルで泳動した。ゲルは 2.45 x 10
^-3 M NBTで20分染色し、さらに 2.8 x10^-5 Mリボフラビ
ン中に15分浸した。リボフラビンの添加によってスーパ
ーオキシドが生じ、黄色のNBT は紫色のホルマザンにな
るが、Cu/Zn SOD が存在するとこの発色反応を阻害する
ため、発色阻害の程度によりCu/Zn SOD 酵素活性を測定
した。0.1, 0.5, 1.0 単位 (U)の精製されたヒト赤血球
Cu/Zn SOD (Sigma) を同時に泳動し、定量した。

【００５２】結果、ラットCu/Zn SOD とコントロールの
ヒトCu/Zn SOD は泳動度が異なっていた。脊髄における
Cu/Zn SOD 酵素活性は、コントロールと比較して、正常
SDラットが11.3 U/mg 、R4が2.4 U/mg、R13 が4.5 U/mg
であった。正常SDラットとTgラットの脊髄におけるSOD
活性の比はそれぞれ、21 %, 40 %であった（図９) 。H4
6R変異は、酵素活性がほとんどないため、R4、R13 とも
内因性のラットCu/ZnSOD 活性のスポットのみ認めら
れ、導入したヒトのCu/Zn SOD の活性は認められなかっ
た。

【００５３】実施例６ (6) 病理 24週令Tgラット(R4)および正常の25週令SDラットをジエ
チルエーテルで麻酔した後、0.9% 食塩水、次いで 4%
パラホルムアルデヒド液で灌流固定を行った。脳および
脊髄を摘出後アルコールとキシレンで置き換えパラフィ
ン包埋した。切片は5 μm の厚さで作製し、脱パラフィ
ン後、ヘマトキシリンーエオジン (Hematoxilin-Eosin;
HE) 染色および免疫染色を行った。免疫染色は0.3%過
酸化水素加メタノールに30分浸し、内因性ペルオキシダ
ーゼ活性を除去後、以下の一次抗体を0.05 M Tris (pH
7.6), 1.5 % NaCl, 1 % ヤギ血清 (Vector, Burlingam
e, CA, USA)で希釈して4 ℃で一晩反応させた。使用し
た一次抗体は、抗ユビキチン抗体 (1:500 希釈、Dako,
Carpenteria, CA)、抗glial fibrillary acidic protei
n (GFAP) 抗体 (1:500 希釈、Dako) 、抗ヒトリン酸化
ニューロフィラメント(NF) H抗体 (1:500 希釈、SMI 3
1; Sternberger Antibodies, Baltimore, MD)、抗ヒトC
u/Zn SOD 抗体 (1:200 希釈、The Binding Site, Birmi
ngham, England)であった。抗ユビキチン抗体、GFAP抗
体にはHRP の付いた抗ウサギIgG 抗体 (Dako) を、抗NF
H 抗体にはHRP の付いた抗マウスIgG 抗体 (Dako) 、抗
ヒトCu/ZnSOD 抗体にはHRP の付いた抗ヒツジIgG 抗体
をそれぞれ二次抗体に使用し、ジアミノベンジジン (DA
B)で発色した。カウンター染色にはヘマトキシリン染色
を行った。脊髄前根は摘出後、2 % グルタルアルデヒド
で前固定しさらに1 % 四酸化オスミウムで後固定した。
アルコール脱水、プロピレンオキシド置換後、エポキシ
樹脂で包埋した。切片は0.5 μm の厚さで薄切し、トル
イジンブルー染色を行った。

【００５４】結果、Tgラットの病変の主座は脊髄で、主
に前角が障害されていた。腰髄における前角の運動ニュ
ーロンの変性消失が著しく、特に前角外側の運動ニュー
ロンはほとんど消失しアストロサイト、ミクログリアの
増生が認められた（図10a)。変性した運動ニューロンの
細胞質内や、腫大した軸索に、HE染色でエオジン好性の
円形あるいは線状の中心部と淡明な辺縁帯を持つ封入体
がみられた( 図10b,10c)。これらの細胞内封入体は抗ユ
ビキチン抗体陽性（図10d)であったが、抗Cu/Zn SOD 抗
体では陰性であった。また前角に一部残存するニューロ
ンの細胞質は顆粒状にユビキチン抗体で染色された。抗
リン酸化ニューロフィラメント抗体の免疫染色では、腫
大し、蛇行したニューロフィラメントが斑状に強く染色
され（図11a)、これらはユビキチン陽性であった（図11
b)。正常ではニューロンの細胞質は抗リン酸化ニューロ
フィラメント抗体では染色されないが、Tgラットでは一
部のニューロンの細胞質および封入体が陽性であった
（図11a)。

【００５５】GFAP染色では、活性化され肥大したアスト
ロサイトが増加するアストログリオーシスが前角に強く
みられた（図12a)。アストロサイトの細胞質において
も、HE染色で中心部が好酸性で辺縁が淡明な円形の細胞
内封入体（図12b)が見られ、この封入体はGFAP染色陰性
（図12c)、抗Cu/Zn SOD 抗体陰性であった。前角の運動
ニューロンが消失している部位にはミクログリアが著し
く増加していた。頚髄においても前角の運動ニューロン
の変性が見られたが、腰髄に比較して数多くの運動ニュ
ーロンが残存しており、症状の程度と相関していた。ユ
ビキチン染色される細胞と軸索の数、アストログリオー
シス、ミクログリアの増加についても腰髄に比較して少
なかった。脳幹の運動神経核のニューロンではユビキチ
ン化がみられたが、小脳および大脳皮質には認められな
かった。脊髄前角細胞の軸索の通り道である腰髄の前根
では、太い有髄線維密度が減少し、また軸索変性像であ
るミエリンオボイドが見られた (図13a)。

【００５６】本発明において、ラットにおいてもヒト変
異Cu/Zn SOD 遺伝子を導入することで運動ニューロン病
を再現できることが示された。作製したTgラットは、約
5 ヶ月で片側の下肢の筋萎縮を伴う筋力低下で発症し、
痙性対麻痺から四肢麻痺へと進行し、約1 ヶ月の経過で
餌や水分を取ることが不能となり死亡した。筋力の低下
した下肢の筋緊張は亢進し、また発症早期から筋萎縮を
伴うことを併せて考えると、上位および下位の運動ニュ
ーロン両方の障害を含むと考えられた。ヒトではCu/Zn
SOD 遺伝子変異を持つFALS患者の症状が必ずしも下肢か
らの発症が見られるわけではないが (Cudkowicz, M.E.,
McKenna-Yasek, D., Sapp, P.E., et al., Ann. Neuro
l., 41, 210-221 (1997)) 、上位および下位の運動ニュ
ーロンが障害されるヒトのALS と類似の症状であると考
えられる。H46R変異を持つALS 患者は下肢の筋力低下が
初発症状である (Aoki, M., Ogasawara, M., Matsubar
a, Y., et al., J. Neurol. Sci., 126, 77-83 (1994))
が、これまでに作製されている3 系統のヒト変異Cu/Zn
SOD 導入トランスジェニックマウスにおいても導入し
た変異に関わらず、下肢から始まる脱力・筋萎縮の進行
が見られている。また、導入した遺伝子のコピー数が多
く発現している変異Cu/Zn SOD 蛋白が多い系統のTgラッ
トが筋力低下、筋萎縮といった運動ニューロン病の症状
を示し、変異Cu/Zn SOD 蛋白の発現が少ない系統では症
状を示さないことは、変異Cu/Zn SOD 蛋白が獲得した神
経毒性が神経の変性を引き起こすことを示すものと考え
られる。

【００５７】ウェスタンブロッティングでは、中枢神
経、特に脊髄において、導入した変異Cu/Zn SOD 蛋白が
多く発現していた。Cu/Zn SOD の発現は運動ニューロン
のみに多く発現しているわけではなく (Pardo, C.A., X
u, Z., Borchelt, D.R., et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A., 92, 954-958 (1995)) 、選択的に運動ニュ
ーロンが変性する原因として、変異Cu/Zn SOD 蛋白の量
のみでは説明が出来ない。しかし、導入した変異Cu/Zn
SOD 蛋白の多い系統で症状が見られること、脊髄で変異
Cu/Zn SOD 蛋白が多く発現していることは、変異Cu/Zn
SOD 蛋白の量が多いことが選択的な運動ニューロンの変
性に必要条件である可能性を示唆している。これまで作
製されたTgマウスでは蛋白量あたりのCu/Zn SOD 酵素活
性はコントロールマウスと比較して高値であるかあるい
は同じであった (Gurney, M.E., Pu, H., Chiu, A.Y.,
et al., Science, 264, 1772-1775 (1994); Bruijn, L.
I.,Becher, M.W., Lee, M.K., et al., Neuron, 18, 32
7-338 (1997); Wong, P.C.,Pardo, C.A., Borchelt, D.
R., et al., Neuron, 14, 1105-1116 (1995)) 。本発明
で作製されたTgラットでは、単位蛋白あたりのCu/Zn SO
D 酵素活性が著しく低下しているが、これは導入したH4
6R変異が活性を持たないため、導入蛋白が多いほど、内
因性のラットCu/Zn SOD に依存する全体の活性が低下し
たものと考えられる。発現した症状はこれまでのTgマウ
スと大きな違いはなく、Cu/Zn SOD 酵素活性そのものが
運動ニューロン障害と相関しないことが改めて示され
た。

【００５８】本発明で導入した変異はH46R変異である
が、この46番目のヒスチジンはCu/ZnSOD 蛋白の活性中
心に位置し、銅イオンの結合に関与している (Aoki,
M., Ogasawara, M., Matsubara, Y., et al., Nat. Gen
et., 5, 323-324 (1993); Tainer, J.A., Getzoff, E.
D., Richardson, J.S., et al., Nature, 306, 284-287
(1983)) 。このため導入したH46R変異を伴うCu/Zn SOD
は、in vitroで酵素活性がほとんどないことが分かっ
ている (Ratovitski, T., Corson, L.B., Strain, J.,
et al., Hum. Mol. Genet., 8, 1451-1460 (1999))。Tg
ラットのCu/Zn SOD 酵素活性が低下したのは、同じ蛋白
量あたりに、酵素活性のほとんどない導入ヒト変異Cu/Z
n SOD の占める割合が多いためと考えられた。病理では
脊髄前角の運動ニューロンが変性消失し、アストロサイ
トーシス、ミクログリアの増加は主に前角に強く認めら
れた。変異Cu/Zn SOD 遺伝子を導入したTgマウスで報告
されているようなニューロン内での空胞変性 (Wong, P.
C., Pardo, C.A., Borchelt, D.R., et al., Neuron, 1
4, 1105-1116 (1995); Dal Canto, M.C.Gurney, M.E.,
Am. J. Pathol., 145, 1271-1279 (1994))は認められな
かった。変性した神経細胞内にみられたエオジン好性の
中心部と淡明な辺縁帯を持つ封入体はALS 患者にみられ
るhyaline inclusion (HI) (Hirano, A., Kurland, L.
T.Sayre, G.P., Arch. Neurol., 16, 232-243 (1967);
Leigh, P.N., Whitwell, H., Garofalo, O., et al., B
rain, 114, 775-788 (1991)) またはskein-like inclus
ion (SLI) (Lowe, J., Lennox, G., Jefferson, D., et
al., Neurosci. Lett., 94, 203-210 (1988)) に類似
していた。

【００５９】これらは、ALS 以外の神経疾患でも報告は
されている (Matsumoto, S., Goto,S., Kusaka, H., et
al., J. Neurol. Sci., 115, 208-213 (1993))もの
の、孤発性ALS 、FALSのどちらの脊髄前角運動ニューロ
ンにも特徴的に認められる細胞内封入体である。HI、SL
I はユビキチン陽性である点は共通しているが、HIがCu
/Zn SOD 陽性、リン酸化ニューロフィラメント陽性であ
るのに対してSLI は陰性で異なるものであるという説
(Mizusawa, H., Nakano, I, Ohama, E., Amyotrophic L
ateral Scclerosis (Nakano I and Hirano A, ed), Els
evier, Amsterdam,pp.1-5 (1996)) と、一方、電子顕微
鏡レベルでは構造が類似し、抗体では認識されなくなっ
ているが由来は同じである (Migheli, A., Attanasio,
A.Schiffer, D., Neuropathol. Appl. Neurobiol., 20,
282-289 (1994))という説がある。Tgラットの細胞質内
封入体は抗ユビキチン抗体陽性であったが、抗Cu/Zn SO
D 抗体と抗リン酸化ニューロフィラメント抗体では染色
されなかった。一方、アストロサイト内にもエオジン好
性細胞内封入体が認められたが、ユビキチン化されない
ようであった。まれであるが、ALS 患者においてもアス
トロサイトに細胞内封入体が認められることがCu/Zn SO
D 変異を持つ家系 (Kato, S., Hayashi, H., Nakashim
a, K., et al., Am. J. Pathol., 151, 611-620 (199
7))で報告されている。

【００６０】腫大し蛇行した軸索や一部のニューロン
は、リン酸化ニューロフィラメント抗体およびユビキチ
ン抗体で斑状に強く染色された。正常な前角運動ニュー
ロンはリン酸化されないが、ALS 患者の運動ニューロン
および軸索にリン酸化されたニューロフィラメントが蓄
積し (Mizusawa, H., Matsumoto, S., Yen, S.H., et a
l., Acta. Neuropathol., 79, 37-43 (1989); Sobue,
G., Hashizume, Y., Yasuda, T., et al., Acta. Neuro
pathol., 79, 402-408 (1990)) 、ユビキチン化される
ことが知られており (Schiffer, D., Autilio-Gambett
i, L., Chio, A., etal., J Neuropathol. Exp. Neuro
l., 50, 463-473 (1991))、ユビキチン化された蛋白は
リン酸化されたニューロフィラメントあるいはそれに結
合している蛋白である可能性が考えられた。一方、リン
酸化ニューロフィラメント抗体で染色されない細胞内封
入体が、ユビキチン抗体で強く染色されることから、別
の新規の蛋白がユビキチン化の対象となる可能性が考え
られる。また前根の所見は、前角細胞の変性に比較する
と軽度の軸索障害であり細胞変性に伴うWaller変性によ
るものと考えられる。

【００６１】以上、Tgラットの病理所見は、(1) 病態の
主座が脊髄前角にあり、大型の運動ニューロンの変性が
みられたこと、(2) 残存する前角運動ニューロンに細胞
内封入体が認められ、抗ユビキチン抗体染色されるこ
と、(3) 腫大した軸索がみられ、抗リン酸化ニューロフ
ィラメント抗体および抗ユビキチン抗体で染色されるこ
と、であり、ALS 患者で報告されている病理像を良く再
現している。本明細書において、「ALS と実質的に同等
な症状」とは、上記で観察されているか、あるいは説明
されている状態のうちの一つを指しているものであって
もよいし、健常な個体と比較して区別できる状態であっ
て、最終的にALS と診断された者に現れる異常な状態の
うちのいずれかを指すものであってもよい。本発明によ
り、症状の発現、臨床経過および神経病理の点でヒトの
ALS の病態をよく再現したTgラットが作製でき、個体の
大きさの点から主病変である脊髄での生化学的な分析、
髄液の解析および神経栄養因子の髄注や細胞移植などの
治療法の開発に有用なモデルになると考えられる。また
既存のTgマウスとは異なるH46R変異をもち、神経変性の
原因の一つと考えられているCu/Zn SOD の構造変化や銅
の結合の問題などに関しての解析にも有用なモデルであ
ると考えられる。

【００６２】

【発明の効果】本発明により抗ALS 薬の探索のためのAL
S 動物モデルとして有用な、新規トランスジェニックラ
ットおよびその使用方法が提供される。本発明のトラン
スジェニックラットを用いることにより、ALS 疾患の治
療薬の探索や効果の確認を効率良く行うことが可能であ
る。また、本発明のALS のモデルラット、例えばヒト変
異Cu/Zn SOD 遺伝子を導入したTgラットは、その症状お
よび病理像においてヒトALS の病態をよく再現してお
り、ALS のモデル動物として今後の病態解明や治療法の
開発に有用である。本発明は、前述の説明及び実施例に
特に記載した以外も、実行できることは明らかである。
上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可
能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲
内のものである。

【配列表】SEQUENCE LISTING <110> TOHOKU TECHNO ARCH CO., LTD. <120> ALS MODEL RAT <130> PTA0500NQ <140> <141> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 1 ttgggaggag gtagtgatta 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 2 agctagcagg ataacagatg a 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 3 gtcgtagtct cctgcagcg 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 4 gagttaaggg gcctcagac 19 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide to act as a primer for PCR <400> 5 ctcatgaaca cggaatccat gc 22

【図面の簡単な説明】

【図１】Cu/Zn SOD遺伝子の構造を示す。全長は11.5 k
b, 5つのエクソンから成り立っている。Exはエクソンを
示す。制限酵素の略語は、B; BamHI, Nd; NdeI, P; Pst
I, R1; EcoRI, X; XbaI である。

【図２】PAC dJ1001A14 のDNA のサザンブロッティング
の結果を示す電気泳動の写真を示す。レーンE1, E2は、
0.1 μg, 0.01 μg のDNA をEcoRI, BamHIで切断後、泳
動している。分子量は、約11.5 kb であった。レーンP
1, P2は、0.1 μg, 0.01μg のDNA をPstIで切断後、泳
動したもので、分子量はそれぞれ約2.5, 3.5, 5.5 kbで
あった。

【図３】H46R 変異の導入を説明する図である。Cu/Zn S
OD 遺伝子全長をpBR322にクローニングし、さらにエク
ソン2 を含むフラグメントをpKF18 にサブクローニング
した。点突然変異を入れた変異導入用プライマーとプラ
スミドのカナマイシン耐性を獲得させる配列が組み込ま
れたセレクションプライマーを同時にハイブリダイズし
た菌株を拾い、そのシークエンスを確認した（右）。

【図４】Tg ラットにおける導入遺伝子の確認作業にお
ける結果を示す電気泳動の写真である。プライマー5F,
5RによるPCR を行い、導入遺伝子の確認を行った（PCR
産物の大きさは219 bp）。PC; positive control。ファ
ウンダーラット；R2, R4, R10, R13, R17 にそれぞれ遺
伝子の導入が確認された。

【図５】Tg ラットにおける導入遺伝子の確認作業にお
ける結果を示す電気泳動の写真である。 SOD cDNA をプ
ローブに用いたサザンブロッティング。コントロールと
して、導入遺伝子を1 コピー、10コピー、100 コピー分
を泳動し、比較している。

【図６】発症し痙性対麻痺を呈したTgラット (22週令）
を示す写真である。下肢の筋萎縮、筋力低下を示してい
る。足底が上を向いて、足および膝関節は硬直してい
る。上肢の筋力低下は比較的軽いため、体を引きずって
前に進むことは可能である。

【図７】Tg ラットにおけるCu/Zn SOD 蛋白の発現の様
子を示す電気泳動の写真である。本図では Tg ラットの
脊髄におけるCu/Zn SOD 蛋白の発現を示す。r は、内因
性のラットのCu/Zn SOD 蛋白で、h が導入したヒト変異
Cu/Zn SOD 蛋白を示す。

【図８】Tg ラットにおけるCu/Zn SOD 蛋白の発現の様
子を示す電気泳動の写真である。本図では Tg ラット
（R4）の各臓器におけるCu/Zn SOD 蛋白の発現を示す。
r は、内因性のラットのCu/Zn SOD 蛋白で、h が導入し
たヒト変異Cu/Zn SOD 蛋白を示す。

【図９】Tg ラット脊髄におけるCu/Zn SOD 活性の様子
を示す電気泳動の写真である。正常SDラットおよびTgラ
ットの脊髄蛋白中のCu/Zn SOD 活性を示す。r は、内因
性のラットのCu/Zn SOD 活性、h はコントロールに用い
た0.1, 0.5, 1.0 単位のヒト赤血球Cu/Zn SOD 活性を示
す。

【図１０】Tg ラット（24週令）腰髄の病理所見を写し
た生体組織の形態を示す写真である。図10a: 前角のニ
ューロンが消失し、アストロサイト、ミクログリアの増
加が見られた（HE染色、x4) 。図10b: 近位軸索内は腫
大しエオジン好性の封入体がみられる（矢印）。図10c:
神経細胞内にエオジン好性の封入体がみられる（矢
印）（7b, 7c; HE染色、x40)。図10d: 抗ユビキチン抗
体による免疫組織化学。封入体（矢印）はユビキチン陽
性であった（x40)。

【図１１】Tg ラット（24週令）腰髄の免疫組織化学
（１）の結果を示す生体組織の形態を示す写真である。
図11a: 腫大した軸索は（矢印）、抗リン酸化ニューロ
フィラメント抗体で斑状に染色された。一部の残存した
ニューロンが染色された（白抜き矢印）。図11b: 腫大
した軸索はユビキチン陽性であった (11a, 11b; x40)。

【図１２】Tg ラット（24週令）腰髄の免疫組織化学
（２）の結果を示す生体組織の形態を示す写真である。
図12a: 抗GFAP抗体による免疫組織化学。前角に肥大し
たアストロサイトの増生がみられた (x4) 。図12b: エ
オジン好性の封入体（矢印）がみられるアストロサイト
もあった（HE染色）。図12c: 封入体（矢印）は抗GFAP
抗体陰性であった（12b, 12c; x40)。

【図１３】ラット脊髄の生体組織の形態を示す写真であ
る。図13a: Tg ラット（24週令）脊髄前根を示す。有髄
線維密度は減少し、ミエリンオボイドが認められた。図
13b: コントロールラットの脊髄前根を示す。（13a, 13
b; トルイジンブルー染色、x40）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 笠井 憲雪 宮城県仙台市宮城野区小田原１−９−33− 103 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA03 CA09 CA20 DA02 FA02 GA12 GA18 GA25 HA13 HA14 4B065 AA91X AA93Y AB01 AC20 BA16 BA24 BD50 CA43 CA44 CA46 4C084 AA17 ZA222

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic latera
   l sclerosis; ALS)あるいはそれと実質的に同等な症状
   を発症することのできることを特徴とするトランスジェ
   ニックラットまたはその子孫。
2. 【請求項２】 運動ニューロン病を示していることを特
   徴とする、請求項１記載のトランスジェニックラットま
   たはその子孫。
3. 【請求項３】 四肢のいずれかに筋萎縮を伴う筋力低下
   症状を発症することを特徴とする、請求項１又は２記載
   のトランスジェニックラットまたはその子孫。
4. 【請求項４】 病理所見が、次のいずれかの少なくとも
   一を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか
   一記載のトランスジェニックラットまたはその子孫： (1) 病態の主座が脊髄前角にあり、大型の運動ニューロ
   ンの変性がみられること、 (2) 残存する前角運動ニューロンに細胞内封入体が認め
   られ、抗ユビキチン抗体に陽性であること、 (3) 腫大した軸索がみられ、抗リン酸化ニューロフィラ
   メント抗体及び／又は抗ユビキチン抗体に陽性であるこ
   と。
5. 【請求項５】 ヒト変異銅・亜鉛スーパーオキシドジス
   ムターゼ(copper/zinc superoxide dismutase; Cu/Zn S
   OD）遺伝子配列を有することを特徴とするトランスジェ
   ニックラットまたは当該遺伝子配列を有するその子孫。
6. 【請求項６】 胚形成初期において導入されたヒト変異
   Cu/Zn SOD 遺伝子配列を、生殖細胞または体細胞に有す
   る請求項１〜５のいずれか一記載のラットまたはその子
   孫。
7. 【請求項７】 外来の変異Cu/Zn SOD 遺伝子を組み込ん
   だDNA を有することを特徴とするラットまたは該DNA を
   有するその子孫。
8. 【請求項８】 ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子を含むトラン
   スジェニック動物作製用組換え遺伝子を全能性細胞に導
   入し、当該全能性細胞を仮親動物に移植し、前記仮親動
   物を飼育出産させて所望の形質が発現された仔動物であ
   る始祖動物を得る工程を含むことを特徴とする請求項１
   〜７のいずれか一記載のトランスジェニックラットの作
   製方法。
9. 【請求項９】 ラットで発現するタンパク質遺伝子由来
   のプロモーター領域と、ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子とを
   含むトランスジェニック動物作製用組換え遺伝子を全能
   性細胞に導入することを特徴とする請求項８記載の方
   法。
10. 【請求項１０】 ラットで発現するタンパク質遺伝子由
    来のプロモーター領域と、ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子と
    を含むトランスジェニックラット作製用組換え遺伝子。
11. 【請求項１１】 請求項１〜７のいずれか一記載のラッ
    トまたはその子孫を用いることを特徴とするALS の予防
    及び／又は治療薬のスクリーニング方法。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載のスクリーニング方法
    を用いて得られるALS の予防及び／又は治療活性を有す
    る化合物またはその塩。
13. 【請求項１３】 ヒト変異Cu/Zn SOD 遺伝子配列を有す
    ることを特徴とするラット胚幹細胞。
14. 【請求項１４】 請求項１〜７のいずれか一記載のラッ
    トまたはその子孫に由来することを特徴とするラット胚
    幹細胞。