KR20100088125A - 불활성화된 내인성 유전자좌를 갖는 트랜스제닉 닭 - Google Patents

불활성화된 내인성 유전자좌를 갖는 트랜스제닉 닭 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조류 PGC의 장기간 배양물으로부터 얻은 트랜스제닉 닭 및 연장된 PGC 배양물으로부터 유도된 트랜스제닉 새를 생산하는 기술에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에서, 이 PGC는 PGC의 DNA를 변형시키기 위해, 구체적으로 외인성 단백질을 코딩하는 이식유전자를 도입하기 위해 유전 구성체로 형질감염될 수 있다. 공지된 절차에 의해 숙주 조류 배아와 조합될 때, 이 변형 PGC는 트랜스제닉 자손을 생산하기 위해 생식선을 통해 전이된다. 본 발명은 PGC의 장기간 배양물을 포함하는 조성물 및 유전적으로 변형된 이로부터 유래하는 자손을 포함한다. 유전자 불활성화를 성취하기 위한 PGC로 도입된 유전자 변형은 게놈으로의 이식유전자의 무작위 통합, 인테그라제를 사용하여 도입된 게놈에 대한 부위 특이적 변화, 동형접합성 재조합에 의해 도입된 게놈에 대한 부위 특이적 변화, 및 Lox 부위 또는 부위 특이적 재조합에 대한 기질인 다른 서열에 인접한 DNA의 절단에 의한 게놈으로 도입된 통상적인 돌연변이를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.

Description

불활성화된 내인성 유전자좌를 갖는 트랜스제닉 닭{TRANSGENIC CHICKENS WITH AN INACTIVATED ENDOGENOUS GENE LOCUS}
트랜스제닉 동물은 예로서, 항체와 같은 가치있는 약학 제품의 지속적인 생산이 상당 진보할 수 있는 잠재력을 제공한다. 그러나, 트랜스제닉 동물을 생산하는 것은 오직 몇몇 종에 대해서만 극복이 된 상당한 기술적 장애를 포함한다. 외인성 단백질을 코딩하는 유전자 변형을 또다른 종의 DNA로 도입시킬 수 있는 능력은 각각의 종에 대해서 개발되어야 하는 몇가지 독특한 기술을 필요로 한다. 동물의 유전적 특징 및 신체적 특징을 변경시키는 한가지 접근법으로는 세포를 동물의 수혜자 배아 내로 도입하는 것이 있다. 이러한 세포는 수혜자 배아로부터 태어난 동물의 조직에 기여할 수 있고, 생성된 동물의 트랜스제닉 자손의 게놈에도 기여할 수 있는 능력을 갖는다.
특정 사례에서, 예로서, 단백질 또는 항체와 같은 외인성 산물을 코딩하는 DNA를 포함하는 이식유전자로 세포를 공학처리할 수 있다. 이식유전자는 단백질 생산에 대한 청사진을 포함하고, 세포를 수혜자 배아 내로 삽입함으로써 형성된 동물의 조직 내에서 단백질을 발현할 수 있도록 하는 충분한 코딩 요소 및 조절 요소를 포함한다. 몇몇 상황하에서는 모든 조직 유형에서 발현이 일어날 수 있도록 발현이 편재해 있는 것이 바람직하다. 그러나, 예로서, 가치있는 항체의 수집과 같이, 가치있는 단백질이 요구되는 대부분의 상황하에서는 발현이 발현된 단백질의 수집을 촉진시킬 수 있는 특정의 특이적인 조직 유형으로 제한되어야 한다. 예를 들면, 젓 중의 단백질 발현을 통해서는 단순히 젓를 수집하고 외인성 단백질을 분리시킴으로써 단백질을 용이하게 수집할 수 있다. 닭에서, 난백 중 활발한 항체 생산은 가치있는 단백질의 발현과 수집을 위해 관심이 가는 비히클을 제공한다. 추가로, 조직 특이 발현이 닭의 난관에 특이적인 경우, 상기 발현을 통해서는 인간 환자 치료에 사용되었을 때에 항체의 치료학적 유용성을 증가시키는 특정의 구체적이고 바람직한 화학적 특성을 갖는 항체가 생산된다. 따라서, 연구 및 상업적 개발에서 있어서 특히 관심이 가는 한 분야는 바람직한 화학적 특성을 갖는 단백질의 단리와 수집을 촉진시킬 수 있도록 난백 또는 난황 중에서 항체를 선택적으로 발현시킬 수 있는 유전공학 처리된 닭이 된다.
외인성 항체 생산의 경우, 조류의 생물학적 시스템은 효율적인 농장 재배, 신속한 성장, 및 경제적인 생산이라는 많은 이점을 제공한다. 추가로, 조류의 난은 항체의 대량 합성과 산물의 용이한 단리 및 수집, 이 두가지 측면 모두에서 이상적인 디자인을 제공한다. 추가로, 본 발명과 관련하여 하기에 기술하는 바와 같이, 예를 들면, 척추 동물, 식물, 또는 세균 세포 시스템과 비교하여 트랜스제닉 닭 발현 시스템이 갖는 이점은 쉽게 증명될 수 있고, 이는 다량의 항체 산물에 대해 유일의 유익한 화학적 특성을 갖도록 하는데 적용될 수 있다. 트랜스제닉 닭을 생성하고자 하는 목표는 다년간 과학자들에 의해 추가되어 왔다. 비록 그 목표가 예로서, 마우스, 소, 및 돼지와 같은 기타 다른 종에서 이루어지기는 하였지만, 트랜스제닉 동물의 DNA 내로 도입될 수 있는 이식유전자의 크기 및/또는 발현의 부족이라는 고유의 한계로 인해 난관을 겪은 레트로바이러스 기술이나 직접 주사 기술을 사용하지 않고서는 트랜스제닉 닭은 생성되지 못했다. 또한, 바이러스 벡터는 예를 들면, 상동성 재조합에 의해 제공되는 것과 같은, 게놈에 대한 부위 특이 변화를 필요로 하는 적용을 잘 따르지 못한다.
추가로, 몇몇 상황하에서 동물 그 자신의 내인성 유전자는 가치있는 단백질의 발현을 위해 특별히 디자인된 유전자 구성체의 도입으로부터 생성된 가치있는 단백질 생산을 방해할 수 있다. 그러한 상황하에서의 이상적인 해결 방안은 동물의 내인성 유전자를 불활성화시키는 것이 될 것이다. 불행하게도, 닭을 유전공학적으로 처리하는 것은 독특한 도전이 되기 때문에 내인성 유전자좌를 불활성화시키는 부위 특이 변형을 갖는 트랜스제닉 닭은 기술된 바 없었다. 또한 추가로, 부위 특이 유전자 불활성화의 도입으로 내인성 유전자 기능을 상실한 동물이 생성되고, 그러한 동물은 상보적이며 특이적인 유전자 변형이 그의 게놈 내로 도입되어 있는 다른 동물과 교배될 수 있다. 예를 들면, 특이 유전자가 결핍된 동물 패밀리가 확립될 수 있고, 이는 교배를 통해서 인간에 대한 특이 유전자를 함유하는 동물과 조합될 수 있다. 이러한 경우, 특이적인 동물 표현형 생산이나 내인성 유전자의 삽입에 의해 코딩되는 단백질의 생산을 위해 내인성 유전자 불활성화 뿐만 아니라, 게놈 변형도 도입된 동물 군집이 생성될 것이다. 바이러스 벡터를 통해서는 내인성 게놈을 부위 특이적으로 표적화할 수 없고, 통합 이벤트를 선택할 수 있는 능력도 가질 수 없기 때문에 현재는 그러한 동물이 존재하지 않는다. 따라서, 바이러스 벡터는 내인성 유전자좌를 활성화시킬 수 있는 기전을 제공하지 못한다.
거대 이식유전자가 세포의 게놈 내로 통합될 수 있게 하거나, 게놈에 부위 특이 변화를 도입할 수 있도록 하는데 있어서 세포 배양물이 충분히 안정적이라면, 표적 세포와, 이식유전자로서 사용된 특이 구성체에 따라 달라지는 수개의 상이한 기법에 의해 임의 단백질의 조직 특이 발현을 코딩하는 이식유전자는 트랜스제닉 유기체로 전이될 수 있다. 불활성화된 내인성 유전자를 갖는 유기체를 영속시키는데 동일 기법이 사용될 수 있다. 전 게놈은 세포 하이브리드화에 의해, 온전한 염색체는 마이크로셀에 의해, 서브염색체 분절은 염색체 매개 유전자 전이에 의해, 그리고 킬로베이스 범위의 DNA 단편은 DNA 매개 유전자 전이에 의해서 전이될 수 있다((문헌[Klobutcher, L.A. and F.H. Ruddle, Annu. Rev. Biochem., 50: 533-554, 1981]). 온전한 염색체는 마이크로셀 매개 염색체 전이(MMCT: microcell-mediated chromosome transfer)에 의해 전이될 수 있다(문헌[Fournier, R.E. and F.H. Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74: 319-323, 1977]). 외인성 유전자를 수반하는 임의의 상기와 같은 이식유전자 또는 유전자 불활성화에 관한 구체적인 디자인 또한 외인성 유전 물질, 임의의 유전자 불활성화가 갖는 성질, 및 동물에서 생성되는 표현형의 특징을 고려하여야 한다.
내인성 유전자좌를 불활성화시키거나, 조직 특이 발현을 할 수 있는 이식유전자의 삽입은 이식유전자가 주의깊에 디자인된 것이 아니라면 세포의 다능성을 위협할 수도 있다. 따라서, 적합한 세포주는 배양물 중에서 안정적이어야 하고, 유전자를 불활성화시키거나, 또는 원하는 경우, 조직 특이 및 고수준 발현을 위해 필요한 모든 요소들을 함유하는데 충분할 정도로 크고 복합적인 유전자 구성체로 세포가 형질감염되었을 때에도 다능성을 유지하여야 한다. 생성된 트랜스제닉 동물에서, 이식유전자는 임의로 이식유전자가 발현되도록 디자인된 개개의 특이 조직 유형에서 선택적으로 발현될 수 있다. 이식유전자의 유전 물질에 따라서 이식유전자는, 동물의 생존능이 저하되었거나, 생성된 단백질의 유익한 화학적 성질이 손상되었다면, 기타 다른 조직에서는 발현되지 않을 수 있다.
닭 원시 생식 세포는 11-15 단계의 배아로부터 단리된 후 몇시간 이내에 레트로바이러스 벡터를 사용함으로써 유전적으로 변형되었다(문헌[Vick et al., (1993) Proc. R. Soc. Lond. B 251, 179-182]). 그러나, 그 결과로 이루어진 변형은 무작위로 통합되어 있고, 이식유전자의 크기는 일반적으로 약 15 kb 미만, 보통은 10 kb 미만, 및 가장 보편적으로는 8 kb 미만으로 제한되며, 게놈에 대한 부위 특이 변화는 이러한 기술 사용으로는 형성될 수 없을 뿐만 아니라, 무작위적 통합을 제외한 부위 특이 변형을 확인하는데도 전이 세포는 선택될 수 없다. 15 kb 초과의 외인성 DNA를 배양된 조류 PGC의 게놈 내로 삽입하는 것을 필요로 하는 안정적인 유전자 변형에 관해서는 종래에 보고된 바가 없다.
장기 PGC 세포 배양물 중에 안정적으로 도입될 수 있는 임의의 DNA 이식유전자 또는 구성체의 크기 또는 부위 특이성에 관한 임의의 한계가 배양물 중의 PGC의 게놈을 가치있게 유전적으로 변형시킬 수 있는 능력에 대해 중요한 제약이 될 수 있으며, 결국 생식선을 통해 수혜자 배아의 자손으로까지 전이될 수 있는 유전자 변형의 유형을 제한할 수 있다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 불활성화 벡터 또는 외인성 DNA 서열을 트랜스제닉 닭의 게놈 내로 도입하는 것이 고도로 바람직한 유전자 변형이다. 그러한 트랜스제닉 닭을 다수 생성할 수 있다면, 다량의 가치있는 단백질이 상기 닭에서 발현될 수 있고, 난에서 수집될 수 있다. 조류의 난은 생물학적으로 활성인 단백질에 대하여 이상적인 저장소를 제공하고, 단백질이 단리될 수 있는 편리한 환경을 제공한다. 조류 동물은 또한 광범위한 트랜스제닉 기술에 대해 관심이 가는 후보물질이다. 그러나, 유전자 변형이 도입됨으로써 생식선으로 전이될 수 있도록 하는 배양된 세포 군집이 존재하지 않기 때문에 조류 종에 모든 포유동물 트랜스제닉 기법을 적용시켰을 때 성공을 이루지 못했다. 최근 논문을 통해서 Sang 등은 "PGC가 전이 이후에 발생 중에 있는 생식샘으로 이동할 수 있는 능력을 상실하지 않으면서 유전자 표적 이벤트를 확인하는데 필요한 장기간의 시간 동안 PGC가 배양물 중에서 유지될 수 있고, 증식할 수 있는 가능성은 없다(It is unlikely that PGCs can be maintained in culture and proliferate for the extended period necessary to identify gene targeting events without losing their ability to migrate to the developing gonad after transfer)"라고 언급한 바 있다(문헌[Prospects for Transgenesis in the Chick, Mechanisms of Development, 121, 1179-1186, (2004)]). 따라서, 현재까지는 유전적으로 형질감염된 PGC가 생성된 바 없고, 조류 PGC로 도입된 유전자 변형을 살아있는 성숙한 동물로 전이하는 것도 입증된 바 없다.
원시 생식 세포(PGC: primordial germ cell)는 정자와 난자의 전구체이며, 대부분의 동물에서 발생 초기 단계에 체성 조직으로부터 분리된다. 본 발명에 따라, 닭 PGC를 단리시키고, 배양하고, PGC의 생식선으로의 위탁을 유지시키면서 유전적으로 변형시킨다. 또한, PGC는 유도되어 배아 생식 세포(EGC: embryonic germ cell)로 분화되는데, 이는 PGC의 체성 조직으로의 위탁이라는 점에서 닭 배아 줄기 세포(ESC: chicken embryonic stem cell)와 유사하다. 이러한 PGC는 체성 조직과 생식선로 위탁되고, 닭에서 게놈의 유전자 변형에 대한 독특한 공급원을 제공한다.
트랜스제닉 동물, 특히 마우스 생산은 포유동물의 유전자 기능을 설명하는데 중요하였다. 전통적인 접근법은 이식유전자를 게놈 내로 무작위로 통합하거나, 또는 상동성 재조합에 의해서 이식유전자를 특이 유전자좌 내로 표적화하여 삽입하는 것이다.
이식유전자를 무작위로 삽입하는 것에는 2가지 단점이 있다. 첫번째이자 주된 단점은, 많은 유전자가 다양한 발생 단계에서 필수 기능을 제공하는 역할을 하며, 이러한 유전자의 전사를 생략하면 빈번하게는 배아가 사망한다는 점이다. 프로모터의 제어하에 조직 특이성 및 발생 단계별로 조절되는 유전자 발현을 부여하는 부위 특이 재조합효소, 예로서, Cre-LoxP 또는 Flp-FRT를 사용함으로써 배아 사망을 미연에 방지할 수 있다. 이러한 경우, 부위 특이 재조합을 사용함으로써 이산 세포에서 및/또는 다른 정상 동물과 같은 맥락에 있는 발생 단계 동안의 이산 시간에 유전자를 불활성화시킬 수 있다(조건부 유전자 변형이라고 명명됨). 예를 들면, Cre-LoxP 시스템을 사용하여 β 세포 중의 인슐린 수용체 유전자를 특이적으로 불활성화시킴으로써 2형 당뇨병에서의 인슐린 분비 결함과 유사한 인슐린 분비 결함을 형성할 수 있다(문헌[Kulkarni et al. 1999 Tissue-specific knockout of the insulin receptor in pancreatic beta cells creates an insulin secretory defect similar to that in type 2 diabetes. Cell 96:329-39]). 초기에는, DNA 폴리머라제 β의 무반응 대립유전자가 동형접합성이면 배아 치사가 발생하는 것으로 밝혀졌다. 항원 수용체 유전자 정렬을 위해 필요한 그의 가능한 요건을 분석하기 위해서 조건부 넉아웃 접근법을 사용하여 T 세포 중 DNA 폴리머라제 β를 결핍시켰다(문헌[Gu et al. 1994. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science 265:103-106]).
이식유전자의 무작위 삽입, 및 표적화된 삽입, 이 둘 모두는 트랜스제닉 동물에서 이식유전자로부터 양성 선택 카세트를 절단하지 못한다는 그의 무능력함으로 인해 난관을 겪었다. 선택 카세트가 존재하면 많은 문제가 일어날 수 있는데, 그 예로는 선택 카세트에 빈번하게 존재하는 강한 전사 조절 요소에 기인하는 인접한 유전자좌에서의 유전자 발현 파괴가 있다(문헌([Lerner et al. 1993 CD3 zeta/eta/theta locus is co linear with and transcribed antisense to the gene encoding the transcription factor Oct-1. J Immunol. 151:3152-62]; [Ohno et al. 1994 Targeted disruption of the CD3 eta locus causes high lethality in mice: modulation of Oct-1 transcription on the opposite strand. EMBO J.13:1157-65]). 조직 특이 프로모터의 제어하에 부위 특이 재조합효소를 사용함으로써 양성 선택 카세트를 제거할 수 있다.
Cre는 34 개의 염기쌍으로 이루어진 DNA 요소인 2 개의 LoxP 부위 사이의 재조합을 촉진시키는 재조합효소이다. 2 개의 LoxP 부위가 동일한 배향으로 게놈 내로 통합되면, Cre에 의해 촉매화되는 재조합은 개재 DNA를 절단한다. LoxP 부위는 무작위로 게놈 내로 삽입되기 이전에 이식유전자 내로 통합될 수 있거나, LoxP 부위는 표적 벡터의 사용으로 게놈내 정확한 위치로 삽입될 수 있다. 개재 DNA의 절단 후에, 인접한 LoxP 부위들은 단일의 LoxP 부위로 변환된다. Cre 절단 이후 잘 인식되지 못하는 산물을 생성하는 돌연변이체 LoxP 부위도 이용가능하다. 부위 특이 재조합효소 중 λ 인터그라제 수퍼패밀리의 또다른 구성원인 Flp 재조합효소는 Cre 재조합효소와 동일한 DNA 재조합 기전을 공유한다. Cre와 유사하게, Flp 재조합효소는 정의된, 34 개의 염기쌍으로 이루어진 표적 부위(FRT 부위) 2 개를 재조합한다. 개재 DNA의 절단 후에, 인접한 FRT 부위들은 또한 단일의 FRT 부위로 변환된다.
조건부 넉아웃의 용도 중 하나는 특정 조직 중 정확한 발생 단계에서 제거되는 치사 산물을 세포에서 발현시키는 것이다. 예를 들면, Grieshammer 등(문헌[Grieshammer et al. (1998 Muscle-specific cell ablation 조건부 upon Cre-mediated DNA recombination in transgenic mice leads to massive spinal and cranial motoneuron loss. Dev Biol. 197:234-47)])은 구체적으로 마우스의 골격근 발생을 연구하기 위해 근육 세포에서 디프테리아 독소 A 단편을 발현시키기 위하여 Cre-LoxP 시스템을 사용하였다. 시험관내 또는 생체내의 배아발생 중 후기 및/또는 성체 조직에서 유전자 변화가 정확하게 유도될 수 있도록 Cre-LoxP 시스템의 일시적인 제거를 부가하고자 하는 목적으로 리간드로 조절된 형태의 Cre 또한 개발되었다.
염색체 재배열이 유전병과 유산의 주요 원인이 되며, 이는 암 진행 및 유지와도 관련이 있다(문헌([Ramirez-Solis et al. 1995 Chromosome engineering in mice. Nature 378:720-4]; [Rabbitts et al. 2001 Mouse models of human chromosomal transposition and approaches to cancer therapy. Blood Cells Mol Dis. 27: 249-59])). 염색체 전좌는 대개 비정상적인 유전자 융합을 일으키고, 그 결과, 종양 특이 mRNA 및 단백질은 유전자 요법을 위해 관심이 가는 표적이 된다. 따라서, 부위 특이 재조합효소 사용에 의해 특이 브레이크포인트를 이용하여 염색체 재배열을 공학처리할 수 있는 능력을 사용함으로써 인간 질병에 대한 마우스 모델을 생산하게 되었다. 예를 들면, 급성 백혈병에 대한 모델을 만들기 위하여 마우스에서 인간 재배열 t(8:21)(q22; q22) 및 t(9:11)(p22q23)에 상응하는 전좌를 성공적으로 유도하였다(문헌([Buchholz et al. 2000 Alteration of Cre recombinase site specificity by substrate-linked protein evolution. Nat Biotechnol.19: 1047-52]; [Collins et al. 2000 Inter-chromosomal recombination of Mil and Af9 genes mediated by cre-LoxP in mouse development. EMBO Rep.1: 127-32])). 무작위 염색체 결실은 게놈 중 무작위 위치에 LoxP 부위를 삽입한 후, Cre 재조합효소를 발현시킴으로써 생성하였다(문헌[Zhu et al. 2007. Efficient generation of 무작위 염색체 결실, Biotechniques 42, 572-575]).
조건부 유전자 변형은 세포 계통을 지정하는 동안 유전자 발현을 조작할 수 있는 강력한 도구가 되어 왔고, 세포 운명에 관한 분석은 정상적인 발생 과정을 이해하는데 기여하였다. 예를 들면, 중뇌와 후뇌 협착에서 기원하는 인그레일드(engrailed) 2-발현 세포의 성체 운명을 결정하는데 있어서 Cre-LoxP 시스템은 마우스에서 계통 추적을 유전적으로 활성화시키는데 사용되어 왔다(문헌[Zinyk et al. 1998 Fate mapping of the mouse midbrain-hindbrain constriction using a site-specific recombination system. Curr Biol. 8: 665-8]). 이러한 접근법은 이종 교배된 2 마리의 마우스계를 포함하였다. 1 마리는 배아 중뇌와 후뇌 협착부에 발현될 수 있도록 지시하는 인그레일드-2(En-2) 게놈 조절 단편의 제어하에 Cre를 발현하는 Cre 재조합효소 마우스이고, 1 마리는 재조합이 일어났음을 "지시하고," 유전성 계통 마커로 형질전환시킴으로써 상기 재조합 이벤트의 영구적인 기록을 제공하는 이식유전자를 포함하는 지표/리포터 마우스이다. 지표 마우스계는 광범위하게 발현되는 닭 β 액틴 유전자로부터 유래된 조절 서열에 의해 유도되는 전사/번역-LoxP-중지 카세트의 LoxP-중지부를 갖는다. En2-Cre 마우스와 지표 마우스를 교배하면 이중 트랜스제닉은 각 이식유전자의 카피본 하나씩을 수반하게 된다. En2 조절 요소 하에 Cre를 발현한 세포에서만, 중지부를 절단하고, lacZ 발현을 허용하면서, 리포터 구성체의 LoxP 사이의 재조합이 이루어졌다. Cre 매개 절단는 세포 유전성이기 때문에, 마킹된 세포 및 그의 모든 자손은 심지어 Cre이 더이상 발현되지 않는 후에도 후기 단계에서 lacZ를 발현시켰다. 따라서, 성체 이중 트랜스제닉 동물의 뇌에서 LacZ에 대해 염색한 결과, 중뇌와 후뇌 협착 발생 중 일시적으로 Cre를 발현시키는 세포 모두가 자손인 것으로 밝혀졌다.
발명의 개요
본 발명은 트랜스제닉 닭 및 트랜스제닉 조류를 유전공학적으로 처리할 수 있는 기술, 및 표적화 구성체를 원시 생식 세포 내로 상동적으로 통합시킴으로써 생성된 불활성화된 내인성 유전자좌를 포함하는 트랜스제닉 닭을 생성하는데 사용되는, 장기 PGC 배양물을 포함한다. 이러한 트랜스제닉 닭은 내인성 유전자좌 중 적어도 일부의 결실로부터 유발되는 유전자 불활성화를 일으키는 상동성 재조합에 의해 닭 원시 생식 세포의 게놈 내로 통합된 이식유전자를 갖는다. 본 발명은 이식유전자 구성체, 상기 이식유전자(종종 넉아웃 벡터, 표적 벡터, 넉아웃 구성체 등으로도 언급됨)를 포함하는 원시 생식 세포의 안정적인 배양물을 포함하며, 여기서, 내인성 유전자 불활성화를 위해 디자인된 이식유전자는 재조합 이벤트가 달성될 수 있고, 형질감염된 세포를 선택하는데 충분한 시간 동안 배양물 중에서 유지된 원시 생식 세포의 게놈 내로 안정적으로 도입된다.
본 발명은 또한 그의 게놈이 내인성 유전자좌의 불활성화에 의해 변형된 것인(내인성 유전자 발현에 필요한 유전자 일부의 부위 특이 결실을 포함하나, 이에 한정되지 않음) 원시 생식 세포 및 생성된 트랜스제닉 닭을 포함한다. 상기 실시태양들 모두의 경우, 본 발명은 또한 내인성 게놈의 부위 특이 변형으로부터 생산된 것인, 생성된 트랜스제닉 닭을 포함한다. 본 발명은 또한 특정 적용에 있어서 항체의 치료학적 유용성을 향상시키는 유익한 화학적 특성을 갖는, 닭에서 생산된 항체에 관한 것이다. 닭에서 생산된 항체는 척추 동물, 식물, 또는 세균 세포 시스템에서 생산된 항체와 비교하였을 때 독특한 화학적 변형 패턴을 갖는 바, 독소를 표적 조직, 예로서, 종양에 결합시키고자 하는 목적으로 상기 닭에서 생산된 항체가 환자에게 투여되면 표적 조직은 증가된 치료학적 효능으로 치료된다. 일 실시태양에서, 외인성 단백질이 조직 특이적으로 발현될 수 있도록 하는 이식유전자를 삽입하는 것을 비롯한 유전자 변형을 조류 내로 도입하기 위해 특별히 디자인된 유전자 구성체를 사용하여 장기 PGC 배양물을 공학처리한다. 동일의 다능성 세포에서 불활성화된 유전자좌를 공학처리하든, 또는 불활성화된 내인성 유전자좌를 포함하는 트랜스제닉 닭의 이산 군집을 공학처리하든 이러한 공학처리 과정을 통해서 외인성 단백질의 발현을 촉진시키기 위하여 이식유전자가 삽입되어 있는 조류와 추후에 교배시키기 위한 목적으로, 불활성화된 내인성 유전자좌를 갖는 트랜스제닉 닭과 조합된, 단백질 발현을 코딩하는 외인선 DNA의 조합물을 수반하는 트랜스제닉 조류는 유일의 이익이 되는, 외인성 단백질을 발현하는 동물 군집을 제공한다.
불활성화된 내인성 유전자좌를 갖는 트랜스제닉 닭은 또한 유전자 발현 연구를 위해 가치있고, 선택된 내인성 유전자좌를 불활성화시킬 수 있는 능력없이는 이루어질 수 없는 독특한 유전자 기능 선택에 가치있는 동물 모델을 제공한다. 유사하게, 내인성 닭 유전자좌의 불활성화는 면역글로불린 유전자 재배열을 방해하고 내인성 항체 발현을 불활성화시키는, V, D, 또는 J 부위를 비롯한 내인성 면역글로불린 유전자좌의 특이 부위에서 이루어질 수 있다. 그 결과, 본 발명의 일 실시태양은 내인성 닭 면역글로불린 유전자좌의 선택된 부위에서 부위 특이 유전자 변형으로 발생되는 내인성 면역글로불린 유전자 발현, 및 내인성 면역글로불린 단백질 생산이 실질적으로 결핍된 트랜스제닉 닭을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 이식유전자는 내인성 면역글로불린 생산을 코딩하는 경쇄 및 중쇄, 둘 모두의 표적화된 불활성화를 위해 구성된다. 본 발명의 트랜스제닉 조류는 또한 난관에서 이식유전자 유래 항체를 발현시킬 수 있고, 항체는 난에 다량 축적된다. 바람직한 실시태양에서, 외인성 항체 단백질은 내인성 항체 생산이 결핍된 배경하에서 발현이 되는 인간 DNA 서열에 의해 코딩되는 바, 천연 인간 항체는 내인성 조류 항체 생산의 부재하에서 닭 난관에서 발현되고, 이로써, 오로지 인간 항체만을 난으로부터 수집할 수 있는 능력이 생기게 된다.
본 발명은 항체의 조직 특이 발현을 나타내는 조류 군집, 외인성 항체 발현을 할 수 있는 이식유전자 구성체, 닭에서 생산되고 특별히 정의된 화학적 특성을 갖는 항체의 단리된 조성물, 및 조류 생산, 항체 생산과 관련된 방법, 및 그의 인간에서의 용도를 포함한다. 본 발명은 장기 원시 세포 배양물 및 장기 원시 세포 배양물로부터 유래된 키메라 또는 트랜스제닉 조류를 생산하는 특별한 기법을 사용하고, 여기서, PGC의 게놈은 안정적으로 통합된, 외인성 단백질을 발현하는 이식유전자를 가지며, 이로써, 배양된 세포의 자손은 안정적으로 통합된 이식유전자를 포함하게 된다. 하기 기술되는 방법에 의해서 숙주 조류 배아에 도입되면, 상기 변형된 기증자 세포는 생성된 동물의 특이성을 갖는 선택된 체성 조직으로 이식유전자를 발현하는 조류를 생산하게 된다.
본 발명은 또한 트랜스제닉 닭에서 발현되고, 척추 동물, 식물, 또는 세균 세포 시스템과 비교하여 특정의 바람직한 화학적 특성을 갖는 외인성 단백질의 조성물을 포함한다. 구체적으로, 이러한 단백질, 특히 항체는 농도가 감소된 푸코스, 갈락토스, N 아세틸 뉴라민산, N-글리코릴뉴라민산과, 농도가 상승된 만노스를 갖는다. 이러한 특성 중 일부 또는 그 전부를 갖는 항체는 인간에 투여되면 증가된 치료학적 유용성을 보인다. 구체적으로, 이러한 항체 조성물은 향상된 항체 의존형 세포 독성(ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity)을 보인다. 따라서, 본 발명의 방법은 트랜스제닉 닭에서 항체를 발현시킴으로써 항체 조성물의 치료학적 유용성이 ADCC 효과에 기초하였을 때, 향상될 수 있도록 하기 위해 트랜스제닉 닭을 사용하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 외인성 항체가 난백 중에 정의된 정량으로 농축될 수 있도록 본원에서 정의된 유익한 화학적 성질을 갖는 외인성 항체를 난관 조직에서 발현시키는 트랜스제닉 닭을 포함한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 외인성 단백질은 트랜스제닉 조류의 게놈 내로 도입된 이식유전자 구성체에 의해 코딩된 인간 서열 모노클로날 항체이다. 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하는 인간 모노클로날 항체는 난관에서 발현될 수 있도록 특별히 구성되고, 적절한 프로모터와 조직 특이 발현을 촉진시키는 조절 서열을 포함하는 이식유전자 내에 포함되어 있다.
본 발명은 또한 장기간 배양된 조류의 원시 생식 세포(PGC) 배양물, 및 장기배양물의 생성에 의해 가능해지는 수개의 추가적인 발명에 관한 것으로, 여기서, 조류 PGC는 상기 배양물 중에서 증식하게 되고, 여기서, PGC 배양물은 다회에 걸친 계대접종을 통해 확장됨으로써 배양물의 생존능은 40 일, 60 일, 80 일, 100 일 이상으로 연장될 수 있다. 본 발명의 PGC는 장기 배양물 중에서 증식하게 되고, 수혜자 배아로 주사되었을 때에는 생식선 키메라를 생산하게 된다.
본 발명은 또한 원하는 결과를 얻기 위해 유전 물질을 PGC의 게놈 내로 도입하는 것에 관한 것이다. 일 실시태양에서, 확실하게 이식유전자 산물이 생산될 수 있도록 하기 위해 주변에 HS4 요소가 있는 유전자 구성체가 본 발명의 PGC 내로 도입될 수 있다. 다른 실시태양에서, 닭 게놈의 반복 요소 내로의 구성체 삽입을 지시하는 인터그라제를 사용함으로써 유전자 변형이 실행될 수 있다. 다른 실시태양에서, 선별 가능한 마커를 코딩하는 DNA는 유전자 산물이 생산되지 못하도록 하기 위해 닭 게놈의 부위 내로 삽입될 수 있다.
조건부 돌연변이가 닭 세포에서 생성된 바는 있지만, Cre을 발현하는 트랜스제닉 세포주가 제조된 바 있는 마우스와는 달리, 편재성이거나, 조직 특이성이거나, 발생 단계별로 조절되는 프로모터의 제어하에 Cre 재조합효소를 발현하는 트랜스제닉 닭 세포주는 제조된 바 없다. 뮤린 세포에서, Cre 재조합효소(문헌[Araki et al. 1997 Efficiency of recombination by Cre transient expression in embryonic stem cells: comparison of various promoters. J Biochem 122:977-82])) 및 세포 투과성 Cre 재조합효소(문헌[Jo et al. 2001 Epigenetic regulation of gene structure and function with a cell-permeable Cre recombinase. Nat Biotechnol. 19:929-33])의 일시적인 발현은 LoxP 부위 사이의 DNA를 절단하는데 사용되어 왔다. 그러나, 닭 DT40 세포주에서는 Cre 재조합효소가 일시적으로 발현된 경우에도 LoxP 부위 사이의 DNA는 제거될 수 없었다(문헌[Fukagawa et al. 1999 The chicken HPRT gene: a counter selectable marker for the DT40 cell line. Nucleic Acids Research 27, 1966-1969]). 이후, Cre 이식유전자를 DT40의 게놈 내로 도입시킴으로써 LoxP 및/또는 돌연변이체 LoxP 부위 사이의 DNA 서열을 절단할 수 있었다(문헌([Fukagawa et al. 1999 The chicken HPRT gene: a counter selectable marker for the DT40 cell line. Nucleic Acids Research 27, 1966-1969]; [Arakawa et al. 2001 Mutant LoxP vectors for selectable marker recycle and conditional knockouts BMC biotechnology 1, 7-14]; [Dhar et al. 2001 DNA repair studies: experimental evidence in support of chicken DT40 cell line as a unique model. J. Environ Pathol Toxicol Oncol 20, 273-83]; [Kanayama et al, 2005 Reversible switching of immunoglobulin hypermutation machinery in a chicken B cell line. Biochem. Biophys. Res. Commun. 327, 70-75])).
닭에서 조건부 돌연변이를 제조할 수 있는 능력은 도움이 될 수 있다. 예를 들면, LoxP 부위가 측면에 위치하는 중지 코돈이 존재하면 침묵화되는 편재성 프로모터의 제어하에 아폽토시스를 유도하는 유전자를 사용하는 배아 줄기 세포로부터 실질적으로 유래된 닭을 생산할 수 있다. 이러한 닭 계통을, 투명 구역에서 발현되는 프로모터의 제어하에 Cre 재조합효소를 코딩하는 유전자를 수반하는 조류 계통과 교배하면 배아는 발생하지 못할 것이다. 아폽토시스를 유도하는 유전자의 발현도 동시에 함께 일어나는 배아로 배아 줄기 세포를 주사하면, 배아는 실질적으로 배아 줄기 세포로부터 유래될 수 있다.
다른 적용에서, 선별 가능한 마커를 코딩하는 서열을 포함하는 이식유전자는 LoxP 부위 측면에 위치할 수 있다. 이러한 이식유전자를 수반하는 트랜스제닉 조류를, 생식선에서 발현되는 프로모터의 제어하에 Cre 재조합효소를 발현하는 조류와 교배시킬 수 있다. 이러한 교배로부터 생산된 조류는 선별 가능한 마커가 절단된 이후에 부화될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1a: PGC는 54 일 동안 배양물 중에서 유지되었다. 세포는 비부착 상태이고, 둥근 형태를 유지하였다는 것에 주목한다. 화살표 기호는 상기 배양물 중에서 육안으로 볼 수 있는 수개의 분열 세포를 표시한다.
도 1b: 적어도 136 일 동안 배양물 중에서 유지시켰을 때, 장기 PGC 세포 배양물은 안정적인 것으로 나타났다. 이러한 세포를 방사선 조사 처리된 STO 세포의 영양 세포층 상에서 배양하였다.
도 2: 생식 세포 마커 CVH(Vasa) 및 Dazl의 RT-PCR에 의해 측정된 유전자 발현. 세포를 32 일 동안 배양물 중에서 배양하였다. 레인 1은 분취량의 PGC 중 CVH 및 Dazl, 둘 모두가 발현되었음을 나타낸다. 레인 2의 두번째 시료는 액틴 부재하에서 측정된 바, 충분한 mRNA를 포함하지 않았다. CES 세포 또한 분석하였다; 액틴은 발현되었지만, cES 세포는 CVH를 발현시키지 못했고, Dazl은 단지 약하게만 발현되었다.
도 3: 166 일 동안 배양물 중에서 유지된 13번 및 16번 PGC 배양물 시료의 웨스턴 분석. 정소를 양성 대조군으로서 사용하였고, 간을 음성 대조군으로서 사용하였다. 토끼 항닭 CVH IgG를 1차 항체로서 사용하였다.
도 4: 염색체 말단의 반복 증식 프로토콜(TRAP: Telomeric Repeat Amplification Protocol) 분석. 2 개의 상이한 PGC 세포주(13번 세포주 및 16번 세포주)의 상이한 세포 추출액 희석액을 146 일 동안 배양물 중에서 유지시켰다. 양성 대조군은 형질전환된 인간 신장 세포주 293으로 구성되었고, 음성 대조군은 어떤 주형도 첨가되지 않은 용해 완충액이었다. PGC와 양성 대조군 레인에서, 반복 서열이 육안으로 관찰되었는데, 이는 텔로머라제가 존재한다는 것을 시사하는 것이다.
도 5a: PGC로부터 유래된 cEG 세포는 배양물 중에서 유지되었다. 도 5b: 닭 배아 줄기 세포. 두가지 세포 유형 모두에서 작은 세포, 큰 핵(단회색) 및 뚜렷이 나타나는 핵소체에 주목한다.
도 6: 원시 생식 세포(PGC) 세포주 중 cx-neo 이식유전자의 서던 분석.
도 7: 치킨 바사 상동체(CVH: chicken vasa homologue) 및 1B3에 대한 항체로 염색된 DT40 세포(음성 대조군 군집), EG 세포, ES 세포 및 PGC의 FACS 분석. DT40, ES 및 EG 세포는 두 마커 모두에 대하여 음성인 반면, 대다수의 PGC는 CVH 및 1B3, 둘 모두에 대해 염색되었다. 사용된 세포는 PGC 102; ES 439 및 EG 455였다.
도 8: 2 개의 원시 생식 세포 PGC 세포주 중 HS4-β-액틴-neo 이식유전자의 서던 분석.
도 9: 원시 생식 세포(PGC) 세포주 TP103 중 HS4 베타-액틴-eGFP-베타-액틴-puro 이식유전자의 서던 분석. 플라스미드 대조군 DNA를 NotI를 사용하여 선형화시켰다. DNA를 KpnI로 분해하여 내부 단편을 유리시켰다. TP103 및 플라스미드, 둘 모두에서, 같은 크기의 단편이 유리되었다. TP103의 게놈 DNA를 NcoI, MfeI, 및 SphI로 분해하였다면 분해된 플라스미드 DNA의 상응하는 레인에 있는 것보다 더 큰 띠가 출현하여야 한다. MfeI로 분해된 TP103 게놈 DNA의 레인에서는 어떤 띠도 관찰되지 않았는데, 이는 상기 띠가 너무 크다는 것이 이유가 될 수 있다. NcoI 및 SphI 분해물을 나타내는 레인에서는 플라스미드 DNA에서 유리된 단편보다 실질적으로 더 큰 단편이 TP103 게놈 DNA에서 유리되었는데, 이는 이식유전자가 TP103 세포주의 게놈 내로 도입되었음을 시사하는 것이다.
도 10: 염색체 모두가 이배체라는 것을 보여주는 G-09의 핵형. GGA 2의 하나의 카피본에서는 대다수의 p-암이 결실되어 있거나, 또다른 염색체로 전위되어 있다. CGA 2의 또다른 카피본은 정상이다. 세포는 ZZ(수컷)이다.
도 11: DAPI로 염색된, 발생 18 일째의 정소 절편. GFP 양성 세포가 정세관 내에 위치한다는 것을 육안으로 뚜렷이 볼 수 있었다.
도 12: DAPI로 염색된 패널은 E18 정소의 정세관을 통해 본 절편을 나타낸다. GFP 발현 세포는 정세관 내에 위치하였고, 항CVH 항체로 염색되었다.
도 13: β-액틴-GFP 이식유전자로 안정적으로 형질감염된 PGC를 수반하는 키메라로부터의, X단계(EG&K) 내지 34 단계(H&H)로 발생된 트랜스제닉 자손. 이러한 사진에서도 제시된 바와 같이, 조직 모두 GFP 발현을 보였다.
도 14. 조직학적 검사를 위해 제조된 β-액틴-GFP 이식유전자로 안정적으로 형질감염된 PGC를 수반하는 키메라로부터 유래된 조직. 청색의 DAPI 염색은 핵이 존재한다는 것을 나타내는 것이고, 녹색 형광은 모든 조직이 GFP 이식유전자를 발현시킨다는 것을 입증하는 것이다.
도 15: 클론에 의해 유래된 것인, 형질감염된 PGC 세포주가 키메라 닭의 생식선에 기여할 수 있으며, EG 세포로 분화될 수 있다는 것을 보여주는 서던 블롯 분석. 상단 패널: 이식유전자 삽입의 내부(KpnI) 및 연접 단편(NcoI, AflII)을 검출하기 위하여 HS4 b액틴-eGFP-b액틴-puro 구성체로 형질감염된 PGC로부터의 게놈 DNA, 형질감염된 PGC를 사용하여 제조된 키메라 수탉으로부터 유래된 3 개의 배아, 및 형질감염된 PGC로부터 유래된 EG 세포를 제한효소로 분해하였다. 분해된 DNA를 0.7% 아가로스 겔 상에서 분리하고, 나일론 막 상에서 블롯팅하고, 방사선 표지된 eGFP 서열로 프로빙하였다. 하이브리드화 단편의 크기는 PGC, EG 세포, 및 녹색 형광을 나타내는 2 개의 배아(GFP+ 배아)에서 동일하였다. 세번째의, 비형광성 배아(WT 배아)는 어떤 하이브리드화도 나타내지 않았다. 하단 패널: 구성체 개략도를 나타내는데, 여기서, 제한 부위의 위치가 표시되어 있고, 예측되는 제한 단편의 크기도 하단에 제시되어 있다. 2 개의 KpnI 부위가 존재하는데, 이를 통해 5.3 kb 단편이 형성되었다. NcoI 및 AflII는 구성체 내에서 1번 절단을 실행하는데, 이로써, 관찰되는 제한 단편은 삽입 부위의 측면에 위치하는 게놈 DNA와 구성체를 연결하는 연접 단편이다.
도 16a. 본 연구에서 사용되는 무작위 통합 구성체에 대한 다이어그램. 2가지 기본 유형의 구성체가 사용되었다: 강한 프로모터에 의해 유도되는 선별 가능한 마커 카세트(약물 내성 마커 및 EGFP), 및 두 세트의 HS4 절연체가 측면에 위치하는 유사 구성체. 사용된 프로모터는 마우스 PGK, 닭 β-액틴, β-액틴 + CMV 인핸서(CAG) 또는 ERNI였다. 구성체는 하기와 같았다: neo 또는 puro 내성 유전자의 발현을 유도하는 프로모터로 구성된 약물 선별 가능한 마커 카세트(첫번째줄); CAG-EGFP 유전자의 첨가(두번째줄); 절연 처리된 약물 선별 가능한 마커만 단독(세번째줄); EGFP 유전자가 첨가된, 동일의 절연 처리된 선별 가능한 마커 카세트(네번째줄); 및 선별 가능한 마커 측면에 위치하는 LoxP 부위 및 관심 있는 전매 유전자(별표와 같이 박스로 표시)를 사용한 CAG-EGFP CAG-neo 구성. NotI를 사용하여 구성체를 선형화시킨 후, 형질감염을 수행하여, 제시된 것과 같은 벡터 형상을 얻었다.
도 16a. 본 연구에서 사용되는 인터그라제 구성체에 대한 다이어그램. attB 부위가 상기 HS4-β-액틴-puro 구성체에 첨가되어 있는 attB 함유 플라스미드는 좌측에 있다. CAG 프로모터로부터 세포에서 인터그라제를 발현시키는데 사용된 플라스미드는 우측에 있다. 양 플라스미드 모두 환형 DNA로서 형질감염되었다.
도 17. 형질감염된 PGC로부터 수득한 attL 서열과 attB의 정렬. attB 플라스미드와, 인터그라제 매개 형질감염으로부터 유래된 PGC 클론 중 게놈 서열 사이의 연접부를 나타낸다. 첫번째 줄은 야생형 attB 부위이며, 정상의 재조합 교차점인 중심 TTG는 밑줄로 표시되어 있다. PGC 중 인터그라제 매개 삽입으로부터의 attL 서열을 그 아래 나타낸다. 플라스미드 상의 attB와 게놈 중의 위(pseudo) attP 부위 사이의 어느 위치에서 스플라이싱이 일어났는지를 측정하기 위하여 PGC 서열을 attB와 비교하였다. PGC 서열 중, 플라스미드가 기증한 attB 서열은 소문자로 표기되어 있고, 게놈 위 attP 서열은 굵은 대문자로 표기되어 있다.
도 18a. PGC 삽입 부위로부터의 PO41 유사 반복부와 PO41 공통 서열의 정렬. PO41 유사 반복부 내로 삽입된 것인, 모든 클론으로부터의 PGC 측면 서열을 서로서로, 그리고 PO41 공통 서열과 함께 정렬하였다. 맨 처음 21 개의 뉴클레오티드는 벡터가 기증한 attB 서열이고(정렬 상단에 표시), 그 다음은 각 클론으로부터의 게놈 측면 서열이 기증한 것이다. 적어도 서열의 절단 이상을 공유하는 뉴클레오티드는 검은색 박스로 표시되어 있다.
도 18b. attP와 PO41 서열의 서열. 100 bp의 attP 부위를 100 bp의 PO41, 또는 41 bp에 대한 대략 2.5 개의 카피본으로 이루어진 반복부와 함께 정렬하였다. attP 중 중심의 교차 영역인 TTG는 윗줄 표시되어 있다.
도 19. 닭 IgL 유전자의 표적화.
도 20a. 맨 위쪽 줄에 있는 것은 닭 IgL 유전자인 IgL pKO5에 대한 표적화 벡터의 다이어그램이다. 이는 IgL 유전자의 2.3 kb J-C 부위를, HS4 절연체가 측면에 위치하는 3.1 kb HS4-ERNI-puro 선별 가능한 마커로 대체하기 위해 디자인된 것이다. 두 상동성 암의 길이는 2.3 kb 및 6.3 kb이다. 3' 말단의 β-액틴-EGFP 유전자를 통해 녹색 형광에 대한 puro-내성 클론을 스크리닝할 수 있고, 이로써 표적화된 클론을 강화시킬 수 있다. 말단의 점선 표시는 pKO 벡터 골격이다(Stratagene). 중간 줄에 있는 것은 IgL 유전자의 생식선 입체형태의 야생형 대립유전자에 관한 다이어그램(단일의 가변(V), 연결(J) 및 불변(C) 부위 유전자 포함)이다. 표적화된 클론의 서던 분석에 사용되는 제한 부위가 제시되어 있고(S, SacI; B, BstEII), 야생형 단편 크기는 그 하단에 이중 화살표 표시로 제시되어 있다. 맨 아래쪽 줄에 있는 것은 J 및 C 부위가 결실되어 있고, HS4-ERNI-puro로 대체되어 있는, 돌연변이체 대립유전자의 구조이다. 제한 지도가 제시되어 있는데, 돌연변이체 단편 크기는 그 하단에 제시되어 있다. 서던 분석법에 사용된 프로브는 표적화 벡터 외부 양쪽에 있으며, 그의 위치도 표시되어 있다. 스케일 막대 = 1 kb.
도 20b. 클론 4 개의 서던 블롯 분석. 4 개의 퓨로마이신-내성 클론을 분석하였는데, 이중 2 개는 녹색을 띠지 않았고(클론 1 및 2), 이중 둘은 녹색을 띠었다(클론 3 및 4). 좌측 패널에서, PGC 클론으로부터의 게놈 DNA를 SacI로 분해하고, 프로브 A와 하이브리드화시켜 IgL 유전자 5'측의 표적화를 분석하였다. 우측 패널에서, DNA를 BstEII로 분해하고, IgL 유전자 3'측의 표적화를 위해서 프로브 B와 하이브리드화시켰다. 클론 2가 이형접합성의 표적화된 클론에 대하여 예측된 크기를 갖는 단편으로 나타났다.
도 21. IgL 넉아웃을 수반하는 PGC로 제조된 GO 수탉으로부터 유래된 정액 중 면역글로불린 경쇄 유전자의 불활성화에 대한 마커인 ERNI-puro의 PCR. IgL 넉아웃 대립유전자에 존재하는 ERNI-puro 선별 가능한 마커에 대해 실시되는 PCR에서 정맥 시료로부터 제조된 10 ng의 게놈 DNA를 사용하였다. 대조군으로부터 내인성 닭 β-액틴 유전자에 대한 프라이머도 포함하였다. ERNI-puro PCR에 대한 양성 대조군으로서, IgL 넉아웃 대립유전자를 갖는 PGC를 사용하였다.
도 22: BN 조류에서의 ALDH3A2 발현. 상단에 있는 패널은 2 개의 동형접합성 BN 조류(BN/BN), 1 개의 이형접합성 BN 조류(BN/+) 및 1 개의 야생형 조류(+/+)로부터 단리된 RNA 상에서 실시된 ALDH3A2에 대한 RT-PCR을 보여준다. 또한, RT-반응에 대한 음성 대조군(-RT-대조군), 양성 게놈 대조군 및 PCR 반응에 대한 2 개의 음성 대조군(-대조군 PCR)도 제시되어 있다. 544 bp 및 680 bp 띠는 각각 엑손 5와 엑손 6 사이에 스플라이싱되지 않은 인트론을 포함하지 않는 알데히드 데하이드로게나제, 및 그를 포함하는 알데히드 데하이드로게나제의 mRNA가 존재한다는 것을 나타낸다. 하단에 있는 패널에서 597 bp 띠는 모든 시료 중에 RNA가 존재한다는 것을 확인시켜준다. RT-PCR을 통해서 ADH가 이형접합성 BN 조류에서는 발현되지만, 동형접합성 BN 조류에서는 발현되지 못한다는 것으로 나타났고, 이는 이식유전자 삽입으로 상기 유전자의 전사가 중지되었다는 것을 시사한다.
도 23. 알데히드 데하이드로게나제 3 패밀리 구성원 A2 전사체에서 야생형 대립유전자로부터 유래된 RT-PCR 산물의 서열. 산물 A 및 B는 각각 엑손 5와 6 사이에 존재하는 136 bp의 스플라이싱되지 않은 인트론을 포함하지 않는 전사체 및 그를 포함하는 전사체로부터 유래된 것이다.
도 24: UbC-LoxP-중지-LoxP-리퍼(Reaper) 이식유전자를 수반하는 닭. A. 3 개의 UbC-LoxP-중지-LoxP-리퍼 트랜스제닉 세포주(6-03, 6-51 및 9-51)의 서던 블롯 분석. G1 조류 및 UbC-LoxP-중지-LoxP-리퍼 벡터로부터의 게놈 DNA 시료를 SpHI 또는 BclI로 분해하였다. 분해된 DNA를 0.7% 아가로스 겔 상에서 분리하고, 나일론 막으로 블롯팅하고, 방사선 표지된 리퍼 특이 프로브와 하이브리드화시켜 연접 단편을 확인하였다. 하이브리드화 단편의 크기는 게놈 DNA에 대하여 벡터보다 더 컸고, 이는 이식유전자가 통합되어 있다는 것을 시사하는 것이다. B. UbC-LoxP-중지-LoxP-리퍼 구성체를 나타내는 개략도. 이식유전자는 UbC-프로모터 및 LoxP-중지-LoxP-리퍼 이식유전자로 구성되어 있다. SV40 폴리아데닐화 신호(SV40) 및 블라스티시딘 내성 카세트(bsd)를 UbC-LoxP-중지-LoxP-리퍼 이식유전자의 3' 프라임에 삽입하였다. 5' 및 3' LTR이 구성체 측면에 위치하였다. 제한 부위의 위치가 표시되어 있고, 예측되는 제한 크기도 제시되어 있다.
도 25: pLenti-ERNI-Cre 이식유전자를 수반하는 닭. 도 25a. 8 개의 ERNI-Cre 세포주의 서던 블롯 분석. 게놈 DNA 시료를 BglII로 분해하였다. 분해된 DNA를 0.7% 아가로스 겔 상에서 분리하고, 나일론 막으로 블롯팅하고, 방사선 표지된 Cre로 프로빙하였다. 예측되는 하이브리드화 단편의 크기는 4.6 kb였다. 도 25b. ERNI-Cre 이식유전자를 나타내는 개략도. 이식유전자는 ERNI 프로모터 및 Cre 이식유전자로 구성되어 있다. SV40 폴리아데닐화 신호(SV40) 및 블라스티시딘 내성 카세트(bsd)를 ERNI-Cre 이식유전자의 3' 프라임에 삽입하였다. 5' 및 3' LTR이 구성체 측면에 위치하였다. BglII 제한 부위의 위치가 표시되어 있고, 예측되는 제한 크기도 제시되어 있다.
도 26: Doc-2 세포주로부터의 GFP 양성 및 GFP 음성 세포의 FACS 분류. PGC에서 Cre 재조합효소를 발현하는 ERNI-Cre 이식유전자를 포함하는 환형 플라스미드로 Doc-2 세포주를 형질감염시킴으로써 두가지 부류의 세포를 생성하였다. GFP 음성 세포는 CX-eGFP 유전자를 수반하는 도킹 부위 벡터 상의 LoxP 부위 사이에 존재하는 서열을 절단함으로써 얻어진 결과물이다.
도 27: Doc-1 PGC 세포주 중 10,652 bp의 이식유전자 통합을 보이는 2 마리의 병아리, 및 닭에 관한 서던 분석. DOC1 PGC 세포주(P로 마킹된 레인), 및 DOC1 PGC로 제조된 GO 키메라를 교배시킴으로써 유래된 2 마리의 병아리(C1 및 C2로 마킹된 레인)로부터의 게놈 DNA를 BglII 또는 EcoRI로 분해하였다. 분해물을 아가로스 겔 상에서 분별하고, 나일론 막으로 옮기고, 방사선 표지된 EGFP 서열과 하이브리드화시켰다. 본 분석을 통해서 벡터 통합 부위에서 측면에 위치하는 게놈 서열에 연결된 도킹 부위 벡터를 포함하는 연접 단편을 검출한다. 이러한 연접 단편의 크기는 통합 부위에 따라 다르며, PGC에서 각 이식유전자 삽입 이벤트에 대한 진단제가 된다. 이러한 경우, BglII 단편은 대략 12 kb이고, EcoRI 단편은 12 kb보다 더 크다. 단편 크기는 PGC 및 그로부터 유래된 병아리에서 동일하였는데, 이는 상기 병아리들이 DOC1 삽입을 수반하는 PGC로부터 유래되었다는 것을 보여주는 것이다.
도 28: 10 마리의 상이한 pLenti-ERNI-Cre 트랜스제닉 닭 계통에 의한 리퍼 이식유전자의 Cre 매개 재조합에 대하여 실시된 서던 블롯 분석. 도 28a. Cre 이식유전자의 카피본 하나와, LoxP 이식유전자의 카피본 하나를 수반하는 이중 트랜스제닉 배아로부터 유래된 뇌(b) 및 근육(m)으로부터 단리된 DNA에 대한 서던 블롯 분석. 게놈 DNA를 SacI로 분해하였다. 분해된 DNA를 0.7% 아가로스 겔 상에서 분리하고, 나일론 막으로 블롯팅하고, 렌티바이러스 벡터 골격(블라스티시딘 유전자 및 SV40 서열)의 일부로 구성된 프로브와 하이브리드화시켰다. 상기 프로브는 전장의 LoxP-리퍼 이식유전자와 재조합된 LoxP-리퍼 이식유전자, 둘 모두에 동등하게 하이브리드화한다. 전장(재조합되지 않은 것)의 이식유전자 대 재조합된 이식유전자의 띠 강도비가 Cre 세포주의 활성을 나타낸다. 도 28b. LoxP-리퍼 이식유전자의 Cre 매개 재조합을 나타내는 개략도. 전장 LoxP-리퍼 이식유전자는 동일한 배향으로 LoxP 부위가 측면에 위치하는 1.4 kb의 서열(이는 중지 카세트로 명명됨)을 포함한다. 두 LoxP 부위 사이의 재조합을 통해 염색체로부터 1.4 kb 개재 서열이 절단되고, 단일의 LoxP 부위만이 남게 된다. 절단 후, 재조합된 LoxP-리퍼 이식유전자의 크기는 1.4 kb로 축소된다. 프로브와 SacI 제한 부위의 위치가 표시되어 있고, 예측되는 제한 크기도 제시되어 있다.
도 29: Cre4 세포주에 의한 3 개의 상이한 리퍼 LoxP 카세트 이식유전자(6-03, 6-51 및 9-51)의 재조합. 도 29a: 3 개의 상이한 LoxP-리퍼 세포주(6-03, 6-51 및 9-51)에 대한, LoxP-리퍼 이식유전자의 카피본 하나만을 수반하는 트랜스제닉 배아(R), 또는 Cre4 이식유전자의 카피본 하나와 LoxP-리퍼 이식유전자의 카피본 하나를 수반하는 이중 트랜스제닉 배아(C+R)의 서던 블롯 분석. 게놈 DNA를 SacI로 분해하였다. 분해된 DNA를 0.7% 아가로스 겔 상에서 분리하고, 나일론 막으로 블롯팅하고, 리퍼 유전자 및 렌티바이러스 벡터 골격(블라스티시딘 유전자 및 SV40 서열)의 일부로 구성된 프로브와 하이브리드화시켰다. 예측되는 하이브리드화 단편의 크기는 전장(재조합되지 않은) LoxP-리퍼 단편의 경우 2.8 kb였고, 재조합된 LoxP-리퍼 단편의 경우에는 1.4 kb였다. 도 29b. LoxP-리퍼 이식유전자의 Cre 매개 재조합을 나타내는 개략도. 전장 LoxP-리퍼 이식유전자는 동일한 배향으로 LoxP 부위가 측면에 위치하는 1.4 kb의 서열(이는 중지 카세트로 명명됨)을 포함한다. 두 LoxP 부위 사이의 재조합을 통해 염색체로부터 1.4 kb 개재 서열이 절단되고, 단일의 LoxP 부위만이 남게 된다. 절단 후, 재조합된 LoxP-리퍼 이식유전자의 크기는 1.4 kb로 축소된다. 프로브와 SacI 제한 부위의 위치가 표시되어 있고, 예측되는 제한 크기도 제시되어 있다.
도 30: 절단되지 않은 GFP 양성 Doc 2 세포주(레인 1) 및 cx-GFP-cx-neo 서열이 결실된 Doc 2 세포(레인 2)에 대한 서던 분석. 세포를 녹색 형광 발현에 대하여 FACS 분석법으로 분류하였다. 2 개의 세포 군집으로부터의 게놈 DNA를 제조하고, HindIII 제한 효소로 분해하고, DNA를 퓨로마이신 내성 유전자로부터의 방사선 표지된 서열과 하이브리드화시켰다. 5521 bp의 예측 단편이 GFP 양성(절단되지 않은 세포) 세포에 존재하였고, 1262 bp의 예측 단편이 절단된 세포에 존재하였다. 이러한 결과는 Cre-Lox 재조합을 통해서 DOC2 세포에 통합된 도킹 부위 구성체 중 두 LoxP 부위 사이에 존재하는 CX-EGFP-CX-neo 서열이 결실된다는 것을 시사한다.
도 31: IgL pKO5B 표적화 벡터의 다이어그램. 첫번째 줄은 표적화 벡터 IgL pKO5B의 구성을 나타낸다. 상기 줄에서는 LoxP 및 attP 부위를 비롯한 5' 상동성 부위 뿐만 아니라, 3' 상동성 부위에 대한 벡터 구성을 보여준다. 두번째 줄은 닭 야생형 IgL 대립유전자에 대한 표적화 벡터의 관계를 보여준다. 세번째 줄은 J 및 C 유전자 결실 또는 유전자 파괴로 형성된 돌연변이체 대립유전자를 보여준다.
도 32: KO-07 넉아웃 클론 중의 IgL 유전자좌 결실을 보여주는 서던 블롯 분석. 좌측 패널: IgL pKO5B로 형질감염된 5 개의 클로날 PGC 세포주로부터의 DNA를 SacI로 분해하고, 0.5 kb의 SacI-BstEII 단편으로 프로빙하였을 때의, 5' 상동성 부위에 대해 수득된 하이브리드화. 야생형 IgL 유전자좌는 대략 10 kb이고, 표적화된 결실을 포함하는 돌연변이체 단편은 대략 4 kb이다. 우측 패널: 5 개의 동일한 클론으로부터의 DNA와 3' 상동성 부위에 대해 수득된 하이브리드화. 게놈 DNA를 BstEII로 분해하고, 3' 1.7 kb의 Nsil-MfeI 단편(이는 또한 표적화 벡터 외부에 존재)과 하이브리드화시켰다.
도 33: IgL 넉아웃이 7 개의 닭 배아 중 5 개(배아 2,3,4,6 및 7)에게로 전이되었음을 보여주는 서던 블롯. 이형접합성의 표적화된 KO-07 넉아웃 PGC로부터 유전된 야생형 IgL 대립유전자를 갖는 야생형 배아였다.
발명의 상세한 설명
본원에서 사용되는 닭 배아 줄기(cES) 세포라는 용어는 ES 세포 형태를 보이며, X단계(E-G&K)의 배아(대략 마우스 포배 단계와 동등)의 투명 구역으로부터 유래된 수혜자 배아 중의 체성 조직에 기여하는 세포를 의미한다. CES 세포는 마우스 ES 세포와 수개의 시험관내 특징들, 예로서, SSEA-1+, EMA-1+ 및 텔로머라제+를 공유한다. ES 세포는 모든 체성 조직을 콜로닝화시킬 수 있는 능력을 갖고 있다.
본원에서 사용되는 원시 생식 세포(PGC)라는 용어는 PGC 형태를 보이며, 수혜자 배아 중 오로지 생식선에만 기여를 하는 세포를 의미하는데, PGC는 12-17 단계(H&H)의 배아로부터 채취된 전혈로부터 유래될 수 있다. PGC 표현형은 (1) 생식선 특이 유전자 CVH 및 Dazl이 상기 세포주에서 강하게 전사하는 경우, (2) 세포가 CVH 단백질을 강하게 발현시키는 경우, (3) 세포가 X단계의 수혜자 배아로 주사된 경우에도, 12-17 단계(H&H)의 수혜자 배아로 주사된 경우에도 체성 조직에는 기여하지 않는 경우, (4) 세포가 EG 세포를 일으키는 경우(하기 참조), 또는 (5) 12-17 단계(H&H)의 배아로 주사되었을 때, 세포가 PGC 유전자형을 생식선을 통해 전이하는 경우에 의해 확립될 수 있다(문헌([Tajima et al. (1993) Theriogenology 40, 509-519]; [Naito et al., (1994) Mol Reprod. Dev., 39, 153-161]; [Naito et al., (1999) J Reprod. Fert. 117, 291-298])).
본원에서 사용되는 닭 배아 생식(cEG) 세포라는 용어는 PGC로부터 유래된 세포로서, 기능면에서 뮤린 EG 세포와 유사한 세포를 의미한다. cEG 세포의 형태는 cES 세포의 형태와 유사하며, cEG 세포는 X단계(E-G&K)의 수혜자로 주사되었을 때, 체성 조직에 기여한다.
본원에서 사용되는 트랜스제닉이란 용어는 그의 체성 세포 및 생식 세포에서 이식유전자를 코딩하고, 이식유전자에 의해 부여받은 소질을 그의 자손에게 전이할 수 있는 동물을 의미한다. 트랜스제닉이란 용어는 또한, 내인성 유전자좌 중 한정된 유전자 분절의 결실, 원시 생식 세포의 게놈 내로 통합되는 이식유전자 또는 표적화 구성체의 사용에 의해 유전자 있는 그대로의 정확한 결실을 통한 유전자 불활성화, 기능 파괴, 중지, 또는 넌센스 서열, attP 부위 또는 부위 특이 유전자 변형을 통해 유전자좌를 기능적으로 불활성화시키는 기타 다른 인공물의 삽입을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 내인성 유전자좌 중 부위 선택성이고 특이성인 유전자 불활성화를 포함하는 동물도 의미한다. 현 레트로바이러스 기술로는 부위 특이 변형이나 형질전환된 세포의 선별을 할 수 없기 때문에, 그리고, 장기 PGC 세포 배양물을 지속시킬 수 있고, 부위 특이 유전자 변형, 예로서, 유전자 불활성화를 공학처리할 수 있는 능력이 없기 때문에, 트랜스제닉이란 용어는 레트로바이러스 시스템을 제외시킨다.
그러나, 선택된 유전자의 기능을 변화시키고, 유전자 변형으로부터 원하는 표현형을 생성하는 부위 특이 유전자 변경을 포함하는 동물은 포함한다. 이러나 이식유전자 및 그로부터 유래된 동물을 보편적으로는 "넉인"으로 지칭한다. 이식유전자는 표적화를 위해 선택된 유전자의 크기 또는 조직에 따라서 적어도 10 kb, 바람직하게, 10-25 kb인 내인성 DNA의 결실부를 삽입할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 트랜스제닉 조류에는 전체적인 또는 부분적인 결실이나 기타 다른 기능 파괴를 위해 표적화되는 내인성 유전자 표적에 상응하는 어떤 내인성 유전자도 없다.
본원의 실시예에서는 닭으로 설명되었지만, 기타 다른 조류 종, 예로서, 메추라기, 칠면조, 꿩 등이 적절한 실험을 수행하지 않고도 닭을 대신할 수 있으며, 본원에서 개시된 방법을 성공적으로 수행함으로써 합리적인 기대를 할 수 있다.
조직 특이 발현을 위해 디자인된 DNA 구성체를 배양물 중의 ES 세포 내로 삽입함으로써, 닭의 난백 중에서 모노클로날 항체와 같이 가치있는 약학 제품을 발현하는 닭을 생산할 수 있다. PCT US03/25270, WO 04/015123(Zhu et al)을 참조한다. 상기 동물에 대하여 허용되는 중요한 기술은 클로닝된 세포의 유전자형이 배양물 중에서 공학처리될 수 있도록 하는데 충분한 장시간 동안 생존가능한 상태로 있는, 실제 장기 ES 세포 배양물의 생산 및 유지이다.
그러나, ES 세포와 달리, 원시 생식 세포(PGC)는 단지 단기간인 것을 기본으로 하여 배양되어 왔다. 일단 배양 기간이 짧은 며칠을 넘어가게 되면, 이러한 세포는 오로지 생식선에만 기여할 수 있는 능력을 상실하게 된다. 전형적으로, 현 배양물 기법을 사용하여 배양물 중에서 유지되는 PGC는 증식하지 않고, 증가하지 않는다. 강력한 성장을 하지 못하게 되면, 배양물은 "말기"의 배양물이고, 무기한적으로 유지될 수도 없다. 이러한 말기 세포 배양물은 퇴화되고, 세포 그들의 독특한 형태를 상실하게 되며, 배아 생식(EG) 세포로 되돌아 가게 된다. 배아 생식 세포는 PGC와는 다른 형태를 얻고, 생식선으로만 그가 제한되는 성질도 상실하게 되고, 배아의 조기 발생 단계에서 주사되면 체성 조직에 기여할 수 있는 능력을 획득하게 된다. 예정된 유전자형을 수혜자 배아의 생식선으로 도입하여 동물이 원하는 유전자형을 미래 세대에게로 전이할 수 있도록 하기 위해서는 PGC가 정자와 난자의 선조체로 알려져 있기 때문에 PGC가 유일하게 관심이 가는 것이다.
유전자 불활성화 또는 외인성 DNA의 삽입을 포함하거나, 이를 포함하지 않는 장기 PGC 배양물은 예로서, 가금류 및 난 생산 산업에서 의존하게 되는 중요한 닭 교배 계통의 가치있는 유전적 특징들을 지속시키는 것과 같은, 여러 중요한 이점을 제공한다. 현재, 사고나 질병을 통해서 가치있는 교배 계통이 상실되는 것을 막기 위한 특별 대책에 착수하게 되었다. 이러한 대책안을 위해서는 종축으로서 계통 구성원을 다수 유지시켜야 하며, 전세계 여러 곳에서 이러한 종축을 클로닝하여야 한다. 교배 계통 내의 유전적 다양성을 보존하는 것도 중요하기 때문에 예비로 다수의 가치있는 동물을 유지시키는 것 또한 필요하다. 살아있는 예비 종축 이외의 PGC 세포 배양물 중 가치있는 교배 계통의 유전적 특징을 보존함으로써 대량의 예비 교배 군집에 드는 비용 문제를 피할 수 있다.
장기 PGC 배양물은 (문헌[van de Lavoir, M-C, Diamond, J., Leighton, P., Heyer, B., Bradshaw, R., Mather-Love, C, Kerchner, A., Hooi, L., Gessaro, T., Swanberg, S., Delany, M., and Etches, R.J. (2006). Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature 441, 766-769])에 기재되어 있다.
PGC를 사용하여 유전공학 처리된 닭을 생산하기 위해서는 유전자 변형을 PGC의 유전자형에 도입하여야 하고, 유전자 변형이 일어난 희귀 세포를 단리시켜야 하고, 분석하고 수혜자 배아로 도입하여 GO 키메라를 형성하기 위한 목적으로 유전적으로 변형된 세포의 군집을 확장시켜야 한다. 배양물 중 세포를 표적화하는 매우 다양한 유전자 조작 기법이 잘 알려져 있다. 그러나, 한가지 주요 난점은, 배양물 중 PGC의 유전자형을 변경시키기 위해서는 형질감염된 세포가 배양물 중에서 성장을 하고 증식을 하면서 동시에 배양물은, 유전자 변형을 도입하는데 적합하고, 성공적으로 형질전환된 세포를 선택하는데 적합한 기간 동안 생존가능한 상태로 유지되어야 한다는 점이다. 증식할 수 있는, 성공적으로 형질전환된 세포는 클론 유도된 후 또는 거의 클론 유도된 후 수일 내지 수주 이내에 많은 세포(예로서, 104 개 내지 107 개의 세포)를 생성할 수 있는 그의 능력에 의해서 식별될 수 있다. 시조 세포는 원하는 유전자 변형을 수반하는 희귀 세포가 될 것이다. 전형적으로, 이러한 세포는 잘 알려져 있는 유전자 변형 기법(예로서, 리포펙션 또는 전기천공)을 적용한 후 10-4 내지 10-7의 빈도로 배양물 중에서 생성된다. 그러므로, 배양물 중에서 PGC를 성공적으로 생산하기 위해서는 충분한 갯수의 세포를 증식시키고 생성하여 희귀의 유전적으로 변형된 세포가 배양물 중에서 선택될 수 있도록 세포에 공간 및 영양을 제공하기 위해 세포를 계대접종할 필요가 있다.
상기와 같은 군집을 제공하기 위해서는 시험관내 유전자 분석과 키메라 생산에 사용될 수 있도록 세포를 개개의 유전적으로 변형된 세포로부터 104 개 내지 107 개의 세포 콜로니로 성장시킬 수 있을 정도로 배양 조건이 충분히 강해야 한다. 이러한 공학처리된 PGC는 생성된 동물이 성숙기에 접어들면 전적으로 정조세포 또는 난조세포(즉, 정자 및 난자)의 신생 군집에만 기여하게 될 것이다. 상기 생성된 동물에서, 체성 조직 전체는 수혜자 배아로부터 유래될 것이며, 생식선에는 기증자 세포 및 수혜자 배아, 둘 모두가 기여한 점도 포함되어 있을 것이다. 상기와 같이 생식선에 대한 기여는 혼합되어 있기 때문에, 이러한 동물은 "생식선 키메라"로서도 알려져 있다. 키메라성 정도에 따라 키메라성의 자손은 기증자 세포로부터 유래되거나, 수혜자 배아로부터 유래될 것이다.
닭에서 생식선은 X단계(E-G&K) 배아의 배반엽상층으로부터 신생 배반엽하층으로 진입하는 세포로서 시작된다(문헌[Kagami et al., (1997) Mol Reprod Dev 48, 501-510]; [Petitte, (2002) J Poultry Sci 39, 205-228])). 배반엽하층이 전방으로 진행됨에 따라, 전-원시 생식 세포는, 거대 글리코겐 적재 세포로서 확인될 수 있는 생식 반월로 앞쪽으로 휩쓸려 가게 된다. 이러한 형태학적 기준에 기초하여 생식선에 존재하는 세포를 확인할 수 있는 가장 빠른 시점은 배양 시작 후 대략 8 시간째(문헌[Hamburger and Hamilton, (1951) J Morph 88, 49-92]에 의해 확립된 다단계 시스템을 사용하였을 때 4 단계)이다. 원시 생식 세포는 12-17단계(H&H) 동안 혈관구조를 통해 이동할 때까지 4 단계(H&H)부터 생식 반월에 존재하게 된다. 이 때, 원시 생식 세포는 약 200 개의 세포로 이루어진 작은 군집이다. 혈관구조로부터 원시 생식 세포는 생식 능선로 이동하게 되고, 생식샘이 분화함에 따라 난소 또는 정소로 도입된다(문헌([Swift, (1914) Am. J. Anat. 15, 483 - 516]; [Meyer, (1964) Dev. Biol. 10,154-190]; [Fujimoto et al. (1976) Anat. Rec. 185,139-154])).
현재까지 검사된 모든 종에서 원시 생식 세포는 EG 세포로 분화되지 않고서는 장기간 동안 배양물 중에서 증식하지 못했다. 종래의 전기천공 또는 리포펙션 프로토콜에 의해 유전자 변형 또는 불활성화를 도입시키기 위해 충분한 갯수의 세포가 생산될 수 있도록 장기 배양해야 한다. 전형적으로, 이러한 프로토콜은 105 개 내지 107 개의 세포를 필요로 하며, 따라서, 모든 세포 분열이 (1) 동시에 일어나고, (2) 2개의 생존가능한 딸세포를 생산한다고 가정하면, 단일의 전구체로부터 이러한 세포를 생산하기 위해서는 17 내지 24회의 배가가 일어나야 한다. 유전자 변형을 세포 게놈 내로 도입하는 것은 드물게 일어나는 이벤트이며, 전형적으로는 1×104 개 내지 1×106 개 세포 중 한번 일어난다. 유전자 변형 이후, 세포는 유전자 변형을 수반하고/거나 발현시키는 단일 세포로부터 콜로니를 확립시킬 수 있어야 한다. 콜로니는 이식유전자의 정확도 평가를 위해서 PCR 또는 서던 분석법에 의해 분석될 수 있고, 이후 13-15 단계(H&H)의 수혜자 배아로 주사되는 충분한 갯수의 세포를 제공할 수 있는 105 개 내지 107 개의 세포로 이루어진 군집으로 확장될 수 있어야 한다. 따라서, 세포 군집을 생산하기 위해서는 추가의 17 내지 24회의 세포 분열이 필요하며, 유전적으로 변형된 세포 군집을 생산하기 위해서는 총 34 내지 58회의 배가가 필요하다. 세포 주기가 24 시간이라고 가정하면, 13-15 단계(H&H)의 수혜자 배아로 주사하기 위해 유전적으로 변형된 원시 생식 세포를 생산하려면 최소 34 일 및 일반적으로 58 일 배양하여야 한다. 이어서, 주사된 세포는 생식선을 콜로니화할 수 있어야 하고, 기능성 생식세포를 형성할 수 있어야 하며, 수정 후 새로운 개체로 발생할 수 있어야 한다.
본원에 기술된 바와 같이 배양물 중에서 유지되는 PGC는 배양물 중에서 유지되는 동안 특징적인 PGC 형태를 유지한다. PGC 형태는 직접 관찰을 통해 관찰할 수 있고, 배양물 중의 세포 성장은 세포가 배양물 중에서 증식하였는지를 확인할 수 있는 일반 기법에 의해 평가할 수 있다. 증식성 세포 배양물은 비말기인 것으로 정의되고, 후반의 다른 두 시점에서는 배양물 중 더 많은 갯수의 세포가 관찰된다. 본 발명의 배양물 중 PGC는 임의의 특정 배양물 중에 1×105 개 이상의 세포를 가질 수 있고, 이 수치는 시간이 경과함에 따라서 증가한다는 것을 관찰할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 배양물 수명에서 초기 시점과 비교할 때, 수일, 수주, 또는 수개월이 경과한 후에는 더 많은 갯수의 세포를 포함하는 증식성 PGC 배양물을 포함한다. 이상적으로 배양물은 적어도 1×105 개의 세포를 함유하고, 임의의 기간 동안 배양물 중에서 성장시킨 후에는 더 많은 갯수의 세포를 갖는 것을 관찰할 수 있다. 추가로, PGC가 배양물 중 우세한 종인 것으로 관찰될 수 있는 바, 닭 이외의 공급자 세포가 제공한 최소의 기여를 고려하면, 세포 배양물의 증식성 성분은 기타 다른 닭 유래의 세포를 실질적으로 배제하고, 본질적으로는 닭 원시 생식 세포로 구성된 것이다.
배양물은 또한 계대접종에 의해 증식될 수 있도록 특징을 보이는 바, 현존 배양물로부터의 세포 시료 또는 세포 분취액은 분리될 수 있고, 새로운 배양 배지에 놓일 경우에도 강한 성장을 나타낼 것이다. 정의하면, 세포 배양물을 계대접종할 수 있는 능력이란 세포 배양물이 성장하고 증식하며 비말기라는 것을 나타내는 것이다. 추가로, 본 발명의 세포는 수회에 걸친 계대접종 이후 생식선 키메라를 형성할 수 있고 PGC 형태를 유지할 수 있는 능력을 입증한다. 본원에서 기술하는 바와 같이, 이러한 증식은 외인성 DNA 서열의 안정적인 통합에 적합한 임의의 세포 배양물이 갖는 본질적인 특성이 된다.
PGC는 임의의 공지된 기법에 의해 수득할 수 있고, 본원에 기술되어 있는 배양 조건하에서 성장시킬 수 있다. 그러나, 전혈을 15 단계의 배아로부터 제거하고, 하기 기술하는 바와 같이 배양 배지에 직접 놓는 것이 바람직하다. 이러한 접근법은 문헌에 기재되어 있는 기타 다른 접근법(여기서는, PGC의 프로세싱 및 분리 단계 이후에, 이를 배양물 중에 놓는다)과는 차이를 보인다. PGC와, 처음부터 공존할 수 있는 전혈로부터 유래된 기타 다른 세포 사이의 차별적인 활발한 성장을 통해 본원에 기술된 바와 같이 배양물 중 거대 PGC 군집이 생성된다. 따라서, 전혈로부터 직접적으로 유래된 PGC는 배양물 중에서 세포 농도가 크게 성장하게 되고, 무한대로 계대접종될 수 있고, 강한 성장과 증식을 나타내는 바, 배양물 중의 PGC가 본질적으로는 유일의 성장성 및 증식성 세포가 된다.
본 발명의 한가지 측면은 그 모두가 그의 생식선에 유전적으로 동일한 PGC 유래의 세포를 갖는 다수의, 예를 들면, 3 마리 초과, 4 마리 초과, 5, 10, 15 및 20 마리 초과의 생식선 키메라 트랜스제닉 동물이 생산된다는 것이다. 본 발명의 다른 측면은 그의 생식선에 유전적으로 동일한 PGC 유래의 세포를 갖는 생식선 키메라 군집이 형성되며, 상기 군집 내에서는 생식선 키메라를 생산하기 위해 동일의 장기 세포 배양물을 사용하였다는 것을 반영하는 연령에 따른 격차가 나타나는 군집이 형성된다는 것이다. 연령에 따른 격차는 시간이 경과함에 따라 원시 생식 세포를 배양할 수 있는 현 이용가능한 능력 밖에 있고, 냉동시키지 않고 190 일 경과하였을 때만큼 높다. 따라서, 본 발명은 그의 생식선에 동일한 PGC 유래의 세포를 가지며, 세포 냉동 과정없이 40 일, 60 일, 80 일, 100 일, 190 일 초과 등, 또는 그 범위에 포함된 임의의 다른 적분값까지 연령별로 차이를 보이는 2 개 이상의 생식선 키메라를 포함한다. 본 발명은 또한 생식선 키메라를 생산하는데 사용되고, 그로부터 추가의 생식선 키메라가 생산될 수 있는 것인, 비말기 PGC 배양물의 생존과 함께, 그의 생식선에 유전적으로 동일한 PGC 유래의 세포를 갖는 성적으로 성숙한 생식선 키메라의 생존을 포함한다.
PGC는 극도로 안정적인 방식으로 배양물 중에서 유지될 수 있기 때문에, 세포는 또한 배양물 중에서 유지된 PGC의 표현형으로 정의되는 자손을 생산할 수 있는 능력을 갖는 생식선 키메라를 생산하기 위한 장기간 보관 방법을 형성하기 위해 냉동 보관되고 해동된다.
다수의 생식선 키메라를 생산할 수 있는 능력은 또한 PGC 유래의 유전자형을 생식선 키메라의 자손으로 전이할 수 있는 능력을 제공한다. 따라서, 본 발명은 생식선 중 불활성화된 내인성 유전자좌를 가지며, 유전적으로 동일한 PGC 유래의 세포를 갖는 생식선 키메라 군집과, 그의 유전자형 및 표현형이 배양물 중에서 성장한 PGC의 유전자형에 의해서 전적으로 결정되는 생식선 키메라의 자손, 이 둘 모두를 포함한다. 생식선 중에 PGC 유래의 넉아웃 표현형이 도입된 것이 관찰되었다. 따라서, 본 발명은 불활성화된 내인성 유전자좌를 포함하는 원시 생식 세포의 유전자형에 대한 생식선 전이에 의해서 생산되는 생식선 키메라의 자손을 포함한다. 따라서, 본 발명은 부위 특이 유전자 불활성화로 구성된 PGC를 포함하는 원시 생식 세포 배양물, 그의 생식선의 일부로서 상기 원시 생식 세포를 갖는 생식선 키메라, 및 넉아웃 유전자형 및 표현형을 갖는 생식선 키메라의 자손, 이러한 각각의 생존을 포함한다.
수혜자 배아 중 기증자 유래의 PGC와 수혜자 유래의 PGC의 비는 PGC 유래의 키메라 중의 생식선이 쉽게 콜로니화될 수 있도록 변경될 수 있다. 발생 중에 있는 닭 및 메추라기 배아에서, 이를 부설판에 노출시키면 원시 생식 세포 군집이 생식 반월로부터 생식 능선으로 이동함에 따라 상기 원시 생식 세포 군집은 현저히 감소하거나 제거될 수 있다(문헌([Reynaud (1977a) Bull Soc. Zool. Francaise 102, 417-429]; [Reynaud (1981) Arch Anat. Micro. Morph. Exp. 70, 251-258]; [Aige-Gil and Simkiss (1991) Res. Vet. Sci. 50, 139-144])). 24 내지 30 시간 동안 배양시킨 후, 난환에 부설판을 주사하고, 50 내지 55 시간 동안 배양시킨 후, 원시 생식 세포를 혈관구조로 다시 도입시키게 되면, 생식선은 기증자 유래의 원시 생식 세포와 함께 재증식하게 되고, 이어서, 기증자 유래의 생식세포가 생산된다(문헌([Vick et al. (1993) J. Reprod. Fert. 98, 637-641]; [Bresler et al. (1994) Brit. Poultry Sci. 35 241-247])).
본 발명의 방법은 닭으로부터, 예로서, 15 단계의 배아의 전혈로부터 PGC를 수득하는 단계, 상기 PGC를 배양물에 놓는 단계, 내인성 유전자좌의 불활성화를 위해 공학처리하는 단계, 공학처리된 PGC를 증식시켜 그의 갯수를 증가시키고 다회에 걸친 계대접종을 가능하게 만드는 단계, 공학처리된 PGC의 장기 배양물로부터 생식선 키메라를 생산하는 단계, 및 공학처리된 PGC에서 유전자 불활성화를 보이는 유전자형 및 표현형을 갖는 생식선 키메라의 자손을 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 또한 유전자 불활성화 또는 유전자 "넉아웃"을 배양물 중의 PGC 군집 내로 삽입하여 불활성화되거나 기능적으로 파괴된 내인성 유전자좌를 포함하는, 안정적으로 형질감염된 PGC를 생성하는 단계, 안정적으로 통합된 이식유전자를 수반하는 세포를 상기 군집으로부터 선별하는 단계, 안정적으로 통합된 이식유전자를 수반하는 유전적으로 변형된 세포를 수혜자 배아에 주사하는 단계, 배아를 생식선 중 불활성화된 유전자좌를 포함하는 생식선 키메라로 발생시키는 단계, 생식선 키메라를 성적 성숙기까지 사육하고 생식선 키메라를 교배시켜 유전자 불활성화는 배양된 PGC로부터 유래된 것인 트랜스제닉 자손을 수득하는 단계를 포함한다. 유전자를 불활성화시키기 위해서 PGC 내로 도입되는 유전자 변형으로는 게놈 내로의 이식유전자의 무작위 통합, 유전자의 프로모터 부위로 삽입된 이식유전자, 게놈 중 반복 요소 내로 삽입된 이식유전자, 인터그라제의 사용으로 도입되는 게놈에 대한 부위 특이 변화, 상동성 재조합에 의해 도입되는 게놈에 대한 부위 특이 변화, 및 Lox 부위 또는 부위 특이 재조합을 위한 기질인 기타 다른 서열이 측면에 위치하는 DNA를 절단함으로써 게놈 내로 도입된 조건부 돌연변이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
하기 기술하는 바와 같이, 본 발명에 따라, 닭 PGC 세포주는 14-16 단계(H&H)의 배아로부터 채취된, 크고 둥근 형태의 혈액으로부터 유래된다(도 1). 이러한 세포는 장기간 배양한 후 그가 가진 형태와 PGC 유래의 자손을 생산할 수 있는 그의 능력에 의해서 확인되어 진다. 또한, PGC 배양물은 생식선 특이 유전자인 Dazl 및 CVH(도 2)를 발현하며, CVH 단백질은 배양물 중의 상기 세포에 의해서 생산된다(도 3). 배양물 중의 PGC는 텔로머라제를 발현시키는데(도 4), 이는 중요한 표현형이 된다. 추가로, PGC는 적절한 배양 조건하에서 배아 생식(EG) 세포를 형성한다(도 5). 유추하면, 마우스 및 인간 PGC는 유사한 방식으로 처리되면 EG 세포를 형성할 수 있을 것이다. 마우스 EG 세포는 체성 조직에 기여할 것이며, 닭 EG 세포 또한 키메라에서 검은색을 띠는 깃털 색소 침착으로 표시되는 바와 같이, 체성 조직에 기여할 것이다. 닭 PGC는 서던 분석으로 제시한 바와 같이(도 6), 유전적으로 변형되었다. 본 실시태양에서, CX 프로모터는 PGC의 게놈 내로 안정적으로 통합되며, 이 또한 PGC의 게놈 내로 통합된 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제(APH)를 코딩하는 유전자의 발현을 촉진시키는데 사용되고, 유전적으로 변형된 PGC를 선별하기 위해 배양 배지에 첨가된 네오마이신에 대한 내성을 부여하는 데 사용된다.
[실시예]
실시예 1. 닭 PGC 배양물의 유도
14-17 단계(H&H)의 배아의 굴 종말부(sinus terminalis)로부터 채취된 혈액 2 내지 5 ㎕를 줄기 세포 인자 (SCF; 6 ng/ml 또는 60 ng/ml), 인간 재조합 섬유아세포 성장 인자(hrFGF: human recombinant Fibroblast Growth Factor; 4ng/ml 또는 40 ng/ml), 10% 우태아 혈청, 및 80% KO-DMEM 조절된 배지를 함유하는 96 웰 플레이트 중에서 배양시켰다. 바람직하게는 1 내지 3 ㎕를 15-16 단계(H&H)의 배아의 혈관구조로부터 채취하였다. 96 웰 플레이트의 웰에 방사선 조사 처리된 STO 세포를 3×104 개의 세포/㎠의 농도로 시딩하였다.
10% 우태아 혈청, 1% pen/strep; 2 mM 글루타민, 1 mM 피루베이트, 1X 뉴클레오시드, 1X 비필수 아미노산 및 0.1 mM β-머캅토에탄올로 보충된 DMEM 중에서 BRL 세포를 포화상태까지 배양하고, 5% 우태아 혈청을 함유하는 DMEM 중에서 3 일 동안 배양하여 KO-DMEM 조절된 배지를 제조하였다. 24 시간 후에 배지를 제거하고, 새 배치의 배지를 3 일 동안 조절하였다. 이를 3회 반복하고, 3 개의 배치를 조합하여 PGC 배양 배지를 제조하였다.
배양물 중에서 대략 180 일이 경과한 후에, 하나의 PGC 세포주를 40% KO-DMEM 조절된 배지, 7.5% 우태아 혈청 및 2.5% 닭 혈청으로 구성된 배지 중에서 배양하였다. 이러한 조건하에서 PGC의 배가 시간은 대략 24-36 시간이었다.
배양을 개시할 때, 우세한 세포 유형은 태아 적혈구 세포였다. 3주 이내에 우세한 세포 유형은 PGC 세포였다. 2 개의 PGC 세포주는 개개의 배아로부터 개시된 18 개의 배양물로부터 유래되었다.
PGC 세포주를 9 개월 이상 동안 배양하였고, 이는 둥근 형태를 유지하였으며, 비부착 상태로 유지되었다(도 1a &B). 10% 혈청 및 10% DMSO를 함유하는 CO2 비의존성 배지 중에서 냉동보존한 후, PGC를 성공적으로 해동시켰다.
실시예 2. 배양된 PGC 는 CVH 및 Dazl 을 발현시킨다
초파리에서의 생식선 특이 유전자인 VASA의 닭 상동체인 CVH의 발현은 닭의 생식선 내의 세포로 제한되며, 이는 생식 반월 중 대략 200여 개의 세포에 의해 발현된다(문헌[Tsunekawa, N., Naito, M., Sakai, Y., Nishida, T. & Noce, T. Isolation of chicken vasa homolog gene and tracing the origin of primordial germ cells. Development 127, 2741-50. (2000)]). 수컷에서의 생식선의 적절한 기능을 위해서는 CVH가 발현되어야 하며; CVH 기능 상실은 수컷 마우스의 불임을 유발한다(문헌[Tanaka, S. S. et al. The mouse homolog of Drosophila Vasa is required for the development of male germ cells. Genes Dev 14, 841-53. (2000)]). Dazl의 발현은 개구리(문헌[Houston, D. W. & King, M. L. A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus. Development 127, 447-56, 2000]), 아흘로틀(axolotl)(문헌[Johnson, A. D., Bachvarova, R. F., Drum, M. & Masi, T. Expression of axolotl DAZL RNA, a marker of germ plasm: widespread maternal RNA and onset of expression in germ cells approaching gonad. Dev Biol 234, 402-15, 2001]), 마우스(문헌[Schrans-Stassen, B. H., Saunders, P. T., Cooke, H. J. & de Rooij, D. G. Nature of the spermatogenic arrest in Dazl -/- mice. Biol Reprod 65, 771-776, 2001]), 래트(문헌[Hamra, F. K. et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 14931-6, 2002]), 및 인간(문헌[Lifschitz-Mercer, B. et al. Absence of RBM expression as a marker of intratubular (in situ) germ cell neoplasia of the testis. Hum Pathol 31, 1116-1120, 2000])의 생식선로 제한된다. Dazl이 결실되면 트랜스제닉 마우스에서는 정자발생 과정에 결함이 일어났다(문헌[Reijo, R. et al. Diverse spermatogenic defects in humans caused by Y chromosome deletions encompassing a novel RNA-binding protein gene. Nat Genet 10, 383-93, 1995]).
32 일이 경과한 후, PGC를 PBS로 세척하고, 펠릿화하고, 올리고텍스 디렉스 mRNA 키트(Oligotex Direct mRNA kit)(Qiagen)를 사용하여 조직 시료로부터 mRNA를 단리시켰다. 이어서, 퍼스트-스트랜드 cDNA 합성(First-Strand cDNA synthesis)(Invitrogen)에 대한 수퍼스크립트 RT-PCR(Superscript RT-PCR) 시스템을 사용하여 9 ㎕의 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. 2 ㎕의 cDNA를 다음 PCR 반응에서 사용하였다. CVH 서열(수탁 번호 AB004836), Dazl 서열(수탁 번호 AY211387), 또는 β-액틴 서열(수탁 번호 NM_205518)로부터 유래된 프라이머 서열은 하기와 같았다:
Figure pct00001
프라이머 V-1 및 V-2를 사용하여 CVH 전사체로부터 751 bp 단편을 증폭시켰다. 프라이머 Dazl-1 및 Dazl-2를 사용하여 Dazl 전사체로부터 536 bp 단편을 증폭시켰다. 프라이머 Act-RT-1 및 Act-RT-R을 사용하여 내인성 닭 β-액틴 전사체로부터 597 bp 단편을 증폭시켰다. 암플리태크 골드(AmpliTaq Gold)(Applied Biosystems)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 PCR 반응을 실시하였다(도 2).
실시예 3. PGC 는 CVH 단백질을 발현시킨다
T-Per 조직 단백질 추출용 키트(Pierce)를 사용하여 새로 단리된 PGC로부터 단백질을 추출하였다. 1% NP4O; 0.4% 데옥시콜레이트가 첨가된 66 mM EDTA; 10 mM Tris(pH 7.4) 중에서 세포를 용해시켜 세포로부터의 단백질을 추출하였다. 시료를 4-15% Tris-HCL 레디 겔(ready gel)(Bio-Rad) 상에서 전개시켰다. 막으로 전이한 후, 수퍼 시그날 웨스트 피코 케미루미네슨트 섭스트레이트 키트(Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate kits)(Pierce)를 사용하여 설명서에 따라 웨스턴 블롯을 실시하였다. 토끼 항 CVH 항체를 1차 항체(1:300 희석)로서 사용하고, HRP 접합된 염소 항토끼 IgG 항체(Pierce, 1:100,000)를 2차 항체로서 사용하였다(도 3).
실시예 4. 배양된 PGC 는 텔로머라제를 발현시킨다
원시 생식 세포를 펠릿화하고, PBS로 세척하고, 분석할 때까지 -80℃에서 냉동시켰다. 세포 추출액을 제조하고, 텔로머릭 리피트 앰플리케이션 프로토콜(TRAP: Telomeric Repeat Amplification Protocol)(문헌[Kim, N. et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 266, 2011-2014, 1994])에 기반한 TRAPeze 텔로머라제 디텍션 키트(TRAPeze Telomerase Detection Kit)(Serologicals Corporation)를 사용하여 제조사의 지침서에 따라 분석하였다(도 4).
실시예 5. 배아 생식( EG ) 세포는 PGC 배양물로부터 유래될 수 있다
세포가 플레이트에 부착될 수 있도록 하고, FGF, SCF 및 닭 혈청을 제거하고, ES 세포 배양물에 대하여 사용된 조건과 동일한 조건하에서 세포를 배양함으로써 닭 EG 세포는 PGC로부터 유래되었다(문헌([van de Lavoir et al., 2006 High Grade Somatic Chimeras from Chicken Embryonic Stem Cells, Mechanisms of Development 12, 31-41]; [van de Lavoir and Mather-Love (2006) Chicken Embryonic Stem Cells; Culture and Chimera Production, Methods in Enzymology, in press])). cEG 세포의 형태는 cES 세포의 형태와 매우 유사하였다(도 5a, B). cEG 세포를 X단계(E-G&K)의 배아에 주사하였을 때, 상기 세포는 체성 조직을 콜로니화하고, 소아에서와 같이, cES 세포에 의해 제조된 키메라와 동일한 것으로 보이는 키메라를 제조할 수 있는 능력을 가졌다. 닭 EG 세포는 새로 유래된 트랜스제닉 PGC 세포주와 클론으로부터 유래된 트랜스제닉 PGC 세포주, 이 둘 모두에서 관찰되었다. GFP 양성 PGC로부터 유래된 EG 세포를 서던 분석한 결과, EG 세포가 PGC로부터 기원한다는 것이 입증되었다(도 15).
실시예 6. 배양된 수컷 PGC 는 수탉에서 기능성 생식세포를 발생시킨다
수컷 원시 생식 세포주는 각각의 바드 록(Barred Rock) 배아로부터 유래되었다. 세포주를 확립시킨 후에, 세포를 13-15 단계(H&H)의 배아에 주사하였다. 표현형으로는 부화된 병아리가 화이트 레그혼(White Leghorn)과 유사하였다. 성적으로 성숙해질 때까지 수컷을 사육하고, 바드 록 암탉과 교배시켰다(표 1). 검은색을 띠는 자손은 주사받은 PGC가 생식선 전이라는 방법으로 전이되었음을 나타내었다. 수탉의 생식선 전이율은 <1% 내지 86%로 다양하게 나타났다(표 1).
[표 1]
Figure pct00002
X단계의 배아의 배하강에도 PGC를 주사할 수 있다. 209 일 동안 배양한 후, 1000 개 또는 5000 개의 PGC를 방사선 조사 처리된 배아에게 주사하였다. 부화된 수컷 병아리를 성적으로 성숙해질 때까지 사육하고, 생식선 전이를 시험하기 위하여 교배시켰다. 시험받은 4 마리의 수탉 중 3 마리에서 생식선 전이가 관찰되었는데, 그 빈도는 0.15 내지 0.45%로 다양하게 나타났다. 이는 PGC가 창자배형성 이전에 주사되면 생식선을 콜로니화할 수 있다는 것을 시사한다. 14 마리의 암컷 키메라의 1,625 마리의 자손에서는 수컷 PGC의 생식선 전이가 관찰되지 않았다.
실시예 7. 배양된 암컷 PGC 는 암탉에서 기능성 생식세포를 발생시킨다
66 일 동안 배양된 바드 록 배아 유래의 암컷 PGC를 13-16 단계(H&H)의 화이트 레그혼 배아에 주사하였는데, 부화된 병아리는 모두 그 표현형이 화이트 레그혼이었다. 암탉을 성적으로 성숙해질 때까지 사육하고, 바드 록 수탉과 교배시켰다. 암컷 PGC가 암컷 키메라를 통해 전이되었으며, 그 빈도는 69% 이하였다(표 2).
[표 2]
Figure pct00003
암컷 PGC를 또한 수컷의 수혜자 화이트 레그혼 배아에도 주사하였다. 수컷 키메라를 성적으로 성숙해질 때까지 사육하고, 바드 록 암탉과 교배시켰다. 시험받은 수탉 3 마리의 506 마리의 자손에서는 암컷 PGC의 생식선 전이가 관찰되지 않았다.
실시예 8. PGC 로부터 유래된 자손은 생식적으로 정상이다
3 마리의 수컷과 4 마리의 암컷 비트랜스제닉 PGC 유래의 자손을 함께 교배시켰다. 난중 53 내지 100% 사이의 난이 생식능력이 있었고(표 3), 생식능력이 있는 난 중 79 내지 100%에서 배아의 부화가 이루어졌는데(표 3), 이는 PGC 유래의 자손이 생식적으로 정상이라는 것을 시사한다.
[표 3]
Figure pct00004
실시예 9. 원시 생식 세포를 14-17 단계의 배아로부터 단리시켰으며, 이는 생식선에 기여하는 것으로 나타났다(실시예 1-8 참조). 이 시점에서 PGC는 혈관계를 순환한다. 혈관계 형성 이전에, PGC를 고유배 앞쪽에 있는 생식 반월에 놓았다. 생식 반월 중의 PGC 전구체는 잘 이해되지 않지만, 일반적으로는 PGC가 X단계(Eyal-Giladi and Kochav)의 배아의 투명 구역에 있는 세포로부터 유래된다고 가정된다(문헌[Petitte, J.N. 2002. The Avian germline and Strategies for the Production of Transgenic Chickens. Journal of Poultry Science 39, 205-228]). PGC가 X단계의 배아에 있는 동안에는 생식 반월 중 그를 확인하는데 사용되는 고전적인 형태적 기준의 사용으로는 확인할 수 없었다. 놀랍게도, X단계의 바드 록 배아로부터 유래된 분산된 세포를 배치한 결과, PGC가 발생되었고, 이는 생식선에 기여하는 것으로 나타났다. 본 발명자들은, 개별적으로 배반엽을 수집하고, 이를 파스퇴르(Pasteur) 피펫에서 분쇄하여 기계적으로 분산시킴으로써 상기 원리를 입증하였다. 세포를 세척하고, 실시예 1에 기술된 배지를 함유하며 미리 방사선 조사 처리된 BRL이 시딩되어 있는 48 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 시딩 후 맨 처음 6-10 일 동안 배양물을 계대접종하였다. 이후, PGC 농도에 따라 계대접종하였다. 2 개의 수컷 세포주(PGC-A12 및 PGC-B11)를 확립시키고, 이를 각각 45 일 및 36 일 동안 배양한 후, 실시예 6에 기술된 바와 같이, 수혜자 배아에 주사하였다. 각각의 세포주로부터 5 마리의 수컷 키메라를 생산하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 바드 록 표현형은 10 마리의 수컷 중 3 마리에서 생식선을 통해 전이되었으며, 이는 기능성 PGC가 되는 것으로 예정된 세포가 제공된 배지 중에서 배양될 수 있다는 것을 입증한다.
[표 4]
Figure pct00005
실시예 10. PGC 의 네오마이신 및 퓨로마이신에 대한 감수성
PGC의 퓨로마이신 및 네오마이신에 대한 감수성을 측정하여, 모든 조직에서 강하게 발현되는 CX-프로모터의 제어하에 항생제 내성을 발현하는 세포가 성장할 수 있도록 하는데 필요한 퓨로마이신 및 네오마이신의 농도를 확립하였다. 형질감염되지 않은 세포 모두를 제거하는데에는 300 ㎍/ml 농도의 네오마이신이 10 일 동안 필요하다는 것이 본 실험을 통해 입증되었다. 7-10 일 이내에 PGC를 제거하는데에는 0.5 ㎍/ml 농도의 퓨로마이신이면 충분하였다.
실시예 11. PGC 의 유전자 변형
20 마이크로그램(20 ㎕)의 NotI 선형 cx-neo 이식유전자(도 6 참조)를 167 일 동안 배양된 5.8×106 개의 PGC 군집에 첨가하였다. 세포 및 DNA를 800 ㎕의 전기천공용 완충액 중에 재현탁시키고, 672 볼트의 8회의 방형파 펄스 및 100 μsec 지속시간을 가하였다. 10 분 후, 세포를 배양 배지에 재현탁시키고, 24 웰 플레이트로 분취하였다. 전기천공 후 2 일이 경과하였을 때, 배지 1 ml당 300 ㎍의 네오마이신에 첨가하여 cx-neo 이식유전자를 발현하는 세포를 선별하였다. 19 일 동안 계속하여 세포를 선별하였다. 19 일 후, 세포 선별을 중단하고, 분석을 위해 세포를 확장시켰다. 추가로 31 일 동안 PGC의 비율은 300 ㎍/ml로 유지되었는데, 이는 PGC가 항생제에 대하여 기능적으로 내성을 띤다는 것을 입증한다.
도 6을 참고하면, 플라스미드 대조군의 경우, cx-neo 플라스미드 DNA를 NotI와 선형으로 배치한 후, EcoRI 또는 BamHI로 분해하여 HindIII 분해에 의한 온전한 플라스미드보다 조금 더 작은(5 kb) 단편을 수득하였다. StyI 또는 NcoI로 분해함으로써 cx-neo 플라스미드의 대략 2 kb의 내부 단편이 유리되었다. EcoRI 및 KpnI로 분해함으로써 대략 2.6 kb의 좀 더 큰 내부 단편이 유리되었다. PGC 세포주로부터 유래된 게놈 DNA를 EcoRI, BamHI 및 HindIII로 분해한 결과 6 kb보다 더 큰 띠가 나타났고, 이는 cx-neo 이식유전자가 PGC 게놈 내로 도입되었음을 보여주는 것이다. KpnI와 함께 StyI, NcoI 및 EcoRI로 분해한 후 플라스미드 DNA 중에서 나타난 내부 단편이 또한 PGC로부터 유래된 게놈 DNA에도 존재하였고, 이는 cx-neo 이식유전자가 변경되지 않고 PGC 게놈 내로 통합되었다는 것을 시사한다. 종래의 이식유전자 구성 기법을 사용함으로써 예로서, 조절 요소, 조직 특이 프로모터 및 예시된 단백질을 코딩하는 외인성 DNA와 같은 추가 요소를 도입시킬 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, PGC에서 유전자 변형을 실시하여 트랜스제닉 동물을 생산하는 것은 단지 극소수의 종에서만 입증되었다. 마우스에서 ES 세포를 사용하여 이루어진 유전자 조작을 참고로 하여 그와 유사한 유전자 조작을 닭 PGC에서도 이룰 수 있다. 마우스에서, 키메라 및 트랜스제닉 자손을 생산하기 위하여 따로 상동성 재조합을 사용한 후, 배아 줄기(mES) 세포로 염색체를 전이하는 것이 잘 알려져 있다. 부위 특이 상동성 재조합 또는 유전자 표적화를 위한 강력한 기법이 개발되었다(문헌([Thomas, K.R. and M.R. Capecchi, Cell 51:503-512, 1987]; [Waldman, A.S., Crit. Rev. ONcol. Hematol. 12: 49-64, 1992]) 참조). 유전자를 조작하고, 이를 mES 세포로 전이하여 안정적인 유전자 키메라를 제조하기 위해 클로닝된 DNA 삽입(문헌[Jakobovits, A., Curr. Biol. 4: 761-763, 1994]) 및 Cre-LoxP 시스템 기법에 의한 염색체 단편의 조작 및 선별(문헌([Smith, A.J. et al., Nat. Genet. 9:376-385, 1995]; [Ramirez-Solis, R. et al., Nature 378:720-724, 1995]; 미국 특허 제4,959,317호; 제6,130,364호; 제6,130,364호; 제6,091,001호; 제5,985,614호) 참조)을 이용할 수 있다.
원시 생식 세포의 게놈은 일반적으로 휴지 상태에 있는 것으로 여겨지며, 따라서, 염색질은 고도로 응축된 상태에 있는 것일 수 있다. 종래 전기천공 프로토콜을 확장적으로 시험한 결과, PGC의 게놈 내로 유전자 변형을 도입하기 위해서는 특별한 방법이 필요하다는 것이 제안되었다. 하기 기술하는 바와 같이, 발현을 증진시키기 위하여 이식유전자를 닭 β-글로빈 유전자좌로부터 유래된 절연체 요소로 감쌀 수 있다. β-글로빈 절연체 요소를 포함하면 일반적으로는, 배양할 수 있고, 분석할 수 있고, 수혜자 배아로 주사할 수 있는 클론이 생산된다.
항생제(예로서, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, his-D, 블라스티시딘, 지오신, 및 gpt) 내성 유전자의 발현을 유도하는데 사용되는 종래의 프로모터는 편재적으로 발현된다. 전형적으로, 프로모터는 예로서, β-액틴, CMV, 또는 유비퀴틴과 같은 "하우스키핑" 유전자로부터 유래된다. 구성적 프로모터는 전형적으로 모든 세포에서 고수준으로 발현되기 때문에 유용하긴 하지만, 이는 닭의 일생동안 모든 조직은 아니지만, 대부분의 조직에서 계속하여 발현된다. 일반적으로, 발현은 그 동안 발현이 필요한 발생 단계와 조직으로만 제한되어져야 한다. 원시 생식 세포 선별을 위해, 발현에 필요한 기간은 항생제가 배지 중에 존재할 경우, 원시 생식 세포가 시험관내 존재하는 기간이다. 일단 세포가 배아 내로 삽입되고 나면, 선별 가능한 마커(즉, 항생제 내성 유전자)의 발현을 중지시키는 것이 바람직할 수 있다. 항생제 내성 유전자의 발현을 제한하기 위해서는 "신경조직의 유도에 대한 조기 반응"(ERNI: early response to neural induction) 프로모터가 사용된다. ERNI는 발생 초기 단계(예로서, X단계(E-G&K))) 동안 및 배양물 중에서 선택적으로 발현되는 유전자이며, 따라서, 이러한 프로모터는 유전자 변형을 수반하는 PGC를 선별하기 위해서 항생제 내성 유전자의 발현을 유도하는데 사용된다. ERNI는 발생 초기 단계 동안에만 발현이 되기 때문에, 항생제 내성을 부여하는 유전자는 성숙한 동물에서는 발현되지 못한다.
실시예 12. 장기 PGC 세포 배양물의 동질성
장기간 동안 배양한 후의 PGC 배양물의 동질성을 측정하기 위하여, ES, EG, DT40(닭 B 세포주) 및 PGC를, 치킨 바사 상동체에 대한 항체인 항CHV와 1B3 항체로 염색하였다(문헌[Halfter, W., Schurer, B., Hasselhorn, H. M., Christ, B., Gimpel, E., and Epperlein, H. H., An ovomucin-like protein on the surface of migrating primordial germ cells of the chick and rat. Development 122, 915-23. 1996]). CVH 항체의 발현은 생식 세포로 제한되는 바, 따라서, 항CVH 항체는 그에 대해 신뢰할 수 있는 마커가 된다. 1B3 항원은 오보뮤신 유사 단백질의 이동 및 생식샘의 콜로니화 동안 닭 PGC 표면 상에 존재하는 오보뮤신 유사 단백질을 인식한다.
세포를 CMF/2% FBS 중에서 세척하고, 5 분 동안 4% 파라포름알데히드 중에서 고정시키고, 다시 세척하였다. 바사에 대해 염색된 세포 분취액을 1-2 분 동안 0.1% TritonX-100을 사용하여 투과시켰다. 1차 항체를 20 분 동안 첨가하고, 세포를 2회에 걸쳐 세척하고, 15 분 동안 2차 항체(CVH와 대조군에 대한 Alexa 488 항토끼 IgG, 및 1B3에 대한 Alexa 488 항토끼 IgM)와 함께 배양시켰다. 대조군으로서, 세포 분취액을 2차 항체로만 염색하였다. 추가로 2회 더 세척한 후, FACS 분석을 위해 세포를 제조하였다.
도 7을 참고하면, DT40, ES 및 EG 세포는 모두 CVH 및 1B3 Ab로 염색되었을 때 배경을 나타내었다. 그러나, PGC는 CVH 및 1B3 항체, 둘 모두에 대하여 보다더 강하게 염색되었다. CVH 또는 1B3, 어떤 것으로도 염색되지 않은 PGC가 소량 존재하는데, 이는 소량의 세포가 PGC 표현형을 나타내지 않는다는 것을 시사하는 것이다. 2 개의 모체 PGC 세포주와, PGC 13 모체 세포주로부터 유래된 4 개의 형질감염된 세포주(G-09, P84, P97/6 및 P97/33)를 바사 및 1B3 항체(PGC13 및 102)에 대하여 시험하였다. 모두 같은 패턴을 보였는데, 이는 각종 PGC 배양물이 PGC 표현형을 발현하는 세포를 동일하게 높은 비율로 함유한다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 13: 원시 생식 세포의 유전자 변형
환형 CX-GFP 플라스미드를 사용하여 전기천공한 바, PGC의 일시적 형질감염율은 1-30% 사이로 다양하였다. 100 μsec 및 800 V의 8회의 방형파 펄스를 사용함으로써 본 발명자들은 CX-neo 구성체를 수반하는 PGC 세포주를 수득하였는데, 이를 G-09로 지정하였다. 도 6을 참조한다. 서던 블롯 분석을 사용하여 구성체 통합을 평가하였다. 그러나, 상기 안정적으로 형질감염된 세포주를 단리시키는 것은 반복성 이벤트는 아니었다. G-09를 제외하고, 방형파 및 지수적 소멸 펄스, 둘 모두를 사용한 37 개의 형질감염 실험에서 선형 구성체를 사용하여 17×107 개의 PGC를 전기천공시킨 후에도 PGC의 안정적인 형질감염은 이루어지지 않았다. 이러한 실험 각각에서, PGC의 갯수는 1×106 개 내지 10×106 개로 다양하였다. 마우스, 닭 및 인간에서의 ES 세포 연구에 광범위하게 사용되는 하기의 프로모터들을 시험하였다: CAG로도 명명되는 CX 프로모터(CMV 인핸서와 함께 β-액틴 프로모터 포함)(문헌[Niwa, H., Yamamura, K., and Miyazaki, J., Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108, 193-9.1991]), MC1 프로모터 및 Ubc 프로모터. 이러한 프로모터 중 어느 것도 형질감염율을 증가시키지는 못했다. 선별 가능한 마커가 발현될 수 있고, 유전적으로 발현된 세포가 클론을 유도할 수 있도록 하기 위해 통합된 구성체와 함께 절연체를 사용하였다.
절연체는 불활성 염색질 도메인으로부터 활성인 염색질 도메인을 분리하고, 인근 인핸서의 활성화 효과로부터, 또는 인근 응축된 염색질의 침묵화 효과로부터 유전자를 절연시키는 DNA 서열이다. 닭에서, β-글로빈 유전자좌의 5'에 위치하는 5'HS4 절연체의 특징은 (Felsenfeld)와 그의 동료들에 의해서 잘 규명되었다(문헌[Burgess-Beusse, B., Farrell, C, Gaszner, M., Litt, M., Mutskov, V., Recillas-Targa, F., Simpson, M., West, A., and Felsenfeld, G. (2002)). The insulation of genes from external enhancers and silencing chromatin. Proc. Natl. Acad . Sci . U S A 99 Suppl. 4, 16433-7]). 이러한 절연체는 β-글로빈 유전자좌를 구성적으로 응축된 염색질의 상류 부위로부터 보호한다. 본 발명자들은 닭 β-액틴-neo 카세트의 5' 및 3', 둘 모두의 절연체로서 닭 β-글로빈 5'HS4 서열을 사용하여 네오마이신 내성을 유도하는 닭 β-액틴 프로모터와 이식유전자를 조립하였다.
닭 β-글로빈 유전자좌로부터의 과감수성 부위 4의 250 bp 중심 서열은 하기 프로모터 세트를 사용하여 PCR 증폭시켰다:
Figure pct00006
PCR 산물을 pGEM-T로 클로닝하고, 서열을 분석하였다. pGEM 클론 중의 HS4를 BamHI 및 BglII로 분해하여 삽입체를 유리시키고, BglII로 분해하여 벡터를 선형화시킴으로써 HS4 부위를 직렬 중복화시켰다. HS4 절연체 카피본을 함유하는 벡터에 HS4 단편을 결찰시켰다. 클론을 스크리닝하고, HS4의 카피본 2 개가 동일한 배향으로 있는 클론을 선별하였다. 이를 2X HS4로 명명하였다.
실시예 14: HS4 β- 액틴 - neo 를 사용한 대량 선별
Buerstedde로부터 β-액틴 neo를 입수하고(클론 574), p블루스크립트(pBluescript)로 옮겼다. 이어서, β-액틴 neo의 5' 및 3' 말단 모두에서 2X HS4를 클로닝하여 HS4-β-액틴 neo를 생산하였다. 상기 구성체를 사용하여 8회에 걸쳐 형질감염을 실시하였다. 각 형질감염마다, 5×106 개의 PGC를 400 ㎕ 전기천공용 완충액(Specialty Media) 중에 재현탁시키고, 20 ㎍의 선형 DNA를 첨가하였다. 1회의 지수적 소멸(ED: Exponential Decay) 펄스(200 V, 900-1100 μF도 함께) 또는 8회의 방형파(SW) 펄스(250-350 V, 100 μsec)를 제공하였다. 형질감염 후, 세포를 며칠 동안 성장시킨 후, 네오마이신 선별(300 ㎍/ml)을 추가하였다. 각 형질감염물은 풀로서 성장시켰다. 8 개의 형질감염물 중 5 개로부터 내성 세포를 단리시켰다.
2 개의 형질감염된 세포 풀 상에서 서던 분석을 실시하였다(도 8). PGC 세포주 P84 및 P85로부터 유래된 2 ㎍의 게놈 DNA, 및 20 pg의 플라스미드(HS4-β-액틴 neo)를 분해하였다. 분해물을 0.7% 겔 상에서 전개시키고, 밤새도록 10X SSC 중에서의 모세관 이동법에 의해 나일론 막으로 이동시키고, 래피드 Hyb(Rapid Hyb)(Amersham)에서 2 시간 동안 방사선 표지된 neo 유전자 서열로 프로빙하였다. 세척시킨 후, 블롯을 -80℃에서 밤새도록 필름에 노출시켰다. 도 7을 참고하면, 레인 1은 P84이고, 레인 2는 P85이고, 레인 3은 플라스미드이다. 플라스미드 대조군의 경우, NotI를 사용하여 HS4-β-액틴-neo 플라스미드 DNA를 선형화시켰다. 2.3 Kb의 내부 단편을 얻기 위해, PGC DNA 및 선형화된 플라스미드를 BamHI로 분해하였다. P84 및 P85, 둘 모두 크기가 2.3 Kb인 내부 단편을 나타내었다. 대략 2.6 Kb의, 좀 더 큰 내부 단편은 HindIII로 분해하여 유리시켰다. 게다가, 상기 내부 단편은 P84 및 P85 분해물, 2가지 모두에 존재하였다. P84 및 P85의 게놈 DNA를 EcoRI 및 BglII로 분해하였을 때, 이식유전자가 게놈 내로 통합되었다면, 2.9 Kb보다 더 큰 띠가 출현하여야 한다. P84에서는 어떤 연접 단편도 관찰되지 않았으며, 이는 P84가 수개의 다른 클론으로 이루어진 복합물임을 시사하는 것이다. P85에서, 4.5-5 kb의 연접 단편이 EcoRI 분해물에 존재하였고, 5 Kb의 연접 단편이 BglII 분해물에 존재하였는데, 이는 P85가 게놈 내로 통합되었으며, 배양물이 실질적으로는 하나의 클론으로 구성되어 있음을 시사하는 것이다. 본 실시예는 원시 생식 세포에서 선별 가능한 마커의 신뢰할 수 있는 발현을 위한 구성체의 바람직한 요소로서 절연체가 갖는 유용성을 제시한다.
실시예 15: 유전적으로 변형된 PGC 의 클론 유도
하기 실시예는 유전적으로 변형된 원시 생식 세포의 세포주는 클론에 의해 유도될 수 있다는 것을 제시한다.
먼저, β-액틴-eGFP를 제조하였다. XmnI 및 KpnI를 사용하여 eGFP 유전자를 CX-eGFP-CX-puro로부터 유리시키고, EcoRI 및 XmnI를 사용하여 β-액틴을 HS4-β-액틴 puro로부터 유리시키고, 상기 2 개를 3원 결찰로서 EcoRI 및 KpnI로 분해된 p블루스크립트로 클로닝하여 β-액틴 EGFP를 생산하였다. 이어서, BamHI 및 KpnI를 사용하여 β-액틴 eGFP를 유리시키고(T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 블런트화시키고), BglII 및 EcoRV로 분해된 HS4-β-액틴 puro로 클로닝하였다.
상기 구성체를 사용하여 5회에 걸쳐 형질감염을 실시하였다. 각 형질감염마다, 5×106 개의 PGC를 400 ㎕ 전기천공용 완충액(Specialty Media) 중에 재현탁시키고, 20 ㎍의 선형 DNA를 첨가하였다. 1회의 ED 펄스(150-200 V ;900 μF) 또는 SW(350 V, 8 펄스, 100 μsec) 펄스를 제공하였다. 형질감염 후, 세포를 개개의 48 웰에 플레이팅하고, 며칠 동안 성장시킨 후, 선별(0.5 ㎍/ml)을 추가하였다. 총 5 개의 클론이 5 개의 형질감염물 중 4 개에서 관찰되었다. 클론 TP103 하나를 서던법에 의해 분석하였다(도 9). 도 11을 참고하면, 플라스미드 대조군 DNA를 NotI를 사용하여 선형화시켰다. DNA를 KpnI로 분해하여 내부 단편을 유리시켰다. TP103 및 플라스미드, 둘 모두에서, 같은 크기의 단편이 유리되었다. TP103의 게놈 DNA를 NcoI, MfeI, 및 SphI로 분해하였다면 분해된 플라스미드 DNA의 상응하는 레인에 있는 것보다 더 큰 띠가 출현하여야 한다. MfeI로 분해된 TP103 게놈 DNA의 레인에서는 어떤 띠도 관찰되지 않았는데, 이는 상기 띠가 너무 크다는 것이 이유가 될 수 있다. NcoI 및 SphI 분해물을 나타내는 레인에서는 플라스미드 DNA에서 유리된 단편보다 실질적으로 더 큰 단편이 TP103 게놈 DNA에서 유리되었는데, 이는 이식유전자가 TP103 세포주의 게놈 내로 도입되었음을 시사하는 것이다.
HS4 -β- 액틴 - puro 의 클론 유도
먼저, CX-EGFP-CX-puro(XmnI-EcoRI)로부터의 puro, pBS(상기 참조)(Sal-XmnI) 중 β-액틴 neo로부터의 β-액틴 및 p블루스크립트(SaiI-EcoRI)의 3원 결찰에 의해 β-액틴 puro를 제조하였다. 이어서, BamHI로 분해된 β-액틴 puro를 BamHI/SAP로 처리된 2X HS4 벡터로 결찰시켜 2 개의 2X HS4 카피본을 함유하는 pBS로 β-액틴 puro를 클로닝하였다.
상기 구성체를 사용하여 3회에 걸쳐 형질감염을 실시하였다. 각 형질감염마다, 4-5×106 개의 PGC를 400 ㎕ 전기천공용 완충액(Specialty Media) 중에 재현탁시키고, 20 ㎍의 선형 DNA를 첨가하였다. 1회의 ED 펄스(200 V, 900 μF)를 제공하였다. 형질감염 후, 세포를 개개의 48 웰에 플레이팅하고, 며칠 동안 성장시킨 후, 선별(0.5 ㎍/ml)을 추가하였다. 2 개의 형질감염물 중에서는 어떤 콜로니도 관찰되지 않았다. 세번째 형질감염물로부터 2 개의 콜로니를 단리시켰다.
HS4 - cx - eGFP - cx - Puro 의 클론 유도
HS4-cx-eGFP-cx-Puro를 사용하여 3회에 걸쳐 형질감염을 실시하였다. 5×106 개의 PGC를 400 ㎕ 전기천공용 완충액(Specialty Media) 중에 재현탁시키고, 20 ㎍의 선형 DNA를 첨가하였다. 각 형질감염에 8회의 SW 펄스(350 V, 100 μsec)를 제공하였다. 형질감염 후, 세포를 개개의 48 웰에 플레이팅하고, 며칠 동안 성장시킨 후, 퓨로마이신 선별(0.5 ㎍/ml)을 추가하였다.
cx - neo 의 클론 유도
cx-neo 선별 가능한 마커를 수반하는 플라스미드를 사용하여 PGC 13 세포주를 전기천공시켰다. 네오마이신에 노출시킨 후, 네오마이신에 대해 내성을 띠는 세포주를 유도하였다(G-09). 상기 세포주의 핵형을 결정하였고, 모든 세포는 염색체 2의 p-암에서 결실을 나타내었다(표 5 및 도 10). 상기 데이타는, G-09가 염색체 2의 p-암에 기호 결실(signature deletion)을 수반하는 PGC로부터 클론에 의해 유도될 수 있다는 것을 입증한다.
[표 5]
Figure pct00007
실시예 16: PGC 에서의 선별 가능한 마커의 조직 특이 발현
유전자 ERNI는 닭 배아의 원시선 이전 단계로부터 발현되고, 이는 헨젠 결절(Hensen's node)로부터의 신호에 대해 반응하는 조기 반응 유전자이다(문헌[Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C, Sirulnik, A., and Stern, C. D. (2000). Initiation of neural induction by FGF signalling before gastrulation. Nature 406, 74-8]). 추가로, ERNI는 닭 ES 세포에서 발현된다(문헌[Acloque, H., Risson, V., Birot, A., Kunita, R., Pain, B., and Samarut, J. (2001). Identification of a new gene family specifically expressed in chicken embryonic stem cells and early embryo. Mech Dev 103, 79-91]). ERNI 유전자 (cENS-1로도 명명됨)는 고유한 5' 및 3' UTR 서열 이외에도, 단일의 장쇄 오픈 리딩 프레임이 486 bp의 직접 반복부가 측면에 위치하는 특이한 구조를 갖는다. 이러한 구조는 레트로바이러스 LTR 유사 구조를 연상시키다는 견해에 기초하여, (Acloque) 등(문헌[Acloque et al. 2001])은 프로모터/인핸서 활성에 대하여 cDNA 서열의 다른 부분을 분석하였고, 3' UTR 중 고유한 서열 부위가 프로모터로서의 역할을 한다는 것을 발견하게 되었다. 본질적으로 (문헌[Acloque et al., 2001])에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머를 디자인하여 ERNI 유전자의 3' UTR의 822 bp의 단편을 증폭시켰다. ERNI 서열을 증폭시킨 후, SV40 폴리A 부위와 함께 네오마이신-내성 유전자 상류에 클로닝하여 ERNI-neo(1.8 kb)를 생성하였다. 이어서, 2X HS4 절연체를 ERNI-neo 선별 가능한 마커 카세트 양쪽에 클로닝하였다.
HS4-Erni-neo를 사용하여 2회에 걸쳐 형질감염을 실시하였다. 5×106 개의 PGC를 400 ㎕ 전기천공용 완충액(Specialty Media) 중에 재현탁시키고, 20 ㎍의 선형 DNA를 첨가하였다. 첫번째 형질감염에서는 1회의 ED 펄스(175 V, 900 μF)를 제공하고, 두번째 형질감염에서는 8회의 SW 펄스(100 μsec 및 350 V)를 제공하였다. 형질감염 후, 세포를 개개의 48 웰에 플레이팅하고, 며칠 동안 성장시킨 후, 네오마이신 선별(300 ㎍/ml)을 추가하였다. 첫번째 형질감염(ED 펄스)에서는 5 개의 콜로니가 단리되었고, 두번째 형질감염(SW 펄스)에서는 11 개의 콜로니가 단리되었다.
안정하게 형질감염된 클론이 단리되었다는 것은 ERNI가 PGC에서 발현되고, 이는 조직 특이 프로모터로서 사용될 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 17: 형질감염된 PGC 의 생식선에 대한 기여
PGC를 HS4-β액틴-GFP로 형질감염시키고, 13-15 단계(H&H)의 배아의 혈관구조로 주사하였다. 18 일째 생식샘을 회수하고, 고정시키고, 절개하고, CVH 항체로 염색하여 생식 세포를 확인하였다. 이어서, 생식샘 중 GFP 양성 세포의 존재에 대하여 염색된 절편을 분석하였다. 수컷(도 11) 및 암컷 생식샘, 둘 모두에서 GFP 양성 생식 세포가 관찰되었다. 이러한 배아의 뇌, 심장 근육, 및 간의 조직학적 표본을 검사한 결과, 하나의 슬라이드에서 단지 4 개의 녹색 세포만이 관찰되었다. 이러한 데이타는 몇몇 배양된 PGC가 이소성 위치에서 관찰되기는 하지만, 대다수의 배양된 PGC는 우선적으로 생식선을 콜로니화시킨다는 것을 입증한다.
GFP 양성 세포가 생식 세포인지 여부를 측정하기 위하여 절편을 항CVH 항체로 염색하였다. 도 12에서 관찰할 수 있는 바와 같이, GFP 양성 세포는 또한 CVH 단백질에 대해서도 염색되는데, 이는 GFP 양성 세포가 생식 세포임을 시사하는 것이다.
도 12를 참고하면, GFP 양성 세포는 상기 절편에 존재하고, DAPI/GFP 패널은 GFP 양성 세포가 정세관 내에 위치한다는 것을 보여준다. 생식 세포를 항CVH 항체로 염색하였을 때, 이는 생식 세포의 세포질의 윤곽을 나타내는 매우 짙은 빨간색 환을 나타내었다. DAPI/CVH 패널은 이러한 세포가 정세관 내에 위치한다는 것을 보여준다. 마지막 패널은 GFP 양성 세포가 CVH에 대해서도 염색이 되며, 정세관은 GFP 음성인 CVH 양성 생식 세포을 함유한다는 것을 보여준다.
실시예 18. 유전적으로 변형된 PGC 의 생식선 전이
하기 이식유전자: β액틴-neo, β액틴-eGFP-β액틴-puro, 또는 cx-eGFP-cx-puro 중 하나로 형질감염된 바드 록의 PGC를 13-14 단계(H&H)의 배아의 혈관구조로 주사하였다. 병아리를 부화시키고, 수컷을 성적으로 성숙해질 때까지 사육하고, 바드 록 암탉과 교배시켜 이식유전자의 생식선 전이 여부를 측정하였다. 검은색을 띠는 자손 모두 PGC 유래의 것이고, 이를 이식유전자의 존재 여부에 대하여 시험하였다(표 6). 생식선 전이율(%)은 검은색을 띠는 병아리의 마리수를, 깃털 색상으로 평가받은 병아리의 총 마리수로 나누어 계산하였다(표 6).
[표 6]
Figure pct00008
실시예 19. 이식유전자는 멘델 법칙으로 유전된다
β액틴-neo, β액틴-GFP, 또는 cx-GFP 중 하나를 포함하도록 유전적으로 변형된, 바드 록 PGC를 수반하는 키메라 수탉 사이의 교배를 통해 탄생된 검은색을 띠는 자손을 이식유전자의 존재 여부에 대하여 분석하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 이식유전자는 PGC 자손의 대략 50% 만큼 유전되는데 이는 멘델의 유전 양식을 시사하는 것이다.
[표 7]
Figure pct00009
실시예 20: 유전적으로 변형된 PGC 를 수반하는 키메라 자손에서 이식유전자의 편재성 발현
β액틴-GFP가 게놈 내로 안정적으로 통합되어 있는 PGC 수반 키메라를 야생형 암탉과 교배시키고, GFP 발현에 대하여 배아를 평가하였다. 배아에서의 발현에 관한 일례들은 도 13에 제시되어 있는데, 여기서, GFP는 발생 34 단계(H&H) 이하의 트랜스제닉 자손의 모든 조직에서 발현된 것으로 나타났다. 노령 동물에서 냉동 절편을 사용하여 조직학적으로 검사하기 위해 조직을 제조하였다. 1 내지 2 주령된 병아리의 췌장, 피부, 폐, 뇌, 난소, 신장, 윤활낭, 십이지장, 유방, 심장, 간, 및 비장으로부터 유래된 조직은, 여전히 부화 후 동물에서 편재적으로 발현된다는 것을 입증하였다.
실시예 21: HS4 함유 이식유전자는 닭 게놈의 프로모터 부위로 삽입된다
HS4 함유 구성체가 우선적으로, 침묵화는 막고, 선별 가능한 마커가 발현될 수 있도록 하는 게놈의 특정 부위 내로 삽입되었는지 여부에 관한 문제를 다루기 위해 본 발명자들은 본 클론성의 형질감염된 PGC 세포주 중 이식유전자 삽입 부위를 확인하였다. 게놈 DNA를 형질감염된 PGC 세포주로부터 추출하고, 이식유전자를 절단하지 않는 제한 효소, 또는 HS4 요소 중 1번 절단하는 제한 효소를 사용하여 분해하였다. DNA를 자가 결찰시키고, E. 콜라이(E. coli)로 형질전환시켰다. 세포를 암피실린 플레이트 상에 플레이팅하여 amp 유전자를 함유하는 콜로니를 벡터 측면에 위치하는 게놈 서열에 결합된 플라스미드로부터 단리시켰다.
HS4-구성체 형질감염된 PGC 세포주 중 31 개로부터 플라스미드를 정제하고, 서열을 분석하였다. 본 발명자들은 BLAT(UCSC Chicken Genome Browser Gateway) 및 BLAST(NCBI) 검색을 실시하여 각각의 삽입에 대한 게놈 위치를 지도화하였다. 놀랍게도, 31 개의 HS4 함유 구성체 중 25 개가 CpG 섬으로 삽입되었는데, 이는 보편적으로는 프로모터 부위, 특별히 하우스키핑 유전자의 부위에서 관찰되는 것이다. CpG 섬으로 삽입된 유전자는 EST에 의해 정의된 바, 공지 유전자이든 신규의 유전자이든 그들 대부분(23/25)이 연관이 있다고 볼 수 있다(표 8). CpG 섬은 대개 전사 출발 부위 상류의 수백개의 염기쌍으로부터 제1 엑손을 거쳐 제1 인트론으로까지 걸쳐져 있으며, 삽입은 이러한 부위 모두에서 나타났다. 내인성 유전자에 비하여 벡터의 전사 배향에 있어서는 어떤 성향도 보이지 않았다. 이러한 유전자 중 다수는 예로서, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 알데히드 데하이드로게나제, 및 미토콘드리아 용질 운반체와 같은 하우스키핑 유전자로서의 그의 공지된 기능에 기초하여 PGC에서 발현되는 것으로 예측되었다. EST에 의해 정의된 바, 삽입 중 7 개는 신규 유전자에서 이루어졌다. 이러한 EST 중 5 개는 원래 생식샘 또는 PGC 라이브러리로부터 클로닝된 것이며, 이는 상기 유전자들이 본 발명의 PGC 세포주에서도 발현될 수 있다는 것을 제안한다. 유전자 삽입 중 3 개는 CpG 섬이 아닌, 더 많은 원위(distal) 인트론에서 이루어졌다. 삽입 중 5 개는 어떤 명백한 유전자도 포함하지 않는 부위에서 이루어졌다. 이러한 삽입 중 3 개는 LINE 또는 위성 반복부에서 매우 인접한 위치에서 이루어졌다.
[표 8]
Figure pct00010
Figure pct00011
실시예 22: phiC31 인테그라제을 사용한 효율적인 통합
또한, 본 발명자는 attB 부위와 attP 부위 간의 부위-특이적 재조합을 촉매하는 phiC31 인테그라제 시스템을 사용하여 닭 게놈에 외래 DNA를 삽입시켰다. phiC31 attB 및 attP 부위 간의 재조합은 비가역적이기 때문에, attB 부위를 보유하는 원형 구성체의 게놈 내 삽입은 안정하고, 인테그라제가 지속적으로 존재하는 경우에도 고리화되어 탈삽입되지 않는다. 개구리(Allen and Weeks 2005 Nature Methods 2, 975-9.Transgenic Xenopus laevis embryos can be generated using phiC31 integrase.), 마우스(Olivares et al. 2002 Nature Biotechnology 20, 1124-8. Site-specific genomic integration produces therapeutic Factor IX levels in mice; Belteki et al 2003 Nature Biotechnology 21,321-4. Site-specific exchange and germline transmission with mouse ES cell expressing phiC31 integrase) 및 인간 세포(Groth et al 2000 Proc Natl Acad Sci U S A. 97,5995-6000. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cell; Thyagarajan et al 2001, Mol Cell Biol. 21, 3926-34. site-specific genomic integration in mammalian cell mediated by phagephiC31 integrase)에서, phiC31 인테그라제가 비변형 게놈으로의 attB-함유 플라스미드의 통합을 매개할 수 있다는 것을 보여주었으며, 이러한 결과들은 이들 종의 게놈이 인테그라제가 인식하는 박테리아 attP 부위와 충분한 서열 상동성을 갖는 슈도-attP 부위를 함유하고 있다는 것을 의미한다. 또한 효율적인 통합을 위해서, 도입되는 플라스미드가 attP 부위보다는 attB 부위를 보유해야 한다는 것도 확인되었다(Belteki et al 2003; Thyagarajan 2001). attB 부위를 절연된 HS4 β-액틴 EGFP β-액틴 퓨로(HS4 BGBP) 구성체에 부가하여, attB HS4 BGBP를 생성시켰다. 도 16B의 좌측 패널에 나타낸 바와 같이, 이 실험에서 사용된 인테그라제 구성체는 att-B 부위가 HS4 β-액틴 EGFP β-액틴 퓨로 구성체에 부가된 att-B 함유 플라스미드를 포함하여 도시하였다. 도 16B의 우측 패널에는, 세포 내에서 CAG 프로모터로부터 인테그라제를 발현시키기 위해 사용한 플라스미드를 도시하였다. 2가지 유형의 인테그라제를 제작하였는데, 그 중 하나는 SV40 핵 국재화 신호를 갖고 있는 것이고, 다른 하나는 이러한 신호가 없는 것이다. attB HS4 BGBP 및 CAG-인테그라제 플라스미드 DNA를 원형 플라스미드로서 PGC에 공동형질감염시켰다. 무-인테그라제, 선형 HS4 BGBP에 비하여 높은 증가량으로 콜로니가 형성되었는데, 단지 5 ㎍의 DNA를 사용한 106 세포당 5 내지 10 콜로니인 것에 비해 선형 DNA 20 ㎍ 사용한 106 세포 당 0.3 콜로니로서, DNA 당 콜로니가 20배 이상 증가한 것으로 나타났다. NLS형 인테그라제는 비 NLS형에 비하여 보다 적은 콜로니를 형성시켰다. 이러한 결과는 인테그라제가 닭 게놈에서 슈도 attP 부위를 인식할 수 있고, PGC에서 효율적이고 안정한 형질감염을 위해 사용할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 23: 인테그라제 클론에 대한 삽입 부위 동정
인테그라제 및 attB-함유 플라스미드를 사용한 안정한 형질감염의 효율성 증가는 phiC31 인테그라제가 인식할 수 있는 슈도 attP 부위를 닭 게놈이 함유하고 있다는 것을 의미한다. 벡터의 무작위적인 절단에 의해서가 아닌, 인테그라제 매개 반응을 통해 attB HS4 BGBP 플라스미드가 통합된다는 것을 증명하기 위해, 5 개의 독립적인 PGC 클론에서 얻은 게놈 DNA에 대해 서던 블롯 분석법을 수행하였으며, 그 결과, 각 경우에서, attB 부위를 통한 통합과 일치하는 구조를 갖는, 온전한, 전장 이식유전자가 관찰되었다(결과 도시하지 않음). 뉴클레오티드 수준에서 재조합 중지점을 더욱 특징규명하고, 슈도 attP 부위를 동정하며, 삽입된 염색체 부위를 동정하기 위해서, 본 발명의 인테그라제 PGC주 12 개에서 게놈 삽입 부위와 벡터간 접합부를 클로닝하고 서열분석하였다. 무인테그라제 세포주에 대해 상기 기술한 바와 같이 플라스미드 회수법(rescue)을 수행하였다. 본 발명자들은 상기 접합부 단편의 클로닝 효율이 현격하게 감소되는 것을 관찰하였는데; 획득된 E.coli 콜로니 수가 무인테그라제 PGC 세포주에 대한 형질전환 당 평균 69 콜로니에서, 인테그라제 매개 PGC 세포주에서는 형질전환 당 3.1 콜로니로 감소되었다. 이러한 결과의 원인은 분명하지 않지만, 가능성있는 이유 중 하나는 인테그라제 클론에 측접된 반복적인 DNA(하기 참조)를 제한효소로 분해하는 것이 보다 어렵기 때문일 수 있다. 플라스미드 DNA를 콜로니로부터 정제하고, 서열 분석하여 attL 및 측접 서열을 확인하였다(하기 표 9 참조). 게놈 DNA를 형질전환유전자 내부를 절단하는 효소로 분해하였기 때문에, 벡터 백본 상에서 amp 유전자에 인접한 측점 게놈 DNA만이 이 방법으로 확인할 수 있었고, 형질전환유전자 삽입부의 다른쪽에 측접한 DNA는 확인되지 않았다.
도 17에는, 인테그라제 매개된 형질감염으로 유래한 PGC 클론에서 attB 플라스미드와 게놈 서열간 접합부를 도시하였다. 윗쪽줄은 야생형 attB 부위이고, 보통재조합 교차점인 코어 TTC는 밑줄표시하였고(서열 번호 9), 아래는 인테그라제 매개된 삽입에서 유래한 attL 서열(서열 번호10-21)이다. 플라스미드 상의 attB와 게놈의 슈도 attP 부위사이에서 스플라이싱이 발생하는 부분을 결정하기 위해서, PGC 서열을 attB(서열 번호 9)와 비교하였다. PGC 서열에서, 플라스미드가 제공하는 attB 서열은 아래쪽 경우이고, 게놈 슈도 attP 서열은 위쪽 경우이고 굵게 표시하였다.
플라스미드 상에서 attB 서열의 대략 절반을 구성하는 attL 서열이 게놈 내 슈도 attP 부위에 연결된 각 경우에서 발견되었는데, 이는 인테그라제가 재조합 반응을 매개한다는 것을 의미한다. 플라스미드 발생 attB와 게놈간 재조합은 정확하지는 않았고 일반적으로 attB의 코어 TTG 뉴클레오티드에서 일어나지 않았다. BLAT 및 BLAST 검색으로 각 삽입의 게놈 위치를 지도화하였다. 놀랍게도, 지도화할 수 있는 11 삽입 중 7 삽입이 반복적인 DNA 서열에서 일어났다. RepeatMasker Web Server(Institute for Systems Biology) 및 ClustalW 서열 정렬을 사용하여, 반복부를 분석하였고 이 서열들을 이전에 동정된 P041 반복부(Wicker et al)로 분류할 수 있다는 것을 확인하였다. 도 18A에는, P041 공통 서열(서열 번호 29)과 PGC 삽입 부위 유래의 PO41 유사 서열의 정렬 결과를 도시하였다. P041-유사 반복부에 삽입된 모든 클론의, PGC 측접 서열을 P041 공통 서열(Wicker et al. 2004) 및 상호간에 정렬시켰다. 처음 20 뉴클레오티드는 벡터가 제공한 attB 서열(상기 정렬 결과에 표시한 바와 같음)이었고, 다음으로는 각 클론 유래의 게놈 측접 서열이 후속되었다. 절반 이상의 서열을 공유하는 뉴클레오티드는 검은색 박스로 표시하였다. 서열 정렬 결과는 PGC 세포주 중 2 개(2-47 서열 번호 23 및 18-5-36-2 서열 번호 22)는 동일 게놈 부위에 attB HS4 BGBP 삽입물을 보유하고 있다는 것을 의미한다. 이 2 삽입부는, attB-슈도 attP 접합부의 뉴클레오티드 서열이 상기 2 삽입부 간에 상이하다는 사실로 확인된 바와 같이, 독립적이다. 다른 서열(18-3-12 서열 번호 24)은 20 bp 삽입부를 제외하고 처음 둘과 동일하였다. 삽입부에서 동정된 P041 반복부의 어떠한 것도 공통 서열의 정확한 복사체가 아니었으며, PO41 공통 서열과 삽입 부위 반복부간의 서열 상동성 비율은 뉴클레오티드 동일성이 47%(18-3-43)∼ 77%(1-30)였다. 도 18B에 도시한 바와 같이, 100 bp의 attP와 PO41 공통 반복부의 100 bp를 정렬한 결과 서열 동일성이 약 46%로 확인되었는데, 이는 인간 세포에서 슈도 attP 부위에 대해 관찰된 것보다 높다(Thyagarajan 2001). P041 반복부는, 게놈 내에서, 각각이 수 킬로베이스의 41 bp 반복부로 이루어진, 259 위치가 존재하는 것으로 여겨진다(Wicker et al). 몇몇 측접 게놈 단편은 크기가 10-12 kb 범위였고; 이들 단편 중 2 말단을 서열분석한 결과, 둘 모두 반복적이었는데, 이러한 결과는 반복부의 전체 길이가 크다는 것을 의미한다. 따라서, PO41 서열은 닭 게놈에서 phiC31 인테그라제에 대한 거대하고, 바람직한 표적이다.
나머지 4 인테그라제-매개 삽입은 고유한 DNA 서열에 존재하였다. 이들 서열 중 하나(19-1-1 서열 번호 12)는 염색체 21 상에 고유한 서열의 통합 영역에 존재하였고, 다른 하나(1-41 서열 번호 10)는 염색체 5 상의 빌름 종양(WT1) 유전자의 닭 오르쏘로그(orthologue)의 프로모터 영역에 삽입되었다. 한 서열(5-7 서열 번호 11)은 염색체 1 상에서, 국소 유전자 패밀리 또는 저카피수 반복부를 대표할 수 있는, 다중 위치에 존재하였다. 한 서열(18-4-11 서열 번호 13)은 닭 게놈이나 일반적인 '비중복' 데이타베이스 상에 있는 서열과 일치하지 않았으며, 따라서, 아직 서열분석되지 않은 게놈 영역인 것으로 판단된다. 마지막으로 한 삽입부(2-38 서열 번호 21)는 데이타베이스에서 확인할 수 없는 슈도 attP 부위로 구성된 매우 짧은 서열만을 생성하였다.
[표 9]
Figure pct00012
실시예 23: 유전자 변형 염색체의 동정
본 발명자들은 또한 본 발명자들이 위치를 지정할 수 있는 고유 서열에 삽입을 함유하는 세포주에 대해 삽입이 일어난 염색체를 주목하였다. PGC의 28 개 독립 삽입 중, 본 발명자들은 닭 핵형의 38 염색체 중 17 개의 다른 염색체에서 삽입부를 관찰하였다(표 8 및 9). 삽입의 대략 절반이 거대염색체(염색체 1-6; 13 삽입)에 존재하였고, 나머지 절반은 극소염색체(염색체 7-38; 14 삽입)에 존재하였으며, 삽입 하나는 Z 염색체에 존재하였다. 거대염색체 및 극소염색체로의 삽입 비율은 게놈에 대한 물리적 기여도에 비례하였으며, 이는 통합을 위한 영역에 치우침이 존재하지 않는다는 것을 의미한다.
실시예 24 : 유전자 표적화
표적화 벡터는 상동성 재조합을 통해 내인성 유전자좌에 삽입시 면역글로불린 경쇄 유전자의 J 및 C 영역이 HS4 ERNI-퓨로 선별 카세트로 치환되도록 설계되었다(도 19). 상기 언급한 바와 같이, ERNI 프로모터(퓨로마이신 카세트를 구동함)는 초기 배아에서 특이적으로 발현되며(Acloque et al, 상동), 다른 프로모터와 유사한 빈도로 PGC에서 약물 내성 콜로니를 생성할 것으로 예측된다. 도 20에서, 상부선은 닭 IgL 유전자, IgL K05에 대한 표적화 벡터의 다이아그램이다. 이 벡터는 IgL 유전자의 J-C 영역이 3.1 kB HS4 ERNI-퓨로 선별 마커로 치환되도록 설계된 것이다(I 및 HS4 절연체로 표시). 2 개의 상동성 암은 길이가 2.3 및 6.3 kB였다. 3' 말단에서, β-액틴 EGFP는 표적화된 클론에 대해 농축시키기 위해 녹색 형광에 대해 퓨로-내성 클론을 스크리닝가능하게 한다. 말단의 점선은 pKO 벡터 백본(Stratagene)이다. 중간선은 단일한 가변(V), 연결(J) 및 불변(C) 영역 유전자를 갖는 IgL 유전자의 생식선 구조의 야생형 대립유전자의 다이아그램이다. 표적 클론의 서던 분석에 사용된 제한효소 부위를 도시하였으며(S, SacI; B, BstEII), 이중 화살표머리로 야생형 단편 크기를 아래에 도시하였다. 하부선에는 J 및 C 영역이 결실되고 HS4 ERNI-퓨로로 치환된 돌연변이체 대립유전자의 구조를 도시하였다. 제한효소 지도를 도시하고, 돌연변이체 단편 크기를 아래에 도시하였다. 서던 분석에 사용된 프로브는 표적화 벡터의 양쪽 외부에 존재하며 이의 위치를 도시하였다.
총 1.05×108 세포 및 210 ㎍의 선형 DNA를 사용하여, 21 형질감염체로부터 4 클론을 분리하였다. 클론 중 2 클론이 GFP를 발현하였는데 이들이 게놈에 무작위적으로 통합되었고 GFP 유전자를 보유한다는 것을 의미한다. 통합부의 양쪽 측면 유래 프로브를 사용한, 4 클론의 서던 블롯 분석 결과, 비녹색 클론 중 하나(클론 2)가 표적화 돌연변이체에 대해 이형접합성인 것으로 확인되었다. 도 20에는, 4 퓨로마이신 내성 클론을 서던 분석한 결과를 도시하였다. 클론 1 및 2는 녹색이 아닌 반면, 클론 3 및 4는 GFP를 발현하였다. 좌측 패널에, PGC 클론 유래 게놈 DNA를 SacI으로 효소분해하고 프로브 A와 혼성화시켜 IgL 유전자의 5' 측면 상에서 표적화를 분석하였다. 우측 패널에는, DNA를 BstEII로 효소분해하고 IgL 유전자의 3' 측면상의 표적화를 위한 프로브 B와 혼성화하였다. 클론 2는 이종접합성, 표적화 클론에 대해 예상한 크기의 단편을 나타내었다.
실시예 25: J-C 넉아웃 벡터를 보유한 GO 키메라
실시예 24에 기술한 J-C 넉아웃을 보유한 PGC를 13-15기(H&H)의 흰색 레그혼 수용자 배아의 혈관구조에 주입하였다. 표현형적으로, 부화된 병아리가 흰색 레그혼과 닮았다. 숫컷을 생식 성숙기까지 사육하고 복부 마사지하여 정액을 회수하였다. 전방향 프라이머 ERNI-133F: 5'-TTGCTCAAGCCCCCAGGAATGTCA-3'(서열 번호 32) 및 역방향 프라이머 Puro-8R: 5'-CGAGGCGCACCGTGGGCTTGTA-3'(서열 번호 33)를 사용한 PCR 분석 결과를 도 21에 도시하였다. 도 21에서, 예상한 248 bp 크기의 증폭된 DNA가 2 이상의 GO 키메라의 정액에 존재하였으며 이는 유전적으로 변형된 원시 생식 세포가 생식선으로 유입되었다는 것을 의미한다.
실시예 26: 알데히드 디히드로게나제 유전자좌로의 0- 액틴 - 네오 삽입
모세포주 15 유래의 PGC를 성장시키고, 198 V 및 900 μF의 기하급수적 감속을 사용하여, 400 ㎕ 중 5×106 세포를 20 ㎍의 선형 β-액틴-네오 구성체로 전기천공하고, 48-1 ㎠ 웰에 평판배양하여 단일 클론을 얻었다. 이 세포들을 네오마이신 존재하에서 성장시켜, 네오마이신 내성 클론을 성장시키고 새로운 웰로 옮겨 증식시켰다. 이식유전자의 안정한 통합을 확인하기 위해 세포를 서던 블롯 분석으로 분석하고 서열분석한 결과 19번 염색체에서, 알데히드 대사에 관여하는 효소인, 알데히드 디히드로게나제 유전자의 프로모터 영역에 상기 구성체가 통합되었음이 확인되었다.
β-액틴-네오 구성체를 보유하는 PGC를 성장시키고 13-16 단계(H&H) 수용자 배아에 주입하였다. 이 배아를 부화시키고 4 마리의 수탉을 생식 성숙기까지 성장시키고 생식선 전이를 시험하였다. 상기 수탉들의 생식선 전이율은 각각 0, 0, 0.5 및 0.5%였다. 이들 수탉 중 한 마리에서 낳은 이형접합성 자손을 생식 성숙기로 성장시키고 교배하여 동형접합성 자손을 얻었다.
[표 10]
Figure pct00013
이형접합성 수탉과 암탉의 5 교배쌍은 총 73 마리의 병아리를 생산하였고 BN 이식유전자의 존재에 대해 이들을 평가하였다. 총 10 마리의 병아리(14%)가 야생형이었고, 46 마리 병아리(63%)는 이형접합성이고 17 마리 병아리(23%)는 동형접합성이었다(표 10). 이러한 분포도는 멘델의 분리 법칙으로 예측한 18.25/36.5/18.25 분포도와 유의한 편차가 없었다(Chi-square=6.55). 부화 무렵 사망한 병아리 비율은 유전형간에는 유사하였다. 이러한 결과는 BN 이식유전자의 삽입이 치명적인 표현형을 유도하지 않는다는 것을 의미한다.
동형접합성 수탉을 생식 성숙기로 성장시켜 수정능력을 시험하였다. 5 마리 수탉을 야생형 암탉과 교배하고 수정능력, 배아 사멸 및 부화 비율을 계산하였다(표 11). 비록 2 마리 수탉의 수정능력이 비교적 낮았지만, 이 닭들의 정액 생산이 빈약하였고 따라서 정액주입 당 정자 수도 낮았다. 2 마리 수탉의 수정능은 매우 양호하였고(>90%), 한 마리 닭의 수정능력은 중간 수준이었다. 모든 닭들에서 유래한 수정 달걀의 부화능은 정상 범위 내였다. 이러한 결과를 종합하면, 이들 결과는 BN/BN 닭의 번식 기능이 정상이라는 것을 의미한다.
[표 11]
Figure pct00014
BNN 이식유전자가 알데히드 디히드로게나제 유전자로 통합되어 동형접합성 닭의 생존에는 영향이 없었기 때문에 본 발명자들은 알데히드 디히드로게나제 메세지 전사를 평가하였다.
2 마리의 BN/BN 동형접합성 닭, 1 마리의 BN/+ 이형접합성 닭 및 1 마리의 야생형 닭(+/+)에서 채취한 혈액으로부터 Oligotex Direct mRNA Kit(Qiagen)를 사용하여 mRNA를 준비하였다. 제1 가닥 cDNA 합성을 위해 Thermo-Script RT-PCR 시스템(Invitrogen)을 사용하여 5 mL RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 하기 프라이머를 사용한 후속 PCR 반응에 1 mL cDNA를 사용하였다:
ALDH3A2-3 AGTGGTCACCGGGGGAGT (서열 번호 34)
ALDH3A2-4 TCACAGACACAATGGGCAGG (서열 번호 35)
액틴 RT-1 AAC ACC CCA GCC ATG TAT GTA (서열 번호 36)
액틴 RT-2 TTT CAT TGT GCT AGG TGC CA (서열 번호 37)
ALDH3A2-3 및 A2-4 프라이머(서열 번호 34, 35)는 알데히드 디히드로게나제 3 패밀리 구성원 A2 전사체에 대한 544 및 680 bp PCR 생성물을 증폭시켰다. 액틴 RT-1 및 RT-2 프라이머(서열 번호 36, 37)을 사용하여 액틴 전사체에 대한 597 bp PCR 생성물을 증폭하였다. 도 22에 도시한 바와 같이, 알데히드 디히드로게나제 3 패밀리 구성원 A2 전사체는 이형접합성(BN/+) 및 야생형 닭(+/+)에서는 검출되었지만, 동형접합성 BN 닭(BN/BN)에서는 관찰되지 않았는데 β 액틴-네오 이식유전자의 삽입이 형태적 표현형을 갖지 않는 알데히드 디히드로게나제 3 유전자의 삽입적 넉아웃을 일으켰다는 것을 의미한다.
상기 프라이머들이 알데히드 디히드로게나제 3 패밀리 구성원 A2 전사체를 증폭시켰다는 검증은 544 bp 및 680 bp PCR 생성물을 서열분석하여 수행하였다. 544 bp 생성물은 전체적으로, 엑손 5 와 6 사이의 136 bp 미스플라이싱 인트론을 또한 함유하는 680 bp PCR 생성물 내에 포함된다(도 23). 이들 서열을 공개된 닭 게놈과 비교한 결과 이들은 동일하였다.
실시예 27: 미지의 EST 로 β- 액틴 - gfp -bβ- 액틴 - 퓨로의 삽입
모세포주 54 유래 PGC를 성장시키고 5×106 세포를 20 ㎍의 선형 β-액틴-네오 구성체로 전기천공하고, 48-1 ㎠ 웰에 평판배양하여 단일 클론을 얻었다. 이 세포들을 네오마이신 존재하에서 성장시켜, 네오마이신 내성 클론을 성장시켰다. 내성 클론을 새로운 웰로 옮기고 증식시켰다. 세포를 서던 블롯 분석하여 이식유전자의 안정한 통합을 확인하였고 서열분석하여 구성체가 염색체 8에 새로운 유전자(EST C0769951)에 통합되었음을 확인하였다.
PGC 구성체를 성장시키고 13-16 단계(H)H 수용자 배아의 혈관구조에 주입하였다. 이 배아를 부화시키고 8 마리 수탉을 생식 성숙기까지 성장시키고 생식선 전이를 시험하였다. 상기 수탉의 생식선 전이율은 각각 0, 1, 11, 12, 13, 16, 28 및 92%였다. 이들 수탉에서 얻은 이형접합성 자손을 생식 성숙기까지 성장시키고 교배하여 동형접합성 자손을 얻었다(표 12).
[표 12]
Figure pct00015
이형접합성 수탉 및 암탉의 8 교배쌍은 총 298 마리 병아리를 생산하였으며 이들에 대해 BGBP 이식유전자 존재를 평가하였다. 총 90 마리 병아리(30%)가 야생형이었고, 128 마리 병아리(46%)가 이형접합성이었으며 80 마리 병아리(25%)가 동형접합성이었다. 이러한 결과는 25% 야생형, 50% 이형접합성 및 25% 동형접합성 자손의 예상치에 부합하는 것으로서 이식유전자가 멘델 법칙으로 유전되었음을 의미한다. 대부분의 동형접합성 자손은 부화 무렵 또는 부화시에 사망하였고 모든 병아리 중 95%는 6주령에 사망하였다. 이 결과는 BGBP 이식유전자의 삽입이 생존에 필수적인 유전자의 기능적 넉아웃을 일으켰음을 의미한다.
이러한 문제를 극복하기 위해서, 이식유전자를 비제어된 무작위 삽입부보다는, 사전에 결정된 위치에 삽입시키는 것이 이롭다. 게놈내 기지의 위치에 이식유전자를 삽입시키는 능력은 무작위 삽입보다 더욱 강력한 장점을 갖는다. 단백질 생성물의 과발현을 목적으로 삽입된 이식유전자는 높은 수준의 발현이 가능한 것으로 알려져 있고 이질염색질 침식에 의한 침묵을 겪지 않은 위치에 삽입될 수 있다. 또한, 이식유전자의 삽입은 이형접합 또는 동형접합 상태인, 동물 또는 세포주에 어떠한 유해한 영향도 야기하지 않을 것으로 예측할 수 있다. 따라서, 발현 수준이 높고 중요한 내인성 유전자를 파괴하지 않은 것을 찾기 위해 수많은 상이한 무작위 삽입물을 스크리닝할 필요가 없게 된다.
실시예 28. 조건부 아폽토시스 -유도 유전자( Reaper )를 보유하는 트랜스제닉 조류의 형성
Reaper 이식유전자의 고안
Reaper 이식유전자(LoxP-stop-LoxP-Reaper 구성체)를 다음과 같이 형성하였다. D. 멜라노가스터(D. melanogaster) 배아 폴리(A)+ RNA 및 REAPER F1(CAC CAG AAC AAA GTG AAC GA 서열 번호 38) 및 REAPER F2(TGT TTG ACA AAA AAT TGA TGC) 프라이머 서열 번호 39를 사용한 RT-PCT로 Reaper cDNA를 클로닝하였다. Reaper cDNA를 CX-골격의 RI 부위로 삽입하여 CX-Reaper 구성체를 형성하였다. KpnI 부위를 부위 지정 돌연변이유발법으로 개시 코돈의 Reaper cDNA 3' 프라임으로 삽입하였다. pBS302(Gibco/BRL)로부터의 1.5 kb LoxP-stop-LoxP 카세트를 KpnI 부위로 클로닝하여 CX-LoxP-stop-LoxP-Reaper를 형성하였다. RI 및 NotI 부위를 이용하여 pENTRB2 클론(Invitrogen)으로 LoxP-stop-LoxP-Reaper 단편을 삽입하였다. 그 다음 LoxP-stop-LoxP-Reaper 단편을 pLenti6/UbC/V5-DEST(pLenti Gateway Vector Invitrogen)으로 재조합하여 UbC-LoxP-stop-LoxP-Reaper 구성체를 형성하였다.
ViraPower 렌티바이러스 발현계를 이용한 트랜스제닉 조류의 생성
LoxP-stop-LoxP-Reaper 이식유전자를 보유하는 렌티바이러스를 형성하기 위해서, ViraPower 렌티바이러스 발현계(Invitrogen)를 이용하였으며, 최대 4.8 x 109 cfu/ml의 높은 렌티바이러스 역가를 형성하였다. 바이러스 생성을 위해서, 리포펙타민을 사용하여 VSV-G 코딩 플라스미드를 포함하는 virapower 패키징 혼합물과 UbC-LoxP-stop-LoxP-Reaper 구성체로 293T 세포를 동시 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후에 바이러스 상청액을 모으고, 원심분리로 농축하였다. 바이러스 현탁액으로 HT 1080 세포에 형질도입하여 바이러스 역가를 측정하였다. 고 역가로 인해 높은 형질도입 및 생식선 전이율이 얻어졌다.
바이러스로 닭 배아를 감염시키기 위해서 농축 바이러스 용액 1.5 ㎕를 X기 배아의 배하강으로 주입하였다. 37.5∼38℃에서 3일 동안 항온처리한 후에, 배아를 제2의 대리 난각으로 옮기고, 37.5∼38℃ 및 50% 습도에서 부화할 때까지 항온처리하였다. 총 398개의 배아에 UbC-LoxP-stop-LoxP-Reaper 이식유전자를 보유하는 바이러스를 주입하였다. 155 마리의 조류가 부화하였으며, 볏 조직으로부터 분리한 DNA 상에서의 PCR로 이식유전자의 존재 및 성별을 분석하였다. 13 마리의 수컷 병아리는 UbC-LoxP-stop-LoxP-Reaper 이식유전자에 대해 양성이었다. 이중 10 마리는 정액으로부터 분리한 DNA에서의 PCR에 의해 UbC-LoxP-stop-LoxP-Reaper 이식유전자에 대해서도 양성이었다. 3 마리의 수컷(6-03, 6-51 및 9-51 GO 시초 수컷)은 이식유전자를 다음 세대에 전이하였다. 6-03, 6-51 및 9-51의 전이 빈도는 각각 0.32%, 0.26 % 및 0.16%이었다(표 13).
[표 13]
6-03, 6-51 및 9-51 GO 수탉에 대한 생식선 전이 빈도
Figure pct00016
GO 시초 수컷(6-03, 6-51 및 9-51, 상이한 삽입체 보유)을 종계로 사육하고, 이의 G1 자손을 이식유전자의 존재 및 이식유전자의 통합 부위에 대해 분석하였다. 각 조류로부터의 게놈 DNA를 서던 블롯 분석으로 분석하였다. SphI 또는 BcII로 게놈 샘플 및 UbC-LoxP-stop-LoxP-Reaper 벡터(대조군)를 분해하였다. 분해된 DNA를 0.7% 아가로스 겔 상에서 분리하고, 나일론 막으로 블롯팅하고, 방사성 Reaper 특이적 프로브로 프로빙하여 연결 단편을 확인하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, 하이브리드화 게놈 단편의 크기는 대조군보다 크며, 이는 이식유전자가 통합되었음을 나타내는 것이다. 6-03, 6-51 및 9-51 종에 대한 하이브리드화 게놈 단편은 크기가 다르며, 이는 6-03, 6-51 및 9-51가 서로 독립적인 종임을 나타내는 것이다.
실시예 29. Cre - 리컴피나제를 보유하는 닭 형성
Cre 이식유전자의 고안 및 조립
닭에서 Cre 리컴비나제를 발현하기 위해서, Cre 유전자를 닭 ERNI 프로모터의 전사 조절 하에 배치한 이식유전자를 만들었다. ERNI 유전자(cENS-1로도 알려짐)는 조기 닭의 배아(배아가 장배형성 전의 세포의 미분화판인 경우 방금 낳은 알의 단계인 X기 부근), 및 신경 조직에서 발현된다. 따라서, Cre 이식유전자는 조기 배아에서 발현되도록 고안되어, LoxP-Reaper 이식유전자 또는 게놈 내에 위치한 다른 LoxP-함유 이식유전자의 LoxP 부위의 재조합을 촉진한다. Cre는 초기 단계에서 발현되기 때문에, 생성된 발생 닭은 모든 배엽층과 몸체의 모든 세포에서 재조합 이식유전자를 보유한다.
Cre 이식유전자를 닭의 생식선으로 도입하기 위해서, 렌티바이러스 벡터법을 취하였다. 렌티바이러스 이식유전자는 Invitrogen pLenti6-V5 Dest 렌티바이러스 벡터를 기초로하여 구성되었다. pLenti6-V5 Dest의 렌티바이러스 벡터 성분을 ERNI-Cre 유전자와 조합하여 pLenti-ERNI-Cre 구성체를 생성하였다. 렌티바이러스를 생성하고 사용하여 초기 배아를 감염시켰으며, 게놈으로 안정하게 통합되었다. pLenti-ERNI-Cre 이식유전자를 보유하는 약 20 마리의 트랜스제닉 시초 조류를 생성하였다.
닭 ERNI 프로모터는 하기 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시켰다:
ERNI -738: 5'-ATGCGTCGACGTGGATGTTTATTAGGAAGC-3' 서열 번호 40
ERNI +83: 5'-ATGCGCTAGCTGGCAGAGAACCCCT-3' 서열 번호 41
822 bp PCR 산물을 pGEM T-easy(Promega)로 클로닝하고 서열결정하였다. 그 다음 ERNI 프로모터를, SacII(이후, T4 DNA 폴리머라제로 블런트됨) 및 SpeI로 분해하여 벡터로부터 방출시켰다. ClaI(이후, T4 DNA 폴리머라제로 블런트됨) 및 SpeI로 분해하여 렌티바이러스 벡터 pLenti6 V5-Dest(Invitrogen)로부터 CMV 프로모터를 제거하였다. 그 다음 ERNI 프로모터를 pLenti6V5-Dest 렌티바이러스 벡터 골격에 결찰시키고, 그 내부의 CMV 프로모터를 ERNI 프로모터로 교체하여 pLenti-ERNI를 얻었다.
Cre 유전자는, 하기 프라이머와 함께 클로닝을 위한 편리한 제한 부위(5' 말단에서의 BglII 및 3' 말단에서의 EcoRI) 및 N-말단상에서의 SV40 핵 위치 서열을 이용하여 PCR 증폭시켰다:
Cre-C: 5'-CCG CCG GAG ATC TTA ATG CCC AAG AAG AAG AGG AAG CTG TCC AAT TTA CTG ACC GTA CAC-3' 서열 번호 42
Cre-Rl: 5'-TCGAATTCGAATCGCCATCTTCCAGCAGGCG-3' 서열 번호 43
1040 bp PCR 산물을 BglII 및 EcoRI로 분해하고 겔 정제하였다. 셔틀 벡터pENTR 2B(Invitrogen)를 BamHI 및 EcoRI로 분해하고, 벡터 골격을 겔 정제하였다. Cre PCR 산물을 pENTR 2B 벡터에 결찰시키고, 클론을 얻었다. 클론을 서열 결정하여 Cre 유전자가 예상대로 있는지, 그리고 PCR 증폭 과정에서 임의의 돌연변이를 획득하지는 않았는지 확인하였다.
Cre 유전자를 pLenti-ERNI 구성체로 재조합하고 ERNI 프로모터의 전사 제어 하에 배치하기 위해서, Cre 유전자원으로서 pENTR 2B-Cre 클론과 수용체로서 pLenti-ERNI 벡터를 사용하여 LR 클로나제 반응(Invitrogen)을 실시하였다. 따라서, 최종 구성체 pLenti-ERNI-Cre(8408 bp)를 얻었으며, 이를 이용하여 ERNI-Cre 이식유전자를 보유하는 렌티바이러스를 생성하였다.
pLenti - ERNI - Cre -이식유전자를 보유하는 트랜스제닉 조류의 생성
293FT 세포에서 pLenti-ERNI-Cre 렌티바이러스를 생성하였다. 렌티바이러스를 생성하기 위한 각각 293FT 세포로의 형질감염을 위해서, 75% 컨플루언시의 8백만 293FT 세포를, 리포펙타민 시약(Invitrogen)을 사용하여 3 ㎍ 환형 pLenti-ERNI-Cre 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. Virapower 패키징 혼합물(Invitrogen)을 사용하여 293FT 세포 중에서 렌티바이러스를 제조하는데 필요한 바이러스 단백질을 발현시켰다. 형질감염 2일 후에 렌티바이러스를 함유하는 세포 배양 상청액을 수거하고, 여과시켜 세포 파편을 제거하고, 90분 동안 48,000 g에서 원심분리하여 렌티바이러스 입자를 농축시켰다. 바이러스 펠릿을 배양 상청액의 초기 부피의 1/200에 재현탁시키고, 40 ㎕ 분액으로 -80℃에서 냉동시켰다.
렌티바이러스 종균을 10-4∼10- 8으로 연속 희석하고 1 ㎕ 폴리브렌을 이용하여 HT1080 배양물에 첨가하여 HT1080 세포 상에서 렌티바이러스 종균의 각 배치의 감염 역가를 측정하였다. 렌티바이러스 첨가 2일 후에, 블라스티시딘 선별(5 ㎍/ml)을 개시하였다. 블라스티시딘의 독성으로 인해 세포가 죽기 때문에 2일마다 배양 배지를 교체하였다. 블라스티시딘 선별을 개시한지 10일 후에, 크리스탈 바이올렛으로 콜로니를 염색하고, 계수하고, 역가를 계산하였다. 108∼2×109의 역가를 얻었다. 바이러스로 닭 배아를 감염시키기 위해서 농축 바이러스 용액 1.5 ㎕를 X기 배아의 배하강으로 주입하였다. 37.5∼38℃에서 3일 동안 항온처리한 후에, 배아를 제2의 대리 난각으로 옮기고, 37.5∼38℃ 및 50% 습도에서 부화할 때까지 항온처리하였다. 총 310개의 배아에 Erni-Cre 이식유전자를 보유하는 바이러스를 주입하였다. 96 마리의 병아리가 부화하였으며, 볏 조직으로부터 분리한 DNA 상에서의 PCR로 이식유전자의 존재 및 성별을 분석하였다. 8 마리의 수컷 병아리는 Erni-Cre 이식유전자에 대해 양성이었다. 13 마리 수컷은 정액으로부터 분리한 DNA에서의 PCR에 의해 Erni-Cre 이식유전자에 대해서도 양성이었다. 6 마리 수컷중 4 마리는 Erni-Cre 이식유전자를 다음 세대에 전이하였다. Erni-Cre GO 수탉의 생식선 전이 빈도는 0.24∼1.32%로 다양하였다(표 14).
[표 14]
Erni-Cre G0 수탉의 생식선 전이 빈도
Figure pct00017
pLenti - ERNI - Cre 이식유전자를 보유하는 트랜스제닉 닭의 분석
pLenti-ERNI-Cre 이식유전자가 닭의 게놈으로 온전히 통합되었는지를 확인하기 위해서, 서던 블롯 분석을 이용하였다. Cre 이식유전자를 보유하는 것으로 PCR에 의해 먼저 확인된 닭 유래의 게놈 DNA를 추출하여, 바이러스 5' 및 3' LTR 서열(BglII)에서 절단하는 효소로 분해하여 전길이의 온전한 이식유전자가 관찰되도록 하였다. 분석을 위해서, 서로 다른 독립적인 이식유전자 삽입체를 가지는 조류를 선택하였다. 게놈 DNA를 BglII 효소로 분해하고, 나일론 막으로 옮기고, 방사성 Cre 유전자로 프로빙하였다. 도 25는 8 ERNI-Cre 종의 대표적인 서던 블롯 결과를 도시한다. 시험된 11개의 종 중에서 10개의 종은 예측한 4.6 kb ERNI-Cre 이식유전자 밴드를 포함하였는데, 이는 이식유전자가 게놈 내로 온전히 통합되었음을 나타낸다. 하나의 종이 더 적은 밴드를 가지는데, 이는 이식유전자의 결실 또는 재배열을 나타내는 것이다.
실시예 30. 부위 특이적 이식유전자 통합이 가능한 세포주 확립
외래 DNA를 소정의 위치로 숙주 게놈으로 삽입하기 위한 2가지 주 방법, 즉 상동성 재조합(유전자 표적화) 또는 attP와 같은 인식 부위로의 부위 특이적 재조합이 있다. 상동성 재조합은 대부분의 척추동물 세포 유형에서는 비효율적이며, 일반적으로 목적하는 삽입체를 가지는 하나 또는 수 개의 클론을 동정하기 위해서 여러개의 클론을 스크리닝해야 한다. 부위 특이적 재조합은 다수의 클론을 스크리닝하지 않고 소정의 위치에 외래 DNA를 삽입하는데 사용할 수 있는 고 충실도, 고 효율의 공정이다. 부위 특이적 삽입은 게놈 내 배치된 고유의 attP 부위 또는 가성-attP 부위로 attB 함유 구성체를 삽입하는 phiC31 인테그라제의 사용에 따라 달라진다. 도킹 부위로서 게놈 내에 배치된 진정한 attP 부위를 사용하기 위해서, attP 부위를 원하는 소정 위치로 배치해야 한다. attP 부위를 무작위 삽입 또는 상동성 재조합으로 게놈 내의 원하는 위치에 둔다. 무작위 삽입으로 인식 부위를 게놈 내에 두는 경우, 삽입 위치에서 중요한 유전자가 파괴되지 않는다는 것이 입증되어야 한다. 게놈 내에 배치된 인식 부위는, phiC31 인테그라제를 이용하여 이식유전자의 삽입을 위한 "도킹 부위"로 기능한다.
도킹 부위에서 인테그라제 매개의 이식유전자 삽입체를 특이적으로 선별하기 위해서, 정확한 삽입체를 선별하기 위한 선별 마커 시스템을 사용한다. attP 부위가 프로모터 없이 (퓨로마이신 내성 유전자와 같은) 약물 선별 마커에 인접하도록 도킹 부위를 고안한다. 따라서 도킹 부위를 가지는 세포는 퓨로마이신을 이용한 약물 선별에 민감하다. 도킹 부위로 삽입하고자 하는 이식유전자는 attB 부위에 인접한 프로모터를 포함하지만, 선별 가능한 마커는 포함하지 않는다. 도킹 부위로 이식유전자를 삽입하면 선별 가능한 마커의 상류에 프로모터가 배치되어, 전사를 활성화시키고 퓨로마이신 내성을 부여한다. 이식유전자를 게놈 내의 다른 위치에 삽입하면 약물 내성을 유도하지 않으며, 그러한 삽입체는 약물 선별에 의해 제거된다.
attP 도킹 부위 구성체는 퓨로마이신 내성과 같이 프로모터를 포함하지 않는 약물 선별 가능한 마커에 인접하여 배치된 attP 부위로 구성된다. 퓨로마이신 내성 유전자가 발현되지 않기 때문에, 네오마이신 선별 가능한 마커를 구동시키는 β-액틴 프로모터와 같은 또 다른 선별 가능한 마커가 또한 포함되어야 한다. EGFP 유전자도 포함되어야 한다. 이들 성분의 각 측면에 측접하여 2 카피의 β-글로빈 HS4 절연체가 있어서 인접 크로마틴으로부터 구성체를 절연 처리하였다. 구성체의 EGFP 부분 및 β-액틴 neo를 추가로 제거하기 위해서, 이들 성분에 측접하여 LoxP 부위가 배치된다. 구성체의 이들 부분 모두는 진정한 attP 부위를 게놈으로 전이하기 위한 비히클로서 작용한다. DNA 성분의 순서는 HS4; attP; 프로모터가 없는 퓨로마이신 내성 유전자; LoxP; β-액틴 또는 CAG 프로모터; EGFP; β-액틴 또는 CAG 프로모터; 네오마이신 내성 유전자; HS4; 플라스미드 골격(pBluescript)이다. 이 구성체를 선형화하고 배양된 PGC를 형질감염시키고, 약물 내성 콜로니를 얻는다. 이들 콜로니를 추가 분석을 위해 증식시킨다.
게놈 내에 도핑 부위의 위치를 아는 것이 중요하기 위해서, 각 클론 내의 도킹 부위 구성체의 염색체 삽입 부위를 결정한다. 측접 게놈 DNA를 얻고, 서열 결정하고 닭 게놈 데이타베이스와 비교한다. 대부분의 클론은 CpG 섬에 삽입되는 것으로 확인되는데, 이는 유전자, 특히 하우스키핑(housekeeping) 및 편재 유전자의 프로모터 영역과 정상적으로 연결된 게놈의 영역이다. 또한, 대부분의 삽입체는 유전자의 프로모터 영역, 제1 엑손 또는 제1 인트론 내에 있는 것으로 확인된다. 따라서, 다수의 삽입체는 이들 유전자의 기능을 파괴하는 것으로 예측된다(실시예 29; 표 8 참조). 이들 유전자는 발현 서열 태그(EST) 서열을 기초로 한 알려진 유전자이거나 또는 예상 유전자이다. 바람직한 세포주는, DOC1 또는 DOC33와 같이 유전자를 파괴하지 않는 것으로 보이는 것들이다.
도킹 부위의 CAG-EGFP-CAG-neo 부분은 Cre-Lox 재조합으로 결실시킬 수 있다. Cre-Lox 재조합 후에, 도킹 부위에 남은 모든 것은 HS4 절연체, attP 부위, 및 프로모터가 없는 puro 유전자이다. 이는 세포 및 트랜스제닉 닭에서 생성되는 외래 단백질의 수를 감소시키며, 이는 특히, CAG 또는 β-액틴과 같은 강력한 프로모터로부터 편재적으로 발현되는 경우 건강에 영향을 줄 수 있다. Cre-Lox 재조합은, 환형 Cre-발현 벡터로 도킹 부위 클론을 일시적으로 형질감염시켜서 세포 배양물에서 실시할 수 있다. 수 일 후에, CAG-EGFP 유전자를 절단하여 유발되는 EGFP 발현 상실에 대해 배양물을 모니터링한다. 세포의 약 50%는 더 이상 EGFP를 발현하지 않으며, 이들 세포를 유세포 분석법으로 분류하여 정제할 수 있다(도 26).
대안적으로, 도킹 부위 구성체를 보유하는 트랜스제닉 닭을 ERNI-Cre 이식유전자(Cre4 조류)를 보유하는 닭과 교배하여 Cre 재조합을 실시할 수 있다.
도킹 부위 통합을 보유하는 트랜스제닉 닭이 만들어진 경우, 생성되는 동형접합성 닭은 유전자 내에 삽입체를 가짐에도 불구하고 건강하며 생식력이 있을 수 있다. 이러한 세포주의 예는 TP85 세포주(BN이라고도 함; 실시예 26 참조)이며, 유전자의 삽입체는 닭 19번 염색체 상에 알데히드 데히드로게나제 3 패밀리 구성원 A2를 코딩한다. 상기 구성체는 HS4-절연 β-액틴 neo 이식유전자이며, 유전자의 전사 개시 부위 약 10 bp 내에 프로모터 영역으로 삽입된다. 삽입체에 대한 조류 동형접합체는 건강하고 생식력이 있다.
그러나, 일부 경우에 삽입체는 유해 효과, 예컨대 발육 장애, 해부학적 또는 생리학적 결함, 불임 등을 유발할 수 있다. 실시예 27 참조. 따라서, 무작위로 삽입된 도킹 부위 삽입체가 동물 내에 임의의 유해 효과를 유발하지 않는다는 것을 입증하는 것이 중요하다.
실시예 31: 10.5 kb 이상의 발현 DNA 로 이루어지는 도킹 세포주의 확립
Doc-1 세포주는 HS4; attP; 프로모터가 없는 퓨로마이신 내성 유전자; LoxP; CAG 프로모터; EGFP; CAG 프로모터; 네오마이신 내성 유전자; HS4로 이루어진 이식유전자를 보유한다(실시예 29 참조). 상기 구성체를 선형화하여 배양된 PGC로 형질감염시키고, 약물 내성 콜로니를 얻었다. 추가 분석을 위해 이들 콜로니를 증식시켰다. 수용체 배아로 Doc-1 세포주를 주입하고 G0 키메라 병아리를 부화시켰다. 수탉을 성 성숙시키고, 그 정자를 GFP 양성 정자의 존재에 대해 FACS 분석으로 분석하였다. 교배를 위해 2 마리의 수탉을 선별하였으며 생식선 전이율은 3% 및 8%였다. GFP 양성 병아리로부터 혈액을 채취하고 도킹 부위의 존재를 확인하는 서던 분석으로 분석하였다(도 27).
실시예 32: 표적화된 도킹 부위 삽입
진정한 attP 부위가 유전자의 CpG 섬 내에 배치되는 것을 피하기 위해서, 닭 게놈 내 소정의 부위에 attP 부위가 배치되도록 유전화 표적화법을 이용할 수 있다. 게놈의 영역을 선별하고, 고충실도의 PCR 또는 플라스미드 벡터내의 게놈 클로닝으로 상동성 암을 제조하고, PGC 클론의 형질감염 및 선별을 위해서 표적화 벡터를 선별 가능한 마커와 조립한다.
실시예 33: 도킹 부위를 보유하는 세포주로의 부위 특이적 삽입
도킹 부위로 삽입하기 위해서, attB 부위를 함유하는 환형 구성체를 구성한다. attB 함유 구성체는 상기 실시예에 사용된 것과 유사하지만, 선별 가능한 마커가 없다는 중요한 차이가 있다. 대신에, 프로모터(예, ERNI 프로모터)가 attB 부위에 인접 배치되어, 도킹 부위로의 통합시 프로모터가 도킹 부위 내의 선별 가능한 마커의 발현을 유도하는 위치에 배치되도록 한다.
프로모터-attB 골격을 attP-프로모터가 없는 puro 도킹 부위로의 삽입을 위한 선별에 이용할 수 있다. attB 구성체는 다른 관심 유전자, 예컨대 항체와 같은 약학 단백질을 코딩하는 유전자 발현을 유도하는 조직 특이적 프로모터를 보유한다.
도킹 부위의 기능 및 도킹 부위 내의 통합 효율은 도킹 부위를 함유하는 PGC 세포주에서 시험하였다. 5×106 세포를 Erni-attB를 함유하는 구성체 0.5 ㎍ 및 인테그라제를 발현하는 환형 구성체 0.5 ㎍로 동시형질감염시켰다. 전기천공 후에, 단일 콜로니를 얻기 위해 세포를 48-1 cm2 웰에 다시 플레이팅하였다. 48개의 웰 중 42개 웰에서 콜로니가 관찰되었다.
PCR 결과, attP와 attB의 재조합으로 생성된 attL 부위의 증폭으로 ERNI-attB 구성체가 도킹 부위로 정확하게 통합되었다는 것을 확인하였다. 하나의 프라이머가 ERNI 서열 내에 있고 하나의 프라이머는 퓨로마이신 서열 내에 있으며, ERNI 프로모터가 퓨로마이신 유전자의 상류에 통합되면 증폭이 일어날 수 있다. 3개의 프라이머 세트를 사용하여 생성된 모든 양성 결과는 다음과 같다:
ERNI-37F + puro-8R 산물 크기 152 bp
ERNI-133F + puro-8R 산물 크기 248 bp
ERNI-342F + puro-83R 산물 크기 522 bp
프라이머 서열:
ERNI-37F ACCACGGCAACGGGAGAGGCTTAT 서열 번호 44
ERNI-133F TTGCTCAAGCCCCCAGGAATGTCA 서열 번호 32
ERNI-342F TGGGCAAAGGCAGAGGAATC 서열 번호 45
puro-8R CGAGGCGCACCGTGGGCTTGTA 서열 번호 33
puro-83R GCGTGGCGGGGTAGTCG 서열 번호 46
DOC2 세포로 ERNI-attB 형질감염시켜 얻은 4개의 독립적인 클론을 PCR에 의해 테스트하였으며, 4개의 모든 클론은 모두 3개의 프라이머 세트를 갖는 정확한 크기의 증폭 산물을 나타냈다. ERNI-133F 서열 번호 32 + puro-8R 서열 번호 33 프라이머로 형성한 PCR 산물을 클로닝하여 서열결정하여 PCR 산물이 옳은 지 확인하였다. 서열은 예측한 attL 서열(attB 및 attP의 조합)과 완전히 매칭되고 예측한 부분적 ERNI 및 퓨로마이신 서열을 포함하였다. 따라서, 인테그라제 매개의 재조합 교차 사건이 attB 및 attP 부위 내의 정확한 코어 뉴클레오티드에서 일어나며, 진짜인 것으로 확인되었다.
실시예 34: Cre 는 닭 배아에서 LoxP 부위를 효과적으로 재조합한다
온전한 pLenti-ERNI-Cre 이식유전자를 갖는 10개의 Cre 세포주(및 재배열된 ERNI-Cre 이식유전자를 갖는 1개의 세포주)를 Cre 재조합효소 활성에 대해 시험하였다. ERNI 프로모터가 초기 배아에서 Cre 재조합효소의 고도 발현을 구동하는 것으로 기대되더라도, 이식유전자가 게놈의 바람직하지 않은 구역으로 통합이 일어나는 경우 침묵할 수 있다(이러한 현상은 '위치 효과'로 알려져 있음). 따라서, 원하는 활성도를 갖는 세포주 또는 세포주들을 선별하기 위해 Cre 세포주 모두에서 Cre 재조합효소의 전부에서 활성을 측정하는 것이 중요하다.
Cre 이식유전자의 활성도를 측정하기 위해, Cre가 1개의 카피수의 Cre 이식유전자 및 1개의 카피수의 LoxP 이식유전자를 보유하는 2중 트랜스제닉 배아에서 LoxP-리퍼 이식유전자의 재조합을 촉매하는 능력을 서던 블롯으로 분석하였다. LoxP-리퍼 이식유전자는 동일한 배향으로 LoxP 부위에 인접한 1.4 kb 서열(중지 카세트라 칭함)을 함유하였다. 2개의 LoxP 부위 간의 재조합에 의해 염색체로부터 1.4 kb 개재 서열이 절단되어 단일 LoxP 부위가 남는다. 이후, 개재 서열은 염색체에 더 이상 연결되어 있지 않기 때문에 소실되었다. 절단 후, LoxP-리퍼 이식유전자는 크기가 1.4 kb 감소하였다. LoxP-리퍼 이식유전자의 크기 감소가 Cre 재조합효소 활성을 측정하는 데 사용되는 서던 블롯 검정이 개발되었다. 제한 효소 SacI에 의한 분해로 리퍼 유전자 및 렌티바이러스 벡터 백본의 일부(블라스티시딘 유전자 및 SV40 서열)로 이루어진 프로브에 하이브리드화될 때 대략 2.8 kb의 (재조합되지 않은) 전장 LoxP-리퍼 단편이 생성되었다. Cre 매개 재조합 및 1.4 kb 중지 서열의 절단시, 리퍼 SacI 단편은 동일한 프로브로 혼성화될 때 크기가 대략 1.4 kb 감소하였다. 상기 프로브는 Cre 재조합에 의해 영향을 받지 않는 서열에 하이브리드화하여 전장 LoxP-리퍼 이식유전자 및 재조합 LoxP-리퍼 이식유전자 둘 다에 동등하게 하이브리드화하였다.
다양한 pLenti-ERNI-Cre 트랜스제닉 세포주에 의해 발현된 Cre 활성도를 산출하기 위해, (재조합되지 않은) 전장 이식유전자 및 재조합된 이식유전자의 띠 강도의 비를 측정하였다. Cre가 활성이 아닌 경우, 재조합된 리퍼가 관찰되지 않거나 거의 관찰되지 않으며, 전장만이 관찰되었다. Cre가 적당히 활성인 경우, SacI 단편 둘 다가 관찰되었으며, 이는 일부 세포에서는 재조합이 일어나지만 다른 세포에서는 재조합이 일어나지 않는다는 것을 나타낸다. Cre가 매우 활성인 경우, LoxP-리퍼 이식유전자가 모든 세포에서 재조합되기 때문에 재조합된 리퍼 띠만이 관찰되었다.
Cre 세포주의 활성을 요약한 데이터가 도 28에 도시되어 있다. 시험된 11개의 세포주에서의 Cre 활성은 세포주들 간에 꽤 달랐으며, 몇몇 경우에는 또한 세포주들 내에서도 그러하였다. 11개의 세포주 중 1개의 세포주만이 100%의 LoxP-리퍼 이식유전자(Cre4 세포주) 재조합을 촉매하였다. 이러한 세포주에서, 시험된 모든 배아(18개의 배아 중 18개의 배아) 100%의 재조합을 나타냈다. 다른 세포주에서, 재조합률은 약 5% 내지 약 80% 범위였다.
상기 몇몇 세포주(Cre1, Cre2, Cre11 및 Cre20)의 경우 재조합률에서 배아마다 변동성이 유의적이였다. 예를 들면, Cre11 및 Cre20은 일부 배아에서는 오직 약 10%의 재조합을 촉매하였지만, 다른 배아에서는 60% 이하의 재조합을 촉매하였다. 대부분의 배아의 경우, 뇌 및 골격근 조직을 분석하였고, 재조합률은 모든 경우에 조직 둘 다에서 비슷하였다. ERNI 프로모터가 신경 조직에서 활성인 것으로 생각되므로, 뇌에서는 아마도 재조합률이 증가할 것이라 예상되었지만, 뇌 및 근육에서의 재조합률은 항상 거의 같았다. 관찰된 Cre 재조합효소 활성의 변동이 Cre 발현율의 변동에 의한 것인지 또는 Cre 활성이 발현되는 시간의 변동에 의한 것인지 불명확하다. 예를 들면, Cre4 세포주에서 Cre는 낮은 발현도로 연속적으로 발현되어 발생 15일까지 누적 재조합률이 100%일 수 있는 반면, 다른 세포주에서는 모든 세포에서 재조합이 일어나기 전 초기에 Cre 발현에 침묵할 수 있다. 또는, Cre4는 초기 발생에서만 Cre 단백질을 매우 높게 발현하여, 100%의 재조합률을 촉매할 수 있다.
재조합을 나타내지 않은 유일한 세포주는 재배열된 또는 결실된 이식유전자를 갖는 세포주였다.
실시예 35: 상이한 리퍼 삽입을 보유하는 3개의 닭 세포주의 성공적인 재조합
pLenti-ERNI-Cre 트랜스제닉 닭에서 Cre 재조합효소가 상이한 LoxP 기질의 재조합을 촉매할 수 있는 것을 입증하기 위해, Cre4 세포주를 3개의 상이한 LoxP-리퍼 세포주(6-03, 6-51 및 9-51이라 칭함)에 교차하였다. Cre4 세포주를 선택하였는데, 왜냐하면 이는 이전에 100%의 재조합률을 보였기 때문이다. 1개의 LoxP-리퍼 이식유전자 및 1개의 카피수의 Cre4 이식유전자를 유전받은 배아를 선별하였다.
3개의 LoxP-리퍼 이식유전자의 재조합률을 결정하기 위해, Cre가 1개의 카피수의 Cre 이식유전자 및 1개의 카피수의 LoxP-리퍼 이식유전자를 보유하는 2중 트랜스제닉 배아에서 재조합을 촉매하는 능력을 서던 블롯으로 분석하였다. LoxP-리퍼 이식유전자는 동일한 배향으로 LoxP 부위에 인접한 1.4 kb 서열(중지 카세트라 칭함)을 함유하였다. 2개의 LoxP 부위 간의 재조합에 의해 염색체로부터 1.4 kb 개재 서열이 절단되어 단일 LoxP 부위가 남는다. 이후, 개재 서열은 염색체에 더 이상 연결되어 있지 않기 때문에 소실되었다. 절단 후, LoxP-리퍼 이식유전자는 크기가 1.4 kb 감소하였다. LoxP-리퍼 이식유전자의 크기 감소가 Cre 재조합효소 활성을 측정하는 데 사용되는 서던 블롯 검정이 개발되었다. 제한 효소 SacI에 의한 분해로 리퍼 유전자 및 렌티바이러스 벡터 백본의 일부(블라스티시딘 유전자 및 SV40 서열)로 이루어진 프로브에 하이브리드화될 때 대략 2.8 kb의 (재조합되지 않은) 전장 LoxP-리퍼 단편이 생성되었다. Cre 매개 재조합 및 1.4 kb 중지 서열의 절단시, 리퍼 SacI 단편은 동일한 프로브로 혼성화될 때 크기가 대략 1.4 kb 감소하였다. 상기 프로브는 Cre 재조합에 의해 영향을 받지 않는 서열에 하이브리드화하여 전장 LoxP-리퍼 이식유전자 및 재조합 LoxP-리퍼 이식유전자 둘 다에 동등하게 하이브리드화하였다.
각각의 LoxP-리퍼 세포주에서 Cre-Iox 재조합률을 산출하기 위해, 재조합된 이식유전자에 대한 (재조합되지 않은) 전장 이식유전자의 띠 강도의 비를 측정하였다. Cre4가 모든 3개의 리퍼 세포주에서 중지 카세트를 절단할 수 있는 경우, 모든 세포에서 LoxP-리퍼 이식유전자가 재조합되므로 재조합된 리퍼 띠만이 관찰되었다. 도 29에 도시된 결과는 모든 3개의 리퍼 세포주가 Cre4 이식유전자의 존재하에 중지 카세트가 100% 절단된다는 것을 보여준다.
실시예 37: 닭 게놈에서 통합된 결합 지점으로부터 EGFP 및 네오의 Cre 매개 절단
Cre 재조합을 배양된 PGC에서 및 트랜스제닉 새에서 시험관내 수행하였다. 배양된 PGC에서 Cre-Iox 재조합을 수행하기 위해, 세포를 일시적으로 Cre 발현 벡터로 형질감염시켰다.
Cre 발현 벡터로 형질감염시키는 데 DOC2 세포를 사용하였다. 이 PGC 세포주는 Prkz 및 몇몇 EST에 연결된 CpG 섬에서 21번 염색체에 통합된 결합 지점 구성체를 보유하였다. 출발 DOC2 배양물에서의 모든 세포는 녹색을 형광하였는데, 왜냐하면 이는 결합 지점 구성체에서 CX-EGFP 유전자를 보유하기 때문이다. 2개의 Cre 발현 벡터, 즉 인간 CMV 프로모터의 전사 조절하에 Cre 유전자를 갖는 pBS 185, 또는 ERNI 프로모터가 Cre 발현을 구동하는 ERNI-Cre 구성체를 사용하였다.
Cre 발현 구성체는 일시적으로 DOC2 세포로 형질감염되었다. 수일 후, 배양물을 세포가 Cre 구성체를 흡수하였는지, Cre를 발현하였는지, Cre가 CX-EGFP-CX-네오를 비롯하여 결합 지점 벡터에서 LoxP 부위 사이의 서열을 절단하였는지에 대한 지표자로서 녹색 형광을 모니터링하였다. Cre 형질감염 후, 배양물은 녹색 세포와 비녹색 세포로 이루어졌다. 2개의 군집을 정제하기 위해, 배양물을 유세포 측정법에 의해 녹색 형광에 기초하여 분류하였다. 각 군집(녹색 및 비녹색)으로부터 수백만 세포를 수집하였다.
EGFP 유전자가 세포의 비녹색 군집에서 절단되는 것을 증명하기 위해, 서던 블롯 분석을 사용하였다(참조 도 30). 2개의 세포 군집(녹색 및 비녹색)으로부터 게놈 DNA를 준비하고 HindIII 제한 효소에 의해 분해하였다. DNA를 아가로스 겔에서 분획하고, 나일론 막으로 옮기고 결합 지점에 존재하는 퓨로마이신 내성 유전자로부터 방사선 표지된 서열과 하이브리드화하였다. 퓨로 유전자는 Cre-Iox 재조합에 의해 절단되지 않은 결합 지점 구성체의 구역이어서 퓨로 프로브는 DOC2-절단 세포 및 비절단 세포 둘 다로부터 게놈 DNA에서 단편을 검출할 수 있을 것이다. 예상된 크기의 HindIII 단편은 다음과 같다: EGFP+(비절단), 5521 bp; EGFP-(절단), 1262 bp. 절단 단편을 관찰하였고, 이로써 비녹색 세포에서 Cre-Iox 재조합은 DOC2 세포에서 통합된 결합 지점 구성체에서 2개의 LoxP 부위 사이에 있는 CX-EGFP-CX-네오 서열이 결실되는 것을 나타났다.
실시예 38: IgL pKO5B 표적화 벡터의 생산
닭 IgL 유전자좌를 표적화하기 위해, 표적화된 통합시 유전자좌의 내인성 J 구역 및 C 구역이 결실된 표적화 벡터를 생산하였다(도 31). 벡터는 상기 기재된 IgL pKO5과 동일하지만, 선별 가능한 마커를 변화시켰다. 벡터에서 5' 상동성 구역은 IgL V 구역 근처에 2327 bp 단편으로 이루어지고, 3' 상동성 구역은 C 구역의 하류로부터 6346 bp 단편으로 이루어진다. 상동성 암을 표적화 형질감염에 사용된 세포주로부터 얻은 동질유전자 DNA로부터 클로닝하였다. 표적화 구성체는 하나 이상의 방식을 함유하여 중지 코돈, 넌센스 서열, attP 부위 또는 이들의 조합과 같은 발현을 파괴시켰다. 또한, 벡터는 선별 가능한 마커 유전자 및 부위 특이적 재조합 부위를 함유하였다.
HS4 ERNI - 네오: 804 bp 네오마이신 내성 유전자를 PGC에서 발현을 위해 800 bp ERNI 프로모터의 전사 조절하에 두었다. 닭에서의 ERNI 발현을 매우 초기 배아로 제한하여서 선별 가능한 마커가 성체 닭에서 발현되지 않아야 한다. 닭 β-글로빈 유전자좌로부터 250 bp 코어 HS4 절연체 요소를 반복적으로 중복시켰고 중복된 절연체를 ERNI-네오 선별 가능한 마커의 양측에 위치시켰다. (Cre 매개 재조합의 경우) 단일 LoxP 부위를 HS4-ERNI-네오의 상류로 클로닝하였다.
LoxP = ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT (서열 번호 47)
attP - 퓨로: 600 bp 퓨로 유전자를 프로모터 없이 (phiC31 매개 재조합의 경우) 43 bp attP 부위에 연결시켰다. 이후, attP-퓨로를 HS4-ERNI-네오의 하류로 클로닝하였다.
함께, LoxP-HS4-ERNI-네오-attP-퓨로 선별 가능한 마커 카세트는 4089 bp이었다.
attP = ACGCCCCCAACTGAGAGAACTCAAAGGTTACCCCAGTTGGGGC (서열 번호 48)
5' 상동성 암: PGC35 IgL SacI 클론으로부터 얻은 1994 bp NcoI-BamHI 단편 + PGC35 게놈 DNA로부터 증폭된 333 bp NotI-NcoI PCR 생성물을 (프라이머 5'-NotI, TTCTTGCGGCCGCAGGGAGCCATAGCCTGCTCCCATCATGCCC(서열 번호 49) 및 3'-NcoI, AGAGGAGCCCAGGCCATGGCGGAAT)(서열 번호 50)과 함께) 결찰하여 2327 bp 단편을 생성시켰다.
PCR 단편은 중첩 게놈 NcoI 부위를 함유하여 2개의 단편을 함께 연결시켰다.
수득된 2327 bp 단편을 HS4 ERNI-퓨로의 상류로 pKO 벡터 백본으로 클로닝하기 위해 Nod 및 BamHI와 함께 방출시켰다. NotI 부위가 게놈에 존재하지 않았지만, PCR에 의해 첨가하였다.
3' 상동성 암: 다음의 3개의 단편을 함께 결찰하여 6346 kb Spel - BglII 단편을 생성시켰다: SacI 게놈 클론으로부터 얻은 Spel - EcoRl 단편 + EcoRI-Mfel 게놈 클론으로부터 얻은 EcoRl - ApaLI 클론 + EcoRI-Mfel 클론으로부터 증폭된 300 bp ApaLI - BglII PCR 단편 (프라이머 5' ApaL, AGTGCAGCTGCAGTGCACGGTA(서열 번호 51) 및 3'-BglII, TTCTTAGATCTGTGACAAGCAGTCTCCGGTTAACA(서열 번호 52))
BglII 부위가 게놈에 존재하지 않았지만, PCR에 의해 첨가하였다. 3' 상동성 암은 HS4 ERNI-퓨로와 HS4 β-액틴 EGFP 사이에서 pKO 벡터 백본으로 클로닝되었다.
HS4 β- 액틴 EGFP: 700 bp EGFP 유전자의 발현을 구동하기 위해 1.3 kb 닭 β-액틴 프로모터를 사용하였다. 1개의 카피수의 중복된 HS4 절연체를 말단에 첨가하여 위치 효과로부터 무작위로 삽입된 표적화 벡터를 절연 처리시키고 EGFP를 발현시켰다.
최종 IgL pKO5B 표적화 벡터는 크기가 17,681 bp였고, PGC로 형질감염되기 전에 NotI로 직선화시켰다.
실시예 39: PGC 의 형질감염 및 KO -07 IgL 넉아웃 PGC 세포주의 생성
전기영동 완충액(Amaxa로부터의 V 완충액) 100 ㎕ 중의 38 액적의 5×106 세포를 10 ㎍ DNA 각각으로 형질감염시켰다. 모든 액적을 Amaxa 뉴클레오펙터 펄스 A33(Amaxa)로 전기영동시켰다. 9개의 클론을 얻었고, 그 중 4개는 GFP-양성이었고 추가로 실행하지 않았다. 5개의 비-GFP 발현 클론을 서던 분석을 위해 확장시키고 명칭 KO-07, KO-08, KO-09, KO-10 및 KO-11을 붙였다.
실시예 40: 서던 블롯 분석
상동성 재조합의 5' 측면의 경우, IgL pKO5B에 의해 형질감염된 5개의 클론 PGC 세포주로부터 게놈 DNA를 SacI 제한 효소에 의해 분해시키고 0.7% 아가로스 겔에서 분획시켰다. DNA를 나일론 막으로 이동시키고 상동성 암으로서 사용된 구역으로부터 상류에서 닭 IgL 유전자좌로부터 프로브(즉, 외부 프로브)와 하이브리드화시켰다. 상기 프로브는 0.5 kb SacI-BstEII 단편이고, 대략 10 kb의 야생형 단편 및 대략 4 kb의 돌연변이체 단편을 검출하였다(도 32, 왼쪽 패널). 표적화의 3' 측면의 경우, 게놈 DNA를 BstEII에 의해 용해시키고 블롯을 표적화 벡터에 외부인 3' 1.7 kb Nsil-Mfel 단편과 하이브리드화하였다(도 32, 오른쪽 패널).
실시예 41: 생식선 키메라의 생성
15~16 단계(Hamburger&Hamilton)에서 3000개의 PGC를 배대동맥으로 배아당 주입하였다. 배아를 대리 껍질에서 배양하였다. 부화된 병아리를 성 성숙도로 성장시켰다.
키메라 수탉을 인공 수정에 의해 야생형 바드 록(Barred Rock) 암탉으로 짝짓기시켰다. 정액을 9 마리의 수탉으로부터 수집하고 암탉을 수정시키기 위해 사용하였다. 30 마리 중 6 마리의 수탉은 검정색 깃털 표현형을 자손으로 전이시켜, IgL 넉아웃 PGC의 생식선 전이를 나타냈다(표 1). 수탉 중 1 마리(IV75-41)는 50% 이상의 속도로 전이시켰다.
표 15. IgL 넉아웃 PGC로 이루어진 9 마리의 키메라 수탉에서 IgL 넉아웃의 생식선 전이 속도. (넉아웃 PGC의 생식선 전이를 나타내는) 각각의 수탉에 의해 종웅된 검정색 후대의 수 및 (숙주 PGC로부터의) 흰색 후대의 수를 기재하였다. 검정색 후대를 종웅한 수탉을 볼드체로 기재하였다.
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실시예 42: 넉아웃 배아의 서던 블롯 분석
발생 14일에 검정색 깃털의 배아를 안락사시키고 골격근으로부터 게놈 DNA를 준비하였다. 넉아웃이 실험에서 시험된 7개의 배아 중 5개의 배아(2번, 3번, 4번, 6번 및 7번 배아)로 전이됨을 보이는 서던 블롯을 수행하였다. 1번 배아 및 5번 배아는 이형접합성 표적화 KO-07 넉아웃 PGC로부터 야생형 IgL 대립유전자를 유전받은 야생형 배아였다(도 33).
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Claims (20)

  1. 내인성 유전자좌의 선택된 부분의 결실을 포함하는 트랜스제닉 닭.
  2. 제1항에 있어서, 파괴된 내인성 유전자는 면역글로불린 유전자좌인 트랜스제닉 닭.
  3. 제2항에 있어서, 파괴된 내인성 유전자는 면역글로불린 중쇄 유전자좌인 트랜스제닉 닭.
  4. 제2항에 있어서, 파괴된 내인성 유전자는 면역글로불린 경쇄 유전자좌인 트랜스제닉 닭.
  5. 제2항에 있어서, 파괴된 내인성 유전자는 V-유전자 분절, J-유전자 분절, C-유전자 분절 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 분절의 검출을 포함하는 것인 트랜스제닉 닭.
  6. 제1항에 있어서, 파괴된 내인성 유전자좌는 표적화 구성체를 포함하는 것인 트랜스제닉 닭.
  7. 제1항에 있어서, 상기 표적화 구성체는 중지 코돈, att-p 부위, 넌센스 서열 또는 이들의 조합을 상기 내인성 유전자좌에 삽입하는 것인 트랜스제닉 닭.
  8. 제6항에 있어서, 상기 표적화 구성체는 내인성 유전자좌에 대한 2개의 상동성 구역 및 상기 상동성 구역 사이에 위치한 선별 가능한 마커를 포함하는 것인 트랜스제닉 닭.
  9. 제2항에 있어서, 중쇄 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 및 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자 둘 다의 기능 파괴를 포함하는 트랜스제닉 닭.
  10. 제1항에 있어서, 상기 내인성 유전자좌의 결실 부분은 10 kb 이상을 포함하는 것인 트랜스제닉 닭.
  11. 트랜스제닉 닭을 생산하는 방법으로서,
    표적화 구성체가 세포 게놈으로의 안정한 통합에 의해 내인성 유전자의 적어도 일부를 파괴하도록 표적화 구성체를 닭 원시 생식 세포에 도입하는 단계,
    상기 닭 원시 생식 세포를 닭 배아에 삽입하는 단계, 및
    상기 닭 배아로부터 트랜스제닉 닭을 부화시키는 단계
    를 포함하고, 이 트랜스제닉 닭은 내인성 유전자의 기능 파괴를 포함하는 것인 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 내인성 유전자는 면역글로불린 유전자인 생산 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 면역글로불린 유전자는 경쇄 유전자인 생산 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 면역글로불린 유전자는 중쇄 유전자인 생산 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 표적화 구성체는 V-유전자 분절, J-유전자 분절, C-유전자 분절 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 분절을 결실시키는 것인 생산 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 표적화 구성체는 중지 코돈, 넌센스 서열, att-p 부위 또는 이들의 조합을 삽입하는 것인 생산 방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 표적화 구성체는 내인성 유전자에 대한 2개 이상의 상동성 구역을 포함하는 것인 생산 방법.
  18. 제17항에 있어서, 세포 게놈으로의 표적화 구성체의 통합은 이 표적화 구성체와 내인성 유전자 간의 2개의 상동성 구역 사이에 위치한 선별 가능한 마커를 배치시키는 것인 생산 방법.
  19. 제11항에 있어서, 상기 표적화 구성체는 양성 선별 마커를 포함하는 것인 생산 방법.
  20. 제11항에 있어서, 상기 표적화 구성체는 음성 선별 마커를 포함하는 것인 생산 방법.
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