KR102594009B1 - 형질전환 생식세포의 제조 방법 및 이를 이용한 형질전환 동물의 제조 방법 - Google Patents

형질전환 생식세포의 제조 방법 및 이를 이용한 형질전환 동물의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 MGST2 유전자 도입 및 부설판 처리에 따른 생존 생식세포 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 생식세포의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 형질전환 생식세포를 제조할 경우에는 생체 내에서도 공여세포의 선별을 통해 형질전환 동물의 생산 효율을 크게 향상시킬 수 있다.

Description

형질전환 생식세포의 제조 방법 및 이를 이용한 형질전환 동물의 제조 방법{PREPARING METHOD OF TRANSGENIC GERM CELL AND TRANSGENIC ANIMAL USING THE SAME}
본 발명은 형질전환 생식세포의 제조 방법 및 이를 이용한 형질전환 동물의 제조 방법에 관한 것이다.
다양한 줄기세포 및 배아를 기반으로 하는 생명공학 기술과 높은 효율의 유전자 발현 조절기술 등을 복합적으로 활용한 형질전환 동물 생산은 인류가 직면한 난치병의 치료제 및 건강수명 증진을 위한 핵심기술로 주목받고 있다.
형질전환 동물의 생산에 관한 연구는 대부분은 소, 돼지, 양 토끼 및 염소 등의 포유류를 대상으로 이루어졌으나, 포유류의 경우 시간과 비용의 투자 대비 경제적 측면에서 성공적으로 형질전환 동물을 생산한 경우는 많지 않다. 이렇듯 형질전환 동물의 생산 효율이 저조한 것은 대부분의 포유류들이 한 세대가 비교적 길고, 복잡한 생리적, 형태적 특징을 갖고 있으며, 연구에 드는 천문학적 비용에 기인한다.
한편, 형질전환 조류는 포유류에 비해 성숙기간과 세대 간격이 짧으며 포유류에 비해 번식능력이 대단히 높기 때문에 형질전환된 가금의 계통성립이 용이하고 비교적 적은 노력과 비용으로 많은 개체를 대상으로 하는 실험이 가능하다는 장점이 있다. 그러나, 조류의 경우 포유류와는 달리 수정시 일어나는 일반적인 다정자침입(polyspermy) 현상이나, 수정 후부터 산란 직후까지의 배발생으로 인하여 배발달 X기(stage X)에 해당하는 갓 산란한 계란의 배에는 이미 약 60,000여 개의 분화전능(pluoripotent)한 세포들이 존재한다. 이러한 형태적, 발생적 특징으로 인해 가금에 있어 포유류의 경우와 동일한 방법으로 외래 유전자를 도입하는 것은 매우 어렵다. 또한 조류의 수란관에서 초기 수정란을 채취하기가 기술적으로 지극히 어려울 뿐만 아니라 산란된 난(卵)의 배는 두꺼운 난각으로 둘러싸여 있기 때문에 포유류에 사용되고 있는 유전자 이식 기술의 적용이 불가능하다는 기술적 한계점이 존재한다.
닭의 경우, 포유류 가축들에 비해 산자수가 많고, 달걀을 통한 단백질의 대량생산이 가능하며, 계란(알)의 경우 난 단백질이 10여 종에 불과하여 알을 통하여 생산된 단백질로부터 원하는 물질을 분리 정제하는 것이 용이해 이상적인 생체반응기(bioreactor) 동물로 간주되고 있다.
이처럼 형질전환 닭이 치료용 항체 또는 기능적 물질 생산에 탁월한 장점을 가지고 있음이 기존의 연구를 통해 잘 알려져 있지만, 기술적 한계에 의해 높은 효율로 형질전환 조류를 생산하는 방법에 관한 연구는 진행된 바가 거의 없다.
한국공개특허 제2017-0117095호
본 발명은 수율이 개선된 형질전환 생식세포의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 수율이 개선된 형질전환 동물의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 동물의 생식세포에 목적 유전자 및 MGST2 (Microsomal Glutathione S-Transferase 2) 유전자를 도입하는 단계; 및
상기 생식세포에 부설판을 처리하여 생존하는 생식세포를 선별하는 단계;를 포함하는 형질전환 생식세포의 제조 방법.
2. 위 1에 있어서, 상기 동물은 조류인 형질전환 생식세포의 제조 방법.
3. 위 2에 있어서, 상기 조류는 닭, 메추리, 꿩, 칠면조, 오리로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 형질전환 생식세포의 제조 방법.
4. 위 1에 있어서, 상기 목적 유전자 및 MGST2 유전자는 하나의 벡터에 포함된 것인 형질전환 생식세포의 제조 방법.
5. 위 1에 있어서, 상기 MGST2는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 것인 형질전환 생식세포의 제조 방법.
6. 위 1에 있어서, 상기 부설판 처리 전에 상기 생식세포에 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 더 포함하는 형질전환 생식세포의 제조 방법.
7. 위 6에 있어서, 상기 선별은 형광을 발하는 생식세포를 선별하는 것인 형질전환 생식세포의 제조 방법.
8. 위 1 내지 7 중 어느 한 항의 방법을 포함하는 형질전환 동물의 제조 방법.
본 발명은 MGSTII 유전자 도입 및 부설판 처리단계를 포함하는 형질전환 생식세포의 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 MGSTII 유전자 도입 및 부설판 처리를 통해 체외 배양단계 이외에 생체 내에서도 공여세포의 선별을 도모하여 높은 효율로 형질전환 동물을 제조할 수 있다.
도 1은 piggyBac CMV EGFP CMV MGSTII PGC 세포주를 확립하기 위한 벡터 구성과 세포주 확립 과정 도식화 및 MGSTII 발현 PGC에 대한 부설판의 효과를 확인한 결과이다.
(A) 트랜스포사제를 포함하는 piggyback TK NeoR CMV EGFP CMV MGSTII 벡터 및 PGC로의 도입 도식화. (B) 선별 후, piggyBac TK NeoR CMV EGFP CMV MGSTII 형질전환 PGC 세포주 MGSTII-tg PGC) 확립 (스케일 바=200μm). (C) MGSTII 및 GAPDH-특이 프라이머를 이용한 MGSTII-tg PGC의 gDNA PCR 분석. 증류수 (-)로 처리된 야생형(WT) PGC은 대조군으로 사용. (D-E) MGSTII-tg 및 WT PGC에 대한 부설판의 용량-의존적 효과. (D) 용량-의존적으로 부설판 처리 48시간 후 PGC의 WST1 분석 (평균±SD, n = 3). * P<0.05, ** P<0.001, (E) 다중 부설판 투여량 (0, 1, 2 및 8 μM)의 존재할 경우의 MGSTII-tg 및 WT PG형태. 비히클 대조군은 DMSO으로만 처리된다 (스케일 바=50 μm).
도 2는 MGSTII-tg PGC 이식 후 배아 생식선에서 부설판의 효과를 확인한 결과이다.
(A) 부술판 처리 하에 닭 PGC의 생체 내 효과. 내인성 PGC는 부설판 처리 유무에 관계없이 HH28의 배아 생식선에서 DAZL 면역 염색에 의해 검출된다 (스케일 바=100 μm). (B) 1μM 부설판으로 처리된 MGSTII-tg 및 GFP-tg PGC의 이동 분석. 약 1000개의 GFP-tg 또는 MGSTII-tg PGC가 HH 13-16에 닭 배아의 등쪽 대동맥에 주입된다. HH28에 수용자 배아 생식선에서 형광 세포를 관찰하고 카운팅한다 (스케일 바=100 μm). (C) HH 13-16에서 1000 PGC를 주입한 (i.v.) HH 28 배아의 생식선으로 이동한 PGC의 수 (평균± SD, 각 그룹에 대해 n = 3). * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001.
도 3은 MGSTII-tg 병아리의 GFP 발현 및 이식 유전자의 삽입부위를 확인한 결과이다.
(A) 공여자 MGSTII-tg PGC-유래 병아리. GFP-발현 병아리는 적절한 필터가 장착된 형광 자극 램프를 사용하여 비 형질전환 하이브리드와 구별 가능. (B) gDNA PCR 분석을 통한 MGSTII-tg 병아리의 스크리닝. MGSTII 및 GAPDH-특이적 프라이머를 사용한 형질전환 G1 병아리의 gDNA PCR 분석. MGSTII-tg PGC 및 비-tg gDNA 샘플을 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용. (C) 적절한 필터가 장착된 형광 자극 램프를 사용하여 성체 TG 닭 수컷 (TG 0276) 및 암컷 (TG 0285) 모두에서GFP 발현 검출(20주). (D) 형질전환 닭에서 이식 유전자 통합 부위의 확인. 이식 유전자는 TG 0276에서 14번 염색체의 유전자간 영역과 TG 0285에서 4번 염색체의 유전자간 영역에 통합된다. 검정색 뉴클레오티드는 gDNA 서열을, 노란색 뉴클레오티드는 트랜스포존 인식 서열 (TTAA)을, 빨간색 뉴클레오티드는 piggyBac 벡터 서열의 5 '를 나타낸다.
도 4는 부설판 주입 후 형질전환 닭 생산률 (부화율, 공여자 유래 자손 생산율 및 MGSTII 형질전환 자손 생산율) 향상을 나타낸 결과이다.
(A-C) 성체 생식선 키메라의 고환 단면 및 부설판 처리/비처리한 성체 생식선 키메라 고환에서 GFP-발현 공여자 생식 세포의 검출. (A) WT 수탉 고환 (음성 대조군으로 사용)에서는 GFP 발현은 관찰되지 않았다. (B) 부설판 처리하지 않은 생식선 키메라 수탉의 고환. GFP+ 세포는 정세관의 기저막에 인접하여 드물게 분포. (C) 부설판 처리 2주 후 생식 키메라 수탉의 고환. GFP+ 세포는 정세관 전체에 존재. DAPI를 사용하여 각 패널에서 핵 염색 (스케일 바= 200μm (상부 패널), 50μm (하부 및 소형 패널)). (D-F) 8주간 생식선 키메라의 자손 생산율 분석. (D) 부설판 처리 비처리한 생식선 키메라로부터의 G1 자손 부화율. (E) 부설판 처리/비처리한 공여자-유래 자손 생산의 효율성. (F) 부설판 처리/비처리한 MGSTII-tg 자손(G1) 생산의 효율성. 데이터는 8주간 각 독립 그룹 (매 주의 자손 생산)의 평균± SD로 표시. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 형질전환 생식세포의 제조 방법에 관한 것이다.
이하 본 발명의 일 구현예에 따른 방법을 상세히 설명한다.
먼저, 동물의 생식세포에 목적 유전자 및 MGST2 (Microsomal Glutathione S-Transferase 2) 유전자를 도입한다.
동물의 종류는 제한되지 않으며, 예를 들면 조류일 수 있고, 상기 조류는 예를 들면 닭, 메추리, 꿩, 칠면조, 오리 등일 수 있다.
생식세포는 조류의 원시생식세포로 장기간 체외배양이 가능하여 생식선 키메라를 효율적으로 생산할 수 있으므로, 생식세포 발달 생리 및 유전체 제어를 통한 형질전환 동물 생산에 적합한 세포라면 생식세포의 종류는 제한되지 않는다.
목적 유전자는 형질전환시에 도입하고자 하는 유전자로서 그 형질전환 목적에 맞는 것이라면 그 종류, 유래, 서열 등은 제한되지 않는다. 예를 들면 특정 산물을 생산하도록 하는 것이 형질전환 목적이라면 목적 유전자는 그 산물의 생산에 필요한 유전자일 수 있고, 특정 물질, 질병 등에 저항성을 부여하는 것이 형질전환 목적이라면 목적 유전자는 그 저항성 부여에 필요한 유전자일 수 있고, 질병 동물 모델을 제조하는 것이 형질전환 목적이라면 목적 유전자는 그 질병 유발에 필요한 유전자일 수 있다. 이들 외에도 형질전환 목적에 맞는 유전자를 사용할 수 있다.
MGST2 (Microsomal Glutathione S-Transferase 2) 유전자는 부설판 저항성을 부여하는 유전자로서, 그 유래는 제한되지 않으며, 그 생식세포의 유래 동물의 것일 수도 있고, 그렇지 않을 수도 있다. 그 생식세포의 유래 동물과 상이한 동물 유래인 경우, 생물분류상 그 동물과 상이한 속, 과, 목, 강 또는 문 동물 유래의 것일 수 있다. 구체적인 예를 들자면 생식세포가 닭 유래인 경우, 조류인 오리의 MGST2 유전자를 사용할 수도 있고, 포유류인 인간의 MGST2 유전자를 사용할 수도 있다.
인간의 MGST2 유전자를 사용하는 경우 서열번호 1의 염기로 이루어진 서열을 사용할 수 있다.
유전자의 도입은 당 분야에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면 전기 천공법(electroporation), 초음파 천공법(sonoporation), 유전자 총(gene gun), 리포좀을 이용한 리포펙션(lipofection) 등의 방법으로 수행될 수 있다.
MGST2 유전자를 과발현시키는 방법은 특별히 한정되지 않고 당 분야에 공지된 방법이 제한없이 사용될 수 있으며, 예컨대, MGST2 유전자가 삽입된 발현카세트를 PGC에 도입시켜 발생되는 것일 수 있다.
발현카세트는 특정 유전자를 발현시키기 위한 수단을 나타내며, 통상적인 발현벡터가 상기 발현카세트의 예가 될 수 있다. 예컨대, 발현 카세트는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
발현카세트에 삽입되는 MGST2 유전자는 프로모터와 작동 가능하게 연결된다. 프로모터는 RNA 폴리머라제에 대한 인지 및 적절한 전사에 요구되는 다른 인자를 제공함으로써 코딩서열의 발현을 제어하는 코딩서열의 상류(5')에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 의미할 수 있으며, 코딩서열 또는 기능을 갖는 RNA의 발현을 조절할 수 있는 최소 프로모터와 조절성분을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 의미할 수 있다. "작동 가능하게 연결된다"는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다.
프로모터는 조류 모델 내에서 작동할 수 있으면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 프로모터는 TATA 박스와 전사 개시위치를 특정하는 역할을 하는 짧은 DNA 서열인 최소 프로모터를 포함할 수 있으며, 발현 제어를 위한 조절성분이 더 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 프로모터는 전체가 천연 유전자로부터 유래될 수 있거나, 자연에서 발견된 상이한 프로모터들로부터 유래된 상이한 성분들로 이루어질 수 있으며, 또는 합성 DNA 절편으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 프로모터는 또한 생리적 또는 성장 조건에 대한 반응으로 전사 개시의 유효성을 제어하는 단백질 인자의 결합에 관여하는 DNA 서열을 함유할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 프로모터는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터를 사용할 수 있으며, 그 예로 U6 프로모터, CMV(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, CAG 프로모터, CaMV 35S 프로모터, Rsyn7 프로모터, 라이스 액틴(rice actin) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, ALS 프로모터 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
발현카세트는 프로모터 외에도 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트, 터미네이터, 복제기점, EGFP 등을 포함할 수 있으며, 조류 모델 내에서 작동할 수 있는 것이면 제한 없이 사용할 수 있고, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
유전자 도입에 발현벡터를 사용하는 경우 목적 유전자 및 MGST2 (Microsomal Glutathione S-Transferase 2) 유전자는 하나의 벡터에 포함된 것일 수도 있고, 서로 다른 벡터에 포함된 것일 수도 있다. 이들 유전자가 서로 다른 벡터에 포함된 경우 각 벡터는 생식세포에 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있으며, 순차적으로 도입되는 경우에 그 순서는 제한되지 않는다.
이후, 상기 생식세포에 항생제를 처리하여 형질전환된 생식세포 내 도입된 항생제-저항성 영역에 의해 생존한 세포만을 선별한다.
상기 항생제는 예를 들면 퓨로마이신, 네오마이신, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 하이그로마이신일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
항생제 처리 농도는 항생제-저항성 영역이 도입되지 않은 생식세포, 즉 형질전환되지 않은 생식세포를 사멸시킬 수 있는 농도이면 되는 것이지 특정 농도에 제한되지 않는다. 처리 농도는 예를 들면 10 내지 500ug/ml, 30 내지 300ug/ml, 50 내지 200ug/ml, 100 내지 500ug/ml, 150 내지 300ug/ml, 또는 200 내지 300ug/ml일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
형질전환된 세포의 균질화는 특별히 제한되지 않고 공지된 계대 배양방법에 의할 수 있으며, 예를 들면 2 내지 3주간 상기 항생제를 처리하여 1주 주기로 원심분리를 통해 세포를 수득하고 재현탁하여 다시 배양하는 방식으로 수행될 수 있다.
이후, 세포의 부설판에 대한 저항성을 증명하기 위해, 부설판은 용매에 용해된 상태로 세포에 처리될 수 있다. 용매는 예를 들면 디메틸설폭사이드(DMSO)일 수 있다.
부설판은 MGST2 유전자가 도입되지 않은 생식세포를 사멸시킬 수 있는 충분한 양으로 처리될 수 있으며, 예를 들면 104 내지 105개의 생식 세포에 1 내지 10μM의 농도로 처리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
부설판이 처리되면 MGST2 유전자가 도입되지 않은 생식세포는 사멸하므로, 생존하는 생식세포만 선별함으로써 형질전환된 생식세포를 선별할 수 있다. 생존하는 생식세포의 선별 방법은 특별히 제한되지 않고 공지된 방법에 의할 수 있으며, 예를 들면 배지교체 및 원심분리 등의 방법으로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 부설판 처리 전에 상기 생식세포에 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
형광 단백질을 코딩하는 유전자를 도입된 생식세포는 형광을 발하므로, 보다 쉽게 선별이 가능하다.
형광 단백질을 코딩하는 유전자는 목적 유전자 및 MGST2 유전자와 함께 도입될 수도 있고, 따로 도입될 수도 있다. 형광 단백질을 코딩하는 상기 유전자들과 1개의 벡터에 함께 포함되어 도입될 수 있으며, 서로 다른 벡터에 포함되어 도입될 수도 있다. 서로 다른 벡터에 포함되는 경우에는 각 유전자별로 1개씩 벡터가 사용될 수도 있고, 2개의 벡터가 사용될 수도 있다. 서로 다른 벡터에 포함되어 도입되는 경우 각 벡터가 동시에 도입될 수도 있고, 순차적으로 도입될 수도 있다.
형광 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 생식세포는 형광을 발하고, 그러한 생식세포는 MGST2 유전자도 함께 도입되어 부설판 저항성을 나타내므로, 부설판 처리 이후에 형광을 발하는 생식세포만 선별함으로써 형질전환 생식세포를 선별할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 포함하는 형질전환 동물의 제조 방법에 관한 것이다.
형질전환 PGC 세포주는 동물의 생식세포에 목적 유전자 및 MGST2 (Microsomal Glutathione S-Transferase 2) 유전자를 도입시키고, 부설판을 처리하여 저항성 여부를 확인한 것으로, 세포주 확립방법은 전술한 바와 같다.
상기 확립한 형질전환 PGC 세포주 103개 내지 105개를 조류 배아의 대동맥에 미세 주입하여 생식선 키메라를 생산할 수 있다.
MGSTII-tg PGC에 대한 부설판의 효과를 평가하기 위해, 103개 내지 104개의 GFP-tg PGC 또는 MGSTII-tg PGC을 HH13-16 단계에서 1 내지 10μM 부설판 용액과 함께 주입할 수 있으며, MGSTII의 부설판에 대한 저항성을 확인하기 위한 것이라면 부설판 용액의 농도는 제한되지 아니한다.
생식선 키메라의 성 성숙 후, WL 암컷 닭과 시험 교배하여, 형질전환 PGC로부터 유래된 형질전환 닭을 생산할 수 있다.
이후, 성체 생식선 키메라에 부설판을 처리하여, 공여자-유래 생산 효율과 형질 전환 병아리 생산 효율을 평가할 수 있다.
부설판 농도는 예를 들면 10 내지 50mg/kg, 20 내지 40mg/kg, 30 내지 40mg/kg 일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
부설판은 유기용제에 용해되어 키메라에 주입되는 것으로, 예를 들면 N,N-디메틸 포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO) 등일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
부설판 주입은 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 피하, 피내 등으로 주입/투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. 실험 방법
(1) 실험 동물 및 동물 관리
닭의 관리 및 실험적 용도는 서울대학교 실험 동물 자원 연구소의 승인(SNU-190401-1-1)을 받았다. 닭은 서울대학교 동물 농장의 표준 관리 프로그램에 따라 부양되었으며, 동물 관리, 번식 및 배아 조작 과정은 실험실의 표준 운영 프로토콜을 준수하였다.
(2) 인간 MGSTII 발현 벡터의 구축
인간 마이크로솜 글루타티온-S-트랜스퍼라제 II (MGSTII) 유전자의 코돈은 Gallus gallus 코돈 데이터베이스 (https://www.kazusa.or.jp/codon)를 사용하여 암탉에서의 발현에 최적화되었다. 코돈 최적화된 인간 MGSTII 유전자는 piggyBac TK NeoR CMV GFP FRT 백본 벡터에 통합되었다. 코돈 최적화된 MGSTII CDS는 HindIII, NotI 제한 효소를 이용하여 백본 벡터에 삽입된다. 그 후 CMV MGSTII 카세트는 5' 말단과 3' 말단에 XhoI 제한 부위를 포함하도록PCR로 클로닝하였다. 이 클로닝된 카세트는 XhoI 제한 효소를 사용하여 piggyBac TK NeoR CMV GFP FRT 백본에 통합되었고 최종 벡터인 piggyBac TK NeoR CMV GFP CMV MGSTII를 제조하였다.
(3) 형질 도입 및 PGC의 G418-선별
수컷 PGC는 20% (v/v) FBS (Invitrogen), 2 % (v/v) 치킨 혈청 (Sigma-Aldrich), 1x 뉴클레오사이드 믹스 (EMD Millipore), 2mM L-글루타민, 1x 비필수 아미노산 믹스, 베타-머캅토에탄올, 10mM 나트륨 피루베이트, 1x 항생제 항진균제 믹스 (Invitrogen) 및 인간 섬유아세포 성장인자 (bFGF, 10mg/mL; 코마바이오텍)이 첨가된 녹아웃-DMEM (KO-DMEM) (Invitrogen)에서 유사 분열적으로 비활성화된 마우스 섬유아세포 (MEF)에서 배양되었다. PGC는 5% (v/v) CO2 및 60-70% 상대 습도의 대기 내 37℃에서 배양되었다. piggyBac TK NeoR CMV GFP CMV MGSTII 발현 벡터 및 트랜스포사제 (CAGG-PBase, pCyL43)는 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Life Technologies)을 사용하여 PGC 라인으로 공동-형질 도입되었다. 형질 도입 1일 후, G418 (300mg/mL)은 1달간 형질 도입된 PGC를 선별할 수 있도록 배양 배지에 첨가되었다.
(4) MGSTII-발현 PGC의 부설판 내성 효과를 평가하기 위한 시험관 내 분석
WT 및 MGSTII-tg PGC는 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 용해된 다양한 농도의 부설판 (1, 2, 4, 6 및 8μM, Sigma-Aldrich)을 사용하여 96웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 50,000개 세포로 배양하였다. MGSTII-tg PGC의 부설판 내성을 평가하기 위해, 세포를 특정 농도의 부설판에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 WST-1 방법 (Roche Diagnostic)을 사용하여 세포 생존력을 평가했다. WST-1을 웰당 15μL 첨가하고, 세포를 4시간 동안 배양하였다. 대사 활성 세포에 의해 생성된 포르마잔 염료의 흡광도(A450-A650)는 Epoch 마이크로 플레이트 리더 (BioTek)를 사용하여 검출되었다.
(5) 수여자 배아에 MGSTII-tg PGC 이식
MGSTII-tg PGC를 수여자 배아에 주입하여 생식선 키메라 닭을 생산하기 위해 Hamburger와 Hamilton (HH)단계 HH13-16에서 각 수여자 KO 계란의 뾰족한 끝에 작은 구멍을 만들었고, 적어도 3,000 MGSTII-tg PGC를 함유하는 2μL 엘리컷을 수용자 배아의 등쪽 대동맥에 미세 주입 하였다. 계란 구멍을 파라핀 필름으로 밀봉하고, 추가적 스크리닝 및 최종 부화 전에 계란을 끝이 뾰족한 상태로 배양했다. MGSTII-tg PGC에 대한 부설판의 효과를 평가하기 위해, 대략 1000 GFP-tg PGC 또는 MGSTII-tg PGC을 HH13-16 단계에서 1μM 부설판 용액과 함께 주입하였다.
이식 3일 후, 수용자 배아의 샘플에서 생식선을 HH28에 채취하고, 생식선에서 GFP 발현 PGC의 존재를 형광 현미경 (니콘)으로 이미지화하여 카운팅하였다.
(6) 형질전화 닭 생산 효율성에 대한 시험-교차 분석 및 검증
성 성숙 후, 이식된 공여자 PGC로부터 유래된 형질 전환 닭을 생성하기 위해 추정 생식선 키메라는 WL 암컷 닭과 교배함으로써 시험 교배되었다. 형질전환 (TG) 닭은 검출 필터 (BLS Ltd.)가 달린 형광 자극 램프를 사용하여 확인하고 유전체 DNA PCR로 확인하였다. 공여자-유래 생산 효율과 형질 전환 병아리 생산 효율을 평가하기 위해 성체 생식선 키메라에 40 mg/kg 부설판을 주입하였다. 1mL N,N-디메틸 포름아미드 (Merck)에 용해된 40mg 부설판을 생식선 키메라에 복강 내 주입했다. 부설판 주입 2주 후, 부설판 처리된 생식선 키메라는 야생형 WL 암컷 닭과 교배함으로써 시험 교배되었다. 생식선 키메라의 두 그룹 (부설판 처리 또는 비처리)의 자손 20마리 이상을 8주간 부화율, 형광 발현 및 유전자형을 측정하여 수정률 및 형질 전환 병아리 생산 효율을 분석하였다.
(7) 이식 유전자 통합 부위의 PCR 분석 및 확인
야생형 (WT)과 MGSTII-tg 유전자좌를 구별하기 위해 특정 프라이머 세트를 사용하였다. 통합된 이식 유전자의 존부를 확인하기 위해 정방향 프라이머 (MGST F: 5'- CCACCATGGCAGGCAACAGC-3') 및 역방향 프라이머 (MGST R: 5'- CCGCTCAGAATTGCCGCCTC-3')를 사용하였다. 또한 유전체 DNA PCR은 GAPDH 프라이머 (F: 5'-GGTGGTGCTAAGCGTGTTAT-3', R: 5'-ACCTCTGCCATCTCTCCACA-3')를 대조군으로 사용하여 수행되었다. PCR은 100ng gDNA, 10x PCR 버퍼 (BioFACT), 10mM dNTP, 각 프라이머 5pmol, 0.5U Taq 중합효소 (BioFACT)가 포함된 총 부피 20ml로 이하 열순환 조건에서 수행되었다: 94 ℃에서 5분, 이후 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72 ℃에서 30초의 30주기, 그리고 마지막으로 72℃에서 10분.
이식 유전자 (piggyBac CMV GFP CMV MGSTII TK NeoR) 삽입 부위는 제조업체의 프로토콜에 따라 Genome Walker Kit (Takara)를 사용하여 확인되었다. 유전자-특이적 프라이머는 gDNA에서 유전자의 상류로 이동하기 위해 이식 유전자의 알려진 cDNA 서열로부터 설계되었다. gDNA는 어댑터와 결합된 4가지 제한 효소 (EcoRV, DraI, PvuII, SspI)로 분해되었고, PCR은 중합효소 믹스를 이용하여 수행되었다. PCR 산물은 아가 로스 겔에서 절제되어, Power Gel Extraction Kit (Promega)를 사용하여 정제한 다음 pGEM-T Easy Vector (Promega)에 클로닝했다. 클로닝된 PCR 산물은 ABI Prism 3730 XL DNA 분석기 (Applied Biosystems)으로 서열 분석되었다. 형질전환 닭 유전체에서 이식유전자의 통합 위치를 확인하기 위해, 59 측면 부위의 서열은 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 조립 유전체 데이터 베이스 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi) 및 UCSC Genome Bioinformatics 브라우저 (http: //www.genome.ucsc.edu)를 사용하여 분석되었다.
(8) 조직 면역 염색
야생형 닭의 성체 고환과 부설판-처리 또는 비처리 생식선 키메라 닭은 파라핀-포매 및 절편화하였다 (시리즈 절편, 10μm). 탈파라핀화한 후, 절편을 1x PBS로 3회 세척하고 블로킹 버퍼 (PBS에 5% 염소 혈청 및 1% BSA 포함)로 실온에서 1시간 동안 블로킹했다. 그 다음 절편을 토끼 항-GFP 1차 항체 (Invitrogen, 블로킹 버퍼에 1:200으로 희석)와 함께 4℃에서 밤새 배양했다. PBS로 3 회 세척한 후, 절편을 형광-결합된 2차 항체 (Alexa Fluor 594 또는 488, Invitrogen)와 함께 실온에서 1 시간 배양했다. PBS로 3번 세척한 후, 절편을 DAPI가 포함된 Prolong Gold antifade 시약으로 마운트하고 공초점 형광 현미경 (Carl Zeiss Inc)을 사용하여 이미지화했다.
(9) 통계적 분석
MGSTII PGC 및 WT PGC에 대한 부설판의 용량-의존적 효과를 분석하기 위해 양방향 ANOVA를 사용하여 통계적 유의성을 결정하였다. 일원 분산 분석법을 이용하여 부설 판 처리군과 비처리군의 유의한 차이를 확인하였다. P<0.05는 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었다 (***p <0.001, **p <0.01, *p <0.05).
2. 실험 결과
(1) MGST II 발현하는 닭 PGC 계통 및 부설판에 대한 시험관 내 내성 확립
MGSTII 발현 닭 PGC를 확립하기 위해, 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 및 닭화된 인간 MGSTII의 CMV 기반 발현을 위해 설계된 piggyBac 트랜스포존 벡터를 제조하였다. 그 후, 배양된 PGC는 piggyBac TK NeoR CMV GFP CMV MGSTII 및 트랜스포사제 (CAGG-PBase) 플라스미드로 형질 도입되었다 (도 1A).
형질 도입된 PGC (MGSTII-tg PGC)는 1개월 동안 G418 (300μg/mL) 배양 배지로 선별되었다 (도 1B). MGSTII-tg PGC는 WT PGC 대비 강력한 GFP 형광을 보였고, 특이적으로 MGSTII 유전자를 발현한다 (도 1C).
MGSTII-tg PGC에서 부설판 내성을 분석하기 위해 세포 생존력에 대한 부설판 처리의 시간 및 용량 의존적 효과를 분석하였다. WT 및 MGSTII-tg PGC 증식에 대한 부설판의 효과는 다양한 농도의 부 술판에 48 시간 노출시킨 후 WST-1 분석을 이용하여 조사되었다. 1 μM, 2 μM 및 4 μM 부설판 처리된 세포에서 MGSTII-tg PGC의 증식 속도는 WT PGC의 증식 속도보다 현저히 높았다 (도 1D).
배양된 PGC에서 1μM 및 2μM 부설판 노출은 MGSII-tg PGC에 비해 WT PGC에서 세포수를 감소시켰지만 8μM 부설판은 두 유전자형 모두에서 PGC의 수를 감소시켰다 (도 1E).
이러한 결과는 MGSTII-tg PGC이 부설판에 대한 내성이 증가되었고, 따라서 MGSTII 과발현이 부설판에 대한 내성을 부여함을 시사한다.
(2) 부설판이 PGC 이동에 미치는 영향
후속 연구에서, 혈류 내 및 생식능선으로 이동하는 PGC에 대한 부설판의 효과를 조사하였다. 조류 PGC는 HH 13-16 동안 배아 혈관을 통해 순환하고 HH 28까지 생식선으로 이동한다. 따라서 배아 PGC에 대한 부설판의 효과를 평가하기 위해 1 μM 및 2 μM의 부설판을 HH 13-16 단계에서 배아 혈관에 주입했다.
배아 5.5 일 (HH 28)에, 대조군 및 부설판을 처리한 배아로부터 전체 생식선을 채취했으며, 생식세포 분포를 확인하기 위해 DAZL 면역 염색이 수행되었다. 대조군 생식선 (DMSO 비히클 대조군이 주입된 동물)에서 DAZL+ PGC는 전체 생식선에 분산되었지만 DAZL+ PGC는 1μM 및 2μM 부설판 처리군의 생식선에서 완전히 제거되었다 (도 2A).
배아 단계에서 부설판 내성을 평가하기 위해 부설판에 노출된 MGSTII-tg PGC를 사용하여 생체 내 이동 분석을 추가로 수행했다. 약 1,000 개의 GFP-tg PGC 또는 MGSTII-tg PGC은 1μM 부설판이 있거나 부설판이 없는 상태에서 수여자 HH13-16 배아의 혈류에 주입되었다.
처리되지 않은 PGC에서, PGC의 수는 GFP-tg PGC가 주입된 수여자 배아와 MGSTII-tg PGC가 주입된 배아에서 HH 28의 전체 배아 생식선에서 유사했다 (도 2B). 그러나, 부설판 처리 배아에서 이동된 PGC의 수는 MGSTII-tg PGC가 주입된 배아에 비해 GFP-tg PGC가 주입된 배아에서 극적으로 감소했다 (도 2B).
1μM 부설판을 처리한 MGSTII-tg PGC (174±24.45)를 주입한 배아의 왼쪽 생식선에서 이동된 생식선 PGC의 평균 수는 1μM 부설판을 처리한 GFP-tg PGC (9±7.54)를 주입한 배아뿐만 아니라, 처리되지 않은 GFP-tg PGC (88±20.59) 및 처리되지 않은 MGSTII-tg PGC (112.67±32.47)가 주입된 배아보다 보다 현저하게 높았다.
유사하게, 부설판 처리된 MGSTII-tg PGC (161±33.08)가 주입된 배아의 오른쪽 생식선에서 이동된 세포의 평균 수 역시 다른 그룹보다 유의하게 높았다 (처리되지 않은 GFP-tg PGC: 82±24.06), 처리되지 않은 MGSTII-tg PGC: 58±24.02, 부설판 처리된 GFP-tg PGC: 4.3±3.21) (도 2C). 이러한 결과는 생체 내 이동 활성에 의해 입증된 바와 같이 생체 내에서 MGSTII-tg PGC가 부설판에 내성이 있음을 시사한다.
(3) MGSTII 형질전환 닭의 생산 및 게놈 통합부위의 검출
hMGSTII 발현 형질전환 닭을 생산하기 위해 배양된 MGSTII-tg PGC를 HH 13-16 한국 오계 (KO) 닭 배아에 주입했다. 성 성숙 이후, 생식선 키메라 닭의 정자를 화이트 레그혼 (WL) 암탉을 인공 수정하는 데 사용했다. 두 생식선 키메라 (M0398 및 M0412)에서 공여자 MGSTII-tg PGC 유래 병아리의 효율은 각각 79.74%, 75.61%였다 (표 1). 공여자 유래 자손 중에서 형질전환 병아리는 GFP 발현을 통해 검증되었으며, 이는 비 형질전환 병아리에는 없었다 (도 3A).
GFP 발현 및 이식유전자 게놈 PCR의 분석을 수행하여 공여자 생식 세포 유래 병아리의 약 절반이 형질전환임을 확인했다 (M0398: 33/63마리, 52.38 %, M0412: 14/31마리, 45.16 %) (도 3B, 표 1)
G1 형질전환 닭에서 GFP 발현은 형질전환 수컷 (TG 0276) 1마리와 형질전환 암컷 (TG 0235) 1마리에서 측정되었으며, 성 성숙까지 강력한 GFP 발현이 검출되었다 (도 3C). 후속 분석에서, 유전체 워킹 분석에 의해 유전체 이식유전자 통합 부위가 확인되었다.
PiggyBac TK NeoR CMV GFP CMV MGSTII 이식유전자는 TG0276에서 염색체 14의 유전자간 영역과 TG0285에서 염색체 4의 유전자간 영역으로 통합되었다 (도 3D). 두 유전자 모두 보존된 TTAA 서열을 가지고 있으며, 여기서 PiggyBac 트랜스포존은 트랜스포사제에 의해 삽입될 수 있다.
(4) 부설판 처리후 형질전환 닭 생산률 향상
처리되지 않은 동물에서 공여자 유래 자손과 형질전환 닭 생산 비율을 평가한 후, 동일한 생식선 키메라 (M0398 및 M0412) 및 2개의 추가적인 생식선 키메라 (M0399 및 M0411)는 40mg/kg 부설판의 단일 복강 내 주입을 받았다. 부설판-처리 생신선 키메라는 동물 번호 앞에 "B"를 배치하여 지정했다 (예: B0398, B0399, B0411 및 B0412).
고환에서 GFP+ 생식 세포의 분포를 확인하기 위해 생식선 키메라 야생형 및 처리되지 않은 대조군 고환의 10μm 파라핀 절편은 이식된 형질전환 생식세포의 마커로서 GFP 면역염색 후 형광현미경으로 검사했다 (도 4A-C). 야생형 고환에서 GFP+ 세포는 관찰되지 않았지만 (도 4A), 부설판으로 처리되지 않은 생식선 키메라의 고환에서는 GFP+ 생식세포가 정세관의 기저 근처에 드물게 분산되어 있었다 (도 4B). 놀랍게도, 부설판 처리된 생식선 키메라의 고환에서 GFP+ 생식세포의 분포는 처리되지 않은 대조군 및 WT 고환에 비해 현저하게 증가되었다 (도 4C).
형질전환 자손 생산 효율의 증가를 확인하기 위해 부설판 처리된 생식선 키메라는 암컷 WL 닭의 수정에 의해 시험 교배되었다. 예기치 않게, 부설판 비 처리군 (B0398, B0412)에 사용된 동일한 생식선에서 모든 부설판-처리 생식선 키메라는 비처리 대조군 (70.69-94.05%)에 비해 감소된 부화율을 보였다 (35.59-45.31%) (표 1, 표 2, 도 4D).
대조군 대비 부설판 처리군에서 공여자 유래 자손 생산의 더 높은 효율성에도 불구하고 (각각 94.68%, 78.33%), 이 상관관계는 통계적으로 유의하지 않았다 (표 1, 표 2, 도 4E). 그러나, 부설판 처리군 (80.95%)에서 형질전환 닭 생산율은 비 처리군 (45.16%)에 비해 크게 향상되었다 (표 1, 표 2, 도 4F). 특히, 동일한 생식선 키메라 수탉에서도 부설판 처리에 의해 형질전환 닭 생산 효율이 크게 향상되었다. 형질전환 닭 생산 효율은 M0398에서 52.38 %에서 95.23 %, M0412에서 45.16 %에서 80.95%로 부설판 처리에 의해 크게 향상되었다.
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Claims (8)

  1. 동물의 생식세포에 목적 유전자 및 MGST2 (Microsomal Glutathione S-Transferase 2) 유전자를 도입하는 단계;
    상기 유전자가 도입된 생식세포를 선별하는 단계;
    상기 선별된 생식세포를 배아에 주입하여 생식선 키메라를 생산하는 단계;
    상기 생식선 키메라의 성체에 부설판을 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 피하 또는 피내 처리하는 단계; 및
    상기 부설판 처리된 생식선 키메라를 동물과 교배시키는 단계;를 포함하는 형질전환 비인간 동물의 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 동물은 조류인 형질전환 비인간 동물의 제조 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 조류는 닭, 메추리, 꿩, 칠면조, 오리로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 형질전환 비인간 동물의 제조 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 목적 유전자 및 MGST2 유전자는 하나의 벡터에 포함된 것인 형질전환 비인간 동물의 제조 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 MGST2는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 것인 형질전환 비인간 동물의 제조 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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