CN113226021B - 经遗传修饰的禽及其重构方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开了转基因构建体、使用其的方法及通过此类方法提供的转基因禽，所述转基因构建体包含(i)第一核苷酸序列，其中由所述第一核苷酸序列编码的蛋白质的活性在外源诱导剂的存在下导致生殖细胞死亡，和(ii)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列将所述构建体靶向禽生殖细胞。
Description
技术领域
本发明涉及用于从生殖细胞产生经遗传修饰的和/或野生型禽(例如鸡)的方法、以及使用此类方法产生的禽。
背景技术
从分离的生殖细胞生产禽品种目前是一个在很大程度上效率低下且困难的方法。一个与经遗传修饰的禽的产生相关的具体问题是含有遗传修饰的生殖细胞稳定地传递到禽的后代和此类禽的后续世代中。特别地，当使用常规方法时，生殖细胞的传递效率特别低下，这是供体生殖细胞((可能经遗传修饰或可能未经遗传修饰))与内源性生殖细胞在形成功能性配子方面竞争的结果。
尽管二倍体生殖细胞可以从一种禽移植到宿主禽中，但是由后续形成的配子产生的后代的比例是可变的，一些或所有后代是由源自内源性((宿主鸟))生殖细胞的配子形成的(Nakamura等(2010)Reprod Fert Dev 22(8):1237-1246；Song等(2014)Biol Reprod 90(1):15)。内源性(宿主)生殖细胞可以使用辐射或化疗试剂(例如busulphan)破坏，但是这些毒性试剂也可以杀伤动物以及内源性生殖细胞。Tagami使用化学处理来产生无菌替代宿主鸡(Nakamura等(2010)Biol Reprod 83(1):130-7)。本发明人和Nakamura使用γ辐射杀伤内源性生殖细胞(MacDonald等(2010)Plos One5(11):e15518；Nakamura等,(2012)J Reprod Dev 58(4):432-437)。然而，尽管处理后由供体生殖细胞产生的后代数量增加，但是不是所有后代源自供体生殖细胞，并且该处理杀伤了许多宿主鸡。
已经制备了无菌哺乳动物和鱼转基因系，其在生殖细胞中表达基因产物(硝基还原酶，Ntr)，该基因产物在前药的存在下杀伤生殖细胞。iC9(诱导型caspase9)基因已用于杀伤人和小鼠的干细胞，并且用于杀伤转基因小鼠的内皮细胞。鉴于当应用于哺乳动物和禽时使用生殖细胞修饰技术获得的结果不同，预期此类技术不会直接转移到禽。例如，本发明人先前的工作已经通过基因编辑技术经由DDX4基因的遗传突变产生了不具有生殖细胞的雌性鸡。(Taylor等,Development 2017)。本发明人没有预期到雌性鸡是不育的，因为虽然具有突变型Ddx4基因的雄性哺乳动物是不育的，但是具有突变型Ddx4的雌性哺乳动物具有正常的生育力。因此，生殖细胞修饰技术对哺乳动物的影响可能与对禽的影响非常不同。不育还取决于发育期间内源性生殖细胞何时死亡。在禽中，DDX4不育雌性包含直至孵化的生殖细胞，该生殖细胞可以与注射到经基因修饰的宿主胚胎中的供体生殖细胞竞争。
发明内容
本发明解决了现有技术的许多问题。本发明人已经令人惊讶地表明，通过采用基因工程在生殖细胞中表达重组蛋白(其将根据需要选择性地杀伤宿主生殖细胞，例如在暴露于特定的前药或诱导剂时，而不杀伤宿主鸡中的其他细胞)可以实现供体生殖细胞的高效整合。来自不同禽物种的种质(生殖细胞)可以转移到该宿主禽，并且后代的遗传源自转移的材料(图1)
虽然已经制备了表达基因产物的无菌哺乳动物和鱼转基因系，但是禽和哺乳动物物种的蛋白质活性和功能的差异以及禽与哺乳动物物种之间的基因功能和活性的差异意味着，不能预期在哺乳动物和鱼中使用的技术可转移到禽，并且因此细胞修饰技术在禽中可能具有与在哺乳动物中非常不同的效果。不育还取决于发育期间内源性生殖细胞何时死亡(基因或蛋白质活性的时间性质)。必须在禽中测定许多不同的基因座，以确定它们是否在适当的发育阶段表达转基因，即生殖细胞在胚胎发育期间是否可以100％消融。
因此，本发明的第一方面提供了在所述禽的生殖细胞中包含转基因的转基因禽，其中由所述转基因编码的蛋白质的活性通过外源诱导剂是可诱导的，并且当被诱导时，所述蛋白质的活性导致所述生殖细胞死亡。
本发明的第二方面提供了一种转基因构建体，其包含(i)第一核苷酸序列，其中由所述第一核苷酸序列编码的蛋白质的活性在外源诱导剂的存在下导致生殖细胞死亡，和(ii)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列将所述构建体靶向禽生殖细胞。
第三方面提供了用于修饰禽种质的方法，所述方法包括将转基因构建体施用到所述禽的受精卵中，并孵育所述卵，其中所述转基因构建体是本发明第二方面所述的转基因构建体，并且其中所述转基因构建体整合到所述胚胎的生殖细胞中。
本发明的第四方面提供了包含本发明第二方面所述的转基因构建体或通过根据本发明第三方面所述的方法产生的转基因禽。
在本发明中，禽可以是任何合适的禽。例如，禽可以是鸡形目、鸭形目、雀形目、鹤形目、鹤鸵目、美洲鸵鸟目、鹤鸵目、无翼鸟目、鸨形目、鸽形目、企鹅目、美洲鹫目、鹰形目、鸮形目、鹦形目、鸻形目或鹰形目。适当地，禽是鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、野鸡、松鸡、珍珠鸡、鸽、鸵鸟、鸸鹋、鸣禽、鹦鹉、雀、麻雀、企鹅或猎鹰。在一个实施方案中，禽是鸡。
在本发明中，本发明的转基因构建体和用于本发明的转基因构建体靶向生殖细胞。在一个实施方案中，生殖细胞是原始生殖细胞。在另一个实施方案中，生殖细胞是成年生殖细胞。优选地，所述构建体靶向禽基因组的位点，该位点优先在胚胎性腺的原始生殖细胞或生殖细胞中或在成年禽的睾丸和卵巢中表达。优选地，该位点仅在胚胎性腺或成年禽的的原始生殖细胞或生殖细胞中表达。在一个实施方案中，转基因构建体靶向在禽中仅在生殖细胞中表达的以下位点之一：DAZL、DDX4、DMRT1、MIR383、TDRD15、TDRD5、FKB6、GASZ、DMRTB1、TDRD9、GTSF1、MOV10L1、STK31、RNF17、FDFT1、GNG10、DDX43、KCNH7、SOX21 TUBA1B或PNLDC1。在另一个实施方案中，所述构建体靶向一个或更多个以下RNA编码基因：MSTRG.9846(2:40789480-40848190)、MSTRG.10457(2:71880785-71991485)、MSTRG.17017(3:85453009-8546029)。适当地，该转基因构建体靶向以下位点之一：DAZL、RNF17、TUBA1B、TUBA1C、STK31、FDFT1、gga-mir-6611.有利地，该转基因靶向在鸡PGC中最高度表达的位点。有利地，该转基因靶向在特定禽PGC(例如鹅、鸭等)中最高度表达的位点。
禽物种之间原始生殖细胞RNA转录组的比较确定了大多数禽物种生殖细胞中高水平表达的基因。该分析发现，DAZL是大多数禽中最高的，GTSF1是鹅的第二高，TDRD9是鸭生殖细胞的第二高。因此，不同的基因组位置可能在特定禽物种中更好地起作用。图21分别示出了在鸡、鸭和鹅中的表达水平。
适当地，将转基因靶向在禽生长和生殖周期中在正确时间表达的位点，以允许禽和禽生殖系统的发育，但是将供体和宿主生殖细胞的竞争最小化。例如，在这些实施方案中，本发明人确定，由于所提供表达的时间性质，DDX4不育雌性包含可以与供体生殖细胞竞争直至孵化的生殖细胞。生殖细胞只在孵化后死亡。如所理解的，允许表达直到应用外源试剂、通过提供外源试剂调节表达的能力和考虑表达的时间性质的能力可以提供更有利的系统，即简单敲除宿主中的生殖基因。
适当地，可以选择细胞死亡消融基因及其靶向的位点，以根据需要在胚胎发育期间消融生殖细胞。
细胞死亡消融转基因必须具有足够的活性，以在胚胎发育期间消融大多数生殖细胞。DDX4可以选择作为鸡dazl位点的第二选择。如所理解的，提供具有增加的细胞凋亡活性的细胞消融转基因可以克服使用硝基还原酶指示的消融的缺陷。例如，iCaspase9的增强活性允许使用DDX4位点。如本领域技术人员将理解的，筛选试验可以用于鉴定提供消融或潜在消融的蛋白质(Caspase9或硝基还原酶或任何其他细胞死亡诱导基因)中的氨基酸变化，并且筛选用于使此类蛋白质具有足够的活性或更有活性以在功能上有用水平/以增加的效率提供生殖细胞的消融。随后，可以将此类蛋白质引入任何所列的生殖细胞特异性位点。
在一些实施方案中，发现caspase 9基因(哺乳动物氨基酸型或鸡化氨基酸型(aviCaspase9))特别有利于赋予宿主细胞消融。如实施例中所示的，确定了当引入鸡细胞的DDX4位点时，当在细胞培养物中提供时，aviCaspase9不消融所有生殖细胞。
适当地，当靶向DAZL位点时，可以提供哺乳动物氨基酸Caspase9转基因以消融生殖细胞。适当地，消融提供基本上产生纯供体后代，例如大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于97％、大于99％、100％。适当地，iCaspase9可用于鸡用以进行无菌消融。确定了iCaspase9基因，以在用于的鸡中提供完全无菌消融(图23)。
在一个特定的实施方案中，转基因可以是靶向禽DAZL位点，特别是禽DAZL基因座的c-末端的cDNA。本发明人已经确定，不仅DAZL在原始生殖细胞中以高水平表达并且因此允许选择性地消融细胞，其还提供毒性蛋白的足够表达以提供消融。此外，本发明人已经确定，除了基因座提供的表达水平之外，表达的时间(表达的时间性质)也很重要。DAZL在禽胚胎的原始生殖细胞中早期表达。因此，DAZL的时间表达也有利于其用于毒性蛋白或细胞凋亡诱导蛋白的表达。适当地，在DAZL控制下的iCaspase9是特别有利的。例如，本发明人确定iCaspase9转基因在鸡的DAZL位点中功能良好。
当考虑毒性蛋白或凋亡诱导蛋白(例如，Caspase)的表达时，构建体提供的表达水平和表达时间被认为是重要的，这与其中基因座的破坏可能足够的敲除的使用相反。通过转基因产生的消融程度可以通过转基因的遗传位置改变，例如插入基因的5’端或插入基因的3’端，或作为独立的转基因，其表达由仅在禽生殖细胞中表达的基因的调节区域驱动。
如本文所述，本发明的转基因构建体和用于本发明的转基因构建体包含第一核苷酸序列，由其表达的蛋白质在外源诱导剂的存在下导致生殖细胞死亡。在一些实施方案中，转基因编码其活性或表达可通过外源诱导剂诱导的蛋白质，其中所表达的蛋白质在外源诱导剂的存在下导致所述生殖细胞死亡。
适当地，转基因可以包含编码诱导型二聚化结构域和凋亡诱导结构域的部分。适当地，诱导性二聚化结构域可以是化学诱导性二聚化结构域。在二聚化诱导剂，例如二聚化诱导性化合物的存在下，所表达的蛋白质二聚体导致内源性生殖细胞的凋亡。
在本发明中，可以使用任何合适的细胞凋亡诱导结构域。在一个实施方案中，细胞凋亡诱导结构域包含编码Caspase蛋白的Caspase基因或由其组成。此类Caspase蛋白是Caspase2、3、4、6、7、8、9或10.。此种Caspase蛋白可以含有哺乳动物或禽或其他脊椎动物的氨基酸序列。在一个实施方案中，Caspase是Caspase9。
因此，适当地，可诱导的Caspase9(iC9)基因可在禽(例如鸡)的生殖细胞中表达。当暴露于化学诱导的二聚化(CID)药物时，Caspase9二聚化并被激活，然后导致含有二聚化Caspase9的生殖细胞凋亡。
适当地，所述Caspase基因的表达可以通过经由诱导二聚化的二聚化结构域应用二聚化剂来诱导。可用于本发明的合适二聚化试剂包括AP20187配体(分子B/B，Takara)或该产物的化学变体FK1012、AP1501、AP1903。
在一个此种实施方案中，转基因是编码FKBP12二聚化结构域的cDNA和Caspase9基因，该Caspase9基因靶向选自鸡中的DAZL或DDX4，特别是DAZL或DDX4的基因位点。
在另一个实施方案中，所述转基因可以编码与细胞凋亡诱导结构域融合的二聚化结构域，例如在递送二聚化稳定药物后将导致编码蛋白质二聚化的Caspase基因。例如，转基因可以编码与Caspase分子附接的可稳定多肽接头(SPL)。添加像Asunaprevir和Telaprevir的化合物将Caspase分子的二聚化结构域稳定，导致Caspase分子的激活和细胞死亡的激活(Jacobs等(2018)Nature Methods 15:523-526)
在一个替代的实施方案中，转基因可以编码将前药转化为细胞毒性代谢物的酶。在这样的实例中，可以将前药(其充当外源诱导剂)提供给内源生殖细胞，并且转基因(例如编码细菌硝基还原酶基因的cDNA)的表达可以提供将前药转化为细胞毒性代谢物的酶。
在这样的系统中，可以使用任何合适的酶和通过所述酶激活的前药。例如，如果酶是硝基还原酶，则前药可以是CB1954或甲硝唑。
在一个此种实施方案中，转基因是编码硝基还原酶基因的cDNA，该基因靶向选自鸡的DAZL或DDX4，特别是DAZL或DDX4的基因位点。
在一个实施方案中，本发明的转基因构建体和用于本发明的转基因构建体包含cDNA和2A或IRES序列，使得重组蛋白以与内源基因相等的水平表达。例如，可以将2A肽序列连接到cDNA，以使重组蛋白以与内源基因相等的水平表达。
在一个实施方案中，来自在禽中仅在生殖细胞(germ cell或reproductive cell)中表达的位点(上文给出了此种位点的实例，包括DAZL和DDX4)的核苷酸序列连接到cDNA，其中所述核苷酸序列包含调节区域和直到第一编码甲硫氨酸的第一外显子。DNA的该区域可以以任何合适的方式引入禽中，这种方式将在生殖细胞中特异性表达重组蛋白，例如在转座子中。
本发明的和用于本发明的DAZL和DDX4修复模板的实例在图15、16、17和18中示出。此类修复模板构成本发明的另外的独立方面。
在本发明的方法中，可以采用任何合适的手段将转基因构建体靶向生殖细胞。适当地，基于CRISPR的系统，例如CRISPR/cas系统或基于CRISPR/cfp的系统可用于将转基因靶向生殖细胞。在此种系统中，向导RNA可以将构建体靶向生殖细胞。
根据本发明的另一方面，提供了一种试剂盒，其包含根据本发明的第二方面的转基因构建体和位点特异性核酸酶，例如Cas9，以将构建体靶向在生殖细胞中特异性转录的基因位点。
在用于将转基因构建体靶向生殖细胞的基于CRISPR的系统的替代实施方案中，基于转座子的系统可用于将转基因构建体靶向生殖细胞。在此种系统中，可以通过在转座子内并入以下项来实现靶向：(i)来自在生殖细胞中优先表达、优选仅表达的基因的调节区域以及(ii)所述第一核苷酸序列。例如，此种转座子可以包含DDX4或DAZL的调节区域、Caspase9基因和二聚化结构域(适当地，DAZL和icaspase9)。预期第一核苷酸序列仅在生殖细胞中表达。因此，在应用外源诱导剂时，预期仅杀伤生殖细胞。
本发明第二方面的转基因构建体可用于修饰禽的种质。通过将转基因构建体靶向生殖细胞并施用诱导剂，转基因被激活，使得它可以选择性地杀伤内源性生殖细胞。适当地，生殖细胞的转基因的激活导致生殖细胞数量从正常值减少至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少70％、至少90％、最高达100％。适当地，该方法提供了缺乏内源性生殖细胞的禽。
适当地，当被诱导时，转基因可以在外源诱导剂的存在下以足以导致生殖细胞在体外培养时死亡的水平表达。
在通过例如以下方式杀伤内源性生殖细胞：激活由细胞凋亡诱导结构域编码的蛋白质或通过转基因编码的酶将前药转化为细胞毒性代谢物之后或期间，可以向缺乏生殖细胞的禽(宿主禽)提供细胞(移植细胞)，例如来自相同或不同禽物种的另一种禽的生殖细胞，使得宿主禽产生具有移植细胞的遗传的后代。适当地，该方法可以包括将来自供体禽的生殖细胞移植到替代禽中的步骤。
适当地，可以在移植供体细胞之前停止诱导由转基因编码的蛋白质的活性。
适当地，来自供体禽的移植细胞可以源自冷冻细胞。
如所理解的，由于转基因的作用，从供体禽移植到替代宿主中的生殖细胞将具有增加的与存在于替代宿主中的内源性生殖细胞竞争的机会。
适当地，移植细胞可以是基因编辑的生殖细胞。适当地，基因编辑的生殖细胞可以来自与宿主禽相同或不同的禽物种。
适当地，该方法可以包括向禽提供移植细胞的基因组的步骤。适当地，替代宿主禽可用于从来自该禽物种或来自另一种禽物种的基因编辑的生殖细胞产生多个例如一群基因编辑的禽。
在本发明的一个方面，提供了一种用于产生替代宿主禽的方法，所述方法包括将转基因构建体插入禽的受精卵中，并将所述卵孵育至孵化，其中所述转基因构建体被整合到所述胚胎的生殖细胞中，并且在外源诱导剂的存在下，由所述转基因构建体表达的蛋白质导致所述生殖细胞死亡。该方法使得所述转基因构建体不仅整合到所述胚胎的生殖细胞中，而且整合到后续由所述胚胎产生的禽产生的所有后代的生殖细胞中。
适当地，该方法还可以包括处理用外源诱导剂产生的替代宿主以导致所述内源性生殖细胞死亡。适当地，该方法还包括将外源性生殖细胞移植到所述替代宿主中。
适当地，该方法还包括使来自一种或更多种所述替代宿主禽的雄性和雌性后代杂交，以产生具有所移植的生殖细胞的遗传特征的生殖细胞的后代禽。来自所移植的生殖细胞的后代的检测可以通过标准基因组测序技术进行鉴定。
替代宿主禽可用于移植细胞，特别是来自其他禽物种的生殖细胞。生殖细胞可以是原始生殖细胞、胚胎生殖细胞、生殖母细胞。生殖细胞可以通过移植成年睾丸或卵巢进行移植。替代宿主禽产生具有移植细胞的遗传的后代。
替代宿主禽可用于从以生殖细胞形式储存的冷冻遗传物质中复苏禽物种。复活的禽物种具有冷冻生殖细胞的基因组。
附图说明
现在将参考附图仅以示例的方式描述本发明的实施方案，其中:
图1生殖细胞移植到无菌宿主中的示意图。
图2显示NTR和iCaspase9(iC9)靶向DDX4位点的示意图。靶向DDX4位点的NTR修复模板和靶向DDX4位点的ic9修复模板。
图3显示NTR和iCaspase9(iC9)靶向DAZL位点的示意图。靶向DAZL位点的NTR修复模板和靶向DAZL位点的ic9修复模板。
图4靶向DAZL位点的PGC表达的GFP量为靶向DDX4位点的细胞的约4倍。靶向Dazl位点的含有GFP的PGC表达的GFP荧光比靶向Ddx4位点的含有GFP的PGC高3.8倍。A.GFP荧光的流式细胞术分析。B.靶向PGC的显微照片。
图5在存在或不存在硝基还原酶前药CB1954的情况下培养500个PGC(对照、CAG-NTR或Dazl-NTR)(每种浓度的前药n＝2)。10天后，计数每个孔的总细胞数。每个数据点N＝6，来自三个独立实验。
图6在存在或不存在二聚化分子B/B的情况下培养500个PGC(dazl-GFP、dazl-人-Caspase或dazl-鸡-Caspase)。10天后，计数每个孔的总细胞数。每个数据点N＝6，来自三个独立实验。
图7B/B处理消融了注射的DAZL-iCasp9靶向PGC。HH 16期胚胎注射3500个用CRISPR试剂转染的PGC以在dazl位点插入诱导型Caspase基因和GFP、和3500个用转座子转染的PGC以在基因组中随机插入Td番茄表达盒。在注射后，用50μl 1x Pen/Strep(含或不含25nM二聚体药物B/B)对胚胎给药。在发育第8天，解剖性腺并在荧光下观察。图像代表了每种治疗的三次独立注射。
图8七种iCaspase 9和aviCaspase 9靶向G1后代
将Dazl iCaspase9、Dazl aviCaspase9(鸡)注射到来自DDX4杂合雄性与雌性野生型鸡杂交的可育卵中。将3000个PGC注射到窗口期16HH期胚胎中，将卵密封并孵育至孵化。这些起始鸡的育种已经产生了七个含有靶转基因的转基因G1后代。这里所示的阳性后代是标记42、4、18。用Caspase9特异性引物(MW，分子量标志物)进行PCR A.含有aviCaspase9的靶向PGC。B.含有iCaspase9的靶向PGC。B.使用GFP特异性引物进行PCR。
图9在第6天和第10天的iCaspas9和aviCaspase9 G2胚胎中的GFP表达。
对iCaspase9和aviCaspase9基因PCR呈阳性的G2胚胎进行GFP荧光成像。
图10在第10天的iCaspas9和aviCaspase9 G2胚胎中，GFP表达具有生殖细胞特异性。左侧面板：经B/B注射的iCaspase9和aviCaspase9胚胎中的GFP荧光。右侧面板：DDX4蛋白的免疫荧光(红色)。
图11经B/B处理的iCaspase9和aviCaspase9 G2胚胎无生殖细胞。
将B/B注射至16期鸡胚胎背主动脉(第2.5天)。孵育胚胎，并在第10天检查GFP荧光和DDX4表达。左侧面板：在经B/B注射的iCaspase9和aviCaspase9胚胎中的GFP荧光。右侧面板：DDX4蛋白的免疫荧光(红色)。
图12B/B药物处理aviCaspase9转基因胚胎消融了宿主生殖细胞，并允许所移植的供体细胞占据宿主性腺。向含有靶向DAZL位点的aviCaspase9转基因的HH 16期胚胎注射200个用转座子转染的供体PGC，以在基因组中随机插入用于Td番茄表达的盒。注射细胞在1μl含有0.5mM(最终浓度)B/B二聚化药物的溶液中。在注射后，向卵中添加50μl含有15M(最终浓度)B/B二聚体药物的1x Pen/Strep，并孵育8天。在发育10天时，解剖性腺并在荧光下观察。在经aviCaspase9二聚化药物处理的胚胎中，所有生殖细胞来自Td番茄供体细胞，未检测到内源性(宿主)生殖细胞。
图13合成用于人iCaspase9转基因的DNA。
图14合成用于鸡iCaspase9转基因的DNA。
图15含有鸡优化硝基还原酶基因的DDX修复模板的DNA序列。
图16含有鸡aviCaspase9的DAZL修复模板的DNA序列。
图17含有人iCaspase9的DAZL修复模板的DNA序列。
图18含有人iCaspase9的DDX4修复模板的DNA序列。
图19鸡优化硝基还原酶基因的DNA——该表顶行列出了大肠杆菌Ntr和密码子优化Ntr序列中存在的每个氨基酸的单字母氨基酸代码。表中的第二行列出了大肠杆菌Ntr序列的碱基序列，第三行突出了当优化鸡Ntr基因时所发生的变化。突出显示的列表明已经为产生3AAS Ntr构建体进行的三个突变的位置：密码子41处的苏氨酸已经突变为谷氨酰胺(CAG)；密码子71位处的天冬酰胺已经突变为丝氨酸(AGC)，并且密码子124位处的苯丙氨酸突变为苏氨酸(ACC)。
图20显示了鸡原始生殖细胞的RNA转录组与其他鸡胚胎组织和多能细胞的比较的表，以鉴定仅在生殖细胞中表达并在这些胚胎阶段处于高水平的基因。ESC是鸡胚胎干细胞，EGKX是来自产卵期鸡胚胎的细胞，Non-pluri是66个成年鸡非多能组织和细胞系的汇编。
图21禽PGC中生殖细胞特异性基因的表达。该图显示了鸡、鹅和鸭PGC中生殖细胞特异性基因的相对基因表达。标准化表达值的平均值从DESeq2包获得。这些表达值被标准化为所有样品的读取总数。读取到TDRD9和TUBA1B在鸭PGC中表达较高，GASZ和RNF17在鹅PGC中表达较高，兵器呢其余基因在PGC鸡中表达较高。
图22在存在或不存在二聚化分子B/B的情况下培养500个PGC(dazl-GFP、dazl-iCaspase、dazl-aviCaspase、ddx4-iCaspase9)。10天后，计数每个孔的总细胞数。每个数据点N＝2。
图23显示了caspase9宿主消融的使用，使用将黑色皮肤乌骨鸡供体PGC注射至iCaspase9替代宿主胚胎中，将其孵化和繁殖以产生纯后代。A)Dazl-icaspas 9替代物的后代(胚胎)不含GFP转基因，表明大多数宿主生殖细胞不产生后代(如果未消融，内源性生殖细胞的50％的后代应该是GFP+)。Dazl-aviCaspase9替代物的两个后代含有GFP转基因，表明一些后代源自内源性生殖细胞。(A-C)后代(胚胎和雏鸡)的皮肤呈黑色，表明它们来自供体生殖细胞。
发明详述
FK结合蛋白(FKBP)FKBP12属于受体的亲免疫蛋白家族，并且其氨基酸序列在哺乳动物和鸡之间高度保守(Yazawa等(2003)Comparative Biochem.Physiol: Mol.Integ.Physiol 136(2):391-399)。它是免疫抑制药物FK506的胞质受体，是通过蛋白质二聚作用选择性控制细胞信号传导的靶标。
Spencer和同事已经合成了二聚体FKBP12变体FK1012s，以通过细胞内蛋白质的二聚化或寡聚化介导对细胞信号传导的控制(Spencer等(1993)Science 262:1019-1024)。随后，通过用较小的缬氨酸残基(FKBP12F36V)取代体积较大的苯丙氨酸，在FKBP12中形成特异性结合袋。重新设计的FK1012配体，包括AP1903和密切相关的AP20187，被设计为对FKBP12F36V具有高亲和力和选择性，且与内源性FKBPs的相互作用最小(Clackson等(1998)PNAS95(18):10437-10442；
等(2002)Gene Ther 9(7):444-51)。
Caspase蛋白2、3、4、7、8、9或10是已知诱导程序性细胞死亡的天然存在的蛋白质。Caspase 9(Casp9)在二聚化时激活，并且导致细胞凋亡。Casp9可以被截短以去除其二聚化结构域(CARD)。通过将FKBP12F36V二聚化结构域与Casp9融合，可以在配体引入时选择性诱导细胞消融。该系统被称为诱导型caspase9(iCas9(iC9))系统。AP20187作为B/B同二聚体药物上市。这已经被用于提供诱导细胞消融的系统。该融合蛋白已经用于体外消除细胞(Carlotti等(2005)Cancer Gene Ther 12(7):627-39)。它还已经用于在小鼠、非洲蟾蜍属和斑马鱼中体内消除细胞(Mallet等(2002)Nat Biotechnol 20(12):1234-1239；Pajvani等(2005)Nat Med 11(7):797-803；Hamm等(2009)Invest Ophthalmol Vis Sci 50(2):885-92；Weber等(2016)Development143(22):4279-4287；Shimokawa(2017)Nature 11；545(7653):187-192)。
实施例1
通过用诱导型Caspase 9(iC9)转基因修饰鸡基因组来选择性消融鸡原始生殖细胞(PGC)。
用于产生经iCasp9转染的PGC的DNA构建体的制备
为了在PGCs中特异性表达诱导型Casp9，使用CRISPR/Cas9基因编辑来介导在以下位点中插入在PGCs中特异性表达的序列：
·DDX4：鸡vasa同源物，一种RNA解旋酶，通过DDX4位点在生殖细胞中特异性表达。将外源基因靶向插入DDX4起始密码子(ATG)，以实现相应蛋白质的生殖细胞特异性表达。
·DAZL：DAZL位点驱动RNA结合蛋白DAZL的表达。DAZL表达也是生殖细胞特异性的，并且已经被测量为比DDX4表达高至少10倍(Jean等.2014)。将外源cDNAs靶向插入DAZL位点的终止密码子(TGA)，以实现相应蛋白质的生殖细胞特异性表达。
靶向策略图在图2和图3中示出。
诱导型Caspase 9
质粒pMSCV-F-del Casp9.IRES GFP(https://www.addgene.org/15567/)由Spencer实验室保藏(Straathof等(2005)Blood 105(11):4247-54)，含有与截短的人Casp9融合的FKBP12F36V的cDNA序列(截短使得其二聚化结构域已经被去除以降低了基础活性)，HA标签与Casp9的C-末端融合。该DNA序列在此被称为iCasp9。
iCasp9序列是用化学方法合成的，具有前面的P2A序列，侧翼有BamH1限制性位点，序列内的BamH1位点通过密码子交换去除。在pMA载体中合成了BamH1位点侧翼iCasp9序列(人_iCasp9)。
此外，人iCasp9的Casp9结构域(NP_001220.2的氨基酸135-417)被置换为鸡Casp9蛋白序列(XP_424580.6的氨基酸169-450)的同源氨基酸区域，以产生鸡iCasp9序列。鸡iCasp9序列是用化学方法合成的，具有前面的P2A序列，侧翼有BamH1限制性位点，序列内的BamH1位点通过密码子交换去除。在pMA载体中合成了BamH1位点侧翼iCasp9序列(鸡_iCasp9)。该DNA序列在本文中被称为aviCasp9。
硝基还原酶转基因
硝基还原酶基因存在于某些细菌物种中，并且将某些化学化合物的硝基还原为细胞毒性代谢产物。来自大肠杆菌的硝基还原酶基因被密码子优化用于鸡表达。进行了三次氨基酸取代，这表明在前药底物CB1954的存在下产生了更高的比活性(参见图19)。
DDX4-GFP修复模板
DDX4修复模板最初使用Gibson克隆构建，其允许连接多个重叠的双链DNA片段。通过PCR(Invitrogen引物)或限制性消化(NEB酶)制备该质粒的片段。基因之间包含2A核糖体跳跃序列，以避免融合蛋白的翻译。这些2A肽在其氨基末端设计有GSG接头，其序列包含BamH1限制性切割位点，以允许插入额外的2A连接基因。
使用包含氨苄青霉素耐药性和多克隆位点(MCS)盒的pGEM-T(Promega)载体的序列制备主片段。3kbp pGEM-T序列，连同直至DDX4(左靶向臂)起始密码子的3kbp同源物，是从先前构建的DDX4靶向载体(HOMOL pGEM-T左臂和右臂ddx4+GFPpuropolyA)获得的，其中使用Xcm1和Nco1剪切掉6kbp片段，使用凝胶纯化进行纯化。
使用从鸡PGC(Y2细胞，源自从NARF获得的卵)制备的基因组DNA，通过PCR合成由来自DDX4起始密码子的1.5kbp同源物组成的右靶向臂。该反应的正向引物(CGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGGAGGAGGATTGGGATACCGAACTCGAGCAGGAGGCGGCAGCGGC，75bp)SEQ ID NO:7在CRISPR/Cas9靶向位点处包含T2A核糖体跳过和密码子交换的部分序列，因此修复模板不会被Cas9蛋白切割。该反应的反向引物(GAAATCCAGCTTCCAGTTCCCACCTGGCCAGACAAGGGGCTGCTTGG，47bp)SEQ ID NO:8包含20bp的pGEM-T载体序列的突出端以及在突出端后重新插入Xcm1切割位点的核苷酸。
DDX4修复模板的最终片段(800bp)包含eGFP序列，其再次通过PCR从先前构建的DDX4靶向载体HOMOL pGEM-T左臂和右臂ddx4+GFPpuropolyA合成。该反应的正向引物(GGTGGGCTGCTGGCATTCGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA，41bp)SEQ ID NO:9包含20bp的左靶向臂的突出端以及在突出端后重新插入Nco1切割位点的核苷酸。该反应的反向引物(GATTCTCCTCGACGTCACCGCATGTTAGCAGACTTCCTCTGCCCTCTCCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC，76bp)SEQ IDNO:10包含剩余的T2A序列加上20bp的右臂片段中的部分T2A序列的突出端。
为了连接这些片段，将100ng的主片段与等摩尔量的其他片段的混合物与GibsonHiFi DNA Assembly Master Mix酶(NEB)在50℃孵育1小时。用2μl连接的质粒转化XL-10Gold感受态细胞。通过限制消化验证了从转化细胞制备的小量制备物，并且制备了大量制备物。
最初使用Gibson克隆构建DAZL修复模板，其中通过PCR(IDT引物)或通过限制性消化(NEB酶)制备质粒片段。IDT可以合成长度>100bp的引物，这是这项工作必需的。还构建了修复模板，以包括鸡优化NTR基因，其产物可用于在引入前药时选择性消融细胞。
靶向模板的主片段是3BP pGEM-T序列，它是从上述DDX4-GFP修复模板获得的，其中使用Xcm1和Not1切割DNA。
使用从鸡PGC(Y2细胞)制备的基因组DNA，通过PCR合成了由直至(但不包括)DAZL终止密码子的1.5kbp的同源物组成的左靶向臂。该反应的正向引物(TCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTCTTCGTGGTT，67bp)SEQ ID NO:11包含25bp的pGEM-T载体序列的突出端以及在突出端后重新插入Not1切割位点的核苷酸。该反应的反向引物(AGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGGATCCAACACTTTTGAGCACTGCTCTT，48bp)SEQ ID NO:12包含25bp的P2A核糖体跳过序列的突出端。
第三片段(600bp)包含P2A序列，随后是NTR，其被使用BamH1从DDX4-GFP-NTR修复模板切割，又已经使用DDX4-GFP修复模板构建(用BamH1线性化，并且与包含P2A-NTR序列的插入物连接)。
第四片段(800bp)包含eGFP序列，其通过PCR从DDX4-GFP修复模板合成。该反应的正向引物
(CAGAACATCACCCTGACCGAGGTGGGATCCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA，107bp)SEQ ID NO:13包含25bp的NTR基因的突出端和T2A核糖体跳过的序列。该反应的反向引物(CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG，22bp)SEQ ID NO:14不含突出端。
DAZL-GFP靶向模板的第五且最后片段是右靶向臂，由来自(和包括)DAZL终止密码子的1.5kbp的同源物组成，其使用从鸡PGC(Y2细胞)制备的基因组DNA通过PCR合成。该反应的正向引物(TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGATGAACAAAGACTTTGAAGTACATAAATGTATTACTTTGATGTTAATACAGTTCAGTTTAGTAAGAT，94bp)SEQ ID NO:15包含25bp的eGFP基因的突出端和在相应的CRISPR/Cas9质粒的PAM位点处的突变。该反应的反向引物(CTCTTCGAAATCCAGCTTCCAGTTCCCACCTGGCAATACTATTAAAGCAATAGGT，55bp)SEQ ID NO:16包含25bp的pGEM-T载体序列的突出端以及在突出端后重新插入Xcm1切割位点的核苷酸。
为了连接这些片段，将100ng的主片段以及等摩尔量的其他片段的混合物用Gibson HiFi DNAAssembly Master Mix酶(NEB)在50℃下孵育2小时。用2μl连接的质粒转化XL-10Gold感受态细胞。通过限制消化验证了从转化细胞制备的小量制备物，并且制备了大量制备物。
使用BamH1从DAZL-GFP修复模板中切割出鸡优化NTR序列。使用BamH1从其各自的pMA载体切割人和鸡2A-iCasp9序列(iCasp9和aviCasp9)，并通过T7连接插入开放的DAZL-GFP修复模板。用2μl连接的质粒转化XL-10Gold感受态细胞。通过限制消化验证了从转化细胞制备的小量制备物，并且制备了用于DAZL-avi asp9-GFP(鸡)修复模板和DAZL-iCasp9-GFP(人)修复模板的大量制备物。
使用在crispr.mit.edu上可用的CRISPR设计工具查询150bp的DAZL位点终止密码子内的向导RNA(gRNA)序列。前5个评分导向(向导序列的前两个碱基被GG取代)的正向和反向寡核苷酸(IDT)是用Bbs1粘性末端合成的。通过PCR对寡核苷酸进行退火，并使用消化/连接PCR混合物连接至pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0(https://www.addgene.org/62988/)中。用2μl连接的质粒转化感受态细胞，并从转化的集落制备大量制备物。DAZL-PX459 maxi-prep质粒(#1-5)通过PCR使用导向插入切割位点(Bpi1)下游400bp处与PX459质粒互补的正向寡核苷酸和反向引物进行验证。
所有DNA序列在图13-19中示出。
转染方法
使用Lipofectamine 3000，用1μg DAZL-icasp 9-GFP修复模板(鸡或人)和1μgDAZL-PX459-4或-5转染约150,000个PGC。在于Lipofectamine溶液中5小时后，将PGC沉淀并重新悬浮于完全(FAOT)培养基中。24小时后，给予PGC新鲜培养基，向每个孔中添加2μl0.1mg/ml的嘌呤霉素溶液(最终浓度0.04g/ml)。将PGC用嘌呤霉素孵育48小时，洗涤一次，并重新悬浮于新鲜培养基中。细胞培养1-2周，达到200,000-400,000个细胞的群体，并然后使用FACS分选以成功收集经修饰的(GFP阳性)细胞。GFP阳性细胞是从用DAZL-PX459-4或DAZL-PX459-5转染的PGC获得的，尽管仅用DAZL-PX459-5转染的PGC用于制备鸡。
DAZL-PX459-4，包含以下向导序列：ggtcctattccaggagga SEQ ID NO:17。该导向的PAM位点位于基因组的正向链上，DAZL位点终止密码子上游44bp。
DAZL-PX459-5，包含作为其向导序列：GGCTTACTAAACTGAACTGTSEQ ID NO:18。该导向的PAM位点位于基因组的反向链上，DAZL位点终止密码子下游46bp。虽然DAZL-PX459-5中的导向的PAM位点序列在最终DAZL-iCasp9-GFP修复模板的同源臂中发生突变，但是应注意，DAZL-PX459-4中的导向的PAM位点序列未发生突变。
培养PGCs三周，以选择稳定靶向GFP表达构建体的细胞。使用GFP荧光门控的FACS-ARIA，通过流式细胞术将用ddx4_GFP和dazl_GFP靶向的雌性PGC纯化。将纯化的细胞在培养物中在数量上扩增，通过流式细胞术分析以定量GFP荧光水平。GFP靶向DAZL位点的细胞的荧光比GFP靶向DDX4位点的细胞更强3.75倍(图4)。
将用DDX-恩曲他滨、DDX-icaspase9、DAZL-Ntr、DAZL-icaspase9(人)、Dazl-icaspase9(鸡)靶向的雌性PGC也以类似方式纯化。
用前药CB1954处理含有靶向硝基还原酶基因的PGC。当暴露于该药物时，PGC死亡。与对照细胞相比，含有靶向dazl位点的NTR的细胞的细胞数量减少(图5)。
用B/B二聚化化合物处理含有靶向icaspase9基因的PGC。当用药物处理时，对照未靶向PGC的PGC数量没有减少。含有靶向dazl位点的人和鸡caspase9基因的细胞的PGC数量严重减少(图6)。含有靶向ddx4位点的iCaspase 9的细胞的PGC数量略微减少稍少。将这些细胞与对照红色荧光PGC混合并注射到鸡胚胎中。用B/B二聚体化合物处理鸡胚胎。胚胎中仅可见红色PGC和对照GFP PGCs。Dazl icaspase9 PGC被杀伤(图7)。
Dazl icaspase9靶向鸡的生产
将混合在一起的Dazl iCaspase9(人)或Dazl aviCaspase9(鸡)或二者注射到来自与雌性野生型鸡杂交的DDX4杂合(Z-Z)雄性的可育卵中。将3000个PGC注射到窗口期16HH胚胎中，将卵密封并孵育至孵化。起始(Z-W)雌性孵化鸡的繁殖产生了含有靶向转基因的转基因后代(图8)。
分析Dazl-icaspas 9和Dazl-aviaspase 9靶向鸡和使用B/B二聚化试剂的生殖细胞消融
将G1 Dazl-icaspas 9和Dazl-avicaspas 9鸡饲养至性成熟，并与野生型鸡交配。将交配的可育卵(G2胚胎)孵育，并检查性腺中GFP的表达。Dazl-icaspas9和Dazl-avigaspase 9G2胚胎二者的性腺中的生殖细胞含有性腺中的GFP+细胞(图9)。冷冻切片和用生殖细胞标志物DDX4抗体免疫染色表明，GFP表达细胞是生殖细胞(图10)。对G2胚胎进行了生殖细胞消融试验。将1.0μl的0.1mM B/B二聚化试剂(Takara Bio，Inc)注射到第2.5天(16期Hamilton&Hamburger(HH))鸡胚胎的血流中。将胚胎孵育8天，进行PCR筛选以鉴定iCaspase9胚胎，并检查性腺中GFP的表达。经药物处理的G2 Dazl-icaspas9和Dazl-aviaspase 9胚胎无可见的GFP表达(图11)。冷冻切片和用生殖细胞标志物DDX4抗体免疫染色表明，在Dazl-icaspas 9和Dazl-aviCaspase9胚胎的性腺中几乎不存在可识别的DDX4阳性或GFP+细胞(图11)。为了表明外源性(供体)PGC可以在已绝育的宿主体内定居，向Dazl-avigaspase 9G2胚胎注射了供体红色荧光生殖细胞和B/B药物。将胚胎孵育8天，并检查荧光和生殖细胞。aviCaspase9 G2胚胎在性腺中仅存在供体生殖细胞，未检测到内源性(宿主)生殖细胞。(图12)。
转基因鸡的生殖细胞的消融
iCaspase9转基因靶向PGC中的DDX4或DAZL位点，然后将细胞暴露于二聚化药物。含有插入DAZL位点的转基因的细胞被确定为被抑制/杀伤。不希望被理论所束缚，本发明人认为胚胎期的表达水平对于消融生殖细胞是重要的。
该详细内容在图22中说明。
利用靶向PGC的DAZL位点的caspase 9表达，使用来自黑色皮肤乌骨鸡品种的鸡供体PGC测试了宿主生殖细胞消融和来自供体鸡品种的后代产生。将供体PGC注射到caspase宿主胚胎中，然后将宿主胚胎培养至性成熟并进行饲养试验。如图23所示，用乌骨鸡PGC注射并经B/B药物处理的Dazl-Caspase9宿主的后代被发现有黑色皮肤，表明它们来自供体生殖细胞。
更详细地说，在该实施方案中，将黑色皮肤乌骨鸡PGC与B/B二聚化药物混合，并在卵中时注射到Dazl-Caspase宿主胚胎中。卵被密封，并将胚胎孵化，然后在性成熟时相互杂交。
如果源自内源性GFP+caspase9宿主PGC，则50％的后代应该是GFP阳性。Dazl-aviCaspase9宿主后代中很少是GFP+的，并且没有Dazl-icasp a9后代是GFP+的(在表图23A中表明)。
此外，Dazl-Caspase宿主的胚胎后代表明供体乌骨鸡PGCs的黑色皮肤表型(如图23B所示)。此外，Dazl-Caspase宿主的孵化后代表明供体乌骨鸡PGC的黑色皮肤表型(在表图23C中表明)。
尽管已经参考特定的实施例具体示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种变化。
序列表
<110> 爱丁堡大学理事会
<120> 经遗传修饰的禽及其重构方法
<130> P191530.WO.01
<150> GB1816633.0
<151> 2018-10-12
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2a-iCaspase9-Bam H1位点突变
<400> 1
ggatccggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacctatgc tcgagggagt gcaggtggag actatctccc caggagacgg gcgcaccttc 120
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atatctccag attatgccta tggtgccact gggcacccag gcatcatccc accacatgcc 360
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ctgagcatgg agccctgtgg ccactgcctc attatcaaca atgtgaactt ctgccgtgag 540
tccgggctcc gcacccgcac tggctccaac atcgactgtg agaagttgcg gcgtcgcttc 600
tcctcgctgc atttcatggt ggaggtgaag ggcgacctga ctgccaagaa aatggtgctg 660
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gggtttgagg tggcctccac ttcccctgaa gacgagtccc ctggcagtaa ccccgagcca 960
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agggacccca agagtggctc ctggtacgtt gagaccctgg acgacatctt tgagcagtgg 1140
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<220>
<223> 2a-aviCaspase9
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<210> 3
<211> 5985
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 左臂-GFP-2a-Nitroreductase-T2a-右臂
<400> 3
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gagagccgtc gggatggtgg cgtcagggcg gggggtgctg ctaacgtgct cctggtcctg 2940
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agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 3180
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acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 3660
gcatggacga gctgtacaag ggatccggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg 3720
gagacgtgga ggagaaccct ggacctatgg atatcatcag cgtggccctg aagagacaca 3780
gcaccaaggc cttcgatgcc agcaagaagc tgacccccga gcaggccgag cagatcaaga 3840
ccctgctgca gtacagcccc agcagccaga acagccagcc ctggcacttc atcgtggcca 3900
gcaccgagga aggcaaggcc agagtggcca agagcgccgc cggcaactac gtgttcagcg 3960
agagaaagat gctggatgcc agccacgtgg tggtgttctg cgccaagacc gctatggatg 4020
atgtgtggct gaagctggtg gtggatcagg aggatgccga tggcagattc gccacccccg 4080
aggccaaggc cgccaacgat aagggcagaa agttcaccgc cgatatgcac agaaaggatc 4140
tgcacgatga tgccgagtgg atggccaagc aggtgtacct gaacgtgggc aacttcctgc 4200
tcggcgtggc cgccctgggc ctggatgccg tgcccatcga gggcttcgat gccgccatcc 4260
tggatgccga gttcggcctg aaggagaagg gctacaccag cctggtggtg gtgcccgtgg 4320
gccaccacag cgtggaggat ttcaacgcca ccctccccaa gagcagactg ccccagaaca 4380
tcaccctgac cgaggtggga tccggagagg gcagaggaag tctgctaaca tgcggtgacg 4440
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cagcggcttc ccaggggcgt tctgaggagc aggcgtggat ggtgagctgt gtccagggga 4560
gggcggtgcg gcagggagcg gggcactggg atggcccggt ctgggaaggg gaggccgaga 4620
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ggataagata gaggagtgta atgagagaca gctaaataat attttactac ttgtgggatg 4920
agtgaatatc aggaggaact gctgtaaatt tcaggaggac ctgttgtgaa tcttcagtag 4980
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gaaggtaaca ttgtgatgtc gctttttttc cctgtaggct aactctggca gaccaaacag 5940
cccatccctc cgcttctcca gcagaccaag cagccccttg tctgg 5985
<210> 4
<211> 5155
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 左臂-2a-aviCaspase9-T2a-GFP-右臂
<400> 4
cttcgtggct tggtgaagag atcttctgac ctcttcatca ccccctagaa ttaaggctgt 60
aatcatcatt tcagccattg cttaatccac tataatttct gcatgatttc agaaggctat 120
cttgcttcct tgaaactaat aatacctagt ttgtagtgtt tagggatgtg taaaatgtgt 180
ttatgtcaag attttagtta gtctgataag aattgtggaa gaattgcagc tactaaaaag 240
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atgggaccag ctgccccagc ctgggaggga agcccaagct ctttttcatc caggcctgtg 4560
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gatagaggag tgtaatgaga gacagctaaa taatatttta ctacttgtgg gatgagtgaa 5520
tatcaggagg aactgctgta aatttcagga ggacctgttg tgaatcttca gtagttggcg 5580
ccgctcttac acatcttaca gatgcccctt gagcaaaggg ggataaggag agatgaacgg 5640
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atcagaatga taattttgtt agtttggggt tagtttcctg tagtggtaga tagccacaac 5760
aagaaaaccg cttaagtttt tgtaaaacaa aaaaagcacg atccagaagt aaaaaatatg 5820
ggtagttttt tttgatgttc ctctctcacc tggtgctttg gcatactaat atgtgtctaa 5880
ttgtattaaa caggagaaat ttaaacctag gctttgctgg aaataaaatg ttacaatgct 5940
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taatttaaga gggactgaca tatttaaaat acttaaggat aatctgtagc catgctgtaa 6060
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tgggagactt agcacctaaa tgcactgtta gttcacatac actttgcttg gcctgaaggt 6480
aacattgtga tgtcgctttt tttccctgta ggctaactct ggcagaccaa acagcccatc 6540
cctccgcttc tccagcagac caagcagccc cttgtctgg 6579
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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cggtgacgtc gaggagaatc ctggacctat ggaggaggat tgggataccg aactcgagca 60
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<212> DNA
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<220>
<223> 反向引物
<400> 8
gaaatccagc ttccagttcc cacctggcca gacaaggggc tgcttgg 47
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<211> 41
<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> 反向引物
<400> 10
gattctcctc gacgtcaccg catgttagca gacttcctct gccctctccg gatcccttgt 60
acagctcgtc catgcc 76
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 11
tctcccatat ggtcgacctg caggcggccg cgaattcact agtgattctt cgtggtt 57
<210> 12
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<212> DNA
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<212> DNA
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<223> 正向引物
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<220>
<223> 正向引物
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tctcggcatg gacgagctgt acaagtgatg aacaaagact ttgaagtaca taaatgtatt 60
actttgatgt taatacagtt cagtttagta agat 94
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<212> DNA
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<223> 反向引物
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<220>
<223> 引导序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引导序列
<400> 18
ggcttactaa actgaactgt 20
Claims (12)
1.一种转基因构建体，其包含:
(i)第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码细胞凋亡诱导酶，其中所述细胞凋亡诱导酶是Caspase，其中由所述第一核苷酸序列编码的蛋白质的活性在外源诱导剂的存在下导致生殖细胞死亡；和
(ii)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列将所述转基因构建体靶向禽生殖细胞，其中所述第二核苷酸序列靶向DAZL位点。
2.根据权利要求1所述的转基因构建体，其中所述第一核苷酸序列包含细胞凋亡诱导结构域，并且其中所述外源诱导剂是能够激活所述细胞凋亡结构域以引起生殖细胞凋亡的二聚化剂。
3.根据权利要求1或2所述的转基因构建体，其中所述外源诱导剂选自AP20187配体或AP20187配体的化学变体FK1012、AP1501、AP1903。
4.根据权利要求2所述的转基因构建体，其中所述外源诱导剂是二聚化稳定药物。
5.根据权利要求1或2所述的转基因构建体，其中所述Caspase选自哺乳动物Caspase9、aviCaspase9或iCaspase 9。
6.根据权利要求1或2所述的转基因构建体，其中所述第二核苷酸序列通过同源重组到仅在禽生殖细胞中表达的基因位点来将所述转基因构建体靶向生殖细胞。
7.根据权利要求1或2所述的转基因构建体，其中所述第二核苷酸序列通过CRISPR/Cas系统靶向生殖细胞，其中所述转基因构建体包含靶向生殖细胞特异性序列的向导RNA。
8.一种用于修饰禽种质的方法，所述方法包括将转基因构建体施用到所述禽的受精卵或培养的生殖细胞中，并孵育含有所述转基因构建体的所述受精卵或用含有所述转基因构建体的生殖细胞注射，其中所述转基因构建体是根据权利要求1至7中任一项所述的转基因构建体，并且其中所述转基因构建体整合到胚胎的生殖细胞中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法是产生替代宿主禽的方法，所述方法包括施用所述外源诱导剂从而导致所述生殖细胞死亡的步骤。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述方法还包括将来自供体禽的生殖细胞移植到所述受精卵中并孵育至孵化以产生具有所移植的生殖细胞的遗传同一性的后代禽的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，还包括使来自所述后代禽的雄性和雌性后代杂交，以产生一个或更多个具有所移植的生殖细胞的遗传同一性的生殖细胞的后代禽后续世代。
12.一种转基因禽，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的转基因构建体或是通过权利要求8至11中任一项所述的方法产生的。
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