WO2023127903A1 - 始原生殖細胞が富化された胚を調製する方法 - Google Patents

始原生殖細胞が富化された胚を調製する方法 Download PDF

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WO2023127903A1
WO2023127903A1 PCT/JP2022/048314 JP2022048314W WO2023127903A1 WO 2023127903 A1 WO2023127903 A1 WO 2023127903A1 JP 2022048314 W JP2022048314 W JP 2022048314W WO 2023127903 A1 WO2023127903 A1 WO 2023127903A1
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embryo
dnd1
primordial germ
nanos
human vertebrate
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PCT/JP2022/048314
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俊哉 西村
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国立大学法人北海道大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology. More specifically, the present invention relates to methods of preparing primordial germ cell-enriched embryos.
  • the present invention relates to a method of producing a transgenic non-human vertebrate, a method of producing a germline chimeric non-human vertebrate, or a method of producing a donor non-human vertebrate.
  • the present invention relates to embryos enriched for primordial germ cells.
  • PGC primordial germ cells
  • germ stem cells which are the origin of gametes, from the donor species' embryos or their adult gonads, and transplanting said cells into a surrogate parent (host fish species). and producing functional gametes of the donor fish species.
  • PGCs which are formed in the early stages of embryonic development, are useful as donor cells because they can easily be given useful genetic characteristics by chromosome manipulation techniques (techniques that combine and control the number of chromosomes). Also, if one PGC is transplanted into a host fish species, it is useful because functional gametes of the donor fish species are continuously produced in the host fish species (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 reports that the expression of Dnd1 in whole cells during early development increased the number of PGCs by about 1.5- to 2-fold.
  • Non-Patent Document 3 The number of PGCs did not increase even when the method of Non-Patent Document 2 was used for zebrafish belonging to Cyprinidae, which belongs to the order Cyprinidae, which belongs to the phylogenetic order of medaka, which belongs to the order Arachniformes.
  • the present inventor considered that differentiation into primordial germ cells involved other factors in addition to Dnd1.
  • the present inventors found that introduction of Nanos3, another germ granule factor, in addition to Dnd1 into early embryos markedly increased the number of primordial germ cells per embryo.
  • the present inventors also found that the co-introduction of Dnd1 and Nanos3 markedly increased the number of primordial germ cells per embryo not only in medaka fish but also in zebrafish, which is greatly separated from medaka fish. Based on these findings, the inventors have devised a versatile method that can significantly increase the number of primordial germ cells per embryo.
  • the present disclosure provides the following inventions.
  • [Item 4] The method according to any one of items 1 to 3, further comprising introducing a gametogenic factor into the early embryo.
  • the gametogenic factor is at least one selected from the group consisting of Daz, Dazl, Boule, meioC, Ythdc2 and Rbm46.
  • the early stage embryo is a 1- to 64-cell stage embryo.
  • the non-human vertebrate is an animal belonging to fish.
  • [Claim 9] A method of producing a transgenic non-human vertebrate, comprising introducing Dnd1 and Nanos into an early embryo derived from the non-human vertebrate, and modifying the genes of said early embryo; culturing the Nanos-introduced and gene-modified early embryo to generate a transgenic non-human vertebrate, wherein the early embryo is a 4- to 64-cell stage embryo; The method, wherein the transgenic non-human vertebrate comprises genetically modified primordial germ cells in its gonadal region.
  • a method for producing a donor non-human vertebrate comprising mating the germ-line chimeric non-human vertebrate produced by the method of claim 10, wherein the germ-line chimeric non-human vertebrate is , said donor primordial germ cells in its gonadal region, and wherein said donor non-human vertebrate animal comprises said donor primordial germ cells in its gonadal region.
  • the donor non-human vertebrate and the host non-human vertebrate belong to fish, and the host non-human vertebrate and the donor non-human vertebrate are a combination of mackerel and tuna, a combination of salmon and rainbow trout, Item 12.
  • Item 13 An embryo derived from a non-human vertebrate in which primordial germ cells are enriched, wherein the embryo is an embryo at the blastula stage or later, and the number of primordial germ cells in the embryo is the same as that of the embryo.
  • a primordial germ cell-enriched embryo prepared by the method according to any one of Items 1 to 8, or a non-human spine produced by the method according to any one of Items 7 to 12. animal.
  • FIG. 1 is a flowchart showing procedures for synthesizing Nanos3 -SV40pA mRNA and Dnd1 -SV40pA mRNA.
  • FIG. 2A is a schematic diagram showing the procedure for producing germline chimeric medaka.
  • FIG. 2B is a microscopic image of a donor embryo co-introduced with Dnd1/Nanos3 .
  • FIG. 2C is a microscopic image of a host embryo transduced with donor primordial germ cells taken from a donor embryo.
  • FIG. 2D is a microscopic image of a germline chimeric medaka developed from a host embryo containing donor primordial germ cells in its gonadal region.
  • FIG. 1 is a flowchart showing procedures for synthesizing Nanos3 -SV40pA mRNA and Dnd1 -SV40pA mRNA.
  • FIG. 2A is a schematic diagram showing the procedure for producing germline chimeric medaka.
  • FIG. 2B is
  • FIG. 3A is a schematic showing gene transfer into 1-cell stage embryos to knock down endogenous Dnd1 and/or Nanos3 .
  • FIG. 3B left, is a schematic showing co-introduction of nucleotides encoding Dnd1 and/or Nanos3 into a single cell of a 16-cell stage embryo.
  • FIG. 3B right is a microscopic image showing a 16-cell stage embryo expressing BuckyBall:EGFP.
  • FIG. 3C is a fluorescence image showing the gonadal region (arrowhead) of control medaka.
  • FIG. 3D is a fluorescence image showing the gonadal regions (arrowheads) of medaka developed from embryos co-introduced with Dnd1/Nanos3.
  • FIG. 3E is a fluorescence image showing the gonadal regions (arrowheads) of medaka developed from Dnd1-introduced embryos.
  • FIG. 3F is a fluorescence image showing the gonadal region (arrowhead) of medaka developed from Nanos3-introduced embryos.
  • FIG. 4 is a microscopic image examining the expression of a series of germ granule factors.
  • FIG. 5A is a microscopic image of a donor embryo (DN-OE) overexpressing Dnd1 and Nanos3.
  • FIG. 5B is a microscopic image of a host embryo injected with donor primordial germ cells from a DN-OE embryo.
  • FIG. 5C is a microscopic image of a host embryo injected with control donor primordial germ cells (control embryo).
  • FIG. 5D is a microscopic image of a host embryo (DN-chimeric embryo) injected with donor primordial germ cells from a DN-OE embryo.
  • FIG. 5E is a microscopic image of a chimeric medaka developed from a DN-chimeric embryo.
  • FIG. 5F is a microscopic image showing donor-derived primordial germ cells in the gonadal region of a chimeric medaka developed from a DN-chimeric embryo.
  • FIG. 6 is a fluorescence microscope image of a medaka embryo.
  • the medaka embryo is a next-generation medaka embryo developed from a host embryo injected with donor primordial germ cells derived from a DN-OE donor embryo.
  • FIG. 7A is a fluorescence microscope image of a medaka embryo co-introduced with medaka-derived Dnd1/Nanos3 .
  • FIG. 7B is a fluorescence microscope image of a medaka embryo co-introduced with medaka-derived Dnd1/Nanos2 .
  • FIG. 7A is a fluorescence microscope image of a medaka embryo co-introduced with medaka-derived Dnd1/Nanos3 .
  • FIG. 7B is a fluorescence microscope image of a medaka embryo co-introduced with medaka-derived Dnd1/Nanos2 .
  • 7C is a fluorescence microscope image of a medaka embryo co-introduced with zebrafish-derived Dnd1/Nanos3 (Zdnd1+Znanos3).
  • the dotted box indicates the gonadal region enriched for primordial germ cells.
  • a first aspect of the present disclosure includes introducing Dnd1 and Nanos into early embryos derived from non-human vertebrates; and culturing the early embryos into which the Dnd1 and Nanos have been introduced.
  • a method of preparing an embryo to be transformed is provided.
  • An embryo enriched for primordial germ cells is prepared by the method according to the first aspect.
  • another aspect of the present disclosure provides a primordial germ cell-enriched embryo prepared by a method according to the first aspect.
  • Another aspect of the present disclosure is a primordial germ cell-enriched embryo derived from a non-human vertebrate, said embryo being at the blastula stage or later, wherein the number of primordial germ cells in said embryo is An embryo is provided that has at least three times the number of primordial germ cells in an embryo at the same developmental stage from a non-human vertebrate of the same species as the embryo.
  • primordial germ cell means a cell that differentiates into a germ cell. Primordial germ cells can undergo meiosis and ultimately differentiate into eggs or sperm. Primordial germ cells can be identified, for example, based on known primordial germ cell markers. A known germline marker can be, for example, a marker described in NATURE COMMUNICATIONS (2019) 10:3054, the disclosure of which is incorporated herein by reference. Primordial germ cells can be identified, for example, based on the expression of known germ granule factors. A known germ granule factor may be, for example, vasa, piwil1, piwil2, dazl, tdrd1, tdrd9, or tdrd12. Primordial germ cells, for example, express at least one selected from the group consisting of vasa, piwil1, piwil2, dazl, tdrd1, tdrd9 and tdrd12.
  • Primordial germ cells can be identified, for example, according to known methods.
  • a known method is to introduce a nucleotide operably linked to a promoter of a germ cell marker or germ granule factor and a fluorescent protein into an early embryo derived from a non-human vertebrate, and to detect fluorescence from the fluorescent protein.
  • Including identifying primordial germ cells A known method involves introducing an mRNA containing the 3' untranslated region (UTR) of the germ cell marker or germ granule factor and a fluorescent protein into an early embryo derived from a non-human vertebrate, and detecting the fluorescence of the fluorescent protein.
  • UTR 3' untranslated region
  • the fluorescent protein can be, for example, green fluorescent protein, red fluorescent protein, yellow fluorescent protein, or blue fluorescent protein.
  • untranslated region refers to those regions of the mRNA that flank the coding region and are not translated into protein.
  • the primordial germ cells according to this aspect are induced to differentiate by introducing Dnd1 and Nanos into early embryos of non-human vertebrates.
  • the term "early embryo” includes embryos from the 1- to 64-cell stage.
  • An early stage embryo is, for example, a 1- to 32-cell stage embryo.
  • Early embryos are obtained from sperm and eggs, for example, by natural mating or artificial insemination.
  • Early embryos from the 2-cell stage onwards can be obtained, for example, by culturing fertilized eggs.
  • embryo includes cells or cell masses in the developmental stage after the fertilized egg of a vertebrate.
  • the embryo may be, for example, a one-cell stage embryo (also referred to as a "fertilized egg").
  • An embryo can be, for example, a developed individual (eg, a juvenile, fry, chick, or fetus). In one example, an embryo does not include a developed individual.
  • the term "morula” includes embryos from the 64-cell stage to the blastula stage. A morula is an embryo containing, for example, 65-500 cells.
  • blastula means an embryo that contains a layer of cells surrounding a fluid-filled cavity called the blastocoel.
  • cystula also called gastrula
  • cystula means an embryo in which gastrulation has occurred.
  • ectoderm for example, ectoderm, mesoderm and endoderm differentiation is observed. Differentiation of ectoderm, mesoderm and endoderm can be examined, for example, using their layer structure or known markers.
  • neuroula means an embryo from the time the neural plate is formed until the time the neural tube is complete. The neural plate is formed on the dorsal side of the ectoderm and is the primordium of the central nervous system.
  • pharyngula means an embryo at the stage of embryonic development in which the pharyngeal arches are visible. Pharyngeal arches refer to structures that have a strut-like protruding morphology and differentiate into the head and neck.
  • Morula, blastula, cystula, neurula or pharyngeal embryo can be obtained, for example, by culturing fertilized eggs.
  • the early embryo, morula, blastula, cystula, neurula or pharyngeal embryo, respectively, can be, for example, microscopically examined for embryonic structures (e.g. number of cells; alveolar space; gastrula structure; ectoderm, mesoderm, endoderm).
  • layered structures such as; neural plate; pharyngeal arch) or by observing or detecting the expression of specific markers.
  • Dnd1 and Nanos introduced into early embryos of non-human vertebrates may be in the form of proteins or nucleotides, or a combination thereof.
  • Dnd1 and Nanos may both be proteins, or nucleotides encoding both, or a combination thereof.
  • Either Dnd1 or Nanos may be a protein and the other a nucleotide encoding it.
  • Dnd1 and Nanos are preferably both proteins, or mRNA encoding both, or a combination thereof, so that the effects of Dnd1 and Nanos on the developing embryo can be reduced or negligible.
  • Dnd1 and Nanos are preferably DNAs encoding them, since Dnd1 and Nanos can be expected to have sustained effects in developing embryos.
  • Dnd1 is synonymous with "dead end 1" and is an RNA-binding protein conserved among vertebrates.
  • Dnd1 includes wild-type Dnd1 from an animal of the same or different species as the non-human vertebrate that provided the early embryo into which it is introduced in the methods of the present disclosure.
  • the heterologous animal is, for example, a heterologous animal belonging to the same division or subdivision, preferably the same class or subdivision, as the non-human vertebrate that provided the early embryo into which Dnd1 is introduced. a different animal belonging to the same subclass, a different animal belonging to the same order or suborder, a different animal belonging to the same family or subfamily, or the same genus or They are heterogeneous animals belonging to the same subgenus.
  • the amino acid sequence of Dnd1 and the sequence information of the nucleotide sequence encoding Dnd1 can be obtained from data bank sites provided by public institutions.
  • the nucleotide sequence encoding Dnd1 of medaka can be obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) under Gene ID: 100302723.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the nucleotide sequence encoding Dnd1 of bluefin tuna is available from NCBI under Gene ID: 121902261.
  • Nucleotides encoding Dnd1 of a given species can be prepared, for example, from cells of that species (eg, ovary cells) by RT-PCR using reverse transcriptase.
  • the nucleotide encoding Dnd1 is DNA, it can be synthesized using known genetic engineering techniques.
  • the Dnd1-encoding nucleotide is RNA, it can be prepared by in vitro transcription of the Dnd1-encoding DNA.
  • Dnd1 proteins of a given species are commercially available or can be prepared according to known methods. Said known methods involve isolating and purifying said Dnd1 (eg, purification using HPLC) from a natural source containing said Dnd1 protein.
  • the Dnd1 protein can be prepared according to genetic engineering techniques.
  • the genetic engineering method includes, for example, preparing a plasmid in which a nucleotide encoding Dnd1 is incorporated into an expression vector, introducing the plasmid into a host cell, and culturing the host cell to express the Dnd1.
  • Expressed Dnd1 can be obtained by separating and purifying from host cells or culture supernatant.
  • Dnd1 may have an amino acid sequence that differs from the wild-type Dnd1 amino acid sequence of the non-human vertebrate that provided the early embryo into which Dnd1 is introduced, as long as it has the function in this embodiment.
  • a Dnd1 that has the function in this embodiment and that comprises an amino acid sequence that differs from the wild-type Dnd1 is also referred to as a "Dnd1 variant.”
  • a variant of Dnd1 is, for example, at least 70% (e.g., 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater) sequence identity.
  • the Dndl variant is, for example, at least 50% (e.g., 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 100% or more, 150% or more, or 200% or more) the RNA binding of wild-type Dndl has the connectivity of
  • a variant of Dnd1 is, for example, at least 70% (e.g., 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) sequence identity and at least 50% (e.g., 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more) of wild-type Dnd1 RNA binding. % or more, 100% or more, 150% or more, or 200% or more).
  • Dnd1 variants include wild-type Dnd1 from an animal heterologous to the non-human vertebrate that provided the early embryo into which it was introduced.
  • Dnd1 variants include, for example, wild-type Dnd1 from an animal heterologous to the non-human vertebrate that provided the early embryo into which Dnd1 and Nanos are introduced.
  • the RNA-binding domain in Dnd1 binds to RNA and contains amino acid sequences conserved among vertebrates.
  • the RNA binding domain in Dnd1 is known and disclosed, for example, in Gene 558 (2015) 118-125, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
  • the RNA-binding domain in Dnd1 of medaka contains the amino acid sequence shown by EVFISQIPRDVYEDLLIPLFSSVGALWEFRLMMNFSGQNRGFAYAKYGTAAIANDAIHLLHGYPLGPGARLSV (SEQ ID NO: 7).
  • RNA immunoprecipitation The binding of Dnd1 to RNA can be examined by RNA immunoprecipitation.
  • a host cell into which a nucleotide encoding a fusion protein of Dnd1 and a labeled protein (e.g., fluorescent protein or FLAG) has been introduced is subjected to cross-linking treatment with formaldehyde; extracting nuclei from cells to obtain a nuclear suspension; subjecting the nuclear suspension to a homogenizer to shear the chromatin to obtain an RNA solution; adding an antibody against the labeled protein to the RNA solution , immunoprecipitating a complex of the cross-linked RNA and the fusion protein; recovering the RNA from the precipitate and reverse transcribing it into cDNA; and quantifying the immunoprecipitated RNA by quantitative PCR of the cDNA.
  • a labeled protein e.g., fluorescent protein or FLAG
  • Host cells into which the nucleotide has not been introduced can be subjected to the RNA immunoprecipitation method and the RNA immunoprecipitated for the negative control can be quantified.
  • the binding property of Dnd1 to RNA can be calculated by subtracting the RNA amount of the negative control obtained by the immunoprecipitation method from the RNA amount of the test sample obtained by the immunoprecipitation method.
  • the binding of Dnd1 to RNA can be determined by RNA immunoprecipitation using as host cells cells derived from non-human vertebrates that provided early embryos into which Dnd1 was introduced. Said host cell is preferably derived from an animal of the same species as the non-human vertebrate that provided the early embryo into which Dnd1 is introduced.
  • the labeling protein is, for example, green fluorescent protein.
  • Nanos is an RNA-binding protein with a zinc finger motif that is conserved among vertebrates and invertebrates.
  • Nanos includes wild-type Nanos from animals of the same or different species as the non-human vertebrate into which it is introduced in the methods of the present disclosure.
  • Said heterologous animal is, for example, a heterologous animal belonging to the same division or subdivision, preferably the same class or subdivision, as the non-human vertebrate that provided the early embryo into which Nanos is introduced.
  • a different animal belonging to the same subclass a different animal belonging to the same order or suborder, a different animal belonging to the same family or subfamily, or the same genus or They are heterogeneous animals belonging to the same subgenus.
  • Nanos preferably include Nanos derived from animals of the same species as the non-human vertebrate into which it is introduced. Nanos can be, for example, Nanos 1, Nanos 2 or Nanos 3, or mixtures thereof. Nanos is for example Nanos2 or Nanos3 or a mixture thereof, preferably Nanos3.
  • the amino acid sequence of Nanos and the sequence information of the nucleotide sequence encoding Nanos can be obtained from data bank sites provided by public institutions.
  • a nucleotide sequence encoding medaka Nanos1 can be obtained from NCBI under Gene ID: 100144352.
  • a nucleotide sequence encoding medaka Nanos2 is available from NCBI under Gene ID: 100301601.
  • a nucleotide sequence encoding medaka Nanos3 is available from NCBI under Gene ID: 100144282.
  • a nucleotide sequence encoding Bluefin tuna Nanos3 is available from NCBI under Gene ID: 121909102.
  • Nucleotides encoding Nanos of a given species can be prepared, for example, from cells of that species (eg ovarian cells) by RT-PCR using reverse transcriptase.
  • the nucleotide encoding Nanos is DNA, it can be synthesized using known genetic engineering techniques.
  • the Nanos-encoding nucleotide is RNA, it can be prepared by in vitro transcription of said Nanos-encoding DNA.
  • Nanos proteins of a given species are commercially available or can be prepared according to known methods. Said known methods involve separating and purifying said Nanos (eg, purification using HPLC) from a natural source containing said Nanos protein. Nanos proteins can be prepared according to genetic engineering techniques.
  • Genetic engineering techniques include, for example, preparing a plasmid in which a nucleotide encoding Nanos is incorporated into an expression vector, introducing the plasmid into a host cell, and culturing the host cell to express the Nanos. .
  • Expressed Nanos can be obtained by separation and purification from host cells or culture supernatants.
  • Nanos may have an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence of wild-type Nanos of the non-human vertebrate that provided the early embryo into which Nanos is introduced, as long as it has the function in this embodiment.
  • a Nanos that has a function in this embodiment and that includes an amino acid sequence that differs from said wild-type Nanos is also referred to as a "Nanos variant.”
  • Nanos variants are, for example, at least 70% (e.g., 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, the amino acid sequence of the RNA binding domain in said wild-type Nanos). % or greater, 98% or greater, or 99% or greater) sequence identity.
  • Nanos variants are, for example, at least 50% (e.g., 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 100% or more, 150% or more, or 200% or more) the RNA binding of wild-type Nanos has the connectivity of Nanos variants are, for example, at least 70% (e.g., 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, the amino acid sequence of the RNA binding domain in said wild-type Nanos). % or greater, 98% or greater, or 99% or greater) sequence identity and at least 50% (e.g., 60% or greater, 70% or greater, 80% or greater, 90%) RNA-binding of wild-type Nanos.
  • Nanos variants include wild-type Nanos from an animal heterologous to the non-human vertebrate that provided the early embryo into which it was introduced. Nanos variants include, for example, wild-type Nanos from an animal heterologous to the non-human vertebrate that provided the early embryo into which Dnd1 and Nanos are introduced.
  • RNA-binding domain in Nanos binds to RNA and contains amino acid sequences conserved among vertebrates.
  • RNA-binding domains in Nanos are known and disclosed, for example, in Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 218 (2016) 13-22, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
  • the RNA-binding domain in medaka Nanos3 includes an N-terminal domain (FHLWKDYMGLSDTVK (SEQ ID NO: 8)) and a zinc finger domain (CSFCRHNGESEMVYRSHWLKNQKGDVLCPYLRQYVCPLCGATGAKAHTKRFCPK (SEQ ID NO: 9)).
  • Nanos to RNA can be examined according to the RNA immunoprecipitation method described as a method for examining the binding of Dnd1 to RNA.
  • a “variant” to a wild-type protein may contain deletions, substitutions, additions, or combinations thereof in the amino acid sequence of the wild-type protein.
  • “Deletion” of an amino acid means that an amino acid residue at any position in a given amino acid sequence is missing.
  • a Dnd1 or Nanos variant for example, has an amino acid deletion at the N-terminus, C-terminus, and/or between the N- and C-terminus of the corresponding wild-type Dnd1 or Nanos amino acid sequence.
  • “Addition” of an amino acid means that an amino acid residue is added or inserted at any position in a given amino acid sequence.
  • Dnd1 or Nanos variants have amino acids added or inserted, e.g., at the N-terminus, C-terminus, and/or between the N-terminus and C-terminus of the corresponding wild-type Dnd1 or Nanos amino acid sequence.
  • a Dnd1 or Nanos variant may, for example, be fused with a functional polypeptide (eg, a labeling protein such as green fluorescent protein).
  • a Dnd1 variant or Nanos variant refers to the amino acid sequence of the functional polypeptide minus the amino acid sequence.
  • An amino acid "substitution" means that an amino acid residue at any position in a given amino acid sequence is replaced with another amino acid residue. Amino acid substitutions are, for example, conservative substitutions.
  • a “conservative substitution" of an amino acid means that an amino acid residue in a polypeptide is replaced with another amino acid residue having similar side chain characteristics.
  • Side chains are exemplified by, for example, aliphatic side chains, aliphatic hydroxyl side chains, amide-containing side chains, aromatic side chains, basic side chains, acidic side chains, or sulfur-containing side chains.
  • Side chain characteristics include, for example, charge, side chain size, hydrophobicity/hydrophilicity.
  • a wild-type protein corresponding to a variant has an amino acid sequence with the highest sequence identity to the amino acid sequence of said variant.
  • sequence identity means the percentage of identical amino acids or nucleotides between two optimally aligned polynucleotide sequences or between two amino acid sequences. Sequence identity can be calculated using commercially or publicly available software such as BLAST+.
  • a Dnd1 variant or Nanos variant exhibits, for example, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, or at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of the RNA binding domain in Dnd1 or Nanos. Consists of an amino acid sequence.
  • a protein consisting/only consisting of a given amino acid sequence does not exclude said protein comprising post-translational modifications such as glycosylation.
  • Dnd1 and Nanos may be Dnd1 and Nanos derived from animals of the same species, or Dnd1 derived from different main animals (e.g., Dnd1 from animals belonging to the order Cyprinidae) and Nanos (e.g., animals belonging to the order Arata). Nanos). Dnd1 and Nanos may be introduced into early embryos from non-human vertebrates in the form of nucleotides encoding them. Nucleotides encoding Dnd1 and Nanos may be present in the same nucleotide molecule or in two different nucleotide molecules whose coding sequences are present.
  • the term "coding sequence” means a nucleotide sequence that encodes a particular protein.
  • the nucleotides encoding Dnd1 and Nanos When the nucleotides encoding Dnd1 and Nanos are present in two different nucleotide molecules, the nucleotides encoding Dnd1 and Nanos comprise a first nucleotide molecule encoding Dnd1 and a second nucleotide molecule encoding Nanos. .
  • Ordinal numbers such as “first” and “second” are used to distinguish each component included in a plurality of mutually similar components, and do not limit the order or importance of a certain component.
  • the nucleotides encoding Dnd1 and Nanos may contain additional gene sequences. Additional gene sequences may be, for example, nucleotide sequences encoding fluorescent proteins (eg, green fluorescent protein).
  • the nucleotides encoding Dnd1 and Nanos may be DNA or RNA.
  • RNAs encoding Dnd1 and Nanos may include, for example, a cap structure at their 5' end to facilitate translation.
  • the cap structure can be, for example, 7-methylguanylate.
  • RNAs encoding Dnd1 and Nanos may include, for example, polyadenylation sequences at their 3' ends that stabilize the RNA or facilitate translation.
  • the DNA encoding Dnd1 and Nanos may contain, for example, a promoter functioning as a transcription initiation site at its 5' end.
  • the promoter can be any known promoter. Promoters include, for example, zebrafish heat shock protein (hsp) 70 (TG1096), zebrafish hspa9 (TG1182), zebrafish ubiquitin (TG1057), medaka ⁇ acitn (TG1147), medaka hsp70 ( TG908), medaka EF-1 ⁇ (TG844), medaka gapdh (TG923), medaka vasa (olvas) (TG870), Fugu oct3 (TG913), CMV (TG912, 849), human EF1 ⁇ (TG871), or 8xHSE (artificial heat shock promoter) (TG921).
  • hsp heat shock protein
  • TG1182 zebrafish hspa9
  • zebrafish ubiquitin TG1057
  • DNA encoding Dnd1 and Nanos may include, for example, polyadenylation sequences.
  • a polyadenylation sequence may be present, for example, at the 3' end of the DNA.
  • DNAs encoding Dnd1 and Nanos may be linear DNAs or plasmids.
  • the DNA encoding Dnd1 and Nanos when the nucleotides encoding Dnd1 and Nanos are present in the same nucleotide molecule, the DNA encoding Dnd1 and Nanos comprises a polyadenylation sequence, e.g., said polyadenylation sequence is 3' of said DNA. exists on the edge.
  • both the DNA encoding Dnd1 and Nanos and the DNA encoding Nanos each contain a polyadenylation sequence, e.g., the polyadenylation sequence is , are present on the 3′ end side of the DNA.
  • polyadenylation sequence means a DNA sequence that, when transcribed into RNA, allows the addition of a polyadenylation sequence (also referred to as "poly A sequence") to the 3' end of the transcript.
  • PPC primordial germ cells
  • somatic cells that constitute the body after development in the early stages of development.
  • a known polyadenylation sequence can be used for the polyadenylation sequence.
  • the polyadenylation sequence may be an endogenous sequence or an exogenous sequence.
  • the term "endogenous” means a gene, nucleic acid or protein that is naturally present in an organism or cell, or a gene, nucleic acid or protein that has the same structure as them.
  • the term “exogenous” means a gene, nucleic acid or protein that differs from the native gene, nucleic acid or protein in the organism or cell.
  • the polyadenylation sequence is preferably an exogenous sequence.
  • the polyadenylation sequence can be, for example, SV40pA, BGHpA, hGHpA, or rbGlobpA.
  • a poly-A sequence can be, for example, tens to hundreds of adenine nucleotides.
  • Poly A sequences include, for example, repeats of the AAUAAA sequence.
  • Dnd1 and Nanos may be introduced into the early embryo at the same time, or may be introduced individually at any time. Preferably, Dnd1 and Nanos are introduced simultaneously into said early embryo. Dnd1 and Nanos are introduced simultaneously into the early embryo when the nucleotides encoding Dnd1 and Nanos are present in the same nucleotide molecule.
  • the nucleotide molecule may contain a self-cleaving peptide sequence or a protease cleavage site between the Dnd1 coding sequence and the Nanos coding sequence. Any known self-cleavage peptide sequence can be used as the self-cleavage peptide sequence.
  • a self-cleaving peptide sequence is, for example, a 2A self-cleaving peptide sequence.
  • protease cleavage site Any known protease cleavage site can be used as the protease cleavage site.
  • Protease cleavage sites are, for example, Enterokinase (DDDDK ⁇ ), Factor Xa (IEGR ⁇ /IDGR ⁇ ), Tobacco Etch Virus (ENLYFQ ⁇ G) or Thrombin (LVPR ⁇ GS), PreScission (LEVLFQ ⁇ GP).
  • the order and number of the Dnd1 coding sequence and Nanos coding sequence in the molecule are not particularly limited.
  • the nucleotides include the coding sequence for Dndl on the 5' end and the coding sequence for Nanos on the 3' end.
  • the nucleotides include the coding sequence for Nanos on the 5' end and the coding sequence for Dndl on the 3' end.
  • the nucleotides include two coding sequences for Dnd1 and at least one coding sequence for Nanos.
  • the nucleotides include at least one coding sequence for Dnd1 and two coding sequences for Nanos.
  • the RNA encoding Dnd1 and Nanos when the nucleotides encoding Dnd1 and Nanos are present in the same nucleotide molecule, the RNA encoding Dnd1 and Nanos contains a poly A sequence at its 3' end. In one example, when the nucleotides encoding Dnd1 and Nanos are present in two nucleotide molecules, the RNA encoding Dnd1 and Nanos and the RNA encoding Nanos both have a poly-A sequence at their 3' ends. respectively.
  • Nucleotides encoding Dnd1 and Nanos can be introduced into early embryos derived from non-human vertebrates by, for example, microinjection, electroporation or lipofection.
  • Dnd1 and Nanos may be introduced in protein form into early embryos from non-human vertebrates.
  • the proteins Dnd1 and Nanos can be introduced into early embryos from non-human vertebrates by, for example, microinjection or lipofection.
  • Dnd1 and Nanos are a protein-nucleotide combination
  • said Dnd1 and Nanos can be introduced into early embryos from non-human vertebrates by microinjection or lipofection.
  • Examples of the present disclosure demonstrate that introducing the nucleotide into a one-cell stage embryo can yield a blastula in which most or all of the cells are primordial germ cells (PGCs).
  • PGCs primordial germ cells
  • a blastula in which most or all of the cells are PGCs can be obtained.
  • the early embryo is a 4-cell stage embryo
  • introduction of Dnd1 and Nanos into all four or three cells yields a blastula in which most or all cells are PGCs. be able to.
  • the ratio of the number of cells into which the nucleotide is introduced to the number of cells in the early embryo is, for example, at least 70% or more (e.g., 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% or more). %).
  • Examples of the present disclosure show that introduction of nucleotides encoding Dnd1 and Nanos into a single cell of a 16-cell stage embryo compared to identical embryos except that Dnd1 and Nanos have not been introduced. , demonstrate that they can generate individuals with markedly increased numbers of primordial germ cells in their gonadal region. Examples of the present disclosure also demonstrate that the cells into which Dnd1 and Nanos are introduced may be cells in which the factors that make up the germplasm (germ granule factors) are not localized. In the method of the first aspect, introduction of Dnd1 and Nanos into a predetermined proportion of cells in an early embryo allows the gonadal region of the embryo to be compared to an identical embryo except that Dnd1 and Nanos have not been introduced.
  • Dnd1 and Nanos are introduced by introducing Dnd1 and Nanos into one or more (e.g., 2, 3, or 4) cells.
  • Individuals can be obtained that have a significantly increased number of primordial germ cells in their gonadal regions compared to embryos (individuals) that are identical except that they are not.
  • the predetermined percentage may be, for example, 2%-30%, 2-25%, 2-20%, 2-15%, or 2-10%.
  • the cells in the early embryo into which Dnd1 and Nanos are introduced may be cells in which germ granule factors are localized or cells in which germ granule factors are not localized.
  • the number or ratio of cells when introducing Dnd1 and Nanos into the early embryo can be appropriately selected according to the purpose.
  • Dnd1 and Nanos are introduced into all or most cells of the early embryo.
  • Dnd1 and Nanos are introduced into a predetermined percentage of cells in early embryos for the purpose of obtaining individuals whose gonadal region has a significantly increased number of primordial germ cells compared to wild-type animals.
  • the amount of Dnd1 and Nanos introduced into the early embryo may be known amounts for introducing proteins or genes into the embryo.
  • the ratio of Dnd1 and Nanos introduced into early embryos is, for example, 10:1 to 1:10, 5:1 to 1:5, 3:1 to 1:3, 2:1 to 1:2, or 1: 1.
  • Dnd1 and Nanos are introduced into early embryos by microinjection of a solution containing Dnd1 and Nanos at a volume of 30-60% of the total embryo volume.
  • the 30-60% volume is, for example, 100 pl-500 pl.
  • nucleotides eg, mRNA
  • encoding Dnd1 and Nanos are introduced by microinjecting 100-500 pl of a solution containing 10-500 ng/ml of said nucleotides into medaka-derived early embryos.
  • Early embryos into which Dnd1 and Nanos according to the present disclosure have been introduced can undergo embryonic development by culturing under known culture conditions.
  • Known culture conditions are appropriately set according to the animal species of the embryo.
  • the culturing of the early embryo into which the Dnd1 and Nanos have been introduced includes standing at room temperature in saline or fresh water, for example.
  • the culturing of the early embryo into which the Dnd1 and Nanos have been introduced includes, for example, standing under a temperature according to the animal species.
  • the culturing of the Dnd1- and Nanos-introduced early embryo includes, for example, maintenance in a known medium at 37° C. under a 5% CO 2 environment.
  • culturing the early embryo into which the Dnd1 and Nanos have been introduced for example, maintenance in a known medium at 37° C. in a 5% CO 2 environment to the blastula stage, and then transplanting into the uterus of said non-human mammal.
  • culturing of said Dnd1 and Nanos-introduced early embryos includes in vitro culturing, optionally in vivo culturing.
  • the number of primordial germ cells in said embryo is compared to primordial germ cells in the same embryo except that Dnd1 and Nanos have not been introduced.
  • Identical embryos, except that the Dnd1 and Nanos have not been introduced are embryos at the same developmental stage from the same species of animal that provided the early embryos into which Dnd1 and Nanos have been introduced. Stages of embryonic development include, for example, the 1- to 64-cell stage, the morula stage, the blastula stage, the cystula stage, the neurula stage, the pharyngeal stage, or the developed individual.
  • Examples of the present disclosure show that in medaka and zebrafish, by co-introducing Dnd1 and Nanos into early embryos of said animal species, individuals with significantly increased primordial germ cells compared to wild-type individuals can be obtained.
  • Dnd1 and Nanos according to this aspect are RNA-binding proteins conserved throughout vertebrates, and both play important roles in the formation of germ cells.
  • mice the above technical matters are described in Youngren et al. The ter mutation in the dead end gene causes germ cell loss and testicular germ cell tumors.
  • One embodiment comprises introducing Dnd1 and Nanos into an early embryo derived from a non-human vertebrate; introducing a gametogenic factor; and culturing the early embryo into which said Dnd1 and Nanos have been introduced.
  • the gametogenic factor may be, for example, at least one selected from the group consisting of Daz, Dazl, Boule, meioC, Ythdc2 and Rbm46.
  • Non-human vertebrates that have primordial germ cells in their gonads formed according to this embodiment are more likely to be fertile.
  • Dnd1, Nanos, and the gametogenic factor may all be introduced into the early embryo at the same time, or may be introduced in any combination at any time, or all may be introduced individually at any time. good.
  • Dnd1, Nanos and said gametogenic factor are simultaneously introduced into said early embryo.
  • a combination of Dnd1 and Nanos and said gametogenic factor are each introduced at any time. In said example, for example, the combination of Dnd1 and Nanos is introduced first, then said gametogenic factor.
  • Dnd1, Nanos, and the gametogenic factor are individually introduced into the early embryo at any given time.
  • gametogenic factor is any substance involved in gametogenesis.
  • Said gametogenic factor may be, for example, a DAZ family member or any substance involved in the meiotic transition.
  • DAZ family is a group consisting of three RNA-binding proteins. DAZ family members may play important roles in gametogenesis or meiosis. DAZ family members, for example, have a sequence of 24 amino acids termed the DAZ repeat.
  • a DAZ family member may be, for example, Daz, Dazl or Boule. Daz, Dazl and Boule can differentiate germ cells from human and mouse embryonic stem cells (Nature volume 462, pages 222-225 (2009)).
  • the term “Daz” is synonymous with "Deleted in AZoospermia” and is an RNA binding protein.
  • Dazl is synonymous with "Deleted in azoospermia-like" and is an RNA binding protein.
  • Boe is an RNA binding protein. Boule is found in many vertebrates, including humans, and invertebrates, including sea anemones. Dazl has been found in nearly all vertebrates, including mice and humans. Daz may be Daz1, Daz2, Daz3 or Daz4.
  • a substance involved in meiotic transition may be, for example, meioC, Ythdc2 or Rbm46.
  • meioC is synonymous with "Meiosis-Specific with Coiled-Coil Domain”. meioC is important for meiotic transition in medaka.
  • Ythdc2 is synonymous with "YTH domain containing 2”.
  • Rbm46 is synonymous with "RNA Binding Motif Protein 46".
  • mRNA sequence encoding Dazl of medaka can be obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) under Accession: NM_001104799.1.
  • the amino acid sequences of Dazl derived from medaka, zebrafish and tuna are shown below.
  • the amino acid sequence of Dazl from tuna is the predicted sequence.
  • a gametogenic factor of a given species can be prepared, for example, from cells of that species (eg, ovary cells) by RT-PCR using reverse transcriptase.
  • the gametogenic factor may have an amino acid sequence that differs from the wild-type gametogenic factor of the non-human vertebrate that provided the early embryo into which the gametogenic factor is introduced, as long as it has the function in this embodiment. .
  • a gametogenic factor having a function in this embodiment and comprising an amino acid sequence different from said wild-type gametogenic factor is also referred to as a "gametogenic factor variant.”
  • a gametogenic factor variant may, for example, be at least 70% (e.g., 75% or greater, 80% or greater, 85% or greater, 90% or greater, 95% or greater, 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater) sequence identity.
  • a gametogenic factor variant is, for example, at least 50% (e.g., 60% or greater, 70% or greater, 80% or greater, 90% or greater, 100% or greater, 150% or greater) the RNA-binding of a wild-type gametogenic factor. , or 200% or more).
  • a gametogenic factor variant for example, is at least 70% (e.g., 75% or greater, 80% or greater, 85% or greater, 90% or greater, 95% or greater) the amino acid sequence of the RNA-binding domain in said wild-type gametogenic factor. , 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater) sequence identity and at least 50% (e.g., 60% or greater, 70% or greater) RNA-binding of wild-type gametogenic factor. % or more, 80% or more, 90% or more, 100% or more, 150% or more, or 200% or more).
  • a gametogen variant includes a wild-type gametogen from an animal heterologous to the non-human vertebrate that provided the early embryo into which it is introduced.
  • Gametogenic factor variants include, for example, wild-type gametogenic factors derived from animals heterologous to the non-human vertebrate that provided the early embryo into which the gametogenic factors are introduced.
  • the binding of gametogenic factors to RNA can be examined by RNA immunoprecipitation.
  • the gametogenic factor is, for example, at least one selected from the group consisting of Daz, Dazl, Boule, meioC, Ythdc2 and Rbm46.
  • the gametogenic factor is, for example, at least one selected from the group consisting of Daz, Dazl, Boule and meioC.
  • Said gametogenic factor is for example Daz, Dazl, Boule or meioC or a mixture thereof.
  • Said gametogenic factor is preferably Daz, Dazl or meioC or a mixture thereof.
  • Said gametogenic factor is preferably Daz.
  • Said gametogenic factor is preferably Dazl.
  • Said gametogenic factor is preferably meioC.
  • Said gametogenic factor is preferably Boule.
  • a gametogenic factor may be introduced into an early embryo derived from a non-human vertebrate in the form of a protein or in the form of a nucleotide encoding it.
  • the nucleotides encoding the gametogenic factor may be DNA or RNA.
  • Nucleotides encoding gametogenic factors may include other nucleotide sequences described herein.
  • a gametogenic factor can be introduced into said early embryo according to the methods described herein.
  • Dnd1, Nanos, or gametogenic factor is the manipulation of Dndl, Nanos or a gametogenic factor to be present in one or more cells that make up said early embryo. Point.
  • the form of Dnd1, Nanos, or gametogenic factor upon introduction into the early embryo is not particularly limited.
  • Dnd1, Nanos, or gametogenic factors are introduced into the early embryo, for example, in either or a mixture of nucleotide and protein forms.
  • Dnd1, Nanos or gametogenic factors are preferably introduced into said early embryo in the form of nucleotides (more preferably in the form of RNA).
  • primordial germ cell-enriched embryo derived from a non-human vertebrate, said embryo being at the blastula stage or later, wherein the number of primordial germ cells in said embryo is , providing an embryo that has at least three times the number of primordial germ cells in an embryo at the same developmental stage from a non-human vertebrate of the same species as said embryo.
  • Embryos enriched in primordial germ cells have a significantly increased number of primordial germ cells compared to wild-type animal embryos.
  • a wild-type animal embryo is, for example, an embryo obtained from an animal of the same species as the animal that provided the Dnd1 and Nanos-introduced early embryos according to the present disclosure, wherein Dnd1 and Nanos have not been introduced. embryos at the same developmental stage, except The number of primordial germ cells in said embryo is compared to the number of primordial germ cells in an embryo at the same developmental stage, eg from an animal of the same species as the animal that provided said embryo.
  • Primordial germ cells in embryos can be fractionated or concentrated, for example, by subjecting the embryos to cell detachment treatment using trypsin or collagenase and subjecting the suspension containing the separated cells to density gradient centrifugation. .
  • the number of primordial germ cells in an embryo is compared, for example, by counting the number of cells expressing known primordial germ cell markers or germ granule factors.
  • the number of primordial germ cells in an embryo can be determined, for example, by an immunochemical staining method using an antibody against a known primordial germ cell marker or germ granule factor, or in situ using a probe having a sequence complementary to the mRNA of the marker or factor.
  • Primordial germ cells are labeled by hybridization and compared based on the labeled cells.
  • the number of primordial germ cells in an embryo is compared, for example, based on the expression levels of known primordial germ cell markers or germ granule factors in said embryo.
  • the number of primordial germ cells in the embryo is preferably compared based on the expression level of vasa.
  • the primordial germ cell-enriched non-human vertebrate-derived embryo is an embryo after the blastula stage, such as a morula, a blastula, a neurula, a pharyngeal embryo, or an embryo at a later developmental stage. good.
  • the number of primordial germ cells in said embryo is at least 3-fold (e.g., 5-fold or more, 10-fold or more, 15-fold) than the number of primordial germ cells in an embryo at the same developmental stage from a non-human vertebrate of the same species as said embryo 20 times or more, 25 times or more, or 30 times or more).
  • the primordial germ cell may be genetically modified.
  • one aspect of the present disclosure is a genetically modified primordial germ cell-enriched non-human vertebrate-derived embryo, said embryo being a post-blastula stage embryo, wherein said embryo An embryo is provided in which the number of germ cells is at least three times greater than the number of primordial germ cells in an embryo at the same developmental stage from a non-human vertebrate of the same species as said embryo.
  • the genes of the early embryo can be modified before, simultaneously with, or after introduction of Dnd1 and Nanos into the early embryo derived from non-human vertebrates. Said genes may, for example, be modified simultaneously with the introduction of Dnd1 and Nanos into said early embryo. Said genes may be modified, for example, before or after introduction of Dnd1 and Nanos into said early embryo.
  • the terms "genetic modification”, “genetic modification” or “modifying a gene” mean intentionally modifying a gene through chromosome manipulation technology or DNA recombination technology.
  • Chromosome manipulation techniques include, for example, tetraploidization of chromosomes. If the non-human vertebrate is a fish, the chromosomes can be tetraploidized by treatment of the fertilized egg with pressure, temperature, or chemicals such as cytochalasin B.
  • DNA recombination technology includes, for example, genome editing technology. Recombinant DNA techniques involve introducing deletions, substitutions, additions or combinations thereof into chromosomes using the CRISPR-CAS system.
  • a genetically modified primordial germ cell is prepared by a method comprising introducing Dnd1 and Nanos into an early embryo derived from a non-human vertebrate and modifying the gene; and culturing the early embryo. be.
  • the genetically modified primordial germ cells introduce Dnd1 and Nanos into an early embryo derived from a non-human vertebrate; and culturing early embryos into which said Dnd1 and Nanos have been introduced and which have been genetically modified.
  • the genetically modified primordial germ cell is genetically modified in an early embryo (or cell) from a non-human vertebrate; and introducing Nanos; and culturing early embryos into which said Dnd1 and Nanos have been introduced and which have been genetically modified.
  • the genetically modified primordial germ cell simultaneously introduces Dndl and Nanos into an early embryo (or cell) from a non-human vertebrate and modifies the gene; and culturing the genetically modified early embryo.
  • Ddn1 and Nanos into all or most of the cells of the early embryo (e.g., 1-cell stage, 2-cell stage, 4-cell stage, or 8-cell stage embryo) and modifying the gene, the gene Blastocysts can be obtained that are mostly or entirely primordial germ cells that have been modified.
  • Genetically modified primordial germ cell-enriched embryos can be used to create germ-line chimeric non-human vertebrates as described below.
  • Dnd1 and Nanos are added to a predetermined proportion of cells in an early embryo derived from a non-human vertebrate (e.g., 4-, 8-, 16-, 32-, or 64-cell stage embryos).
  • a non-human vertebrate e.g., 4-, 8-, 16-, 32-, or 64-cell stage embryos.
  • the introduction and modification of the gene results in an embryo (transgenic non-human vertebrate) enriched for genetically modified primordial germ cells.
  • one embodiment of the first aspect provides a method of producing a transgenic non-human vertebrate animal that contains genetically modified primordial germ cells in its gonadal region.
  • One aspect of the present disclosure is a method of producing transgenic non-human vertebrates comprising early embryos (4- to 64-cell stage embryos) derived from non-human vertebrates. introducing Dnd1 and Nanos, and modifying their genes, into at least one cell of the cell); A method is provided comprising developing a human vertebrate, wherein said transgenic non-human vertebrate contains genetically modified primordial germ cells in its gonadal region.
  • gonadal region means the region in the embryo that becomes the organ that produces germ cells in the developed individual.
  • the gonadal region can be, for example, the region where primordial germ cells reside in the embryo.
  • gonadal region is synonymous with gonad.
  • gonad means any organ that produces germ cells in an animal.
  • the gonads include the female ovaries, which produce eggs, or the male testes, which produce sperm.
  • germ cell means a cell lineage that gives rise to gametes (eggs or sperm).
  • the transgenic non-human vertebrate according to this aspect preferably contains genetic alterations essentially only in the primordial germ cells of the gonadal region (gonad).
  • Said transgenic non-human vertebrates for example, do not contain genetic alterations in regions other than the gonadal region (eg, organs such as brain, heart, internal organs; somatic cells such as nerve cells, cardiomyocytes, endothelial cells).
  • regions other than the gonadal region eg, organs such as brain, heart, internal organs; somatic cells such as nerve cells, cardiomyocytes, endothelial cells.
  • transgenic non-human vertebrates containing germ cells containing the genetic modification in their gonadal region are produced even if the genetic modification is a modification that can cause lethality or developmental failure. can do.
  • male and female gametes of the transgenic non-human vertebrates can be used to generate the next generation of non-human vertebrates that are homozygous for the genetic modification.
  • a next-generation non-human vertebrate heterozygous for the genetic modification from a male or female gamete of the transgenic non-human vertebrate and a female or male gamete of an animal of the same species as the non-human vertebrate. can be produced.
  • the transgenic non-human vertebrate according to this aspect can be used, for example, for genetic analysis of diseases.
  • vertebrate means any animal belonging to fish, amphibians, reptiles, birds, and mammals.
  • the vertebrate is a non-human vertebrate, excluding humans.
  • Non-human vertebrates are, for example, any animal belonging to fish, amphibians, reptiles, birds or mammals, preferably any animal belonging to fish, birds or mammals, more preferably any animal belonging to fish or mammals, and also Any animal belonging to the fish family is preferred.
  • fish means a group of animals excluding tetrapods from the subphylum Vertebrates.
  • Fish for example, Scombridae; Amberjack; Salmonidae; Gadidae; Anguillidae; and porgies; Serranidae (sea basses), Paralichthys; Acipenseridae; Oryzias (medakas) or Cyprinidae.
  • Fish of the mackerel family include, for example, yellowfin tuna, blackfin tuna, bigeye tuna, and Pacific bluefin tuna, tuna genus (Thunnus); and Black skipjack tuna, etc.; King mackerel, etc.; Acanthocybium; Atlantic chub mackerel, Chub mackerel, Atlantic mackerel, etc. animals.
  • Fish of the horse mackerel family for example, yellowtail (Amberjack), amberjack (Seriola lalandi), amberjack (Seriola dumerili), etc.; striped jack (Pseudocaranx dentex), etc.; .
  • Fish of the Salmonidae family include, for example, the genus Hucho, such as Parahucho perryi; (white-spotted char), etc.;
  • Fish of the cod family include, for example, Gadus macrocephalus, Gadus morhua, Gadus ogac, Gadus chalcogrammus, and other species of the genus; Micromesistius. good.
  • the fish of the eel family for example, eels such as American eel (Anguilla rostrata), Japanese eel (Anguilla japonica), Marmorata (Anguilla marmorata) and European eel (Anguilla anguilla); animals of the genus Neoanguilla.
  • the fish of the puffer family may be, for example, animals of the genus Takifugu such as Takifugu rubripes and Takifugu porphyreus; Lagocephalus.
  • the sea bream fish may be, for example, animals of the genus Pagrus, such as Pagrus major; the genus Acanthopagrus, such as the black sea bream (Acanthopagrus schlegelii); the genus Dentex.
  • the fish of the grouper family may be, for example, animals of the genus Epinephelus, such as Epinephelus septemfasciatus, Epinephelus bruneus, and Epinephelus akaara;
  • Epinephelus septemfasciatus Epinephelus septemfasciatus
  • Epinephelus bruneus Epinephelus akaara
  • the flounder may be, for example, flounder (Paralichthys olivaceus).
  • the sturgeon family may be, for example, Acipenser medirostris, Huso dauricus, and Huso huso.
  • Fish of the genus Medaka may be animals of the genus Oryzias, such as Oryzias latipes, Oryzias sakaizumii, and Oryzias javanicus.
  • Fish of the family Cyprinidae include, for example, cyprininae such as zebrafish, carp, crucian carp and goldfish; Danioninae such as Rasbora; It may be an animal of the family Leuciscinae.
  • a non-human vertebrate animal is, for example, any animal belonging to the fish family.
  • Animals belonging to the fish family may be, for example, tuna, sturgeon, bonito, yellowtail, amberjack, amberjack, sea bream, salmon, cod, trout, rainbow trout, flounder, tiger puffer, horse mackerel, grouper, eel, or carp.
  • amphibian means a group of animals belonging to the subphylum Amphibia.
  • Amphibians are, for example, animals of the family Hynobiidae; Cryptobranchidae; Salamandridae; Bufonidae; can be
  • Amphibians of the Salamander family may be, for example, animals of the genus Hynobius and Onychodactylus.
  • An amphibian of the family Salamanderidae may be, for example, an animal of the genus Andrias.
  • Amphibians of the family Newt can be, for example, animals of the genera Echinotriton and Cynops.
  • Amphibians of the toad family can be, for example, animals of the genera Rhinella, Bufo.
  • Amphibians of the family Hylaidae can be, for example, animals of the genera Rana, Lithobates, Glandirana, Pelophylax, Odorrana.
  • An amphibian of the family Rhacophoridae may be, for example, an animal of the genera Eifinger frog (Kurixalus), Rhacophorus, Buergeria.
  • the non-human vertebrate according to this aspect is, for example, any animal belonging to amphibians.
  • An animal belonging to amphibians can be, for example, a giant salamander.
  • Reptile means a group of animals belonging to the vertebrate subphylum Reptilia. Reptiles include, for example, Cheloniidae; Dermochelyidae; Geoemydidae; Chelydridae; Trionychidae; Eublepharidae; Cobraidae; Elapinae; Hydrophiinae; or Crotalinae.
  • Reptiles of the sea turtle family include, for example, Chelonia Brongniart such as Chelonia mydas; Caretta such as Caretta caretta; Eretmochelys such as Eretmochelys imbricata. It can be.
  • a leatherback reptile may be, for example, an animal of the genus Dermochelys.
  • Reptiles of the family Pondidae may be, for example, animals of the genus Mauremys, such as the reed turtle (Mauremys reevesii); the genus Cuora, such as the box turtle (Cuora flavomarginata); and the genus Geoemyda.
  • Reptiles of the Snaking Turtle family may be, for example, animals of the genus Chelydra, such as the Snapping Turtle (Chelydra serpentina); and Macrochelys, such as the Alligator Turtle (Macrochelys temminckii).
  • a reptile of the family Sponpidae may be, for example, an animal of the genus Pelodiscus, such as a soft-shelled turtle (Pelodiscus sinensis).
  • a reptile of the family Lizardidae may be an animal of the genus Goniurosaurus, for example Goniurosaurus splendens.
  • Reptiles of the Gecko family include, for example, Lepidodactylus; Hemiphyllodactylus; Perochirus; Gekko japonicus, Gekko vertebralis, etc. good.
  • Reptiles of the family Iguanidae may be, for example, animals of the genus Iguana such as the genus Anolis; the green iguana (Iguana iguana).
  • Reptiles of the lizard family may be animals of the genus Plestiodon, such as Plestiodon elegans and Plestiodon stimpsonii.
  • Reptiles of the family of the crocodile family include, for example, Cyclophiops such as Cyclophiops herminae; Elaphe such as Elapha climacophora and Elaphe quadrivirgata; Calamaria); may be animals of the genus Dinodon, such as Dinodon semicarinatum.
  • a reptile of the cobra subfamily may be, for example, an animal of the genus Sinomicrurus.
  • Reptiles of the subfamily Seasnake can be, for example, animals of the genus Hydrophis; Laticauda; Emydocephalus.
  • Protobothrops such as Protobothrops flavoviridis and Protobothrops elegans; Gloydius such as Gloydius bromhoffii; and Ovophis. .
  • a non-human vertebrate animal according to this aspect is, for example, any animal belonging to reptiles.
  • An animal belonging to reptiles is, for example, a soft-shelled turtle.
  • birds means a group of animals belonging to the vertebrate subphylum Aves. Birds, for example, the family (Megapodiidae), guinea fowl family (Numididae), chickens (Gallus gallus domesticus) Phasianidae (Phasianidae); ostrich family (Struthionidae); Columbidae; Gruidae; Rallidae; Phoeniconaias; Steatornithidae; Nyctibiidae; Caprimulgidae; Genus Aptenodytes; Eudyptes; Diomedeidae; Hydrobatidae; Ciconiidae; Ardeidae; Anhingidae; Accipitridae; Cathartidae; Strigidae; Colius; Harpactes; Bucerotidae; Meropidae; Falconinae; Cacatuida
  • a non-human vertebrate animal according to this aspect is, for example, any animal belonging to the family of birds.
  • Animals belonging to the family of birds can be, for example, chickens, ostriches, parakeets, owls or hawks.
  • mammal means a group of animals belonging to the Mammalia subphylum of the vertebrate subphylum.
  • the mammal is, for example, Monotremata, Marsupial, Afroinsectiphilia, Paenungulata, Xenarthra, Euarchontoglires, or Laurasia It may be an animal of the Laurasiatheria.
  • Monotremes mammals may be, for example, animals of the family Ornithorhynchidae or Tachyglossidae.
  • Marsupial mammals include, for example, the family Didelphidae; the Dasyuridae, such as the Wern devil (Sarcophilus harrisii); the Myrmecobiidae; the Phascolarctidae; (Macropus giganteus), wallaby, and other animals of the kangaroo family (Macropodidae).
  • African insectivorous mammals may be, for example, animals of the family Chrysochloridae; Tenrecidae; Elephantulus; Rhynchocyon.
  • a near-hoofed mammal can be, for example, an animal of the family Procaviidae; Elephantidae; Dugongidae; Trichechidae.
  • the heterologous mammal can be, for example, an animal of the family Bradypodidae; Megalonychidae; Myrmecophagidae; Cyclopedidae; Chlamyphoridae;
  • Euarchoma mammals are, for example, animals of the family Tarsiidae; Cercopithecidae; Hominidae; Hylobatidae; good.
  • Euarchidae mammals include, for example, Muridae; Nesomyidae; Cricetidae; Spalacidae; Calomyscidae; Gliridae) animals.
  • Euarchitian mammals can be, for example, animals of the family Leporidae; Ochotonidae.
  • a euarchist mammal can be, for example, an animal of the Cynocephalidae family.
  • Euarchitian mammals can be, for example, animals of the family Tupaiidae; Ptilocercidae.
  • Mammals of the Laurasia beast may be, for example, animals of the family Erinaceidae; Solenodontidae; and Talpidae.
  • the Laurasiatherian mammal may be, for example, an animal of the family Pteropodidae; Vespertilionidae.
  • a mammal of the Laurasia mammalian family may be, for example, an animal of the family Equidae; Tapiridae, Rhinocerotidae.
  • Laurasia mammals include, for example, the Camelidae family, such as camels and llamas; the Suidae family, such as wild boars and pigs; the Tragulidae family; the Moschidae family; Bovidae, such as cows, antelopes, goats, and sheep; Giraffidae, such as giraffes and okapis; Antilocapridae; Hippopotamidae, such as hippopotamus and pygmy hippo Mysticeti such as Balaenidae; Physeteridae; Delphinidae.
  • the Camelidae family such as camels and llamas
  • the Suidae family such as wild boars and pigs
  • the Moschidae family Bovidae, such as cows, antelopes, goats, and sheep
  • Giraffidae such as giraffes and okapi
  • the non-human vertebrates according to this aspect are non-human mammals.
  • Non-human mammals are, for example, any animal belonging to the rodent family, such as mice, rats, guinea pigs, hamsters, any animal belonging to the non-human primate family, such as chimpanzees, and belonging to the order Artiodactyla, such as cattle, goats, and sheep. It may be any animal, any animal belonging to the perissodactyla order such as a horse, or a companion animal such as a rabbit, a dog, or a cat.
  • the term "derived” or "derived from” means that a specific object is obtained directly or indirectly from a specific source.
  • the non-human vertebrate-derived early embryo is an early embryo obtained in vitro by oviposition or artificial insemination of a non-human vertebrate, or an early embryo obtained by culturing a fertilized egg obtained in vitro. Includes embryos (eg, 32-cell stage embryos).
  • isolated cells derived from an embryo include cells obtained by separating a group of cells that constitute an embryo into individual cells or cells obtained by culturing said cells.
  • a second aspect of the present disclosure is collecting primordial germ cells from a primordial germ cell-enriched embryo according to the present disclosure; and culturing the host embryo into which said donor primordial germ cells have been injected, said germ-line chimeric non-human vertebrate comprising:
  • the animal contains said donor primordial germ cells in its gonadal region and includes a non-human vertebrate that provided said donor primordial germ cells (donor non-human vertebrate) and a non-human vertebrate that provided said host embryos (host non-human).
  • Human vertebrates are closely related.
  • the primordial germ cell-enriched embryo includes, for example, a blastula, a cystula, a neurula, a pharyngeal embryo, or an embryo at a later stage of development (for example, a developed individual such as a juvenile, fry, chick or fetus). ).
  • the primordial germ cell-enriched embryo is a blastula, a cystula, a neurula, a pharyngeal embryo, or an embryo at a later stage of development, and the individual is It is an embryo before development, preferably a blastula or a cystula.
  • Primordial germ cells can be collected from embryos according to known methods depending on the developmental stage of the embryo. Primordial germ cells can be harvested, for example, from blastulae using an aspirator equipped with a glass capillary. Primordial germ cells are separated and enriched by, for example, exfoliating embryos after the cystula using a protease such as trypsin or collagenase, and subjecting exfoliated cells to density gradient centrifugation. can be collected by a protease such as trypsin or collagenase.
  • a marker gene for example, a gene encoding a fluorescent protein
  • the early embryo introduced with Dnd1 and Nanos is prepared by introducing said Dnd1 and Nanos into all or most cells of an early embryo of a non-human vertebrate, at the blastula stage obtained by culturing said early embryo Almost all the cells of the developmentally arrested embryo are primordial germ cells into which the Dnd1 and Nanos have been introduced and the target gene is expressed.
  • the collected primordial germ cells are injected into non-human vertebrate-derived embryos (host embryos). Said injection can be performed, for example, by microinjection.
  • the host embryo into which the donor primordial germ cells are injected or transplanted may be, for example, a blastula, a cystula, a neurula, a pharynx embryo, or an embryo at a later stage of development (e.g., a developed individual such as a juvenile, juvenile, chick, or fetus). including). Any number of donor primordial germ cells can be injected into the host embryo.
  • Donor primordial germ cells are added to the host embryo, e.g. 75, 20-75, 10-60, 20-60, 30-60 can be injected.
  • the non-human vertebrate that provided the donor primordial germ cells (donor non-human vertebrate) and the non-human vertebrate that provided the host embryo (host non-human vertebrate) are closely related.
  • the term "closely related" refers to non-human vertebrates belonging to the same family. Closely related non-human vertebrates may be, for example, non-human vertebrates belonging to the same family, preferably non-human vertebrates belonging to the same genus. In this disclosure, closely related does not exclude the same species. Close relatives can be, for example, non-human vertebrates belonging to the same species.
  • Related non-human vertebrates are, for example, non-human vertebrates that are different and belong to the same family.
  • Closely related non-human vertebrates are, for example, non-human vertebrates that are different and belong to the same genus.
  • the donor non-human vertebrate and the host non-human vertebrate are the same species of non-human vertebrate.
  • the donor non-human vertebrate can be an animal of the same species as the individual animal that provided the donor primordial germ cells.
  • the host non-human vertebrate may be an animal of the same species as the individual animal that provided the host embryo.
  • the host non-human vertebrate that provided the host embryo is sterilized. Sterilization of non-human vertebrates can be performed using known methods (eg, genome editing technology).
  • the donor non-human vertebrate and the host non-human vertebrate belong to fish
  • the donor non-human vertebrate and the host non-human vertebrate are, for example, a combination of tuna and mackerel, a combination of salmon and rainbow trout. , a combination of Tiger puffer and Kusafugu, or a combination of Nishikigoi and Goldfish.
  • a chimeric non-human vertebrate is obtained that contains donor primordial germ cells in its gonadal region.
  • Said chimeric non-human vertebrate is a non-human vertebrate of the same species as the non-human vertebrate that provided the host embryo.
  • the donor primordial germ cells may be genetically modified. Gene transfer into donor primordial germ cells can be performed according to the methods described in this disclosure.
  • One embodiment of this aspect is introducing Dnd1 and Nanos into an early embryo from a donor non-human vertebrate and modifying its genes; said Dnd1 and Nanos introduced and said genes modified Culturing early embryos to prepare primordial germ cell-enriched embryos whose genes are modified; collecting the donor primordial germ cells); injecting the collected donor primordial germ cells into a host embryo derived from a non-human vertebrate; and culturing the host embryo into which the donor primordial germ cells have been injected.
  • a method is provided wherein the non-human vertebrate and the host non-human vertebrate that provided said host embryo are closely related.
  • the germline chimeric non-human vertebrate (host non-human vertebrate) essentially contains genetic modifications only in the primordial germ cells of the gonadal region (gonad). For example, even if the genetic modification is a lethal or developmentally defective modification (e.g., chromosomal tetraploidization), according to the method of this embodiment, germ cells containing the genetic modification are included in the gonadal region. , said germline chimeric non-human vertebrate (host non-human vertebrate) is obtained.
  • a lethal or developmentally defective modification e.g., chromosomal tetraploidization
  • triploid females In fish, triploid females do not produce eggs, so the nutrients used for egg production are used for individual growth. As a result, triploid females are larger in size and have better meat quality than normal diploid females. Triploid individuals are produced from tetraploid eggs and sperm. Individuals for which tetraploid eggs or sperm are prepared (tetraploids) may develop poorly or grow poorly. Therefore, there is an advantage in producing a diploid individual containing tetraploid primordial germ cells in its gonadal region. According to the method of the second aspect, an individual as described above can be produced.
  • Such methods include, for example, introducing Dnd1 and Nanos into an early embryo (e.g., at least one cell of a 4- to 64-cell stage embryo) derived from a non-human vertebrate and making it tetraploid. performing the modification in the early embryo; culturing the Dnd1 and Nanos-introduced and genetically modified early embryo to prepare an embryo enriched in donor primordial germ cells (tetraploid) collecting donor primordial germ cells (tetraploid) from said primordial germ cell-enriched embryo and injecting them into a host embryo (diploid) derived from a non-human vertebrate; culturing a host embryo (diploid) into which a germline chimeric non-human vertebrate has been injected (diploid).
  • an early embryo e.g., at least one cell of a 4- to 64-cell stage embryo
  • tetraploid e.g., at least one cell of a 4- to 64-cell stage embryo
  • performing the modification in the early embryo culturing the Dnd
  • Said germ-line chimeric non-human vertebrate comprises donor primordial germ cells (tetraploid) in its gonadal region and its somatic cells are diploid.
  • a triploid individual can be obtained from an egg (tetraploid) from the germ-line chimeric vertebrate and a sperm (diploid) from a wild-type conspecific non-human vertebrate.
  • Germline chimeric non-human vertebrates produced by the method according to the second aspect are capable of producing donor non-human vertebrates containing donor primordial germ cells in their gonadal regions as described below. can.
  • One aspect of the present disclosure is a method of producing a donor non-human vertebrate comprising mating a germ-line chimeric non-human vertebrate (a host non-human vertebrate), said germ-line chimeric non-human vertebrate (a host non-human vertebrate) comprises donor primordial germ cells in its gonadal region, and said donor non-human vertebrate comprises said donor primordial germ cells in its gonadal region.
  • a germ-line chimeric non-human vertebrate that contains donor primordial germ cells in its gonadal region is, for example, naturally bred with the same germ-line chimeric non-human vertebrate (e.g., a host non-human vertebrate) or artificially.
  • Insemination can produce the next generation of germline chimeric non-human vertebrates (donor non-human vertebrates).
  • a germ-line chimeric non-human vertebrate containing donor primordial germ cells in its gonadal region is, for example, by natural mating or artificial insemination with a donor non-human vertebrate to produce the next generation of germ-line chimeric non-human vertebrates. Animals (donor non-human vertebrates) can be created.
  • the method according to this aspect can be used, for example, for borrower production technology.
  • a host non-human vertebrate e.g., mackerel
  • a non-human vertebrate with high economic value e.g., tuna
  • donor non-human vertebrates e.g, tuna
  • host non-human vertebrates e.g, mackerel
  • introducing Dnd1 and Nanos into an early embryo derived from a non-human vertebrate e.g., an early embryo derived from tuna
  • a non-human vertebrate e.g., an early embryo derived from tuna
  • Culturing an embryo optionally with said gene modified
  • a primordial germ cell-enriched embryo derived from tuna
  • harvesting donor primordial germ cells (derived from tuna) from said embryo injecting into a host embryo (e.g., from mackerel) derived from a non-human vertebrate; culturing said host embryo to produce a germ-line chimeric non-human vertebrate comprising said donor primordial germ cells (from tuna) in its gonadal region.
  • the early embryo is, for example, an embryo at the 1- to 8-cell stage (preferably the 1-cell stage or the 2-cell stage, more preferably the 1-cell stage).
  • the term “comprising” means that the listed elements and/or steps are present and other elements and/or steps may be added.
  • the term “consisting of” means that the listed elements and/or steps are present and other elements and/or steps are excluded.
  • the term “consisting essentially of” means that the recited elements and/or steps are present and the other elements and/or steps are a method of preparing a primordial germ cell-enriched embryo. It means that it may be added to the extent that it does not affect the novel technical features of human vertebrate production methods, germline chimeric non-human vertebrates, and transgenic non-human vertebrates.
  • the term “substantially free” does not exclude “completely free.”
  • SV40pA was amplified from the cyto-YFP-FKBPx5 vector (addgeneID: 103777) and cloned into the BamHI/KpnI site of pGGEV_2'_XcmI-LacZ (addgeneID: 49303).
  • Golden GATEway (GGW) cloning method Kirchmaier et al. Golden GATEway Cloning-A combinatorial approach to generate fusion and recombination constructs.
  • SV40pA was added to the 3′ ends of Nanos3 and Dnd1 . connected to each.
  • cDNAs containing the protein coding regions of zebrafish Nanos3 and Dnd1 , respectively, were prepared from mRNA expressed in cells of zebrafish ovary using reverse transcriptase.
  • the Nanos3 and Dnd1 protein coding regions were amplified from the above cDNAs and cloned into the pGGEV-1_XcmI-LacZ vector.
  • SV40pA was ligated by the GGW cloning method as described above.
  • mRNA was synthesized by an in vitro transcription reaction using a T7 promoter (Fig. 1).
  • Test 1-1 Co-injection of Dnd1 and Nanos3 induced differentiation of almost all cells at the blastula stage into primordial germ cells
  • Medaka one-cell stage embryos (fertilized eggs) were microinjected with 40 ng/ ⁇ l of Nanos3 -SV40pA and Dnd1 -SV40pA mRNA (medaka-derived embryos overexpressing Dnd1/Nanos3: Dnd1/Nanos3-OE embryos).
  • the 1-cell stage embryos were microinjected with mCherry- Nanos3 3'UTR for primordial germ cell labeling and the embryos were cultured. The embryos developed to the blastula stage, but development did not proceed thereafter.
  • PSCs primordial germ cells
  • Approximately 50 primordial germ cells of these embryos were microinjected into wild-type host embryos, and the embryos were cultured. Surprisingly, many of the transplanted cells migrated to the gonad as well as PGCs (Fig. 2C). In late-stage embryos, at least 200 or more PGCs were observed in the gonadal region (Fig. 2D). This result means that a significantly larger number of PGCs were formed than in the wild type, in which about 10 to 40 PGCs are normally formed.
  • Non-Patent Document 2 Regarding the number of primordial germ cells formed, according to the method of the present disclosure, the number of primordial germ cells is increased by about 30-fold or more compared to the wild type (Fig. 2D). Therefore, according to the method of the present disclosure, the number of primordial germ cells can be remarkably increased as compared with the forced expression of Dnd1 alone.
  • Test 1-2 Comparison of introduction of both Dnd1/Nanos3 and introduction of Dnd1 alone or Nanos3 alone in primordial germ cell formation , when both Dnd1/Nanos3 were introduced and overexpressed (OE), development did not progress from the blastula stage onwards, and no individual developed (hatched). Therefore, by introducing Dnd1/Nanos3 into only one cell of a 16-cell stage embryo, it was tested whether an embryo with an increased number of primordial germ cells would develop normally (hatching).
  • endogenous Dnd1 or Nanos3 or both were knocked down (KD) by the CRISPR-Casl3d system (Fig. 3A).
  • EGFP olvas-EGFP
  • Dnd1/Nanos3 gRNA mCherry- Nanos3 3' UTRs (for PGC labeling) were microinjected to knock down endogenous Dnd or Nanos3 or both.
  • 16 cells form a single cell layer of 4 cells ⁇ 4 cells (schematic diagram in FIG. 3B).
  • BuckyBall: EGFP medaka the localization of a factor (germ granule factor) that constitutes germplasm was investigated in 16-cell stage embryos. Germ granule factors were scarcely localized in cells outside the single cell layer (fluorescence image in FIG. 3B). In order to investigate whether cells destined to become cells other than primordial germ cells, in which no germ granule factor is localized, can be induced to differentiate into primordial germ cells by introducing Dnd1/Nanos3 .
  • Embryos microinjected with Dnd1/Nanos3 developed normally (107 individuals). In the gonadal regions of 99 out of 107 individuals (93%), similar to the germline chimeras in test 1-1, significantly increased numbers of olvas-EGFP-positive primordial germs compared to control individuals (Fig. 3C). Cells were observed (Fig. 3D). In embryos microinjected with Dnd1 and Nanos3 alone, olvas-EGFP-positive primordial germ cell formation was confirmed in 18% (19 out of 104 individuals) and 23% (23 out of 102 individuals), respectively. there were. In addition, the number of primordial germ cells formed was extremely low, averaging 3.4 ⁇ 2.4 per individual (FIGS. 3E and F).
  • Tests 1-2 importantly demonstrated that injection of both Dnd1 and Nanos3 into at least one cell of a 16-cell stage embryo resulted in a marked increase in the development of individuals containing primordial germ cells in their gonadal regions. is possible. Injection of both Dnd1 and Nanos3 into a single cell of 4-, 8-, and 32-cell stage embryos also resulted in individuals containing significantly increased primordial germ cells in their gonadal regions. Occurred. Therefore, Examples of the present disclosure show that by injecting both Dnd1 and Nanos3 into a predetermined proportion of cells in early embryos (4- to 32-cell stage embryos), significantly increased primordial germ cells can be produced. It indicates that the development of individuals containing the gonadal region is possible.
  • Tests 1-2 show that cells co-injected with Dnd1 and Nanos3 need not be cells destined to become primordial germ cells (ie, cells in which germ granule factors are localized). Furthermore, Tests 1-2 show that injection of both Dnd1 and Nanos3 causes the formation of significantly greater numbers of primordial germ cells than injection of those genes alone.
  • Test 1-3 PGCs formed with Dnd1/Nanos3-OE express typical germ granule factors Expression of olvas-EGFP was observed.
  • olvas-EGFP is a marker for monitoring the expression of germ granule factor vasa with EGFP.
  • the medaka embryos used in Test 1-2 had a wild-type mother and an olvas-EGFP transgenic medaka father. Therefore, the expression of the vasa gene observed in the developed embryo is not maternally accumulated in the egg, but gene-derived (embryonic-derived) from the formed primordial germ cells themselves.
  • germinal granule factors (piwil1, piwil2, dazl, tdrd1, tdrd9 and tdrd12) other than germinal granule factor vasa was examined by in situ hybridization. As a result, in addition to the vasa gene, all examined germ granule factors were expressed in primordial germ cells formed in Dnd1/Nanos3-OE embryos (Fig. 4).
  • Tests 1-2 and 1-3 showed that primordial germ cells formed by Dnd1/Nanos3-OE were similar to endogenous primordial germ cells in terms of gene expression, in addition to their ability to migrate to the gonad. It shows that it has the property.
  • Test 1-4 mRNA encoding both Dnd1 and Nanos3
  • Test 1-1 two types of mRNA, mRNA encoding Dnd1 and mRNA encoding Nanos3 , were microinjected simultaneously.
  • Test 1-4 the same test as Test 1-1 was performed using single-stranded mRNAs encoding both Dnd1 and Nanos3 .
  • embryos into which the single-stranded mRNA was microinjected stopped developing at the blastula stage, and almost all cells in the blastula became primordial germ cells.
  • Test (2) Enrichment of primordial germ cells in zebrafish embryos It was tested whether the technique for increasing primordial germ cells demonstrated in medaka in Test (1) could be applied to other fish species. In test (2), zebrafish, which are different strains from medaka, were used.
  • a control donor embryo was prepared by microinjecting 40 ng/ ⁇ l EGFP-Nanos3 3′UTR mRNA alone into a 1-cell stage embryo (donor embryo) of zebrafish (FIG. 5A left). Control donor embryos were cultured to the blastula stage and primordial germ cells (donor primordial germ cells) were harvested and injected into untreated embryos (host embryos) (Fig. 5B left).
  • DN-OE embryos had stronger EGFP fluorescence than control embryos, and Nanos3 expression was observed throughout the cells of the embryos (Fig. 5A). DN-OE embryos did not progress normally to the cystula stage, and the individuals did not develop (hatch) (Fig. 5A), similar to the result of medaka in Test 1-1.
  • DN-OE chimeras 16 germline chimeras containing donor primordial germ cells in their gonadal regions were obtained. A large number of EGFP-positive primordial germ cell-like cells were observed in 16 out of 16 individuals (100%) (Fig. 5D).
  • Fig. 5C By culturing host embryos injected with donor primordial germ cells from control embryos, 18 germline chimeras containing control donor primordial germ cells in their gonadal regions were obtained. No EGFP-positive primordial germ cell-like cells were observed in all 18 individuals (0%) (Fig. 5C).
  • EGFP-positive cells were observed in the gonadal regions of all four hatched DN-OE chimeras (Fig. 5E). VASA protein was expressed in the EGFP-positive cells (Fig. 5F).
  • Test (2) shows that co-introduction of Dnd1 and Nanos3 can lead to the formation of embryos containing an increased number of primordial germ cells, even in zebrafish, and that the formed primordial germ cells are similar to endogenous primordial germ cells. It shows that it has properties similar to
  • Test (3) PGCs Formed with Dnd1/Nanos3-OE Produce Functional Gametes
  • An olvas-EGFP/sox9b-DsRed transgenic medaka fish was prepared as a donor. Germ cells of the transgenic medaka fish are labeled with EGFP, and notochord and chondrocytes are labeled with DsRed.
  • a wild-type medaka (Cab strain) was prepared as a host. Host embryos were sterilized by knockdown of dnd/nanos3 using the CRISPR/Casl3d system.
  • Donor cells were collected from the blastula stage embryos derived from the transgenic medaka. Donor cells were implanted into blastula stage host embryos by microinjection using glass capillaries at no more than 20 donor cells per embryo. Transfers were performed on 4-5 host embryos. Said transplantation condition is referred to as "test N20". In a similar manner, donor cells were implanted into blastula stage host embryos at ⁇ 50 donor cells per embryo. Transfers were performed on 2-3 host embryos. Said transplantation condition is referred to as "test N50". The chimeric embryos after transplantation were reared in physiological saline containing antibiotics and hatched. After hatching, the medaka were reared in fresh water for 3 months to reach sexual maturity. Generation of germline chimeras was determined by whether or not olvas-EGFP-positive PGCs were incorporated into the gonads.
  • the fertility of the germline chimera individuals was confirmed by pair mating with wild-type medaka. After mating, the chimeric individuals were dissected and the presence or absence of donor-derived germ cells was examined based on EGFP fluorescence in the gonads.
  • test N20 when donor cells derived from untreated donor embryos (not injected with Dnd1/Nanos3 ) were used, the rate of generation of germline chimeras was 0% (test result 3-1). When donor cells derived from donor embryos microinjected with Dnd1/Nanos3 (Dnd1/Nanos3-OE) were used, the production rate was 89%. Seventy-four percent (14 out of 19 individuals) of the germline chimeras were fertile (test result 3-2).
  • test N50 when donor cells derived from untreated donor embryos were used, the proportion of germline chimeras was 48%, of which 100% (7 out of 7 individuals) were fertile (test result 3 -3). When donor cells derived from Dnd1/Nanos3-OE donor embryos were used, the production rate was 100%, of which 87% (16 out of 18 individuals) were fertile (test results 3-4).
  • next generation embryos were obtained from individuals whose fertility was confirmed. All embryos of the next generation were olvas-EGFP/sox9b-DsRed positive. This indicates that the next generation embryos are derived from donor gametes. Furthermore, olvas-EGFP-positive germ cells were detected in all embryos of the next generation. This indicates that germ cell formation proceeded normally in the next-generation embryos (Fig. 6).
  • dazl mRNA which is required for gametogenesis initiation, was microinjected into donor embryos together with dnd/nanos3 mRNA. Over 50 cells from the donor embryos were transferred into sterilized host embryos (test N50). As a result, the percentage of germline chimeras was 100%, of which 96.5% (26 out of 27 individuals) were fertile. One individual whose fertility could not be confirmed was dissected. As a result, normal testis formation was confirmed. This indicates that gametogenesis in this individual was normal.
  • Test (4) Enrichment of primordial germ cells in medaka embryos by introducing medaka dnd1/nanos2 In Test 4, substantially the same method as in Test 1-2 was used, except that nanos2 was used instead of nanos3. , 16-cell stage embryos of medaka. Specifically, 20 medaka embryos were used. A single outer cell in the medaka embryo was co-injected with nanos2 -encoding mRNA and dnd1- encoding mRNA. As a result, 20 individuals were generated. All 20 individuals were enriched for primordial germ cells (Fig. 7B).
  • FIG. 7A shows the results of applying the same method as Tests 1-4 to 16-cell stage embryos.
  • Nanos genes generally include nanos1 , nanos2 , and nanos3 .
  • Nanos2 is known to function in germline stem cells in adult fish, but not in primordial germ cells in embryos. Test 4 demonstrated that nanos2 is capable of forming primordial germ cells in embryos.
  • Test (5) Enrichment of primordial germ cells in medaka embryos by introduction of zebrafish dnd1/nanos3
  • zebrafish-derived dnd1/ nanos3 Zdnd1 , Znanos3
  • Zdnd1 , Znanos3 zebrafish-derived dnd1/ nanos3
  • Test 5 demonstrated that even nanos and dnd of zebrafish belonging to the order Cyprinidae were able to enrich primordial germ cells in the embryos of medaka belonging to the order order Garda.
  • the results of Test 5 suggest that the disclosed invention can be practiced without obtaining (cloning) Nanos and Dnd1 of the animal species from which primordial germ cells are desired.
  • Nanos and Dnd1 of another animal species belonging to the same division (preferably the same class) as the animal species from which the primordial germ cells are to be obtained e.g. fish species of high economic value
  • the primordial germ cells of said animal species can be enriched.

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Abstract

本開示は、非ヒト脊椎動物由来の初期胚に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドを導入すること；及び前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓヌクレオチドが導入された初期胚を培養することを含む、始原生殖細胞が富化された胚を調製する方法を提供する。

Description

始原生殖細胞が富化された胚を調製する方法
　本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、始原生殖細胞が富化された胚を調製する方法に関する。本発明は、トランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法、生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物を作出する方法、又はドナー非ヒト脊椎動物を作出する方法に関する。本発明は、始原生殖細胞が富化された胚に関する。
　天然の水産生物資源の利用可能量は、近年低水準である。人工的に水産生物資源を確保するために、様々な養殖方法が開発されている。食料として利用される全ての魚種で親魚を養殖し、生殖制御を含む種苗産生技術を確立することは合理的ではない。養殖方法が確立された魚種を親魚（ホスト魚種）として、種苗生産を目指す魚種（ドナー魚種）の配偶子を作り出せれば、生産技術の開発に要する手間を削減できる。このような生産方法は借腹生産とも呼ばれる。マグロのような大型で産業的価値の高いドナー魚種の配偶子を、飼育が容易で安価な近縁種（ホスト魚種、例えばサバ）に作らせる借腹生産技術が開発されている。
　借腹生産技術は、ドナー種の胚又はその成体の生殖腺から配偶子の元となる始原生殖細胞（ＰＧＣ）もしくは生殖幹細胞を単離すること、前記細胞を代理親（ホスト魚種）に移植すること、及びドナー魚種の機能的な配偶子を作らせることを含む。胚の発生初期に形成されるＰＧＣは、染色体操作技術（染色体の数と組み合わせ統御する技術）により有用な遺伝的特性を付与することが容易あるため、ドナー細胞として有用である。また、前記ＰＧＣ一個をホスト魚種に移植すれば、ドナー魚種の機能的な配偶子が前記ホスト魚種で継続的に生産されるため、有用である（非特許文献１）。
　胚におけるＰＧＣの数を増やす技術として、生殖質を構成する因子（生殖顆粒因子）の一つであるｄｅａｄ　ｅｎｄ１（Ｄｎｄ１）をコードするｍＲＮＡを１細胞期の受精卵に導入する方法が、メダカにおいて開発された（非特許文献２）。非特許文献２は、Ｄｎｄ１を発生初期の細胞全体で発現させると、ＰＧＣの数が約１．５倍～２倍に増加したことを報告する。
　ダツ目に属するメダカと系統の離れたコイ目に属するゼブラフィッシュに非特許文献２の方法を用いても、ＰＧＣの数が増えなかった（非特許文献３）。
Ｓａｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ．　Ｘｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｔｅｌｅｏｓｔ　ｆｉｓｈ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｒｍ－ｌｉｎｅ　ｃｈｉｍｅｒａｓ　ｂｙ　ｓｉｎｇｌｅ　ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　７８，１５９－１６６（２００８） Ｈｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｎｄ　ｉｓ　ａ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｓｐｅｃｉｆｉｅｒ　ｏｆ　ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｅｄａｋａ　ｆｉｓｈ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　６，４１１－４２１（２０１６） Ｗｅｉｄｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．ｄｅａｄ　ｅｎｄ，ａ　ｎｏｖｅｌ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ｇｅｒｍ　ｐｌａｓｍ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１３，１４２９－１４３４（２００３）
　始原生殖細胞は、一つの胚あたり約１０～４０個しか形成されない。例えば、借腹生産に係る分野では、胚あたりの始原生殖細胞の数を顕著に増やす方法が求められている。
　胚において、生殖細胞特異的なＲＮＡ結合タンパク質であるＤｎｄ１を発現する細胞のすべてが始原生殖細胞に分化するわけではない。したがって、本発明者は、始原生殖細胞への分化には、Ｄｎｄ１に加えて、別の因子が関与していると考えた。本発明者は、Ｄｎｄ１に加え、別の生殖顆粒因子であるＮａｎｏｓ３を初期胚に導入することで、胚あたりの始原生殖細胞の数が顕著に増加することを見出した。本発明者はまた、Ｄｎｄ１とＮａｎｏｓ３との共導入によって、メダカだけでなく、メダカと系統が大きく離れたゼブラフィッシュでも、胚あたりの始原生殖細胞の数が顕著に増加することを見出した。これらの知見に基づいて、本発明者は、胚あたりの始原生殖細胞の数を顕著に増やすことができる、汎用性のある方法を発明した。
　本開示は、以下の発明を提供する。
［項１］　非ヒト脊椎動物由来の初期胚に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入すること；及び前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚を培養することを含む、始原生殖細胞が富化された胚を調製する方法。
［項２］　前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓは、タンパク質又はそれらをコードするヌクレオチドである、項１に記載の方法。
［項３］　前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが、それらをコードするＲＮＡである場合、その３’端側にポリＡ配列を含み、及び前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが、それらをコードするＤＮＡである場合、外来性のポリアデニル化配列を含む、項１に記載の方法。［項４］　前記初期胚に、配偶子形成因子を導入することを更に含む、項１～３のいずれかに記載の方法。
［項５］　前記配偶子形成因子が、Ｄａｚ、Ｄａｚｌ、Ｂｏｕｌｅ、ｍｅｉｏＣ、Ｙｔｈｄｃ２及びＲｂｍ４６から成る群より選択される少なくとも１つである、項４に記載の方法。
［項６］　前記初期胚が、１細胞期から６４細胞期の胚である、項１～５のいずれかに記載の方法。
［項７］　前記非ヒト脊椎動物が、魚類に属する動物である、項１～６のいずれかに記載の方法。
［項８］　前記非ヒト脊椎動物由来の初期胚の遺伝子を改変することをさらに含む、項１～７のいずれかに記載の方法。
［項９］　トランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、非ヒト脊椎動物由来の初期胚に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入し、かつ前記初期胚の遺伝子を改変すること；及び前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入され、且つ前記遺伝子が改変された初期胚を培養して、トランスジェニック非ヒト脊椎動物を発生させることを含み、前記初期胚が、４細胞期  から６４細胞期の胚 であり、前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物は、遺伝子が改変された始原生殖細胞をその生殖腺領域に含む、方法。
［項１０］　項１～８のいずれかに記載の方法で調製された、始原生殖細胞が富化された胚からドナー始原生殖細胞を採取すること；採取したドナー始原生殖細胞を非ヒト脊椎動物由来のホスト胚に注入すること；及び前記ドナー始原生殖細胞が注入されたホスト胚を培養することを含む、生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、前記生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物は、前記ドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含み、及び前記ドナー始原生殖細胞を提供したドナー非ヒト脊椎動物と、前記ホスト胚を提供したホスト非ヒト脊椎動物とは近縁である、方法。
［項１１］　項１０に記載の方法で作出された生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物を交配させることを含む、ドナー非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、前記生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物が、前記ドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含み、及び前記ドナー非ヒト脊椎動物が、前記ドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含む、方法。
［項１２］　前記ドナー非ヒト脊椎動物及び前記ホスト非ヒト脊椎動物が魚類に属し、前記ホスト非ヒト脊椎動物と前記ドナー非ヒト脊椎動物とが、サバとマグロの組合せ、サケとニジマスの組合せ、トラフグとクサフグの組合せ、又は金魚と錦鯉との組合せである、項１０又は１１に記載の方法。
［項１３］　始原生殖細胞が富化された非ヒト脊椎動物由来の胚であって、前記胚は、胞胚期以降の胚であり、前記胚における始原生殖細胞の数が、前記胚と同種の非ヒト脊椎動物由来、同じ発生段階の胚における始原生殖細胞の数よりも少なくとも３倍多い、胚。
［項１４］　項１～８のいずれかに記載の方法で調製された、始原生殖細胞が富化された胚、又は項７～１２のいずれかに記載の方法で作出された、非ヒト脊椎動物。
図１は、Ｎａｎｏｓ３－ＳＶ４０ｐＡのｍＲＮＡ及びＤｎｄ１－ＳＶ４０ｐＡのｍＲＮＡの合成手順を示すフロー図である。 図２Ａは、生殖系列キメラメダカを作出する手順を示す模式図である。図２Ｂは、Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３を共導入したドナー胚の顕微鏡画像である。図２Ｃは、ドナー胚から採取したドナー始原生殖細胞を導入したホスト胚の顕微鏡画像である。図２Ｄは、ドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含むホスト胚から発生した、生殖系列キメラメダカの顕微鏡画像である。 図３Ａは、内在性のＤｎｄ１及び／又はＮａｎｏｓ３をノックダウンするために、１細胞期の胚に遺伝子を導入することを示す模式図である。図３Ｂ左は、１６細胞期の胚の１個の細胞に、Ｄｎｄ１及び／又はＮａｎｏｓ３をコードするヌクレオチドを共導入することを示す模式図である。図３Ｂ右は、ＢｕｃｋｙＢａｌｌ：ＥＧＦＰを発現する１６細胞期の胚を示す顕微鏡画像である。図３Ｃは、コントロールのメダカの生殖腺領域（矢頭）を示す蛍光画像である。図３Ｄは、Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３を共導入した胚から発生したメダカの生殖腺領域（矢頭）を示す蛍光画像である。図３Ｅは、Ｄｎｄ１を導入した胚から発生したメダカの生殖腺領域（矢頭）を示す蛍光画像である。図３Ｆは、Ｎａｎｏｓ３を導入した胚から発生したメダカの生殖腺領域（矢頭）を示す蛍光画像である。 図４は、一連の生殖顆粒因子の発現を調べた顕微鏡画像である。 図５Ａは、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓ３を過剰発現させたドナー胚（ＤＮ－ＯＥ）の顕微鏡画像である。図５Ｂは、ＤＮ－ＯＥ胚由来のドナー始原生殖細胞を注入したホスト胚の顕微鏡画像である。図５Ｃは、コントロールのドナー始原生殖細胞を注入したホスト胚（コントロール胚）の顕微鏡画像である。図５Ｄは、ＤＮ－ＯＥ胚由来のドナー始原生殖細胞を注入したホスト胚（ＤＮ－キメラ胚）の顕微鏡画像である。図５Ｅは、ＤＮ－キメラ胚から発生したキメラメダカの顕微鏡画像である。図５Ｆは、ＤＮ－キメラ胚から発生したキメラメダカの生殖腺領域におけるドナー由来の始原生殖細胞を示す顕微鏡画像である。 図６は、メダカ胚の蛍光顕微鏡画像である。前記メダカ胚は、ＤＮ－ＯＥドナー胚由来のドナー始原生殖細胞を注入したホスト胚から発生した次世代のメダカの胚である。Ｏｌｖａｓ－ＥＧＦＰ（緑色）は生殖細胞を示し、ｓｏｘ９ｂ－ＤｓＲＥＤ（橙色）は脊索および軟骨細胞を示す。左下画像は、前記蛍光画像中央の白枠で囲んだ領域の拡大画像である。左下画像中の矢印は、生殖領域に形成された生殖細胞（緑色蛍光）を示す。 図７Ａは、メダカ由来のＤｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３を共導入したメダカ胚の蛍光顕微鏡画像である。図７Ｂは、メダカ由来のＤｎｄ１／Ｎａｎｏｓ２を共導入したメダカ胚の蛍光顕微鏡画像である。図７Ｃは、ゼブラフィッシュ由来のＤｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３（Ｚｄｎｄ１＋Ｚｎａｎｏｓ３）を共導入したメダカ胚の蛍光顕微鏡画像である。点線で囲まれた領域は、始原生殖細胞が富化された生殖腺領域を示す。
（始原生殖細胞が富化された胚を調製する方法）
　本開示の第１の態様は、非ヒト脊椎動物由来の初期胚に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入すること；及び前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚を培養することを含む、始原生殖細胞が富化された胚を調製する方法を提供する。第１の態様に係る方法により、始原生殖細胞が富化された胚が調製される。したがって、本開示の他の態様は、第１の態様に係る方法により調製された始原生殖細胞が富化された胚を提供する。本開示の他の態様は、始原生殖細胞が富化された非ヒト脊椎動物由来の胚であって、前記胚は、胞胚期以降の胚であり、前記胚における始原生殖細胞の数が、前記胚と同種の非ヒト脊椎動物由来の同じ発生段階の胚における始原生殖細胞の数よりも少なくとも３倍多い、胚を提供する。
　用語「始原生殖細胞」は、生殖細胞に分化する細胞を意味する。始原生殖細胞は、減数分裂を経て、最終的に卵子又は精子に分化し得る。始原生殖細胞は、例えば、公知の始原生殖細胞マーカーに基づいて特定することができる。公知の生殖細胞マーカーは、例えば、ＮＡＴＵＲＥ　ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ（２０１９）１０：３０５４（その開示内容は引用により本明細書中に組込まれる）に記載のマーカーであってよい。始原生殖細胞は、例えば、公知の生殖顆粒因子の発現に基づいて特定することができる。公知の生殖顆粒因子は、例えば、ｖａｓａ、ｐｉｗｉｌ１、ｐｉｗｉｌ２、ｄａｚｌ、ｔｄｒｄ１、ｔｄｒｄ９、又はｔｄｒｄ１２であってよい。始原生殖細胞は、例えば、ｖａｓａ、ｐｉｗｉｌ１、ｐｉｗｉｌ２、ｄａｚｌ、ｔｄｒｄ１、ｔｄｒｄ９及びｔｄｒｄ１２からなる群より選択される少なくとも１種を発現する。
　始原生殖細胞は、例えば、公知の方法に従って特定することができる。公知の方法は、前記した生殖細胞マーカー又は生殖顆粒因子のプロモーターと、蛍光タンパク質とを作動可能に連結したヌクレオチドを非ヒト脊椎動物由来の初期胚に導入し、前記蛍光タンパク質由来の蛍光に基づいて始原生殖細胞を特定することを含む。公知の方法は、前記した生殖細胞マーカー又は生殖顆粒因子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）と蛍光タンパク質とを含むｍＲＮＡを、非ヒト脊椎動物由来の初期胚に導入し、前記蛍光タンパク質の蛍光に基づいて始原生殖細胞を特定することを含む。蛍光タンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、又は青色蛍光タンパク質であってよい。用語「非翻訳領域」は、ｍＲＮＡにおいてコード領域に隣接するタンパク質に翻訳されない領域を意味する。
　本態様に係る始原生殖細胞は、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを非ヒト脊椎動物の初期胚に導入することによって分化誘導される。
　用語「初期胚」は、１細胞期から６４細胞期の胚を含む。初期胚は、例えば、１細胞期の胚～３２細胞期の胚である。初期胚は、例えば、自然交配又は人工授精によって、精子と卵子とから得られる。２細胞期以降の初期胚は、例えば、受精卵を培養することによって得ることできる。
　用語「胚」は、脊椎動物の受精卵以降の発生期にある細胞又は細胞塊を包含する。胚は、例えば１細胞期の胚（「受精卵」とも称する）であってよい。胚は、例えば、発生した個体（例えば、幼体、稚魚、雛鳥又は胎仔）であってよい。１つの例において、胚は、発生した個体を含まない。用語「桑実胚」は、６４細胞期から胞胚期までの胚を含む。桑実胚は、例えば、６５～５００個の細胞を含む胚である。用語「胞胚」は、胞胚腔と称される液体で満たされた腔を取り囲む細胞層を含む胚を意味する。用語「嚢胚」は、原腸胚とも称され、原腸が形成された胚を意味する。嚢胚では、例えば、外胚葉、中胚葉及び内胚葉の分化が観察される。外胚葉、中胚葉及び内胚葉の分化は、例えば、それらの層構造、又は公知のマーカーを用いて調べることができる。用語「神経胚」は、神経板が形成されてから神経管が完成する時期までの胚を意味する。神経板は、外胚葉の背側に形成され、中枢神経系の原基となる構造である。用語「咽頭胚（Ｐｈａｒｙｎｇｕｌａ）」は、咽頭弓が見られる胚発生期の胚を意味する。咽頭弓は、支柱状に突出した形態を有し、頭部及び頸部へと分化する構造体を指す。
　桑実胚、胞胚、嚢胚、神経胚又は咽頭胚は、例えば、受精卵を培養することにより得ることができる。初期胚、桑実胚、胞胚、嚢胚、神経胚又は咽頭胚はそれぞれ、例えば顕微鏡下で胚の構造（例えば細胞の数；肺胞腔；原腸の構造；外胚葉、中胚葉、内胚葉などの層構造；神経板；咽頭弓）又は特定のマーカーの発現を観察又は検出することで特定できる。
　非ヒト脊椎動物の初期胚に導入されるＤｎｄ１及びＮａｎｏｓは、タンパク質又はヌクレオチドの形態、もしくはそれらの組合せであってよい。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓは、その両方がタンパク質、又は両方をコードするヌクレオチド、もしくはそれらの組合せであってよい。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓは、いずれか一方がタンパク質であって、他方がそれをコードするヌクレオチドであってよい。発生した胚でのＤｎｄ１及びＮａｎｏｓの影響を低減又は無視できるため、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓは、好ましくは、両方ともタンパク質であるか、又は両方をコードするｍＲＮＡであるか、もしくはそれらの組合せである。発生中の胚でのＤｎｄ１及びＮａｎｏｓの持続的な作用が期待できるため、Ｄｎｄ1及びＮａｎｏｓは、好ましくは、それらをコードするＤＮＡである。
　用語「Ｄｎｄ１」は、「ｄｅａｄ　ｅｎｄ　１」と同意義であり、脊椎動物間で保存されたＲＮＡ結合タンパク質である。Ｄｎｄ１は、本開示に係る方法において、それが導入される初期胚を提供した非ヒト脊椎動物と同種又は異種の動物由来の野生型のＤｎｄ１を含む。前記異種の動物は、例えば、Ｄｎｄ１が導入される初期胚を提供した非ヒト脊椎動物と同じ門（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）又は亜門（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ）に属する異種の動物、好ましくは同じ網（ｃｌａｓｓ）又は亜網（ｓｕｂｃｌａｓｓ）に属する異種の動物、同じ目（ｏｒｄｅｒ）又は亜目（ｓｕｂｏｒｄｅｒ）に属する異種の動物、同じ科（ｆａｍｉｌｙ）又は亜科（ｓｕｂｆａｍｉｌｙ）に属する異種の動物、或いは同じ属（ｇｅｎｕｓ）又は同じ亜属（ｓｕｂｇｅｎｕｓ）に属する異種の動物である。Ｄｎｄ１のアミノ酸配列及びＤｎｄ１をコードするヌクレオチド配列の配列情報は、公的機関が提供するデータバンクサイトから入手することができる。例えば、メダカのＤｎｄ１をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１００３０２７２３のもと、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から入手することができる。例えば、クロマグロのＤｎｄ１をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１２１９０２２６１のもと、ＮＣＢＩから入手することができる。
　以下に、メダカ、ゼブラフィッシュ、マグロ由来のＤｄｎ１およびＮａｎｏｓ３のアミノ酸配列を示す
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　所定の種のＤｎｄ１をコードするヌクレオチドは、例えば、その種の細胞（例えば卵巣細胞）から逆転写酵素を用いたＲＴ－ＰＣＲ法により調製することができる。Ｄｎｄ１をコードするヌクレオチドがＤＮＡの場合、公知の遺伝子工学技術を用いて合成することができる。Ｄｎｄ１をコードするヌクレオチドがＲＮＡの場合、前記Ｄｎｄ１をコードするＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写によって調製することができる。所定の種のＤｎｄ１タンパク質は、商業的に入手可能であり、又は公知の方法に従って調製することができる。前記公知の方法は、Ｄｎｄ１タンパク質を含む天然源から、前記Ｄｎｄ１を分離及び精製（例えば、ＨＰＬＣを用いた精製）することを含む。Ｄｎｄ１タンパク質は、遺伝子工学的手法に従って調製することができる。前記遺伝子工学的手法は、例えば、Ｄｎｄ１をコードするヌクレオチドを発現ベクターに組み込んだプラスミドを作製し、前記プラスミドを宿主細胞に導入し、前記宿主細胞を培養することで、前記Ｄｎｄ１を発現させることを含む。発現させたＤｎｄ１は、宿主細胞または培養上清から分離及び精製することで、得ることができる。
　Ｄｎｄ１は、本態様における機能を有する限り、Ｄｎｄ１が導入される初期胚を提供した非ヒト脊椎動物の野生型のＤｎｄ１のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有していてよい。本態様における機能を有し、かつ前記野生型のＤｎｄ１と異なるアミノ酸配列を含むＤｎｄ１は、「Ｄｎｄ１バリアント」とも称する。Ｄｎｄ１のバリアントは、例えば、前記野生型のＤｎｄ１におけるＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）の配列同一性を有する。Ｄｎｄ１バリアントは、例えば、野生型のＤｎｄ１のＲＮＡ結合性の少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、１５０％以上、又は２００％以上）の結合性を有する。Ｄｎｄ１のバリアントは、例えば、前記野生型のＤｎｄ１におけるＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）の配列同一性を有し、かつ野生型のＤｎｄ１のＲＮＡ結合性の少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、１５０％以上、又は２００％以上）の結合性を有する。Ｄｎｄ１バリアントは、それが導入される初期胚を提供した非ヒト脊椎動物と異種の動物由来の野生型のＤｎｄ１を含む。Ｄｎｄ１バリアントは、例えば、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入される初期胚を提供した非ヒト脊椎動物と異種の動物由来の野生型Ｄｎｄ１を含む。
　Ｄｎｄ１におけるＲＮＡ結合ドメインは、ＲＮＡに結合し、脊椎動物間で保存されたアミノ酸配列を含む。Ｄｎｄ１におけるＲＮＡ結合ドメインは、公知であり、例えばＧｅｎｅ５５８（２０１５）１１８－１２５（その開示内容は引用により本明細書に組込まれる）において開示されている。メダカのＤｎｄ１におけるＲＮＡ結合ドメインは、ＥＶＦＩＳＱＩＰＲＤＶＹＥＤＬＬＩＰＬＦＳＳＶＧＡＬＷＥＦＲＬＭＭＮＦＳＧＱＮＲＧＦＡＹＡＫＹＧＴＡＡＩＡＮＤＡＩＨＬＬＨＧＹＰＬＧＰＧＡＲＬＳＶ（配列番号７）で示されるアミノ酸配列を含む。
　Ｄｎｄ１のＲＮＡに対する結合性は、ＲＮＡ免疫沈降法により調べることができる。前記ＲＮＡ免疫沈降法は、例えば、Ｄｎｄ１と標識タンパク質（例えば、蛍光タンパク質又はＦＬＡＧ）との融合タンパク質をコードするヌクレオチドが導入された宿主細胞（テストサンプル）をホルムアルデヒドで架橋処理に供すること；前記宿主細胞から核を抽出して、核懸濁液を得ること；前記核懸濁液をホモジナイザーに供してクロマチンをせん断し、ＲＮＡ溶液を得ること；前記ＲＮＡ溶液に前記標識タンパク質に対する抗体を添加して、架橋されたＲＮＡと融合タンパク質との複合体を免疫沈降すること；沈殿物からＲＮＡを回収して、ｃＤＮＡに逆転写すること；及び前記ｃＤＮＡを定量ＰＣＲにより、免疫沈降されたＲＮＡを定量することを含む。前記ヌクレオチドが導入されていない宿主細胞（ネガティブコントロール）を前記ＲＮＡ免疫沈降法に供して、ネガティブコントロールについて免疫沈降されたＲＮＡを定量することができる。前記Ｄｎｄ１のＲＮＡに対する結合性は、前記免疫沈降法で得られた前記テストサンプルのＲＮＡ量から、前記免疫沈降法で得られた前記ネガティブコントロールのＲＮＡ量を差し引くことで算出できる。Ｄｎｄ１のＲＮＡに対する結合性は、Ｄｎｄ１が導入される初期胚を提供した非ヒト脊椎動物由来の細胞を宿主細胞として用いたＲＮＡ免疫沈降法により決定することができる。前記宿主細胞は、好ましくは、Ｄｎｄ１が導入される初期胚を提供した非ヒト脊椎動物と同種の動物由来の細胞である。前記標識タンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質である。
　用語「Ｎａｎｏｓ」は、ジンクフィンガーモチーフを有するＲＮＡ結合タンパク質であり、脊椎動物間で、及び無脊椎動物間で保存されている。Ｎａｎｏｓは、本開示に係る方法において、それが導入される非ヒト脊椎動物と同種又は異種の動物由来の野生型のＮａｎｏｓを含む。前記異種の動物は、例えば、Ｎａｎｏｓが導入される初期胚を提供した非ヒト脊椎動物と同じ門（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）又は亜門（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ）に属する異種の動物、好ましくは同じ網（ｃｌａｓｓ）又は亜網（ｓｕｂｃｌａｓｓ）に属する異種の動物、同じ目（ｏｒｄｅｒ）又は亜目（ｓｕｂｏｒｄｅｒ）に属する異種の動物、同じ科（ｆａｍｉｌｙ）又は亜科（ｓｕｂｆａｍｉｌｙ）に属する異種の動物、或いは同じ属（ｇｅｎｕｓ）又は同じ亜属（ｓｕｂｇｅｎｕｓ）に属する異種の動物である。Ｎａｎｏｓは、好ましくは、それが導入される非ヒト脊椎動物と同種の動物由来のＮａｎｏｓを含む。Ｎａｎｏｓは、例えば、Ｎａｎｏｓ１、Ｎａｎｏｓ２又はＮａｎｏｓ３、或いはそれらの混合物であってよい。Ｎａｎｏｓは、例えば、Ｎａｎｏｓ２又はＮａｎｏｓ３若しくはそれらの混合物であり、好ましくはＮａｎｏｓ３である。
　Ｎａｎｏｓのアミノ酸配列及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチド配列の配列情報は、公的機関が提供するデータバンクサイトから入手することができる。例えば、メダカのＮａｎｏｓ１をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１００１４４３５２のもと、ＮＣＢＩから入手することができる。例えば、メダカのＮａｎｏｓ２をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１００３０１６０１のもと、ＮＣＢＩから入手することができる。例えば、メダカのＮａｎｏｓ３をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１００１４４２８２のもと、ＮＣＢＩから入手することができる。例えば、クロマグロのＮａｎｏｓ３をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｅ　ＩＤ：　１２１９０９１０２のもと、ＮＣＢＩから入手することができる。
　所定の種のＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドは、例えば、その種の細胞（例えば卵巣細胞）から逆転写酵素を用いたＲＴ－ＰＣＲ法により調製することができる。ＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドがＤＮＡの場合、公知の遺伝子工学技術を用いて合成することができる。ＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドがＲＮＡの場合、前記ＮａｎｏｓをコードするＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写によって調製することができる。所定の種のＮａｎｏｓタンパク質は、商業的に入手可能であり、又は公知の方法に従って調製することができる。前記公知の方法は、Ｎａｎｏｓタンパク質を含む天然源から、前記Ｎａｎｏｓを分離及び精製（例えば、ＨＰＬＣを用いた精製）することを含む。Ｎａｎｏｓタンパク質は、遺伝子工学的手法に従って調製することができる。遺伝子工学的手法は、例えば、Ｎａｎｏｓをコードするヌクレオチドを発現ベクターに組み込んだプラスミドを作製し、前記プラスミドを宿主細胞に導入し、前記宿主細胞を培養することで、前記Ｎａｎｏｓを発現させることを含む。発現させたＮａｎｏｓは、宿主細胞または培養上清から分離及び精製することで、得ることができる。
　Ｎａｎｏｓは、本態様における機能を有する限り、Ｎａｎｏｓが導入される初期胚を提供した非ヒト脊椎動物の野生型のＮａｎｏｓのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有していてよい。本態様における機能を有し、かつ前記野生型のＮａｎｏｓと異なるアミノ酸配列を含むＮａｎｏｓは、「Ｎａｎｏｓバリアント」とも称する。Ｎａｎｏｓバリアントは、例えば、前記野生型のＮａｎｏｓにおけるＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）の配列同一性を有する。Ｎａｎｏｓバリアントは、例えば、野生型のＮａｎｏｓのＲＮＡ結合性の少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、１５０％以上、又は２００％以上）の結合性を有する。Ｎａｎｏｓバリアントは、例えば、前記野生型のＮａｎｏｓにおけるＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）の配列同一性を有し、かつ野生型のＮａｎｏｓのＲＮＡ結合性の少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、１５０％以上、又は２００％以上）の結合性を有する。Ｎａｎｏｓバリアントは、それが導入される初期胚を提供した非ヒト脊椎動物と異種の動物由来の野生型のＮａｎｏｓを含む。Ｎａｎｏｓバリアントは、例えば、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入される初期胚を提供した非ヒト脊椎動物と異種の動物由来の野生型Ｎａｎｏｓを含む。
　ＮａｎｏｓにおけるＲＮＡ結合ドメインは、ＲＮＡに結合し、脊椎動物間で保存されたアミノ酸配列を含む。ＮａｎｏｓにおけるＲＮＡ結合ドメインは、公知であり、例えばＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＰａｒｔＢ　２１８（２０１８）１３－２２（その開示内容は引用により本明細書に組込まれる）において開示されている。メダカのＮａｎｏｓ３におけるＲＮＡ結合ドメインは、Ｎ末端ドメイン（ＦＨＬＷＫＤＹＭＧＬＳＤＴＶＫ（配列番号８））およびジンクフィンガードメイン（ＣＳＦＣＲＨＮＧＥＳＥＭＶＹＲＳＨＷＬＫＮＱＫＧＤＶＬＣＰＹＬＲＱＹＶＣＰＬＣＧＡＴＧＡＫＡＨＴＫＲＦＣＰＫ（配列番号９））を含む。
　ＮａｎｏｓのＲＮＡに対する結合性は、Ｄｎｄ１のＲＮＡに対する結合性を調べる方法として説明したＲＮＡ免疫沈降法に従って、調べることができる。
　野生型のタンパク質に対する「バリアント」は、前記野生型のタンパク質のアミノ酸配列に欠失、置換又は付加若しくはそれらの組合せを含み得る。アミノ酸の「欠失」は、所定のアミノ酸配列における任意の位置のアミノ酸残基が失われていること意味する。Ｄｎｄ１バリアント又はＮａｎｏｓバリアントは、例えば、対応する野生型のＤｎｄ１又はＮａｎｏｓのアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端、及び／又はＮ末端とＣ末端との間のアミノ酸配列でアミノ酸が失われている。アミノ酸の「付加」は、所定のアミノ酸配列において任意の位置にアミノ酸残基が追加又は挿入されていることを意味する。Ｄｎｄ１バリアント又はＮａｎｏｓバリアントは、例えば、対応する野生型のＤｎｄ１又はＮａｎｏｓのアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端、及び／又はＮ末端とＣ末端との間のアミノ酸配列でアミノ酸が追加又は挿入されている。Ｄｎｄ１バリアント又はＮａｎｏｓバリアントは、例えば、機能的なポリペプチド（例えば緑色蛍光タンパク質などの標識タンパク質）が融合されていてもよい。この例において、Ｄｎｄ１バリアント又はＮａｎｏｓバリアントは、前記機能的なポリペプチドのアミノ酸配列を除いた部分のアミノ酸配列を指す。アミノ酸の「置換」は、所定のアミノ酸配列において任意の位置のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味する。アミノ酸の置換は、例えば、保存的置換である。アミノ酸の「保存的置換」は、ポリペプチド内のアミノ酸残基が、側鎖について類似の特徴を有する別のアミノ酸残基で置き換えられていることを意味する。側鎖は、例えば、脂肪族側鎖、脂肪族ヒドロキシル側鎖、アミド含有側鎖、芳香族側鎖、塩基性側鎖、酸性側鎖、又は硫黄含有側鎖が例示される。側鎖の特徴は、例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性を含む。バリアントに対応する野生型のタンパク質は、前記バリアントのアミノ酸配列に対して配列同一性が最も高いアミノ酸配列を有する。
　用語「配列同一性」は、最適にアライメント（整列）された２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのアミノ酸配列間で一致するアミノ酸又はヌクレオチドの割合を意味する。配列同一性は、商業的又は公的に入手可能なソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ＋を用いて算出することができる。Ｄｎｄ１バリアント又はＮａｎｏｓバリアントは、例えば、Ｄｎｄ１又はＮａｎｏｓにおけるＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を示すアミノ酸配列からなる。所定のアミノ酸配列からなる／のみからなるタンパク質は、糖鎖付加等の翻訳後修飾を含む前記タンパク質は排除しない。
　Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓは、互いに同じ種の動物に由来するＤｎｄ１及びＮａｎｏｓであってよく、互いに異なる主の動物に由来するＤｎｄ１（例えばコイ目に属する動物由来
のＤｎｄ１）及びＮａｎｏｓ（例えばダツ目に属する動物由来のＮａｎｏｓ）であってよい。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓは、それらをコードするヌクレオチドの形態で、非ヒト脊椎動物由来の初期胚に導入されてよい。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドは、それらのコード配列が、同一のヌクレオチド分子に存在してもよく、異なる２種のヌクレオチド分子に存在してもよい。用語「コード配列」は、特定のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドが異なる２種のヌクレオチド分子に存在する場合、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドは、Ｄｎｄ１をコードする第一のヌクレオチド分子、及びＮａｎｏｓをコードする第二のヌクレオチド分子を含む。序数である「第一」及び「第二」等は、互いに類似する複数の構成要素に含まれる各構成要素を区別するために用い、ある構成要素の順番又は重要度を限定しない。
　Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドは、追加の遺伝子配列を含んでよい。追加の遺伝子配列は、例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）をコードするヌクレオチド配列であってよい。
　Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするＲＮＡは、例えば、翻訳を促進するキャップ構造をその５’端に含んでよい。前記キャップ構造は、例えば、７－メチルグアニル酸であってよい。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするＲＮＡは、例えば、ＲＮＡを安定化する又は翻訳を促進するポリアデニル配列をその３’端に含んでよい。
　Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするＤＮＡは、例えば、転写開始部分として機能するプロモーターをその５’端に含んでよい。プロモーターは、公知のプロモーターのいずれであってよい。プロモーターは、例えば、ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ｈｓｐ）７０（ＴＧ１０９６）、ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　ｈｓｐａ９（ＴＧ１１８２）、ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ＴＧ１０５７）、ｍｅｄａｋａ　βａｃｉｔｎ（ＴＧ１１４７）、ｍｅｄａｋａ　ｈｓｐ７０（ＴＧ９０８）、ｍｅｄａｋａ　ＥＦ－１α（ＴＧ８４４）、ｍｅｄａｋａ　ｇａｐｄｈ（ＴＧ９２３）、ｍｅｄａｋａ　ｖａｓａ（ｏｌｖａｓ）（ＴＧ８７０）、Ｆｕｇｕ　ｏｃｔ３（ＴＧ９１３）、ＣＭＶ（ＴＧ９１２、８４９）、ｈｕｍａｎＥＦ１α（ＴＧ８７１）、又は８ｘＨＳＥ（人工ヒートショックプロモーター）（ＴＧ９２１）であってよい。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするＤＮＡは、例えば、ポリアデニル化配列を含んでよい。ポリアデニル化配列は、例えば、前記ＤＮＡの３’端側に存在してよい。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするＤＮＡは、直鎖ＤＮＡであってもよく、プラスミドであってもよい。
　１つの例においてＤｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドが、同一のヌクレオチド分子に存在する場合、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするＤＮＡは、ポリアデニル化配列を含み、例えば、前記ポリアデニル化配列は、前記ＤＮＡの３’端側に存在する。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドが、２種のヌクレオチド分子に存在する場合、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするＤＮＡ、及びＮａｎｏｓをコードするＤＮＡはともに、ポリアデニル化配列をそれぞれ含み、例えば、前記ポリアデニル化配列は、前記ＤＮＡの３’端側にそれぞれ存在する。
　用語「ポリアデニル化配列」は、ＲＮＡに転写された場合に、その転写産物の３’端にポリアデニル配列（「ポリＡ配列」とも称する）を付加することを可能にするＤＮＡ配列を意味する。多くの生殖顆粒因子のｍＲＮＡは、その３’ＵＴＲの制御により始原生殖細胞（ＰＧＣ）でのみ安定化し、発生後に身体を構成する体細胞では、発生初期において速やかに分解される（Ｍｉｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｍＲＮＡｓ　ｉｎ　ｓｏｍａ　ａｎｄ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　ｍｉＲ－４３０．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１６，２１３５－２１４２　（２００６））。
　ポリアデニル化配列は、公知のポリアデニル化配列を用いることができる。ポリアデニル化配列は、内在性の配列又は外来性の配列であってよい。用語「内在性」は、生体又は細胞において元々備わっている遺伝子、核酸又はタンパク質、あるいはそれらと同じ構造を有する遺伝子、核酸又はタンパク質を意味する。用語「外来性」は、生体又は細胞において元々備わっている遺伝子、核酸又はタンパク質と異なる遺伝子、核酸又はタンパク質を意味する。ポリアデニル化配列は、好ましくは、外来性の配列である。ポリアデニル化配列は、例えば、ＳＶ４０ｐＡ、ＢＧＨｐＡ、ｈＧＨｐＡ、又はｒｂＧｌｏｂｐＡであってよい。ポリＡ配列は、例えば、数十から数百のアデニンヌクレオチドであってよい。ポリＡ配列は、例えば、ＡＡＵＡＡＡ配列の繰り返し配列を含む。
　Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓは、前記初期胚に同時に導入されてよく、又は個別に任意の時期に導入されてよい。好ましくは、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓは、前記初期胚に同時に導入される。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドが同一のヌクレオチド分子に存在する場合、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓは、前記初期胚に同時に導入される。前記ヌクレオチド分子は、Ｄｎｄ１のコード配列とＮａｎｏｓのコード配列との間に、自己切断ペプチド配列又はプロテアーゼ切断部位を含んでよい。自己切断ペプチド配列は、公知の任意の自己切断ペプチド配列を用いることができる。自己切断ペプチド配列は、例えば、２Ａ自己切断ペプチド配列である。プロテアーゼ切断部位は、公知の任意のプロテアーゼ切断部位を用いることができる。プロテアーゼ切断部位は、例えば、エンテロキナーゼ（ＤＤＤＤＫ↓）、第Ｘａ因子（ＩＥＧＲ↓／ＩＤＧＲ↓）、タバコエッチウイルス（ＥＮＬＹＦＱ↓Ｇ）又はトロンビン（ＬＶＰＲ↓ＧＳ）、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（ＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ）である。
　Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドが、同一のヌクレオチド分子に存在する場合、その分子内でのＤｎｄ１のコード配列とＮａｎｏｓのコード配列の順序及び個数は特に限定されない。１つの例において、前記ヌクレオチドは、５’端側にＤｎｄ１のコード配列を含み、３’端側にＮａｎｏｓのコード配列を含む。他の例において、前記ヌクレオチドは、５’端側にＮａｎｏｓのコード配列を含み、３’端側にＤｎｄ１のコード配列を含む。１つの例において、前記ヌクレオチドは、Ｄｎｄ１のコード配列を２個含み、Ｎａｎｏｓのコード配列を少なくとも１個含む。１つの例において、前記ヌクレオチドは、Ｄｎｄ１のコード配列を少なくとも１個含み、Ｎａｎｏｓのコード配列を２個含む。
　１つの例において、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドが、同一のヌクレオチド分子に存在する場合、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするＲＮＡは、その３’端にポリＡ配列を含む。１つの例において、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドが、２種のヌクレオチド分子に存在する場合、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするＲＮＡ、及びＮａｎｏｓをコードするＲＮＡはともに、それらの３’端にポリＡ配列をそれぞれ含む。
　Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドは、例えば、顕微注入、エレクトロポレーション又はリポフェクションにより非ヒト脊椎動物由来の初期胚に導入することができる。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓは、タンパク質の形態で、非ヒト脊椎動物由来の初期胚に導入されてよい。タンパク質であるＤｎｄ１及びＮａｎｏｓは、例えば、顕微注入又はリポフェクションにより非ヒト脊椎動物由来の初期胚に導入することができる。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが、タンパク質とヌクレオチドとの組合せである場合、前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓは、顕微注入又はリポフェクションにより非ヒト脊椎動物由来の初期胚に導入することができる。
　本開示の実施例は、１細胞期の胚に前記ヌクレオチドを導入することで、ほとんどの又は全ての細胞が始原生殖細胞（ＰＧＣ）である胞胚を得ることができることを実証する。本態様の方法において、初期胚の全て又はほとんどの細胞に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入することで、ほとんど又は全ての細胞がＰＧＣである胞胚を得ることができる。１つの例において、初期胚が４細胞期の胚である場合、４個の細胞すべて又は３個の細胞にＤｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入することで、ほとんどの又は全ての細胞がＰＧＣである胞胚を得ることができる。初期胚の細胞の数に対する前記ヌクレオチドを導入する細胞の数の割合は、例えば、少なくとも７０％以上（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％）である。
　本開示の実施例は、１６細胞期の胚の１個の細胞にＤｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチドを導入することで、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入されていないことを除いて同一の胚と比較して、その生殖腺領域で始原生殖細胞の数が顕著に増加した個体を発生させ得ることを実証する。本開示の実施例はまた、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入する細胞が、生殖質を構成する因子（生殖顆粒因子）が局在していない細胞であってもよいことを実証する。第１の態様の方法において、初期胚で所定の割合の細胞に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入することで、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入されていないことを除いて同一の胚と比較して、その生殖腺領域で始原生殖細胞の数が顕著に増加した個体を得ることができる。１つの例において、初期胚が３２細胞期の胚である場合、１個又は複数個（例えば２個、３個又は４個）の細胞にＤｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入することで、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入されていないことを除いて同一の胚（個体）と比較して、その生殖腺領域で始原生殖細胞の数が顕著に増加した個体を得ることができる。前記所定の割合は、例えば、２％～３０％、２～２５％、２～２０％、２～１５％、又は２～１０％であってよい。前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入される初期胚における細胞は、生殖顆粒因子が局在している細胞であってもよく、又は局在していない細胞であってもよい。１つの例において、初期胚が１６細胞期の胚である場合、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入する細胞の数は、例えば１個（約６％＝１／１６）であってよく、２個（約１３％＝２／１６）であってよい。
　本態様に係る方法において、初期胚にＤｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入する際の、細胞の数又は割合は、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ほとんど又は全ての細胞が始原生殖細胞である胞胚を得る目的の場合、初期胚の全て又はほとんどの細胞にＤｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入する。例えば、その生殖腺領域で始原生殖細胞の数が、野生型の動物と比較して、顕著に増加した個体を得る目的の場合、初期胚で所定の割合の細胞に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入する。初期胚にＤｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入する量は、胚にタンパク質又は遺伝子を導入する場合の公知の量であってよい。初期胚に導入するＤｎｄ１とＮａｎｏｓとの割合は、例えば、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３、２：１～１：２、または１：１である。１つの例において、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓは、胚容積全体の３０～６０％容量のＤｎｄ１及びＮａｎｏｓ含有溶液を、初期胚に顕微注入することで導入される。魚類（例えば、ゼブラフィッシュ又はメダカ）の胚に顕微注入する場合、３０～６０％容量は、例えば、１００ｐｌ～５００ｐｌである。１つの例において、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓをコードするヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）は、１０～５００ｎｇ／ｍｌの前記ヌクレオチド含有溶液１００ｐｌ～５００ｐｌをメダカ由来の初期胚に顕微注入することで、導入される。
　本開示に係るＤｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚は、公知の培養条件下で培養することで、胚発生を進行させることができる。公知の培養条件は、胚の動物種に応じて適宜設定される。胚の動物種が魚類又は両生類である場合、前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚の培養は、例えば、食塩水又は淡水中で室温にて静置することを含む。胚の動物種が爬虫類又は鳥類である場合、前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚の培養は、例えば、その動物種に応じた温度下で静置することを含む。胚の動物種が哺乳類である場合、前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚の培養は、例えば、公知の培地中で３７℃にて５％ＣＯ２環境下で維持することを含む。その生殖腺領域で始原生殖細胞の数が、野生型の動物と比較して、顕著に増加した非ヒト哺乳動物を得る目的の場合、前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚の培養は、例えば、公知の培地中で３７℃にて５％ＣＯ２環境下で胞胚期まで維持し、次いで、前記非ヒト哺乳動物の子宮内に移植することを含む。したがって、前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚の培養は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養、場合によりｉｎ　ｖｉｖｏ培養を含む。前記胚における始原生殖細胞の数は、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入されていないことを除いて同一の胚における始原生殖細胞と比較される。前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入されていないことを除いて同一の胚は、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚を提供した動物と同種の動物由来の同じ発生段階の胚である。胚の発生段階は、例えば、１細胞期から６４細胞期、桑実胚期、胞胚期、嚢胚期、神経胚期、咽頭胚期、又は発生した個体を含む。
　本開示の実施例は、メダカ及びゼブラフィッシュにおいて、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを前記動物種の初期胚に共導入することで、野生型の個体と比較して、始原生殖細胞が顕著に増加した個体が得られることを実証する。本態様に係るＤｎｄ１及びＮａｎｏｓは、脊椎動物全般で保存されたＲＮＡ結合タンパク質であり、そのいずれも生殖細胞の形成に重要な役割を果たす。前記技術的事項は、例えば、マウスに関しては、Ｙｏｕｎｇｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　Ｔｅｒ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅａｄ　ｅｎｄ　ｇｅｎｅ　ｃａｕｓｅｓ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ　ｌｏｓｓ　ａｎｄ　ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ　ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ　４３５，３６０－３６４（２００５）に記載され、アフリカツメガエルに関しては、Ｔａｇｕｃｈｉ　Ａ，Ｗａｔａｎａｂｅ　Ｋ，Ｏｒｉｉ　Ｈ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅａｄ　ｅｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　Ｘｅｎｏｐｕｓｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｄｅｖ　Ｂｉｏｌ　５８：７９３－７９８（２０１４）、Ｍｅｉ　Ｗ，Ｊｉｎ　Ｚ，Ｌａｉ　Ｆ，Ｓｃｈｗｅｎｄ　Ｔ，Ｈｏｕｓｔｏｎ　ＤＷ，Ｋｉｎｇ　ＭＬ，Ｙａｎｇ　Ｊ．Ｍａｔｅｒｎａｌ　Ｄｅａｄ－Ｅｎｄ１　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｖｅｇｅｔａｌ　ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｘｅｎｏｐｕｓ　ａｘｉｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１４０：２３３４－２３４４（２０１３）、及びＬａｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｎａｎｏｓ１　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｔｏ　ｐｒｅｖｅｎｔ　ｅｎｄｏｄｅｒｍ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１３９（８）：１４７６－１４８６（２０２１）に記載され、ニワトリに関してはＡｒａｍａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｃｈｉｃｋｅｎ　Ｄｅａｄ　Ｅｎｄ　Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ａ　Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ　Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ　Ｇｅｒｍ　Ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．ａｎｄ　Ｄｅｖ．５５（２）：２１４－２１８　（２００９）に記載されている。また、Ｔｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｎａｎｏｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｇｅｒｍ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　３０１（５６３７）：１２３９－１２４１（２００３）は、Ｎａｎｏｓが、ハエから哺乳動物に至るまで保存されており、生殖細胞形成に重要な役割を果たすことを記載している。したがって、本態様に係る方法は、メダカ及びゼブラフィッシュなどの魚類だけでなく、他の脊椎動物（例えば、両生類、爬虫類、鳥類、非ヒト哺乳類の任意の動物）にも適用可能であり得る。
　１つの実施形態は、非ヒト脊椎動物由来の初期胚に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入すること；配偶子形成因子を導入すること；および前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚を培養することを含む、始原生殖細胞が富化された胚を調製する方法を提供する。前記配偶子形成因子は、例えば、Ｄａｚ、Ｄａｚｌ、Ｂｏｕｌｅ、ｍｅｉｏＣ、Ｙｔｈｄｃ２及びＲｂｍ４６から成る群より選択される少なくとも１つであってよい。本実施形態に従って形成される始原生殖細胞を生殖腺に有する非ヒト脊椎動物は、妊性を有する傾向が高い。
　Ｄｎｄ１と、Ｎａｎｏｓと、前記配偶子形成因子とは、前記初期胚にすべて同時に導入されてよく、又は任意の組合せで任意の時期に導入されてよく、若しくはすべて個別に任意の時期に導入されてよい。１つの例において、Ｄｎｄ１と、Ｎａｎｏｓと、前記配偶子形成因子とは同時に前記初期胚に導入される。１つの例において、Ｄｎｄ１とＮａｎｏｓとの組合せ、及び前記配偶子形成因子が任意の時期にそれぞれ導入される。前記例において、例えば、Ｄｎｄ１とＮａｎｏｓとの組合せが先に導入され、次いで、前記配偶子形成因子が導入される。１つの例において、Ｄｎｄ１と、Ｎａｎｏｓと、前記配偶子形成因子とが個別に任意の時期に前記初期胚に導入される。
　用語「配偶子形成因子」は、配偶子形成（gametogenesis）に関与する任意の物質である。前記配偶子形成因子は、例えば、ＤＡＺファミリーメンバーまたは減数分裂の移行に関与する任意の物質であってよい。
　用語「ＤＡＺファミリー」は、３個のＲＮＡ結合タンパク質からなるグループである。ＤＡＺファミリーメンバーは、配偶子形成または減数分裂に重要な役割を果たし得る。ＤＡＺファミリーメンバーは、例えば、ＤＡＺリピートと名付けられた２４個のアミノ酸からなる配列を有する。ＤＡＺファミリーメンバーは、例えば、Ｄａｚ、ＤａｚｌまたはＢｏｕｌｅであってよい。Ｄａｚ、Ｄａｚｌ及びＢｏｕｌｅは、ヒトおよびマウスの胚性幹細胞から生殖細胞を分化させ得る（Ｎａｔｕｒｅ　ｖｏｌｕｍｅ　４６２，　ｐａｇｅｓ２２２－２２５（２００９））。用語「Ｄａｚ」は、「Ｄｅｌｅｔｅｄ　ｉｎ　ＡＺｏｏｓｐｅｒｍｉａ」と同意義であり、ＲＮＡ結合タンパク質である。用語「Ｄａｚｌ」は、「Ｄｅｌｅｔｅｄ　ｉｎ　ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ－ｌｉｋｅ」と同意義であり、ＲＮＡ結合タンパク質である。用語「Ｂｏｕｌｅ」は、ＲＮＡ結合タンパク質である。Ｂｏｕｌｅは、ヒトを含む多くの脊椎動物およびイソギンチャクを含む無脊椎動物で見つかっている。Ｄａｚｌは、マウスおよびヒトを含むほぼ全ての脊椎動物で見つかっている。Ｄａｚは、Ｄａｚ１、Ｄａｚ２、Ｄａｚ３又はＤａｚ４であってよい。
　減数分裂の移行に関与する物質は、例えば、ｍｅｉｏＣ、Ｙｔｈｄｃ２またはＲｂｍ４６であってよい。用語「ｍｅｉｏＣ」は、「Ｍｅｉｏｓｉｓ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｗｉｔｈ　Ｃｏｉｌｅｄ－Ｃｏｉｌ　Ｄｏｍａｉｎ」と同意義である。ｍｅｉｏＣはメダカにおいて減数分裂の移行に重要である。用語「Ｙｔｈｄｃ２」は、「ＹＴＨ　ｄｏｍａｉｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　２」と同意義である。用語「Ｒｂｍ４６」は、「ＲＮＡ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｍｏｔｉｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　４６」と同意義である。
　配偶子形成因子のアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列の情報は、公的機関が提供するデータバンクサイトから入手することができる。例えば、メダカのＤａｚｌをコードするｍＲＮＡ配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：　ＮＭ＿００１１０４７９９．１のもとで入手することができる。
　以下にメダカ、ゼブラフィッシュ、マグロ由来のＤａｚｌのアミノ酸配列を示す。マグロ由来のＤａｚｌのアミノ酸配列は予測配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　所定の種の配偶子形成因子は、例えば、その種の細胞（例えば卵巣細胞）から逆転写酵素を用いたＲＴ－ＰＣＲ法により調製することができる。配偶子形成因子は、本態様における機能を有する限り、配偶子形成因子が導入される初期胚を提供した非ヒト脊椎動物の野生型の配偶子形成因子と異なるアミノ酸配列を有していてもよい。本態様における機能を有し、かつ前記野生型の配偶子形成因子と異なるアミノ酸配列を含む配偶子形成因子は、「配偶子形成因子バリアント」とも称する。配偶子形成因子バリアントは、例えば、野生型の配偶子形成因子におけるＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）の配列同一性を有する。配偶子形成因子バリアントは、例えば、野生型の配偶子形成因子のＲＮＡ結合性の少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、１５０％以上、又は２００％以上）の結合性を有する。配偶子形成因子バリアントは、例えば、前記野生型の配偶子形成因子におけるＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）の配列同一性を有し、かつ野生型の配偶子形成因子のＲＮＡ結合性の少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、１５０％以上、又は２００％以上）の結合性を有する。配偶子形成因子バリアントは、それが導入される初期胚を提供した非ヒト脊椎動物と異種の動物由来の野生型の配偶子形成因子を含む。配偶子形成因子バリアントは、例えば、配偶子形成因子が導入される初期胚を提供した非ヒト脊椎動物と異種の動物由来の野生型配偶子形成因子を含む。配偶子形成因子のＲＮＡに対する結合性は、ＲＮＡ免疫沈降法により調べることができる。
　配偶子形成因子は、例えば、Ｄａｚ、Ｄａｚｌ、Ｂｏｕｌｅ、ｍｅｉｏＣ、Ｙｔｈｄｃ２及びＲｂｍ４６から成る群より選択される少なくとも１つである。前記配偶子形成因子は、例えば、Ｄａｚ、Ｄａｚｌ、Ｂｏｕｌｅ及びｍｅｉｏＣから成る群より選択される少なくとも１つである。前記配偶子形成因子は、例えば、Ｄａｚ、Ｄａｚｌ、Ｂｏｕｌｅ又はｍｅｉｏＣ、若しくはそれらの混合物である。前記配偶子形成因子は、好ましくは、Ｄａｚ、Ｄａｚｌ、又はｍｅｉｏＣ、若しくはそれらの混合物である。前記配偶子形成因子は、好ましくは、Ｄａｚである。前記配偶子形成因子は、好ましくは、Ｄａｚｌである。前記配偶子形成因子は、好ましくは、ｍｅｉｏＣである。前記配偶子形成因子は、好ましくは、Ｂｏｕｌｅである。
　配偶子形成因子は、タンパク質の形態で又はそれをコードするヌクレオチドの形態で、非ヒト脊椎動物由来の初期胚に導入されてよい。配偶子形成因子をコードするヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。配偶子形成因子をコードするヌクレオチドは、本明細書に記載の他のヌクレオチド配列を含んでよい。配偶子形成因子は、本明細書に記載の方法に従って、前記初期胚に導入することができる。
　Ｄｎｄ１、Ｎａｎｏｓ又は配偶子形成因子の文脈における、初期胚への「導入」は、Ｄｎｄ１、Ｎａｎｏｓ又は配偶子形成因子が、前記初期胚を構成する１個又は複数個の細胞内に存在させる操作を指す。初期胚への導入する際のＤｎｄ１、Ｎａｎｏｓ又は配偶子形成因子の形態は、特に限定されない。Ｄｎｄ１、Ｎａｎｏｓ又は配偶子形成因子は、例えば、ヌクレオチドの形態及びタンパク質の形態のいずれか又はその混合形態で、前記初期胚に導入される。Ｄｎｄ１、Ｎａｎｏｓ又は配偶子形成因子は、好ましくは、ヌクレオチドの形態（より好ましくはＲＮＡの形態）で、前記初期胚に導入される。
始原生殖細胞が富化された胚
　第１の態様に係る方法により、始原生殖細胞が富化された胚が提供される。したがって、本開示の１つの態様は、始原生殖細胞が富化された非ヒト脊椎動物由来の胚であって、前記胚は、胞胚期以降の胚であり、前記胚における始原生殖細胞の数が、前記胚と同種の非ヒト脊椎動物由来の同じ発生段階の胚における始原生殖細胞の数よりも少なくとも３倍多い、胚を提供する。
　「始原生殖細胞が富化された胚」は、野生型の動物の胚と比較して、始原生殖細胞の数が顕著に増加している。野生型の動物の胚は、例えば、本開示に係るＤｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚を提供した動物と同種の動物から得られた胚であって、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入されていないことを除いて、同じ発生段階の胚である。前記胚における始原生殖細胞の数は、例えば、前記胚を提供した動物と同種の動物由来の胚であって、同じ発生段階の胚における始原生殖細胞の数と比較される。胚における始原生殖細胞は、例えば、前記胚をトリプシン又はコラゲナーゼを用いた細胞剥離処理に供し、分離した細胞を含む懸濁液を密度勾配遠心分離に供することで、分取又は濃縮することができる。胚における始原生殖細胞の数は、例えば、公知の始原生殖細胞マーカー又は生殖顆粒因子を発現する細胞の数を計数することにより比較される。胚における始原生殖細胞の数は、例えば、公知の始原生殖細胞マーカー又は生殖顆粒因子に対する抗体を用いた免疫化学染色法または前記マーカー又は因子のｍＲＮＡと相補的な配列を有するプローブを用いたin situ hybridizationによって始原生殖細胞を標識し、標識された細胞に基づいて比較される。胚における始原生殖細胞の数は、例えば、前記胚における公知の始原生殖細胞マーカー又は生殖顆粒因子の発現量に基づいて比較される。胚における始原生殖細胞の数は、好ましくは、ｖａｓａの発現量に基づいて比較される。
　始原生殖細胞が富化された非ヒト脊椎動物由来の胚は、胞胚期以降の胚であり、例えば、桑実胚、胞胚、神経胚、咽頭胚、又はそれ以降の発生段階の胚であってよい。前記胚における始原生殖細胞の数は、前記胚と同種の非ヒト脊椎動物由来の同じ発生段階の胚における始原生殖細胞の数よりも少なくとも３倍（例えば、５倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、２５倍以上、又は３０倍以上）多い。
遺伝子が改変された始原生殖細胞が富化された胚
　第１の態様に係る方法で調製された始原生殖細胞が富化された胚は、前記始原生殖細胞において遺伝子が改変されていてもよい。したがって、本開示の１つの態様は、遺伝子が改変された始原生殖細胞が富化された非ヒト脊椎動物由来の胚であって、前記胚は、胞胚期以降の胚であり、前記胚における始原生殖細胞の数が、前記胚と同種の非ヒト脊椎動物由来の同じ発生段階の胚における始原生殖細胞の数よりも少なくとも３倍多い胚を提供する。
　前記初期胚の遺伝子は、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを非ヒト脊椎動物由来の初期胚に導入する前、導入と同時又は導入した後に改変することができる。前記遺伝子は、例えば、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓの前記初期胚への導入と同時に改変されてよい。前記遺伝子は、例えば、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓの前記初期胚への導入の前又は後に改変されてよい。
　用語「遺伝子改変」、「遺伝子の改変」又は「遺伝子を改変する」は、染色体操作技術又はＤＮＡ組換え技術によって意図的に遺伝子を改変することを意味する。染色体操作技術は、例えば、染色体の四倍体化を含む。非ヒト脊椎動物が魚類である場合、染色体は、受精卵を圧力、温度、又はサイトカラシンＢなどの化学薬品による処理によって四倍体化し得る。ＤＮＡ組み換え技術は、例えば、ゲノム編集技術を含む。ＤＮＡ組み換え技術は、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムを用いて、染色体に欠失、置換、付加もしくはそれらの組合せを導入することを含む。
　遺伝子が改変された始原生殖細胞は、非ヒト脊椎動物由来の初期胚に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入し、かつその遺伝子を改変すること；及び前記初期胚を培養することを含む、方法により調製される。１つの例において、遺伝子が改変された始原生殖細胞は、非ヒト脊椎動物由来の初期胚に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入すること；前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚（又は細胞）の遺伝子を改変すること；及び前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入され、かつ遺伝子が改変された初期胚を培養することを含む、方法により調製される。他の例において、遺伝子が改変された始原生殖細胞は、非ヒト脊椎動物由来の初期胚（又は細胞）の遺伝子を改変すること；前記遺伝子が改変された前記初期胚（又は細胞）に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入すること；及び前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入され、かつ遺伝子が改変された初期胚を培養することを含む、方法により調製される。他の例において、遺伝子が改変された始原生殖細胞は、同時に、非ヒト脊椎動物由来の初期胚（又は細胞）にＤｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入し、かつその遺伝子を改変すること；及び前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入され、かつ遺伝子が改変された初期胚を培養することを含む、方法により調製される。前記初期胚（例えば、１細胞期、２細胞期、４細胞期、又は８細胞期の胚）の全て又はほとんどの細胞に、Ｄｄｎ１及びＮａｎｏｓを導入し、かつその遺伝子を改変することで、遺伝子が改変された始原生殖細胞がほとんど又は全部である胞胚を得ることができる。遺伝子が改変された始原生殖細胞が富化された胚は、後述する生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物の作出に用いることができる。
　前記方法において、非ヒト脊椎動物由来の初期胚（例えば、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、３２細胞期、又は６４細胞期の胚）で所定の割合の細胞に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入し、かつその遺伝子を改変することで、遺伝子が改変された始原生殖細胞が富化された胚（トランスジェニック非ヒト脊椎動物）が得られる。したがって、第１の態様の１つの実施形態は、遺伝子が改変された始原生殖細胞をその生殖腺領域に含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法を提供する。
トランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法
　本開示の１つの態様は、トランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、非ヒト脊椎動物由来の初期胚（４細胞期から６４細胞期の胚の少なくとも１個の細胞）に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入し、かつその遺伝子を改変すること；及び前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入され、かつその遺伝子が改変された初期胚を培養して、トランスジェニック非ヒト脊椎動物を発生させることを含み、前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物は、遺伝子が改変された始原生殖細胞をその生殖腺領域に含む、方法を提供する。
　用語「生殖腺領域」は、発生した個体において生殖細胞を産生する器官となる、胚における領域を意味する。生殖腺領域は、例えば、胚において始原生殖細胞が存在する領域であってよい。生殖腺領域が発生した個体について言及される場合、前記生殖腺領域は、生殖腺と同意義である。用語「生殖腺」は、動物において生殖細胞を産生するあらゆる器官を意味する。生殖腺は、卵子を産生するメスの卵巣、又は精子を産生するオスの精巣を含む。用語「生殖細胞」は、配偶子（卵子又は精子）を生じる細胞系列を意味する。
　本態様に係るトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、好ましくは、遺伝子改変を本質的に生殖腺領域（生殖腺）の始原生殖細胞にのみ含む。前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物は、例えば、遺伝子改変を生殖腺領域以外の領域（例えば、脳、心臓、内臓などの臓器；神経細胞、心筋細胞、内皮細胞などの体細胞）に含まない。本態様の方法によれば、例えば、前記遺伝子改変が致死性又は発生不全を引き起こし得る改変であっても、前記遺伝子改変を含む生殖細胞をその生殖腺領域に含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出することができる。１つの例において、前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物のオスの配偶子とメスの配偶子とから、前記遺伝子改変をホモで有する次世代の非ヒト脊椎動物を作出することができる。前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物のオス又はメスの配偶子と、その非ヒト脊椎動物と同種の動物のメス又はオスの配偶子とから、前記遺伝子改変をヘテロで有する次世代の非ヒト脊椎動物を作出することできる。本態様に係るトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、例えば、疾患の遺伝子解析に利用することができる。
　用語「脊椎動物」は、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、及び哺乳類に属する任意の動物を意味する。本態様において、脊椎動物は、ヒトを含まない非ヒト脊椎動物である。非ヒト脊椎動物は、例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類又は哺乳類に属する任意の動物、好ましくは魚類、鳥類、又は哺乳類に属する任意の動物、より好ましくは魚類又は哺乳類に属する任意の動物、更に好ましくは魚類に属する任意の動物である。
　用語「魚類」は、脊椎動物亜門から四肢動物を除外した動物群を意味する。魚類は、例えば、サバ科（Scombridae）；アジ科（Amberjack）；サケ科（Salmonidae）；タラ科（Gadidae）；ウナギ科（Anguillidae）；フグ科（Tetraodontidae：puffers）；タイ科（Sparidae：sea breams and porgies）；ハタ科（Serranidae：sea basses）、ヒラメ科（Paralichthys）；チョウザメ科（Acipenseridae）；メダカ属（Oryzias：medakas）又はコイ科（Cyprinidae）の動物であってよい。
　サバ科の魚類は、例えば、キハダ（Yellowfin tuna）、タイセイヨウマグロ（Blackfin tuna）、メバチ（Bigeye tuna）、及びクロマグロ（Pacific bluefin tuna）等のマグロ属（Thunnus）；カツオ属；スマ（Kawakawa）及びBlack skipjack tuna等のスマ属；オオサワラ（King mackerel）等のサワラ属；カマスサワラ属（Acanthocybium）；タイセイヨウマサバ（Atlantic chub mackerel）、マサバ（Chub mackerel）及びノルウェーサバ（Atlantic mackerel）等のサバ属の動物であってよい。
　アジ科の魚類は、例えば、ブリ（Amberjack）、ヒラマサ（Seriola lalandi）、カンパチ（Seriola dumerili）等のブリ属；シマアジ（Pseudocaranx dentex）等のシマアジ属；マアジ等のマアジ属の動物であってよい。サケ科の魚類は、例えば、イトウ（Parahucho perryi）等のイトウ属（Hucho）；サケ（Oncorhynchus keta）、ニジマス（Oncorhynchus mykiss）、サクラマス（Oncorhynchus masou）及びベニザケ（Oncorhynchus nerka）等のサケ属；イワナ（white-spotted char）等のイワナ属；タイセイショウサケ属の動物であってよい。
　タラ科の魚類は、例えば、マダラ（Gadus macrocephalus）、タイセイヨウダラ（Gadus morhua）、グリーンランドダラ（Gadus ogac）及びスケトウダラ（Gadus chalcogrammus）等のマダラ属；ミナミダラ属（Micromesistius）の動物であってよい。ウナギ科の魚類は、例えば、アメリカウナギ（Anguilla rostrata）、ニホンウナギ（Anguilla japonica）、オオウナギ（Anguilla marmorata）及びヨーロッパウナギ（Anguilla anguilla）等のウナギ属；Neoanguilla属の動物であってよい。
　フグ科の魚類は、例えば、トラフグ（Takifugu rubripes）、及びマフグ（Takifugu porphyreus）等のトラフグ属（Takifugu）；サバフグ属（Lagocephalus）の動物であってよい。タイ科の魚類は、例えば、マダイ（Pagrus major）等のマダイ属（Pagrus）；クロダイ（Acanthopagrus schlegelii）等のAcanthopagrus属；キダイ属（Dentex）等の動物であってよい。ハタ科の魚類は、例えば、マハタ（Epinephelus septemfasciatus）、クエ（Epinephelus bruneus）、及びキジハタ（Epinephelus akaara)等のマハタ属（Epinephelus）；スジアラ属（Plectropomus）等の動物であってよい。ヒラメ科の魚類は、例えば、ヒラメ（Paralichthys olivaceus）等であってよい。
　チョウザメ科の魚類は、例えば、チョウザメ（Acipenser medirostris）、ダウリアチョウザメ（Huso dauricus）、及びオオチョウザメ（Huso huso）等であってよい。メダカ属の魚類は、例えば、メダカ（Oryzias latipes、Oryzias sakaizumii）、及びジャワメダカ（Oryzias javanicus）等のメダカ属（Oryzias）等の動物であってよい。コイ科の魚類は、例えば、ゼブラフィッシュ、コイ、フナ及びキンギョ等のコイ亜科（Cyprininae）；ラスボラ等のダニオ亜科（Danioninae）；ニゴイ等のカマツカ亜科（Gobioninae）；ウグイ等のウグイ亜科（Leuciscinae）の動物であってよい。
　本態様に係る非ヒト脊椎動物は、例えば、魚類に属する任意の動物である。魚類に属する動物は、例えば、マグロ、チョウザメ、カツオ、ブリ、カンパチ、ヒラマサ、タイ、サケ、タラ、マス、ニジマス、ヒラメ、トラフグ、アジ、ハタ、ウナギ、又はコイであってよい。
　用語「両生類」は、脊椎動物亜門両生綱（Ａｍｐｈｉｂｉａ）に属する動物群を意味する。両生類は、例えば、サンショウウオ科（Hynobiidae）；オオサンショウウオ科（Cryptobranchidae）；イモリ科（Salamandridae）；ヒキガエル科（Bufonidae）；アマガエル科（Hylidae）；アカガエル科（Ranidae）；又はアオガエル科（Rhacophoridae）の動物であってよい。
　サンショウウオ科の両生類は、例えば、サンショウウオ属（Hynobius）及びハコネサンショウウオ属（Onychodactylus）の動物であってよい。オオサンショウウオ科の両生類は、例えば、オオサンショウウオ属（Andrias）の動物であってよい。イモリ科の両生類は、例えば、イボイモリ属（Echinotriton）及びイモリ属（Cynops）の動物であってよい。ヒキガエル科の両生類は、例えば、ナンベイヒキガエル属（Rhinella）、ヒキガエル属（Bufo）の動物であってよい。アマガエル科の両生類は、例えば、アカガエル属（Rana）、アメリカアカガエル属（Lithobates）、ツチガエル属（Glandirana）、トノサマガエル属（Pelophylax）、ニオイガエル属（Odorrana）の動物であってよい。アオガエル科の両生類は、例えば、アイフィンガーガエル属（Kurixalus）、アオガエル属（Rhacophorus）、カジカガエル属（Buergeria）の動物であってよい。
　本態様に係る非ヒト脊椎動物は、例えば、両生類に属する任意の動物である。両生類に属する動物は、例えば、オオサンショウウオであってよい。
　用語「爬虫類」は、脊椎動物亜門爬虫網（Ｒｅｐｔｉｌｉａ）に属する動物群を意味する。爬虫類は、例えば、ウミガメ科（Cheloniidae）；オサガメ科（Dermochelyidae）；イシガメ科（Geoemydidae）；カミツキガメ科（Chelydridae）；スッポン科（Trionychidae）；トカゲモドキ科（Eublepharidae）；ヤモリ科（Gekkonidae）；イグアナ科（Iguanidae）；トカゲ科（Scincidae）；ナミヘビ科（Colubridae）；コブラ亜科（Elapinae）；ウミヘビ亜科（Hydrophiinae）；又はマムシ亜科（Crotalinae）の動物であってよい。
　ウミガメ科の爬虫類は、例えば、アオウミガメ（Chelonia mydas）等のアオウミガメ属（Chelonia Brongniart）；アカウミガメ（Caretta caretta）等のアカウミガメ属（Caretta）；タイマイ（Eretmochelys imbricata）等のタイマイ属（Eretmochelys）の動物であってよい。オサガメ科の爬虫類は、例えば、オサガメ属（Dermochelys）の動物であってよい。イシガメ科の爬虫類は、例えば、クサガメ（Mauremys reevesii）等のイシガメ属（Mauremys）；セマルハコガメ（Cuora flavomarginata）等のセマルハコガメ属（Cuora）；ヤマガメ属（Geoemyda）の動物であってよい。
　カミツキガメ科の爬虫類は、例えば、カミツキガメ（Chelydra serpentina）等のカミツキガメ属（Chelydra）；ワニガメ（Macrochelys temminckii）等のMacrochelysの動物であってよい。スッポン科の爬虫類は、例えば、スッポン（Pelodiscus sinensis）等のスッポン属（Pelodiscus）の動物であってよい。トカゲモドキ科の爬虫類は、例えば、オビトカゲモドキ（Goniurosaurus splendens）等のトカゲモドキ属（Goniurosaurus）の動物であってよい。ヤモリ科の爬虫類は、例えば、オガサワラヤモリ属（Lepidodactylus）；キノボリヤモリ属（Hemiphyllodactylus）；シマヤモリ属（Perochirus）；ニホンヤモリ（Gekko japonicus）、アマミヤモリ（Gekko vertebralis）等のヤモリ属（Gekko）の動物であってよい。
　イグアナ科の爬虫類は、例えば、アノールトカゲ属（Anolis）；グリーンイグアナ（Iguana iguana）等のイグアナ属（Iguana）の動物であってよい。トカゲ科の爬虫類は、例えば、アオスジトカゲ（Plestiodon elegans）、イシガキトカゲ（Plestiodon stimpsonii）等のトカゲ属（Plestiodon）の動物であってよい。ナミヘビ科の爬虫類は、例えば、サキシマアオヘビ（Cyclophiops herminae）等のアオヘビ属（Cyclophiops）；アオダイショウ（Elaphe climacophora）及びシマヘビ（Elaphe quadrivirgata）等のナメラ属（Elaphe）；ナガヒメヘビ（Calamaria pavimentata）等のヒメヘビ属（Calamaria）；アカマタ（Dinodon semicarinatum）等のマダラヘビ属（Dinodon）の動物であってよい。
　コブラ亜科の爬虫類は、例えば、ワモンベニヘビ属（Sinomicrurus）の動物であってよい。ウミヘビ亜科の爬虫類は、例えば、ウミヘビ属（Hydrophis）；エラブウミヘビ属（Laticauda）；カメガシラウミヘビ属（Emydocephalus）の動物であってよい。マムシ亜科は、例えば、ハブ（Protobothrops flavoviridis）、サキシマハブ（Protobothrops elegans）等のハブ属（Protobothrops）；ニホンマムシ（Gloydius blomhoffii）等のマムシ属（Gloydius）；ヤマハブ属（Ovophis）の動物であってよい。
　本態様に係る非ヒト脊椎動物は、例えば、爬虫類に属する任意の動物である。爬虫類に属する動物は、例えば、スッポンである。
　用語「鳥類」は、脊椎動物亜門鳥綱（Ａｖｅｓ）に属する動物群を意味する。鳥類は、例えば、ツカツクリ科（Megapodiidae）、ホロホロチョウ科（Numididae）、ニワトリ（Gallus gallus domesticus）等のキジ科（Phasianidae）；ダチョウ科（Struthionidae）；カモ科（Anatidae）；サケビドリ科（Anhimidae）；ハト科（Columbidae）；ツル科（Gruidae）；クイナ科（Rallidae）；コフラミンゴ属（Phoeniconaias）；アブラヨタカ科（Steatornithidae）；タチヨタカ科（Nyctibiidae）；ヨタカ科（Caprimulgidae）；アビ科（Gaviidae）；オウサマペンギン属（Aptenodytes）；イワトビペンギン属（Eudyptes）；アホウドリ科（Diomedeidae）；ウミツバメ科（Hydrobatidae）；コウノトリ科（Ciconiidae）；サギ科（Ardeidae）；トキ科（Threskiornithidae）；ペリカン科（Pelecanidae）；ヘビウ科（Anhingidae）；タカ科（Accipitridae）；コンドル科（Cathartidae）；フクロウ科（Strigidae）；ネズミドリ属（Colius）；アジアキヌバネドリ属（Harpactes）；サイチョウ科（Bucerotidae）；キツツキ科（Picidae）；カワセミ科（Alcedinidae）；ハチクイ科（Meropidae）；ハヤブサ亜科（Falconinae）；オウム科（Cacatuidae）；インコ科（Psittaculidae）；フクロウオウム科（Strigopidae）；又はヒバリ科（Alaudidae）の動物であってよい。
　本態様に係る非ヒト脊椎動物は、例えば、鳥類に属する任意の動物である。鳥類に属する動物は、例えば、ニワトリ、ダチョウ、インコ、フクロウ、又はタカであってよい。
　用語「哺乳類」は、脊椎動物亜門の哺乳綱（Mammalia）に属する動物群を意味する。哺乳類は、例えば、単孔類（Monotremata）、有袋類（Marsupial）、アフリカ食虫類（Afroinsectiphilia）、近蹄類（Paenungulata）、異節類（Xenarthra）、真主齧類（Euarchontoglires）、又はローラシア獣類（Laurasiatheria）の動物であってよい。
　単孔目の哺乳類は、例えば、カモノハシ科（Ornithorhynchidae）又はハリモグラ科（Tachyglossidae）の動物であってよい。有袋類の哺乳類は、例えば、オポッサム科（Didelphidae）；タスマニアデビル（Sarcophilus harrisii）等のフクロネコ科（Dasyuridae）；フクロアリクイ科（Myrmecobiidae）；コアラ科（Phascolarctidae）；フクロモモンガ科（Petauridae）；オオカンガルー（Macropus giganteus）、ワラビー（wallaby）等のカンガルー科（Macropodidae）の動物であってよい。
　アフリカ食虫類の哺乳類は、例えば、キンモグラ科（Chrysochloridae）；テンレック科（Tenrecidae）；ハネジネズミ属（Elephantulus）；テングハネジネズミ属（Rhynchocyon）の動物であってよい。近蹄類の哺乳動物は、例えば、ハイラックス科（Procaviidae）；ゾウ科（Elephantidae）；ジュゴン科（Dugongidae）；マナティー科（Trichechidae）の動物であってよい。異節類の哺乳動物は、例えば、ミユビナマケモノ科（Bradypodidae）；フタユビナマケモノ科（Megalonychidae）；オオアリクイ科（Myrmecophagidae）；ヒメアリクイ科（Cyclopedidae）；Chlamyphoridae科；Dasypodidae科の動物であってよい。
　真主齧類の哺乳動物は、例えば、メガネザル科（Tarsiidae）；オナガザル科（Cercopithecidae）；ヒト科（Hominidae）；テナガザル科（Hylobatidae）；クモザル科（Atelidae）；キツネザル科（Lemuridae）の動物であってよい。真主齧類の哺乳動物は、例えば、ネズミ科（Muridae）；アシナガマウス科（Nesomyidae）；キヌゲネズミ科（Cricetidae）；メクラネズミ科（Spalacidae）；ヨルマウス科（Calomyscidae）；トビネズミ科（Dipodidae）；ヤマネ科（Gliridae）の動物であってよい。真主齧類の哺乳動物は、例えば、ウサギ科（Leporidae）；ナキウサギ科（Ochotonidae）の動物であってよい。真主齧類の哺乳動物は、例えば、ヒヨケザル科（Cynocephalidae）の動物であってよい。真主齧類の哺乳動物は、例えば、ツパイ科（Tupaiidae）；ハネオツパイ科（Ptilocercidae）の動物であってよい。
　ローラシア獣類の哺乳動物は、例えば、ハリネズミ科（Erinaceidae）；ソレノドン科（Solenodontidae）；モグラ科（Talpidae）の動物であってよい。ローラシア獣類の哺乳動物は、例えば、オオコウモリ科（Pteropodidae）；ヒナコウモリ科（Vespertilionidae）の動物であってよい。ローラシア獣類の哺乳動物は、例えば、ウマ科（Equidae）；バク科（Tapiridae）、サイ科（Rhinocerotidae）の動物であってよい。ローラシア獣類の哺乳動物は、例えば、ラクダ、及びリャマ等のラクダ科（Camelidae）；イノシシ及びブタ等のイノシシ科（Suidae）；マメジカ科（Tragulidae）；ジャコウジカ科（Moschidae）；シカ、トナカイ及びシフゾウ等のシカ科（Cervidae）；ウシ、アンテロープ、ヤギ及びヒツジなどのウシ科（Bovidae）；キリン及びオカピ等のキリン科（Giraffidae）；プロングホーン科（Antilocapridae）；カバ及びコビトカバ等のカバ科（Hippopotamidae）；セミクジラ科（Balaenidae）等のヒゲクジラ亜目（Mysticeti）；マッコウクジラ科（Physeteridae）；マイルカ科（Delphinidae）の動物であってよい。
　本態様に係る非ヒト脊椎動物は、非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどのげっ歯類に属する任意の動物、チンパンジーなどの非ヒト霊長類に属する任意の動物、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目に属する任意の動物、ウマなどの奇蹄目に属する任意の動物、ウサギ、イヌ、ネコなどの愛玩動物であってよい。
　用語「由来」又は「由来の」は、特定の対象物が特定の供給源から直接又は間接的に得られることを意味する。１つの例において、非ヒト脊椎動物由来の初期胚は、非ヒト脊椎動物の産卵又は人工授精によって体外で得られた初期胚、又は体外で得られた受精卵を培養することにより得られた初期胚（例えば３２細胞期の胚）を含む。他の例において、胚由来の単離細胞は、胚を構成する細胞群を個々の細胞に分離して得られた細胞、又は前記細胞を培養して得られた細胞を含む。
（生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物を作出する方法）
　本開示の第２の態様は、本開示に係る始原生殖細胞が富化された胚から始原生殖細胞を採取すること；採取した始原生殖細胞（ドナー始原生殖細胞）を非ヒト脊椎動物由来の胚（ホスト胚）に注入すること；及び前記ドナー始原生殖細胞が注入されたホスト胚を培養することを含む、生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、前記生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物は、前記ドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含み、及び前記ドナー始原生殖細胞を提供した非ヒト脊椎動物（ドナー非ヒト脊椎動物）と、前記ホスト胚を提供した非ヒト脊椎動物（ホスト非ヒト脊椎動物）とが近縁である、方法を提供する。
　始原生殖細胞が富化された胚は、本開示の第１の態様に係る方法により調製することができる。前記始原生殖細胞が富化された胚は、例えば、胞胚、嚢胚、神経胚、咽頭胚、又はそれ以降の発生段階の胚（例えば、幼体、稚魚、雛鳥又は胎仔などの発生した個体を含む）である。始原生殖細胞の採取のし易さの観点から、前記始原生殖細胞が富化された胚は、胞胚、嚢胚、神経胚、咽頭胚、又はそれ以降の発生段階の胚であって、個体が発生する前の胚であり、好ましくは胞胚又は嚢胚である。始原生殖細胞は、胚の発生段階に応じて公知の方法に従って、胚から採取することができる。始原生殖細胞は、例えば、胞胚からガラスキャピラリーを備えた吸引装置を用いて採取することができる。始原生殖細胞は、例えば、嚢胚以降の胚を、トリプシン又はコラゲナーゼ等のプロテアーゼを用いた細胞剥離処理に供して、剥離した細胞を密度勾配遠心分離に供して、始原生殖細胞を分離及び濃縮することによって採取することができる。
　始原生殖細胞の単離を容易にするために、非ヒト脊椎動物由来の初期胚に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓの導入に加えて、標識となる遺伝子（例えば、蛍光タンパク質をコードする遺伝子）を導入してもよい。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚が、非ヒト脊椎動物の初期胚の全て又はほとんどの細胞に前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入して調製される場合、前記初期胚を培養して得られる胞胚期でその発生が停止した胚は、ほぼすべての細胞が前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入され、かつ標的遺伝子を発現する始原生殖細胞である。
　採取した始原生殖細胞（ドナー始原生殖細胞）は、非ヒト脊椎動物由来の胚（ホスト胚）に注入する。前記注入は、例えば、顕微注入により行うことができる。ドナー始原生殖細胞が注入又は移植されるホスト胚は、例えば、胞胚、嚢胚、神経胚、咽頭胚、又はそれ以降の発生段階の胚（例えば、幼体、稚魚、雛鳥又は胎仔などの発生した個体を含む）である。ドナー始原生殖細胞は、任意の個数をホスト胚に注入することができる。ドナー始原生殖細胞は、ホスト胚に、例えば１０個～１０００個、１０個～５００個、１０個～２５０個、１０個～１５０個、１０個～１００個、２０個～１００個、１０個～７５個、２０個～７５個、１０個～６０個、２０個～６０個、３０個～６０個注入することができる。
　本態様において、ドナー始原生殖細胞を提供した非ヒト脊椎動物（ドナー非ヒト脊椎動物）と、前記ホスト胚を提供した非ヒト脊椎動物（ホスト非ヒト脊椎動物）とは、近縁である。用語「近縁」は、同じ科（ｆａｍｉｌｙ）に属する非ヒト脊椎動物である。近縁の非ヒト脊椎動物は、例えば、同じ科に属する非ヒト脊椎動物同士であってよく、好ましくは、同じ属（ｇｅｎｕｓ）に属する非ヒト脊椎動物同士であってもよい。本開示において、近縁は、同じ種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を排除しない。近縁は、例えば、同じ種に属する非ヒト脊椎動物同士であってよい。近縁の非ヒト脊椎動物は、例えば、異種であって、同じ科に属する非ヒト脊椎動物同士である。近縁の非ヒト脊椎動物は、例えば、異種であって、同じ属に属する非ヒト脊椎動物同士である。１つの例において、ドナー非ヒト脊椎動物とホスト非ヒト脊椎動物とは、同種の非ヒト脊椎動物である。ドナー非ヒト脊椎動物は、ドナー始原生殖細胞を提供した動物個体と同種の動物であってよい。ホスト非ヒト脊椎動物は、ホスト胚を提供した動物個体と同種の動物であってよい。１つの例において、ホスト胚を提供したホスト非ヒト脊椎動物は、不妊化されている。非ヒト脊椎動物の不妊化は、公知の方法（例えばゲノム編集技術）を用いて実施することができる。
　本態様において、ドナー非ヒト脊椎動物とホスト非ヒト脊椎動物とが魚類に属する場合、前記ドナー非ヒト脊椎動物とホスト非ヒト脊椎動物とは、例えば、マグロとサバの組合せ、サケとニジマスの組合せ、トラフグとクサフグの組合せ、又は錦鯉と金魚との組合せである。
　第２の態様に係る方法によれば、ドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含むキメラ非ヒト脊椎動物が得られる。前記キメラ非ヒト脊椎動物は、ホスト胚を提供した非ヒト脊椎動物と同種の非ヒト脊椎動物である。前記ドナー始原生殖細胞は、その遺伝子が改変されていてもよい。ドナー始原生殖細胞への遺伝子導入は、本開示に記載の方法に従って行うことができる。本態様の１つの実施形態は、ドナー非ヒト脊椎動物由来の初期胚に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入し、かつその遺伝子を改変すること；前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入され、かつ前記遺伝子が改変された初期胚を培養して、その遺伝子が改変された始原生殖細胞が富化された胚を調製すること；前記始原生殖細胞が富化された胚から、前記遺伝子が改変された始原生殖細胞（ドナー始原生殖細胞）を採取すること；採取した前記ドナー始原生殖細胞を非ヒト脊椎動物由来のホスト胚に注入すること；及び前記ドナー始原生殖細胞が注入されたホスト胚を培養することを含む、生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、前記生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物は、前記遺伝子が改変されたドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含み、前記ドナー始原生殖細胞を提供したドナー非ヒト脊椎動物と、前記ホスト胚を提供したホスト非ヒト脊椎動物とが近縁である、方法を提供する。
　前記実施形態に係る生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物（ホスト非ヒト脊椎動物）は、遺伝子改変を本質的に生殖腺領域（生殖腺）の始原生殖細胞にのみ含む。例えば、前記遺伝子改変が致死性又は発生不全の改変（例えば、染色体の四倍体化）であっても、本実施形態の方法によれば、前記遺伝子改変を含む生殖細胞をその生殖腺領域に含む、前記生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物（ホスト非ヒト脊椎動物）が得られる。
　魚類において、三倍体のメス個体は卵を産生しないため、卵の産生に利用される栄養が個体の成長に充てられる。この結果、三倍体のメス個体は、通常の二倍体のメス個体よりも、サイズが大きくなり、肉質も良くなる。三倍体の個体は、四倍体の卵子と精子とから作出される。四倍体の卵子又は精子を調製するための個体（四倍体）は、発生不良又は成長不良となることがある。したがって、その生殖腺領域に四倍体の始原生殖細胞を含む二倍体の個体を作出することには利点がある。第２の態様の方法によれば、前記した個体を作出することができる。そのような方法は、例えば、非ヒト脊椎動物由来の初期胚（例えば４細胞期から６４細胞期の胚の少なくとも１個の細胞）に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入し、並びに四倍体とする遺伝子改変を前記初期胚にて行うこと；前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入され、かつ遺伝子が改変された初期胚を培養して、ドナー始原生殖細胞（四倍体）が富化された胚を調製すること；前記始原生殖細胞が富化された胚からドナー始原生殖細胞（四倍体）を採取して非ヒト脊椎動物由来のホスト胚（二倍体）に注入すること；及びドナー始原生殖細胞（四倍体）が注入されたホスト胚（二倍体）を培養して、生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物を作出することを含む。前記生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物は、その生殖腺領域にドナー始原生殖細胞（四倍体）を含み、その体細胞は二倍体である。前記生殖系列キメラ脊椎動物由来の卵子（四倍体）と、野生型の同種の非ヒト脊椎動物由来の精子（二倍体）とから、三倍体の個体を得ることができる。
　第２の態様に係る方法により作出される生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物（ホスト非ヒト脊椎動物）は、後述するドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含む、ドナー非ヒト脊椎動物を作出することができる。
（ドナー非ヒト脊椎動物を作出する方法）
　本開示に１つの態様は、生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物（ホスト非ヒト脊椎動物）を交配させることを含む、ドナー非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、前記生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物（ホスト非ヒト脊椎動物）が、ドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含み、及び前記ドナー非ヒト脊椎動物が、前記ドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含む、方法を提供する。
　ドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含む生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物（ホスト非ヒト脊椎動物）は、例えば、同じ生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物（例えば、ホスト非ヒト脊椎動物）と自然交配又は人工授精により、次世代の生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物（ドナー非ヒト脊椎動物）を作出することができる。ドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含む生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物（ホスト非ヒト脊椎動物）は、例えば、ドナー非ヒト脊椎動物と自然交配又は人工授精により、次世代の生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物（ドナー非ヒト脊椎動物）を作出することができる。
　本態様に係る方法は、例えば、借腹生産技術に利用することができる。ホスト非ヒト脊椎動物として飼育法が確立された動物をホスト非ヒト脊椎動物（例えば、サバ）として用い、経済的価値が高い非ヒト脊椎動物をドナー非ヒト脊椎動物（例えば、マグロ）として用いることで、飼育法が確立されたホスト非ヒト脊椎動物（例えば、サバ）から容易にドナー非ヒト脊椎動物（例えば、マグロ）を作出することができる。より具体的には、非ヒト脊椎動物由来の初期胚（例えば、マグロ由来の初期胚）に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入し、場合によりその遺伝子を改変すること；前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚（場合により前記遺伝子が改変されている）を培養して、始原生殖細胞が富化された胚（マグロ由来）を調製すること；前記胚からドナー始原生殖細胞（マグロ由来）を採取して、非ヒト脊椎動物由来のホスト胚（例えば、サバ由来）に注入すること；前記ホスト胚を培養して、その生殖腺領域に前記ドナー始原生殖細胞（マグロ由来）を含む生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物（サバ）を作出すること；及び前記生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物（サバ）を交配させることを含む、ドナー非ヒト脊椎動物（マグロ）を作出する方法が提供される。前記初期胚は、例えば、１細胞期～８細胞期（好ましくは１細胞期又は２細胞期、より好ましくは１細胞期）の胚である。
　本明細書において用語「含む」は、列挙される要素及び／又はステップが存在し、その他の要素及び／又はステップが追加されてもよいことを意味する。本明細書において用語「からなる」は、列挙される要素及び／又はステップが存在し、その他の要素及び／又はステップを排除することを意味する。本明細書において用語「から本質的になる」は、列挙される要素及び／又はステップが存在し、その他の要素及び／又はステップが、始原生殖細胞が富化された胚を調製する方法、非ヒト脊椎動物の作出方法、生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物、及びトランスジェニック非ヒト脊椎動物などの新規な技術的特徴に影響を与えない範囲で、追加されていてよいことを意味する。本明細書において用語「実質的に含まない」は、「完全に含まない」を排除しない。
　本開示に係る特定の態様又は実施形態の説明、及び前記態様又は実施形態について提供される用語の説明は、特に言及がない限り、本開示中の他の態様及び実施形態にも適宜適用される。本開示にて言及した全ての刊行物及び特許は、それらの刊行物及び特許が個別に、その開示内容全体が参照により組み込まれることを述べた場合と同様に、その開示内容全体が本開示に組み込まれる。
　以下、具体的な実施例を記載するが、それらは本発明の好ましい実施形態を示すものであり、添付する特許請求の範囲に記載の発明をいかようにも限定するものではない。
［実施例］
Ｎａｎｏｓ３－ＳＶ４０ｐＡ及びＤｎｄ１－ＳＶ４０ｐＡ　ｍＲＮＡの合成
　メダカＮａｎｏｓ３及びＤｎｄ１のタンパク質コード領域をそれぞれ、メダカ卵巣のｃＤＮＡ及びｐｃｓ２ＤｎｄＣｈＤＤ３’ベクター（非特許文献２、ＹｕｎＨａｎ　Ｈｏｎｇ博士より分与）から増幅し、ｐＧＧＥＶ－１＿ＸｃｍＩ－ＬａｃＺベクター（ａｄｄｇｅｎｅＩＤ：４９２９６）のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩサイトにクローニングした。ＳＶ４０ｐＡは、ｃｙｔｏ－ＹＦＰ－ＦＫＢＰｘ５ベクター（ａｄｄｇｅｎｅＩＤ：１０３７７７）から増幅し、ｐＧＧＥＶ＿２’＿ＸｃｍＩ－ＬａｃＺ（ａｄｄｇｅｎｅＩＤ：４９３０３）のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩサイトにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ　ＧＡＴＥｗａｙ（ＧＧＷ）クローニング法（Ｋｉｒｃｈｍａｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．Ｇｏｌｄｅｎ　ＧＡＴＥｗａｙ　Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ　ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ　８（１０）：ｅ７６１１７．　（２０１３））に従い、ＳＶ４０ｐＡをＮａｎｏｓ３及びＤｎｄ１の３’端にそれぞれ連結した。
　ゼブラフィッシュＮａｎｏｓ３及びＤｎｄ１のタンパク質コード領域をそれぞれ含むｃＤＮＡを、ゼブラフィッシュ卵巣の細胞で発現するｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて調製した。前記ｃＤＮＡからＮａｎｏｓ３及びＤｎｄ１のタンパク質コード領域をそれぞれ増幅し、ｐＧＧＥＶ－１＿ＸｃｍＩ－ＬａｃＺベクターにクローニングした。上記と同様に、ＧＧＷクローニング法によりＳＶ４０ｐＡを連結した。作製したＤＮＡを鋳型にＴ７プロモーターを用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応によりｍＲＮＡを合成した（図１）。
　内在性のメダカＮａｎｏｓ３及びＤｎｄ１はそれぞれ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｄシステム（Ｋｕｓｈａｗａｈ　ｅｔ　ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｄ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍＲＮＡ　ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ　ｉｎ　ａｎｉｍａｌ　ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　５４（６）：８０５－８１７．ｅ７（２０２０））にて変異を導入し（図１）、内在性のＮａｎｏｓ３とＤｎｄ１をノックダウンした。これにより、顕微注入したＮａｎｏｓ３－ＳＶ４０ｐＡ及びＤｎｄ１－ＳＶ４０ｐＡの効果のみを評価できる（試験１－２）。
試験（１）：メダカ胚における始原生殖細胞の富化
試験１－１：Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓ３の共注入により、胞胚期のほぼ全ての細胞が始原生殖細胞に分化誘導された
　メダカの１細胞期の胚（受精卵）に、４０ｎｇ／μｌのＮａｎｏｓ３－ＳＶ４０ｐＡ及びＤｎｄ１－ＳＶ４０ｐＡのｍＲＮＡを顕微注入した（メダカ由来のＤｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３を過剰発現する胚：Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３－ＯＥ胚）。前記１細胞期の胚に、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｎａｎｏｓ３　３’ＵＴＲを、始原生殖細胞標識のために顕微注入し、前記胚を培養した。前記胚は胞胚期まで発生したが、それ以降発生は進行しなかった。胞胚期で発生が止まった胚では、ほぼ全ての細胞がｍＣｈｅｒｒｙ陽性となり、前記胞胚のほぼ全ての細胞が始原生殖細胞（ＰＧＣ）となった（図２Ａ及び図２Ｂ）。
　これらの胚（ドナー胚）の始原生殖細胞を約５０個、野生型のホスト胚へ顕微注入し、前記胚を培養した。驚くべきことに、移植した多くの細胞が、ＰＧＣと同様に生殖腺へ移動した（図２Ｃ）。発生後期の胚において、少なくとも２００個以上のＰＧＣが生殖腺領域で観察された（図２Ｄ）。この結果は、通常１０～４０個程度のＰＧＣが形成される野生型に比べ、顕著に多い数のＰＧＣが形成されたことを意味する。
　Ｄｎｄ１単独を強制発現させることで、始原生殖細胞の数が、野生型の場合と比べて約１．５～２倍程度増加する（非特許文献２）。形成される始原生殖細胞の数について、本開示に係る方法によれば、始原生殖細胞の数は、野生型の場合と比べて、約３０倍以上増加している（図２Ｄ）。したがって、本開示に係る方法によれば、Ｄｎｄ１単独を強制発現させた場合よりも、始原生殖細胞の数が顕著に増加し得る。
試験１－２：始原生殖細胞形成における、Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３両方の導入と、Ｄｎｄ１単独又はＮａｎｏｓ３単独の導入との比較
　試験１－１で示されたように、１細胞期の胚（受精卵）に、Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３の両方を導入して、過剰発現（ＯＥ）させると、胞胚期以降発生が進行せず、個体は発生（孵化）しなかった。そこで、１６細胞期胚の１つの細胞だけＤｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３を導入することで、始原生殖細胞の数が増加した胚が正常に発生（孵化）するかについて試験した。
　内在性のＤｎｄ１及びＮａｎｏｓ３の影響を排除するために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｄシステムにより、内在性のＤｎｄ１又はＮａｎｏｓ３、もしくはその両方をノックダウン（ＫＤ）した（図３Ａ）。具体的には、生殖細胞がＥＧＦＰで標識されるトランスジェニックメダカ（ｏｌｖａｓ－ＥＧＦＰ）の１細胞期の胚に、Ｃａｓ１３ｄ　ｍＲＮＡ、Ｄｎｄ及びＮａｎｏｓ３のｇＲＮＡ（Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３　ｇＲＮＡ）、並びにｍＣｈｅｒｒｙ－Ｎａｎｏｓ３　３’ＵＴＲを（ＰＧＣ標識用）を顕微注入して、内在性のＤｎｄ又はＮａｎｏｓ３、もしくはその両方をノックダウンした。
　１６細胞期胚では、１６個の細胞が、４細胞×４細胞の一層の細胞層を形成している（図３Ｂの模式図）。１６細胞期胚での、生殖質を構成する因子（生殖顆粒因子）の局在をＢｕｃｋｙＢａｌｌ：ＥＧＦＰメダカを用いて調べた。前記一層の細胞層の外側に存在する細胞には、生殖顆粒因子はほとんど局在していなかった（図３Ｂの蛍光画像）。生殖顆粒因子が局在しておらず、始原生殖細胞以外の細胞になる運命の細胞が、Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３を導入することで、始原生殖細胞に分化誘導されるかについて調べるために、前記一層の細胞層の外側に存在する一個の細胞（図３Ｂの蛍光画像中、＊を付した細胞）に、１０ｎｇ／μｌのＤｎｄ１－ＳＶ４０ｐＡあるいはＮａｎｏｓ３－ＳＶ４０ｐＡを単独か、もしくはそれら両方（Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３）を顕微注入した。
　Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３を顕微注入した胚は、正常に発生した（１０７個体）。１０７個体中９９個体（９３％）の生殖腺領域では、試験１－１の生殖系列キメラと同様に、コントロール個体（図３Ｃ）と比較して、顕著に増加した数のｏｌｖａｓ－ＥＧＦＰ陽性の始原生殖細胞が観察された（図３Ｄ）。Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓ３をそれぞれ単独で顕微注入した胚では、ｏｌｖａｓ－ＥＧＦＰ陽性の始原生殖細胞形成が確認できた個体は、それぞれ１８％（１０４個体中１９個体）及び２３％（１０２個体中２３個体）であった。また、形成された始原生殖細胞の数は、１個体あたり平均３．４±２．４個と非常に少なかった（図３Ｅ及びＦ）。
　試験１－２は、重要なことに、１６細胞期の胚の少なくとも１個の細胞にＤｎｄ１とＮａｎｏｓ３の両方を注入することで、顕著に増加した始原生殖細胞をその生殖腺領域に含む個体の発生が可能であることを示す。４細胞周期の胚、８細胞周期の胚、及び３２細胞期の胚の１個の細胞にＤｎｄ１とＮａｎｏｓ３の両方を注入した場合も、顕著に増加した始原生殖細胞をその生殖腺領域に含む個体が発生した。したがって、本開示の実施例は、初期胚（４細胞期～３２細胞期の胚）で所定の割合の細胞に、Ｄｎｄ１とＮａｎｏｓ３の両方を注入することで、顕著に増加した始原生殖細胞をその生殖腺領域に含む個体の発生が可能であることを示す。
　試験１－２は、Ｄｎｄ１とＮａｎｏｓ３を共注入する細胞は、始原生殖細胞になる運命の細胞（即ち、生殖顆粒因子が局在している細胞）でなくてもよいことを示す。さらに、試験１－２は、Ｄｎｄ１とＮａｎｏｓ３の両方の注入は、それら遺伝子の単独注入と比べて、顕著に多くの数の始原生殖細胞を形成させることを示す。
試験１－３：　Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３－ＯＥで形成した始原生殖細胞は代表的な生殖顆粒因子を発現する
　試験１－２では、Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３－ＯＥによって、形成された多数の始原生殖細胞のほとんどでｏｌｖａｓ－ＥＧＦＰの発現が観察された。ｏｌｖａｓ－ＥＧＦＰは、生殖顆粒因子ｖａｓａの発現をＥＧＦＰでモニターするためのマーカーである。試験１－２で用いたメダカ胚は、母親が野生型であり、父親がｏｌｖａｓ－ＥＧＦＰトランスジェニックメダカであった。このため、発生した胚で観察されたｖａｓａ遺伝子の発現は、卵に蓄積された母性由来のものではなく、形成された始原生殖細胞自身の遺伝子由来（胚性由来）の発現である。生殖顆粒因子ｖａｓａ以外の代表的な生殖顆粒因子（ｐｉｗｉｌ１、ｐｉｗｉｌ２、ｄａｚｌ、ｔｄｒｄ１、ｔｄｒｄ９及びｔｄｒｄ１２）の発現をｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによって調べた。その結果、ｖａｓａ遺伝子に加え、調べた全ての生殖顆粒因子がＤｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３－ＯＥ胚で形成された始原生殖細胞において発現していた（図４）。
　試験１－２及び試験１－３は、Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３－ＯＥによって形成された始原生殖細胞は、その生殖腺への移動能力に加えて、遺伝子発現の観点からも内在性の始原生殖細胞と類似した性質を有することを示す。
試験１－４：　Ｄｎｄ１とＮａｎｏｓ３の両方をコードするｍＲＮＡ
　試験１－１では、Ｄｎｄ１をコードするｍＲＮＡとＮａｎｏｓ３をコードするｍＲＮＡの２種類のｍＲＮＡを同時に顕微注入した。試験１－４では、Ｄｎｄ１とＮａｎｏｓ３の両方をコードする一本鎖ｍＲＮＡを用いて、試験１－１と同様の試験を行った。その結果ｈ、試験１－１と同様、前記一本鎖ｍＲＮＡを顕微注入した胚は、胞胚期で発生が止まり、胞胚のほぼ全ての細胞が始原生殖細胞となった。
試験（２）：ゼブラフィッシュ胚における始原生殖細胞の富化
　試験（１）においてメダカで実証された始原生殖細胞を増加させる技術が、他の魚種にも適用できるかについて試験した。試験（２）では、メダカと系統が離れたゼブラフィッシュを用いた。
　試験１－１（図２Ａ）の方法に従って、ゼブラフィッシュの１細胞期の胚（受精卵）に、７５ｎｇ／μｌのＮａｎｏｓ３－ＳＶ４０ｐＡ、９０ｎｇ／μｌのＤｎｄ１－ＳＶ４０ｐＡ、及び４０ｎｇ／μｌのＥＧＦＰ－Ｎａｎｏｓ３　３’ＵＴＲ（ＰＧＣの標識）のｍＲＮＡを顕微注入した。前記ｍＲＮＡを導入したドナー胚（ゼブラフィッシュ由来のＮａｎｏｓ３及びＤｎｄ１を過剰発現する胚：ＤＮ－ＯＥ胚）を胞胚期まで培養した（図５Ａ右）。培養した胞胚から始原生殖細胞（ドナー始原生殖細胞）を採取し、ゼブラフィッシュの未処理の胚（ホスト胚）に顕微注入した（図５Ｂ右）。
　ゼブラフィッシュの１細胞期の胚（ドナー胚）に、４０ｎｇ／μｌ　ＥＧＦＰ－Ｎａｎｏｓ３　３’ＵＴＲ　ｍＲＮＡのみを顕微注入し、コントロールのドナー胚を調製した（図５Ａ左）。コントロールのドナー胚を胞胚期まで培養し、始原生殖細胞（ドナー始原生殖細胞）を採取して、未処理の胚（ホスト胚）へ注入した（図５Ｂ左）。
　ＤＮ－ＯＥ胚は、コントロール胚に比べ、ＥＧＦＰ蛍光が強く、胚の細胞全体でＮａｎｏｓ３の発現が観察された（図５Ａ）。ＤＮ－ＯＥ胚は、試験１－１でのメダカの結果と同様、嚢胚期にまで正常に進行せず、個体は発生（孵化）しなかった（図５Ａ）。
　ＤＮ－ＯＥ胚由来のドナー始原生殖細胞を注入したホスト胚を培養することで、ドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含む生殖系列キメラ（ＤＮ－ＯＥキメラ）が１６個体得られた。１６個体中１６個体（１００％）で、ＥＧＦＰ陽性の始原生殖細胞様の細胞が多数観察された（図５Ｄ）。コントロール胚由来のドナー始原生殖細胞を注入したホスト胚を培養することで、コントロールのドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含む生殖系列キメラが１８個体得られた。１８個体のすべてで、ＥＧＦＰ陽性の始原生殖細胞様の細胞は観察されなかった（０％）（図５Ｃ）。
　孵化したＤＮ－ＯＥキメラの４個体すべてで、その生殖腺領域にＥＧＦＰ陽性細胞が観察された（図５Ｅ）。前記ＥＧＦＰ陽性細胞では、ＶＡＳＡタンパク質が発現されていた（図５Ｆ）。
　試験（２）は、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓ３の共導入によって、ゼブラフィッシュでも、増加した数の始原生殖細胞を含む胚を形成させることができること、及び形成された始原生殖細胞は、内在性の始原生殖細胞と類似した性質を有することを示す。
試験（３）：Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３－ＯＥで形成したＰＧＣは機能的な配偶子を産生する
　ドナーとしてｏｌｖａｓ－ＥＧＦＰ／ｓｏｘ９ｂ－ＤｓＲｅｄトランスジェニックメダカを準備した。前記トランスジェニックメダカは、生殖細胞がＥＧＦＰで標識され、脊索および軟骨細胞がＤｓＲｅｄで標識される。ホストとして野生型メダカ（Ｃａｂ系統）を準備した。ホスト胚は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｄシステムを用いてｄｎｄ／ｎａｎｏｓ３をノックダンして不妊化した。
　前記トランスジェニックメダカ由来の胞胚期の胚からドナー細胞を採取した。ガラスキャピラリーを用いた顕微注入により、胚１個あたり２０細胞以下のドナー細胞となるように、胞胚期のホスト胚にドナー細胞を移植した。移植は、４個～５個のホスト胚に対して行った。前記移植条件を「試験Ｎ２０」と称する。同様の方法で、胚１個あたり５０細胞以上のドナー細胞となるように、胞胚期のホスト胚にドナー細胞を移植した。移植は、２個～３個のホスト胚に対して行った。前記移植条件を「試験Ｎ５０」と称する。移植後のキメラ胚を抗生物質入りの生理食塩水で飼育し、孵化させた。孵化後のメダカを真水で３ヶ月飼育して性成熟させた。生殖系列キメラの作出はｏｌｖａｓ－ＥＧＦＰ陽性のＰＧＣが生殖腺に取り込まれたか否かで判断した。
　前記生殖系列キメラ個体の妊性は、野生型メダカとペア交配させることで確認した。また、交配後に前記キメラ個体を解剖して、ドナー由来の生殖細胞の有無を生殖腺におけるＥＧＦＰ蛍光に基づいて調べた。
　試験Ｎ２０において、未処理（Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３を注入しない）のドナー胚由来のドナー細胞を用いた場合、生殖系列キメラの作出割合は０％であった（試験結果３－１）。Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３を顕微注入したドナー胚（Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３－ＯＥ）由来のドナー細胞を用いた場合、前記作出割合は８９％であった。前記生殖系列キメラのうち７４％（１９個体中１４個体）が妊性を持っていた（試験結果３－２）。
　試験Ｎ５０において、未処理のドナー胚由来のドナー細胞を用いた場合、生殖系列キメラの割合は４８％であり、そのうち１００％（７個体中７個体）が妊性を持っていた（試験結果３－３）。Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３－ＯＥドナー胚由来のドナー細胞を用いた場合、前記作出割合は１００％であり、そのうち８７％（１８個体中１６個体）が妊性を持っていた（試験結果３－４）。
　妊性が確認できた個体から次世代の胚を得た。次世代の胚はすべてｏｌｖａｓ－ＥＧＦＰ／ｓｏｘ９ｂ－ＤｓＲｅｄ陽性であった。これは、次世代の胚がドナー配偶子に由来することを示す。さらに次世代の胚のすべてでｏｌｖａｓ－ＥＧＦＰ陽性の生殖細胞が検出された。これは、次世代の胚で正常に生殖細胞の形成が進行したことを示す（図６）。
配偶子形成開始因子ｄａｚｌの共注入により妊性が向上
　試験結果３－２及び３－４は、Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３－ＯＥドナー胚由来のドナー細胞を用いて得られた生殖系列キメラの一部が不妊となることを示した。生殖系列キメラが不妊となる原因を調べた。その結果、不妊であった７個体中４個体で生殖細胞が欠損していたことが分かった。残りの３個体は生殖腺が未発達であった。
　さらに孵化後１０日目の生殖腺を調べた。その結果、未処理胚由来のドナー細胞をホスト胚に移植して得られたＸＸ個体では、全ての個体が卵形成を開始していた。他方、ｄｎｄ１／ｎａｎｏｓ３－ＯＥ胚由来のドナー細胞をホスト胚に移植して得られたキメラＸＸ個体では、１４個体中５個体で卵形成が確認できた。残りの８個体は未分化の生殖細胞のみを有し（ｎ＝８）、１個体は生殖細胞を欠損していた（ｎ＝１）。
　これらの結果は、ｄｎｄ１／ｎａｎｏｓ３－ＯＥによって生殖細胞に分化した細胞では、そのすべてが配偶子形成の開始能力を持っていないことを示す。
　ｄｎｄ１／ｎａｎｏｓ３－ＯＥドナー胚由来のドナー細胞を用いて得られた生殖系列キメラの妊性を向上させる試みを行った。配偶子形成開始に必要なｄａｚｌのｍＲＮＡをｄｎｄ／ｎａｎｏｓ３　ｍＲＮＡと一緒にドナー胚に顕微注入した。前記ドナー胚由来の５０細胞以上を不妊化したホスト胚へ移植した（試験Ｎ５０）。その結果、生殖系列キメラの割合は１００％であり、そのうち９６．５％（２７個体中２６個体）が妊性を持っていた。妊性を確認できなかった１個体を解剖した。その結果、正常な精巣形成が確認できた。この個体における配偶子形成は正常であったことを示す。
　これらの結果は、ｄａｚｌをｄｎｄ／ｎａｎｏｓ３と共に用いることで、Ｄｎｄ１／Ｎａｎｏｓ３－ＯＥに由来する生殖系列キメラにおける妊性を向上させ得ることを示す。
試験（４）：メダカｄｎｄ１／ｎａｎｏｓ２導入によるメダカ胚での始原生殖細胞の富化
　試験４では、ｎａｎｏｓ３に代えてｎａｎｏｓ２を用いたことを除いて、実質的に試験１－２と同様の方法を、メダカの１６細胞期の胚に対して行った。具体的には、２０個のメダカ胚を用いた。前記メダカ胚における外側の細胞一個に、ｎａｎｏｓ２をコードするｍＲＮＡとｄｎｄ１をコードするｍＲＮＡとを共注入した。その結果、２０個の個体が発生した。２０個の個体すべてで始原生殖細胞が富化された（図７Ｂ）。図７Ａは、試験１－４と同様の方法を、１６細胞期の胚に対して行った結果を示す。
　一般的にｎａｎｏｓ遺伝子には、ｎａｎｏｓ１、ｎａｎｏｓ２、及びｎａｎｏｓ３がある。Ｎａｎｏｓ２は、胚における始原生殖細胞ではなく、成魚における生殖幹細胞で機能することが知られている。試験４は、ｎａｎｏｓ２が胚において始原生殖細胞を形成する能力があることを実証した。
試験（５）：ゼブラフィッシュｄｎｄ１／ｎａｎｏｓ３導入によるメダカ胚での始原生殖細胞の富化
　試験５では、メダカ由来のｄｎｄ１／ｎａｎｏｓ３の導入に代えてゼブラフィッシュ由来のｄｎｄ１／ｎａｎｏｓ３（Ｚｄｎｄ１、Ｚｎａｎｏｓ３）を導入したことを除いて、実質的に試験１－２と同様の方法を、メダカの１６細胞期の胚に対して行った。具体的には、１３個のメダカ胚を用いた。前記メダカ胚における外側の細胞一個に、Ｚｎａｎｏｓ３をコードするｍＲＮＡとＺｄｎｄ１をコードする一本鎖のｍＲＮＡとを共注入した。その結果、１３個の個体が発生した。１３個の個体すべてで始原生殖細胞が富化された（図７Ｃ）。
　試験５は、コイ目に属するゼブラフィッシュのｎａｎｏｓとｄｎｄであっても、ダツ目に属するメダカの胚において始原生殖細胞を富化させることが可能であることを実証した。試験５の結果は、始原生殖細胞を得たい動物種のＮａｎｏｓおよびＤｎｄ１を入手（クローニング）しなくても、本願開示に係る発明を実施できることを示唆する。例えば、始原生殖細胞を得たい動物種（例えば経済的価値が高い魚種）と同じ門（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（好ましくは同じ網（ｃｌａｓｓ））に属する別の動物種のＮａｎｏｓおよびＤｎｄ１が入手できていれば、それらを、始原生殖細胞を得たい動物種の胚に共導入することで、前記動物種の始原生殖細胞を富化させることができることを示す。

Claims (13)

  1. 　非ヒト脊椎動物由来の初期胚に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入すること；及び
    　前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入された初期胚を培養することを含む、始原生殖細胞が富化された胚を調製する方法。
  2. 　前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓは、タンパク質又はそれらをコードするヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが、それらをコードするＲＮＡである場合、その３’端側にポリＡ配列を含み、及び
    　前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが、それらをコードするＤＮＡである場合、外来性のポリアデニル化配列を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記初期胚に、配偶子形成因子を導入することを更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記配偶子形成因子が、Ｄａｚ、Ｄａｚｌ、Ｂｏｕｌｅ、ｍｅｉｏＣ、Ｙｔｈｄｃ２及びＲｂｍ４６から成る群より選択される少なくとも１つである、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記初期胚が、１細胞期から６４細胞期の胚である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記非ヒト脊椎動物が、魚類に属する動物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記非ヒト脊椎動物由来の初期胚の遺伝子を改変することをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　トランスジェニック非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、
    　非ヒト脊椎動物由来の初期胚に、Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓを導入し、かつ前記初期胚の遺伝子を改変すること；及び
    　前記Ｄｎｄ１及びＮａｎｏｓが導入され、かつ前記遺伝子が改変された初期胚を培養して、トランスジェニック非ヒト脊椎動物を発生させることを含み、
    　前記初期胚が、４細胞期から６４細胞期の胚であり、
    　前記トランスジェニック非ヒト脊椎動物は、遺伝子が改変された始原生殖細胞をその生殖腺領域に含む、方法。
  10. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の方法で調製された、始原生殖細胞が富化された胚からドナー始原生殖細胞を採取すること；
    　採取したドナー始原生殖細胞を非ヒト脊椎動物由来のホスト胚に注入すること；及び
    　前記ドナー始原生殖細胞が注入されたホスト胚を培養することを含む、生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、
    　前記生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物は、前記ドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含み、及び
    　前記ドナー始原生殖細胞を提供したドナー非ヒト脊椎動物と、前記ホスト胚を提供したホスト非ヒト脊椎動物とは近縁である、方法。
  11. 　請求項１０に記載の方法で作出された生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物を交配させることを含む、ドナー非ヒト脊椎動物を作出する方法であって、
    　前記生殖系列キメラ非ヒト脊椎動物が、前記ドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含み、及び
    　前記ドナー非ヒト脊椎動物が、前記ドナー始原生殖細胞をその生殖腺領域に含む、方法。
  12. 　前記ドナー非ヒト脊椎動物及び前記ホスト非ヒト脊椎動物が魚類に属し、
    　前記ホスト非ヒト脊椎動物と前記ドナー非ヒト脊椎動物とが、サバとマグロの組合せ、サケとニジマスの組合せ、トラフグとクサフグの組合せ、又は金魚と錦鯉との組合せである、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 　始原生殖細胞が富化された非ヒト脊椎動物由来の胚であって、
    　前記胚は、胞胚期以降の胚であり、
    　前記胚における始原生殖細胞の数が、前記胚と同種の非ヒト脊椎動物由来の同じ発生段階の胚における始原生殖細胞の数よりも少なくとも３倍多い、胚。
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