JP2003501083A - 鳥類ゲノムを操作するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、鳥類種のゲノムに核酸分子を導入するための方法を特徴とし、この方法は、受精卵の胚盤葉細胞をインビボでその核酸分子と接触させることによっており、その核酸は、ウイルスコートタンパク質と関係がなく、かつこの核酸分子は、１マイクロリットルより大きくかつ０．５ミリリットルより小さい体積で、卵の胚盤中に直接導入される。本発明はまた、トランスジェニック鳥類動物、およびこのようなトランスジェニック動物を作製するための方法を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） 本発明は、トランスジェニック鳥類動物に関する。

【０００２】 異なる種を形成するトランスジェニック動物を生成する能力は、生物医学研究
および生物工学産業の両方に対して大きな影響を有している。トランスジェニッ
ク技術は、ヒト疾患（例えば、Ｓｙｎｄｅｒ，Ｂ．Ｗ．ら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏ
ｄ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐ．４０：４１９〜４２８（１９９５）を参照のこと
）、改良型農業家畜の開発（例えば、Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ら、Ａｎｉｍａｌ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：１４５〜１５９（１９９０）を参照のこと）
、乳における医薬の製造（概説論文について、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ
Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９１中のＥｂｅｒｔ，Ｋ
．Ｍ．およびＪ．Ｐ．Ｓｅｌｇｒａｔｈ「Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｄｏｍｅｓｔ
ｉｃ Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ」を参照のこと）、および異種移植（例えば、Ｏｓｍａｎ，Ｎ．ら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１４６７７〜１４６８２
（１９９７）を参照のこと）の研究のために、実験室種および家畜種の両方に適
用されている。しかし、これらのトランスジェニック動物の多くを作製するため
に使用されるマイクロインジェクションの基本的技術は、効率的でなく、費用が
かかり、そして、ニワトリのような種すべてに容易に適用可能ではない（例えば
、Ｌｏｖｅ，Ｊ．ら、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：６０〜６３（１９
９４）を参照のこと）。

【０００３】 （発明の要旨） 本発明は、鳥類種においてゲノムＤＮＡを操作する方法およびトランスジェニ
ック鳥類動物を生成するための方法を特徴とする。鳥類種のゲノムに核酸分子を
導入するための方法は、堅い卵殻の受精卵の胚盤葉細胞をインビボでその核酸分
子と接触させることにより実行される。好ましくは、この核酸分子は、ウイルス
コートタンパク質と関係がなく、例えば、この核酸は、ウイルス粒子中で送達さ
れない。この核酸分子は、その卵の胚盤中に直接導入される。胚盤（または胚盤
葉）の破壊または胚盤葉細胞の散乱を回避するために、この核酸は、その胚盤の
体積（約１００マイクロリットル以下）よりも小さい体積で送達される。例えば
、この体積は、１マイクロリットルより大きくかつ０．５ミリリットルより小さ
く、そしてこの核酸の導入は、混濁部（胚盤または胚盤葉の周囲の膜または鞘）
を破裂させない。好ましい実施形態において、この核酸は、体積５〜１００マイ
クロリットル、より好ましくは４０〜６０マイクロリットル、そして最も好まし
くは１０〜２０マイクロリットルで送達される。胚盤葉細胞を標的とするために
、この核酸は、胚盤葉または胚盤中に直接送達され、胚盤葉に隣接するかまたは
その下の領域には直接送達されない。胚盤周囲の厚い卵白は、この送達プロセス
の前、間、または後に除去されない。この核酸は、針またはマイクロインジェク
ションピペットを通って、卵殻およびその下の膜に直接送達される。卵中に空気
はほとんどまたは全く導入されず、そしてピペットまたは針により膜に残される
穴は、小さく、自己密封する。従って、この方法は、卵中に不注意にも空気を導
入することを最小にするために卵の開口部の上に水性液体を堆積する必要がなく
、そして核酸送達後に卵の開口部を密封する必要もない。必要に応じて、胚盤葉
細胞は、例えば、卵に電流を加えることにより、インビボで電流に曝される。

【０００４】 この方法は、ＤＮＡのような核酸を、任意の鳥類種（例えば、ニワトリ、ダチ
ョウ、エミュー（ｅｍｕ）、シチメンチョウ（ｔｕｒｋｅｙ）、ガンカモ科の鳥
（ｄｕｃｋ）、ガン亜科の鳥（ｇｏｏｓｅ）、ウズラ（ｑｕａｉｌ）、オウム（
ｐａｒｒｏｔ）、インコ（ｐａｒａｋｅｅｔ）、バタン（ｃｏｃｋａｔｏｏ）、
またはオカメインコ（ｃｏｃｋａｔｉｅｌ））のゲノム中に導入して、治療タン
パク質を産生するため、または非鳥類（例えば、ヒト）の疾患状態についての鳥
類モデルを作製するために、有用である。例えば、この方法は、ニワトリの任意
の品種またはニワトリの任意のハイブリッド品種の受精卵中の胚盤葉細胞に、Ｄ
ＮＡを送達するために使用される。ニワトリの品種としては、白色レグホン、白
色プリマスロック、横斑プリマスロック、ロードアイランドレッド、ニューハン
プシャー、およびダークコーニッシュ（Ｄａｒｋ Ｃｏｒｎｉｓｈ）が、挙げら
れる。

【０００５】 核酸送達は、胚葉（全能性）細胞により核酸の取り込みを最適にし、そして種
々の組織型への分化を開始した細胞による取り込みを最小化（または除去）する
ような時期に行われる。従って、受精卵中の胚盤葉細胞は、その卵の発生ステー
ジＸの間に核酸と接触される。送達は、その卵の産卵後であるが孵卵の前の時間
（細胞分裂および細胞分化が生じる時間）に行われる。

【０００６】 その核酸は、ポリペプチドまたはアンチセンス分子をコードする。例えば、そ
の核酸は、抗体またはそのフラグメントをコードする配列を含む。用語、抗体と
は、インタクトなテトラマー抗体（例えば、モノクローナル抗体）ならびに免疫
学的に活性な抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ） ₂ フラグメント）、操作された単鎖Ｆｖ分子、キメラ分子（例えば、１つの抗体
（例えば、マウス起源）の結合特異性、ならびに別の抗体（例えば、ヒト起源）
の残りの部分を含む抗体）を包含する。好ましくは、この抗体またはそのフラグ
メントは、ヒト起源である。他のポリペプチドとしては、インスリンポリペプチ
ド（例えば、ヒトまたはブタのインスリンポリペプチド）、成長ホルモンポリペ
プチド、カルシトニンポリペプチド、または血清アルブミンポリペプチドが、挙
げられる。例えば、そのトランスジェニック核酸は、ブタ単鎖インスリンポリペ
プチドをコードする。

【０００７】 卵の胚盤葉細胞中でのそのトランスジェニック核酸の転写を指令するために、
その核酸構築物は、卵特異的転写調節エレメントを含む。転写調節配列は、本明
細書全体を通じて使用される包括的用語であり、それが作動可能に連結されてい
るタンパク質コード配列の転写を誘導または制御するＤＮＡ配列（例えば、開始
シグナル、エンハンサー、およびプロモーター）をいう。組換え遺伝子または導
入遺伝子の転写は、プロモーター配列および他の転写調節配列の制御下にある。
例えば、オボアルブミンプロモーター配列が、導入遺伝子の発現を指令するため
に使用され、そしてニワトリリゾチーム遺伝子由来の調節配列が、トランスジェ
ニックテトラマー抗体分子の両方の鎖の等しいかまたは等価な発現を指令するた
めに使用される。「プロモーター」により、転写を指令するに十分な最小のＤＮ
Ａ配列が意味される。プロモーターは、構成的であってもまたは誘導性であって
もよく、そして、プロモーター依存性遺伝子発現を細胞型特異的、組織特異的、
または外部シグナルもしくは外部因子により誘導性にする、他の調節配列または
「エレメント」に連結され得る；このようなエレメントは、ネイティブ遺伝子の
５’領域もしくは３’領域中か、またはイントロン中に位置し得る。

【０００８】 導入遺伝子発現構築物は、以下のエレメントのうちの１つ以上を含む：ニワト
リリゾチームプロモーターまたはオボアルブミンプロモーター、ニワトリリゾチ
ームエンハンサー、およびニワトリリゾチーム遺伝子のマトリックス付着（ｍａ
ｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）領域。このマトリックス付着領域（米国特許
第５，７３１，１７８号（本明細書中に参考として援用される）は、好ましくは
、−１１．７〜−８．８位または＋５．３〜＋９．０位に広がる、ニワトリリゾ
チーム遺伝子の領域を含む。１つまたは両方の配列が、テトラマー抗体の重鎖お
よび／または軽鎖に連結され、その２つの抗体サブユニットの等しいかまたは等
価な発現が提供される。好ましくは、ニワトリリゾチーム遺伝子の−１１．７〜
−８．８位および／または＋５．３〜＋９．０位の領域が、重鎖および軽鎖抗体
コード領域を各々それ自体のプロモーターの制御下に有する構築物の５’末端お
よび／または３’末端に結合される。本発明は、抗体の重鎖および軽鎖コード領
域がともに、各々、マトリックス付着領域に作動可能に連結されたそれ自体のプ
ロモーターの指令下にある、導入遺伝子発現カセットを含む。「作動可能に連結
された」により、コード配列および調節配列が、適切な分子（例えば、転写アク
チベータータンパク質）がその調節配列に結合した場合に遺伝子発現を可能にす
るような様式で連結されていることが、意味される。

【０００９】 本発明はまた、トランスジェニック鳥類動物を包含する。用語「トランスジェ
ニック鳥類動物」とは、移入された核酸配列（移入されたタンパク質コード配列
および／または調節配列を含む）を、その移入された配列が宿主染色体中に組み
込まれているように含む、任意の鳥類種（例えば、ニワトリ）のメンバーをいう
。このような移入および組み込みの結果として、その移入された配列は、生殖細
胞を介してトランスジェニックニワトリの子孫へと伝達され得る。従って、トラ
ンスジェニックニワトリは、移入方法により、新しい核酸配列を生殖細胞に導入
することにより作製される。

【００１０】 トランスジェニック鳥類動物は、その動物の細胞のうちの１つ以上、好ましく
はすべてが導入遺伝子を含む、任意の鳥類である。その導入遺伝子は、その細胞
中に直接導入されるか、またはその細胞の前駆体（例えば、鳥類卵の全能性胚盤
葉細胞）中への意図的遺伝子操作による導入により間接的に導入される。用語、
遺伝子操作とは、古典的交配もインビトロ受精も含まないが、鳥類卵の胚盤葉細
胞中への組換えＤＮＡ分子の導入を指す。この分子は、染色体中に組み込まれ得
るし、またはこの分子は染色体外複製するＤＮＡでもあり得る。１つ以上のポリ
ペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含むトランスジェニック鳥類は、
本発明の範囲内にある。例えば、２つまたは３つの導入遺伝子を含む、二重トラ
ンスジェニック鳥類または三重トランスジェニック鳥類が、作製され得る。

【００１１】 トランスジェニック鳥類動物は、そのゲノム中に非鳥類抗体ポリペプチド（例
えば、ヒト抗体）をコードする核酸を含む。他のトランスジェニック鳥類動物と
しては、そのゲノムが非鳥類インスリンポリペプチド（例えば、ヒトまたはブタ
のインスリンポリペプチド）をコードする核酸配列を含むように操作された鳥類
動物、あるいはカルシトニンポリペプチド、成長ホルモンポリペプチド、または
血清アルブミンポリペプチドをコードする核酸を含む鳥類動物が、挙げられる。
好ましくは、そのポリペプチドはヒト起源である。そのトランスジェニック鳥類
動物は導入遺伝子核酸を発現し、そしてそのトランスジェニック動物の細胞は導
入遺伝子ポリペプチドを産生する。従って、本発明は、抗体ポリペプチド、イン
スリンポリペプチド、成長ホルモンポリペプチド、血清アルブミンポリペプチド
、またはカルシトニンポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む、単離された
鳥類細胞（例えば、鳥類胚盤葉細胞）を包含する。細胞に関して使用される用語
「単離された（単離されている）」とは、その細胞が動物の組織にて天然に存在
する他の細胞型または組成物を実質的に含まないことを意味する。

【００１２】 本明細書中に記載される核酸は、単離されている。卵の胚盤葉細胞中に移入さ
れる単離された核酸（例えば、単離された遺伝子）またはそのフラグメントは、
当該分野で周知のいくつかの方法のいずれかにより単離されている。例えば、そ
の核酸分子は、組換え体であり、そして／または天然に存在する状態でその核酸
分子に隣接する配列から精製されている（すなわち、ＤＮＡが、そのフラグメン
トに通常は隣接する配列（例えば、そのフラグメントが天然に存在するゲノムに
おいて隣接する配列）から取り出されている）。従って、単離された核酸分子は
、合成によってか、あるいは、その遺伝子の転写から誘導されるｍＲＮＡをｃＤ
ＮＡを産生するように逆転写酵素で処理することによってか、あるいは、細胞、
細菌クローン、または他の供給源からその核酸を直接単離することによって、産
生される。

【００１３】 本発明は、ストリンジェントな条件下で、参照配列中の報告された配列のすべ
てまたは一部とハイブリダイズし、かつその参照核酸の生物学的機能を保持する
、配列を包含する。例えば、その核酸は、参照配列に関して１つ以上の配列改変
を含み得る。このような改変は、その参照配列と比較して１つ以上のヌクレオチ
ドの変異、欠失、および／または付加により得られ得る。改変は、その調節配列
の活性を変化させるため、例えば、プロモータ活性を改善するため、転写阻害領
域を抑制するために、構成的プロモーターを調節性にするため、またはその逆の
ために、導入される。改変はまた、後のクローニング工程を容易にする制限部位
を導入するため、または転写活性に必須ではない配列を除去するためにも、なさ
れる。好ましくは、改変された配列は、参照配列と少なくとも７０％（より好ま
しくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少
なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％）同一である。転写調節エレ
メントの場合、その改変は、その参照配列（または天然に存在するラクトフェリ
ンプロモーター配列）と関係する転写プロモーター機能を実質的には改変しない
。例えば、プロモーター改変は、転写の開始部位またはＴＡＴＡボックスを回避
するように操作される。改変された転写調節配列（例えば、エンハンサー）は、
その参照配列のエンハンサー活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７
５％、好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは少なくとも１００％
を保持する。あるいは、その改変された配列は、その参照配列よりも大きい転写
のレベルを指令する。例えば、改変されたエンハンサーは、その参照エンハンサ
ー配列に関係する転写のレベルの少なくとも１１０％を指令する。

【００１４】 ヌクレオチド比較およびアミノ酸比較は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパ
ッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して実行
される。使用したＭｅｇＡｌｉｇｎモジュールは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ法（Ｈｉ
ｇｇｉｎｓら、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ ５（２）：１５１〜１５３）であった
。使用したパラメーターは、ギャップペナルティー（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）
１０、ギャップ長ペナルティー（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）１０
であった。

【００１５】 あるいは、本明細書中に記載される核酸は、参照配列を有するＤＮＡの鎖また
はその相補鎖に、高ストリンジェンシーでハイブリダイズし、そして転写調節活
性を有する。ハイブリダイゼーションは、標準的技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９８９）に記載される技術
）を使用して実行される。「高ストリンジェンシー」とは、高温度および低塩濃
度により特徴付けられる核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄（すなわち、４
２℃で５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション；６５℃で２×ＳＳＣ
および１％ ＳＤＳでの第１の洗浄；その後６５℃で０．１％ ＳＤＳでの第２
の洗浄）をいう。参照遺伝子または参照配列に対して約５０％の配列同一性を有
するＤＮＡ配列を検出するために適切なより低いストリンジェンシー条件は、例
えば、４２℃でホルムアミドの非存在下でのハイブリダイゼーション；４２℃で
６×ＳＳＣおよび１％ ＳＤＳ中での第１の洗浄；ならびに５０℃で６×ＳＳＣ
および１％ ＳＤＳ中の第２の洗浄によって、検出される。

【００１６】 本発明の他の特徴および利点は、明細書および図面および特許請求の範囲から
明らかである。

【００１７】 （発明の詳細な説明） 鳥類生殖系は、雌が精子を貯蔵し得、そして１回に１つの卵子を受精し得ると
いう点で、哺乳動物生殖系と異なる。新たに受精した卵子は、それが生殖管に入
るときは、大きく、もろく、そして卵黄で満ちている。初期胚発生は、その卵が
卵子の周囲で形成されるときに、卵管で生じる。その卵子が生殖管を下に移動す
るにつれ、その卵子は卵白（ｗｈｉｔｅ ａｌｂｕｍｅｎ）の保護層に包まれ、
続いて産卵前に内膜および堅い卵殻に包まれる（図１）。産卵時に、卵子は単一
細胞から、４０〜６０，０００細胞から構成される胚盤葉（胚盤としても知られ
る）へと成熟し、そして雌鳥が十分な卵を産みそしてねぐらに座り始めるまで発
生は止まる。胚盤葉状態において、すべての細胞は全能性であり、そして発生す
るヒナの生殖細胞系へと等しく寄与し得る。

【００１８】 産卵は、卵が産まれる時期である。ニワトリにおいて、産卵は、ステージＸに
生じる（新たに産まれた卵；子宮齢約２０時間）。核酸が胚盤葉または胚盤に導
入される時期は、産卵の後であるが卵の孵卵の前（すなわち、卵が孵卵された後
で第１の細胞分裂の前）である。従って、胚盤葉細胞を効果的に標的とするため
に、ＤＮＡは、６時間以下孵卵された卵の胚盤葉に導入される。卵の発生初期は
ローマ数字で示されるが、胚性ヒナの発生ステージはアラビア数字で示される。
例えば、ステージＸとは、子宮齢約２０時間で生じる、産卵により特徴付けられ
る発生ステージをいい、一方、ステージ１０は、胚性ヒナ発生ステージ（組織分
化により特徴付けられる）をいう。組織分化は発生ステージＸでは生じない。従
って、遺伝子操作は、胚盤葉細胞が胚性組織へと分化する前に行われる。

【００１９】 胚盤は、胚盤が未分化胚盤葉細胞（ステージＸ以前）を含むが、生殖三日月環
領域はヒナ胚発生の初期ステージ（すなわち、ヒナ胚発生ステージ３〜５または
９〜１１）で現れるという点で、生殖三日月環領域と区別される。

【００２０】 胚盤葉の細胞は、遺伝子送達技術を使用してインビトロまたはインビボの両方
で遺伝子操作され、次いで、その卵における発生を可能にするか、レシピエント
未受精卵に移入するか、または精原細胞への発生のために滅菌した雄鳥の精巣に
移入することにより、トランスジェニックニワトリまたはキメラニワトリを作製
するために使用される。トランスフェクションに最適な時間は、トランスフェク
ションのための標的細胞の数を減少するために、産卵と数時間の卵の活性化との
間である。

【００２１】 （核酸の送達およびトランスジェニック動物の作製） 胚盤葉は、（垂直に立てている）卵殻にスカペル（ｓｃａｐｅｌ）または錐で
小さいな穴を切るかまたは空けること、そして穏やかに内膜をはがして卵白を曝
すことによって接近される。胚盤葉は自動的に卵黄の頂部を向き、そして光のも
とで可視化される。キメラニワトリまたはトランスジェニックニワトリの作製の
ために、胚盤葉の細胞は、シリンジおよび小さいゲージの針を使用して、胚盤葉
に直接ＤＮＡを注入することによって、インビボでトランスフェクトされる。こ
のＤＮＡは、裸であるか、あるいは脂質またはＤＮＡ取り込みを容易にするため
に他の適切な化合物（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン）と複合化されている。
このＤＮＡが裸である場合、トランスフェクション効率は、ヒト心臓除細動器の
ようなデバイスを用いて胚盤葉または卵全体に電流を通すことによって、増加さ
れる。電流が卵全体を通る場合、電流に内膜を曝すためにさらに２つの穴が卵殻
中に作製される。なぜなら、この殻は、電気を通さないからである。

【００２２】 あるいは、胚盤葉が卵から取り出され、そして小さいピペットを使用していく
つかの卵由来の細胞とともにプールされる。インビトロで、胚盤葉細胞によるＤ
ＮＡ取り込みは、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リン
酸カルシウム処理、またはリポフェクションのような技術によって、促進される
。トランスフェクション後、その細胞は、トランスジェニックヒナの発生のため
に未受精卵の胚盤中に移入されるか、あるいは繁殖のために精原細胞および精子
における発生を誘導するために滅菌した雄鳥の精巣へと移入される。生じたヒナ
は、公知の方法に従って（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応またはサザンブロット
分析によって）導入遺伝子の存在について試験される。

【００２３】 核酸送達手順の全体的効率は、遺伝子送達の方法および時期に依存する。トラ
ンスフェクション効率は、必要に応じて、例えば以下のような方法により増加さ
れる：１）胚盤葉または胚盤葉由来の細胞を何回ものトランスフェクションに供
すること、２）選択マーカー（例えば、抗生物質遺伝子が挙げられるが、これら
に限定されない）をＤＮＡベクターに付加し、そしてトランスフェクションまた
は細胞移入の後にその抗生物質を卵黄または精巣に注入すること。

【００２４】 この方法は、鳥類（ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、およびガン亜科の
鳥（ｇｏｏｓｅ）を含むがこれらに限定されない）すべてに適用可能である。遺
伝子送達の効率に重要な要素は、トランスフェクションに関する卵活性化の時期
である。細胞をトランスフェクトするための最適な時期は、その細胞が成長を開
始しているが細胞分裂は経験していないように、産卵の後でありかつ活性化（孵
卵）６時間以内である。

【００２５】 以下は、本発明の好ましい実施形態の例であり、そして特に、卵における医薬
の製造のためのトランスジェニックニワトリの作製に関する。導入遺伝子の構造
または組成は、記載される方法のトランスフェクション効率に、ほとんどかまた
は全く影響を有さない。好ましい導入遺伝子構築物としては、以下に作動可能に
連結されたオボアルブミンプロモーターを保有する構築物が挙げられる：ヒト血
清アルブミン遺伝子、ヒトインスリン遺伝子、ネイティブもしくは改変されたブ
タインスリン遺伝子、カルシトニン遺伝子あるいは／ならびに抗体可変領域をコ
ードする遺伝子。本発明は、卵における発現を指令される上記の遺伝子のいずれ
かを保有する、トランスジェニックニワトリを包含する。

【００２６】 （実施例１：インビボ核酸送達） 受精卵を産卵させ、そして収集する（１日目）。卵を室温に移す（孵卵してい
ない）（２日目）。必要に応じて、核酸送達のための操作の前に、その卵を少な
くとも２４時間、室温で（孵卵していない）垂直に配置する（３日目）。

【００２７】 雌鳥の受精卵を収集し、１〜６時間の間加湿インキュベーター中に配置して卵
を活性化した。卵殻にドレメル（ｄｒｅｍｅｌ）を用いて穴を切り、そして内膜
を折り返す。卵を光の上に配置して胚盤を可視化し、その胚盤に脂質／ＤＮＡ複
合体を注入したた。内膜を適所に折り戻しそして卵をパラフィンでシールした。
卵をインキュベーター中に再配置し、そして成長させて孵化させた。得られたヒ
ナから血液サンプルまたは内膜サンプルを採取し、そして導入遺伝子プライマー
を用いるポリメラーゼ連鎖反応によって導入遺伝子の存在について試験した。モ
ザイクヒナまたはキメラヒナを、雄鳥にまで飼育して、導入遺伝子子孫を完全に
産生する。

【００２８】 （実施例２：胚盤葉細胞のインビトロＤＮＡ送達および未受精卵へのトランス
フェクトした卵の移入） １０〜１２個の雌鳥の受精卵を、１〜６時間の間、加湿インキュベーター中に
置いて、細胞分裂を活性化する。卵殻にドレメル（ｄｒｅｍｅｌ）を用いて穴を
切り、そして胚盤葉を可視化するために内膜を折り返す。胚盤葉を、大きな口径
のピペットチップを用いて卵から取り出し、そしてコニカルチューブ中で合わせ
る。卵黄を、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄することによって取り除き、そして
胚盤葉を遠心分離によって収集する。細胞を、コラゲナーゼを用いる処理または
穏やかなピペッティングによって分散させ、遠心分離によって収集する。細胞を
、１〜５ ｇの導入遺伝子を含む無血清培地に再懸濁し、そしてエレクトロポレ
ーションキュベット中で、室温にて静置する。細胞を穏やかに再懸濁し、そして
３００〜５００Ｖおよび２５０〜９６０μＦでエレクトロポレーションする。ト
ランスフェクション後、卵殻に穴を切ること、内膜を折り返すこと、ならびにシ
リンジおよび大きなゲージの針を用いて細胞を胚盤に注入することによって、細
胞を未受精卵の胚盤に移入する。卵をシールし、そして加湿インキュベーター中
で孵卵して、発生を可能にする。得られた雛鳥から血清サンプルを採取し、そし
て標準的な方法を使用して導入遺伝子特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連
鎖反応によって、導入遺伝子の存在について試験する。

【００２９】 （実施例３：胚盤葉細胞のインビトロＤＮＡ送達および雄鳥精巣へのトランス
フェクトした卵の移入） １０〜１２個の雌鳥の受精卵を、１〜６時間の間、加湿インキュベーター中に
置いて、細胞分裂を活性化する。卵殻にドレメル（ｄｒｅｍｅｌ）を用いて穴を
切り、そして胚盤葉を可視化するために内膜を折り返す。胚盤葉を、大きな口径
のピペットチップを用いて卵から取り出し、そしてコニカルチューブ中で合わせ
る。卵黄を、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄することによって取り除き、そして
胚盤葉を遠心分離によって収集する。細胞を、１〜５ ｇの導入遺伝子を含む無
血清培地に懸濁し、そしてエレクトロポレーションキュベット中で、室温にて静
置する。細胞を穏やかに再懸濁し、そして３００〜５００Ｖおよび２５０〜９６
０μＦでエレクトロポレーションする。トランスフェクション後、滅菌した雄鳥
の精巣に細胞を移入して、精原細胞への発生を誘導する。この雄鳥を、繁殖につ
いてモニターし、そして導入遺伝子の存在について試験するために精子を収集す
る。

【００３０】 （実施例４：ベクターの構築） 卵を産む雌鳥の最大の細胞（ｍａｇｎｕｍ ｃｅｌｌ）にインスリンの発現を
標的とするために、ヒトインスリンをコードするゲノム配列を、鳥類の卵におい
て作動可能に連結されている核酸の転写を指令するプロモーターに、作動可能に
連結した。例えば、このプロモーターは、ヒトラクトフェリンプロモーターであ
る。ヒトラクトフェリン発現カセットの構築は、特許出願ＵＳＳＮ０９／４９０
，８０１（この内容は、本明細書によって参考として援用される）に記載されて
いる。

【００３１】 例えば、転写調節エレメントは、乳汁特異的プロモーター（例えば、哺乳動物
ラクトフェリン遺伝子プロモーター）に由来する。この発現カセットは、異種配
列に作動可能に連結されたヒトラクトフェリン遺伝子由来のプロモーター領域を
含む。異種配列は、ラクトフェリンポリペプチドをコードしないものである。こ
のプロモーター領域は、配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも２０ヌクレ
オチドを含む。例えば、このプロモーター領域は、配列番号１または２のヌクレ
オチド１〜１５４を含む。

【００３２】 表１：ヒトラクトフェリンプロモーター領域

【００３３】

【表１】 （配列番号１）。

【００３４】 ＢａｍＨＩ制限部位ＧＧＡＴＣＣ（ヌクレオチド５〜８）およびＸｈｏＩ部位
（ヌクレオチド１４０〜１４５）を斜字体で示す。これらの制限部位は、改変（
例えば、他の制限部位で置換され得るし、または制限酵素認識部位を表さないヌ
クレオチドで置換）され得る。

【００３５】 表２：ヒトラクトフェリンプロモーター領域

【００３６】

【表２】 （配列番号２）。

【００３７】 必要に応じて、上記のラクトフェリン由来のプロモーター領域を、配列番号３
のヌクレオチド配列に連結する（ＧＥＮＭＡＮＫ^TM登録番号Ｓ５２６５９）。

【００３８】 表３：ヒトラクトフェリン遺伝子の５’領域

【００３９】

【表３】 （配列番号３）。

【００４０】 本明細書中に記載される核酸分子および構築物を単離する。「単離された（単
離されている）」は、生物の天然に存在するゲノム中で、目的の配列に隣接する
遺伝子を含まない核酸分子を意味する。従って、この用語は、例えば、ベクター
；自己複製プラスミドもしくはウイルス；または原核生物もしくは真核生物のゲ
ノムＤＮＡに組み込まれるか；あるいは、他の配列とは独立して、別個の分子（
例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるｃＤＮＡ
またはゲノムＤＮＡフラグメントもしくはｃＤＮＡフラグメント）として存在す
る、組換えＤＮＡを含む。この用語はまた、さらなるポリペプチド配列をコード
するハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。この用語は、ゲノム
ＤＮＡの大きなセグメント（例えば、コスミドクローンに存在するゲノムＤＮＡ
のセグメント）を除外する。このゲノムＤＮＡの大きなセグメントは、天然に存
在するゲノムにおいてそれと天然に隣接する１以上の他の遺伝子によって隣接さ
れる所定のＤＮＡ配列を含む。

【００４１】 ラクトフェリン由来の調節配列を、名目上のプロモーター（例えば、名目上の
ラクトフェリンプロモーターまたは異種プロモーター）に結合し、これは、次に
は、転写される配列に作動可能に連結する。転写される異種配列は、ポリペプチ
ドコード配列またはアンチセンス配列である。トランスジェニック哺乳動物（例
えば、鳥類種のメンバー）に取り込まれた場合、ポリペプチドコード配列に作動
可能に連結された本発明の調節配列は、鳥類組織においてコードされたポリペプ
チドの産生を指令する。ラクトフェリン由来の調節配列（例えば、プロモーター
配列）は、転写単位中で、異種核酸配列（例えば、導入遺伝子）に対して５’側
に位置する。ラクトフェリン由来のプロモーター領域の一部を、当該分野で公知
であるアッセイ（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、または抗生
物質耐性遺伝子の発現を、転写のための検出可能なマーカーとして使用する、標
準的なレポーター遺伝子アッセイ）を使用して、導入遺伝子の組織特異的かつ上
昇した発現を可能にするそれらの能力について試験する。

【００４２】 参照配列（例えば、配列番号１または２）において特定されるヌクレオチド配
列、その相補鎖、またはそれらの改変体のすべてまたは一部は、トランスジェニ
ック哺乳動物中で導入遺伝子のような異種核酸配列の転写を指令する際に使用さ
れ得る。核酸フラグメントは、参照ヌクレオチド配列の１つまたはその相補体と
等価な長さの部分と同一である、少なくとも２０個連続するヌクレオチドの部分
である。

【００４３】 鳥類動物の卵における転写を指令する他のプロモーターは、当該分野において
公知である（例えば、ニワトリオボアルブミンプロモーター（ＧＥＮＢＡＮＫ^TM Ｊ００８９５またはＭ２４９９９９）およびニワトリリゾチームプロモーター（
ＧＥＮＢＡＮＫ^TMＪ００８８６またはＶ００４２９））。発現ベクターは、クロ
ーニングされた配列の発現のためにニワトリオボアルブミンプロモーターを使用
して構築される（Ｇａｎｎｏｎら、Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｓ ａｔ ｔｈｅ ５’ｅｎｄ ｏｆ ａ ｃｌｏｎｅｄ ｃｏｍｐ
ｌｅｔｅ ｏｖａｌｂｕｍｉｎ ｇｅｎｅ．、Ｎａｔｕｒｅ ２７８：４２８４
３４；Ｌａｉら、Ｔｈｅ ｏｖａｌｂｕｍｉｎ ｇｅｎｅ ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｉｃｋｅｎ ＤＮＡ ａｒ
ｅ ｎｏｔ ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ７５（５）：２２０５−２２０９；およびＫａｙｅら、ＥＭＢＯ Ｊ
．３：１１３７−１１４４）。導入遺伝子の転写を指令する他の調節エレメント
には、上昇しかつ位置に非依存的な遺伝子活性を媒介する核ＤＮＡ付着エレメン
ト（Ｓｔｉｅｆ，Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：３４３−３４５）および真核
生物発現系の刺激のための付着エレメント（Ｓｉｐｐｅｌら、米国特許第５，７
３１，１７８号）が挙げられる。卵における導入遺伝子の転写を指令するために
有用な他のプロモーターには、当該分野で公知の、コナルブミンプロモーター、
オボムコイドプロモーター、およびオボトランスフェリンプロモーターが挙げら
れる。血液または肝臓組織中での発現のために、ニワトリβグロビン遺伝子由来
のプロモーターが使用される（Ｆｏｌｅｙら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：７２５２−７２５６）。

【００４４】 導入遺伝子によって発現されるタンパク質またはポリペプチド産物には、ヒト
インスリン（ＧＥＮＢＡＮＫ^TMＶ００５６５）、ヒトカルシトニン（ＧＥＮＢＡ
ＮＫ^TMＸ１５９４３；Ｂｒｏａｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：６
９９９−７０１１）、ヒト血清アルブミン（ＧＥＮＢＡＮＫ^TMＭ１２５２３、Ｊ
０４４５７）、およびブタ単鎖インスリンが挙げられる。ブタ単鎖インスリン配
列の核酸配列は、以下の表４および５に示される。

【００４５】 表４：ブタ単鎖インスリン配列Ｉ

【００４６】

【表４】 （配列番号４）。

【００４７】 表５；リゾチームシグナル配列を有するブタ単鎖インスリン配列

【００４８】

【表５】 （配列番号５；太字はシグナル配列を示す）。

【００４９】 本発明は、ストリンジェントな条件下で、参照配列中に報告された配列のすべ
てもしくは一部とハイブリダイズしかつ転写調節機能を保持する、配列を含む。
例えば、その核酸は、参照配列に関連する１以上の配列の改変を含み得る。この
ような改変は、参照配列と比較して、１以上のヌクレオチドの変異、欠失、およ
び／または付加によって得られ得る。改変は、調節配列の活性を変化させるため
（例えば、プロモーター活性を改善するため、転写阻害領域を抑制するため、構
成的プロモーターを調節性プロモーターにするためまたはその逆のため）に導入
される。改変はまた、引き続くクローニング工程を容易にする制限部位を導入す
るため、または転写活性に対して本質的でない配列を除外するためになされる。
好ましくは、改変された配列は、参照配列に対して、少なくとも７０％（より好
ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましく
は少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％）同一である。改変は、
参照配列（または天然に存在するラクトフェリンプロモーター配列）と関連して
いる転写プロモーター機能を実質的には変化させない。例えば、改変は、転写の
開始の部位およびＴＡＴＡボックスを避けるように操作される。

【００５０】 （実施例５：ラクトフェリン発現カセットの構築） ラクトフェリン発現カセットを、ラクトフェリン転写調節エレメントを使用し
て構築した。このカセットは、３Ｋｂのプロモーターならびに、５’末端および
３’末端にそれぞれ唯一のＳａｌＩ制限部位およびＮｏｔＩ制限部位を有する７
Ｋｂの３’隣接配列を含んだ。さらに、このベクターは、異種コード配列の付加
のための唯一のＸｈｏＩ部位を含んだ。

【００５１】 ヒトインスリン遺伝子を、ヒトゲノムＤＮＡから、プライマーＨＩＮＦ３（５
’ＧＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＣＡＴ ＣＡＧ ＡＡ３
’；（配列番号６））／プライマーＨＩＮＲ３（５’ＣＴＣ ＧＧＴ ＧＣＴ
ＣＧＡ ＧＧＣ ＧＧＣ ＧＧＧ ＴＧＴ３’；配列番号７）を用いてＰＣＲ増
幅し、製造業者の取扱説明書に従って、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。この遺伝子を、Ａｍｐｌｉｃｙ
ｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して配列決定し、増幅の間に
塩基の変異が生じていなかったことを確認した。この遺伝子を、ベクターｐＣＲ
２．１からＸｈｏＩフラグメントとして切除し、そしてヒトラクトフェリン発現
カセットのＸｈｏＩ部位にクローニングした。インスリン遺伝子の方向は、制限
分析およびＤＮＡ配列決定によって確認した。完成したベクターを、ＨＬ３１と
名付け、そしてＳａｌＩ〜ＮｏｔＩフラグメントとして細菌バックボーンから切
除し得た。

【００５２】 （実施例６：トランスフェクションのためのＨＬ３１の調製） ベクターＨＬ３１から細菌配列を除去するために、これを、ＳａｌＩおよびＮ
ｏｔＩで完全に消化し、フェノール／クロロホルム、クロロホルムで抽出し、そ
して１％Ｔｒｉｓ酢酸アガロースゲル上で分画した。導入遺伝子をゲルから切除
し、そして１×Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液を含む透析チューブ中に電気的に溶出させ
た。溶出したＤＮＡをエッペンドルフチューブに移し、そして１／１０容量の３
Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２、２．２倍容量のエタノールを添加することによっ
て沈殿させ、そして−２０℃で２４時間、インキュベートした。このＤＮＡを、
１３，０００×ｇ、１０分間の遠心分離によって収集し、そして蒸留滅菌水中で
再懸濁した。このＤＮＡの濃度を、Ｔｒｉｓホウ酸ゲル電気泳動によって、既知
量のλＨｉｎｄＩＩＩ消化した標準に対して見積もった。このＤＮＡを４℃で保
存した。

【００５３】 （実施例７：キメラ導入遺伝子ニワトリの産生） 白色レグホンのニワトリからの発生ステージＸのニワトリの卵を、商業的な供
給元（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ／ＳＰＡＦＡＳ，Ｎｏｒｔｈ Ｆｒａｎｋｌ
ｉｎ，ＣＴ）から入手した。卵を、トランスフェクションの前に、室温で２４時
間順応させて、胚盤／胚盤葉を、卵の上部に方向付けることを可能にした。ドレ
メル（ｄｒｅｍｅｌ）を使用して、１〜２ｃｍの円形の切り込みを気嚢領域の上
の卵殻に作製した。先に進む前に、導入遺伝子を、以下の濃度で注入のために調
製した：ＤＮＡ ５〜１５ｎｇ／ ｌ、１０〜１５％リン脂質（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、５０％ダルベッコ
改変イーグル培地、および残りの容量のリン酸緩衝化生理食塩水。ＤＮＡ／脂質
を、卵への注入の前に最低１５分間、室温で放置する。

【００５４】 注入の直前に、卵殻を取り除いて内殻膜をさらし、そして胚盤の可視化を可能
にした。胚盤が可視化され得ない場合には、小さな開口を膜に作製した。胚盤の
位置決めの後、ＤＮＡ／脂質溶液を胚盤の中心に直接注入した。核酸溶液（ヒト
インスリンをコードする構築物）を、１ｃｃシリンジおよび２７ゲージ針を用い
て５０〜１００ ｌの容量で注入するか、またはハミルトンシリンジに装着した
微量注入針を用いて１０〜２０ ｌの容量で注入した。表６は、代表的な実験か
らのデータを示す。２２８個の卵に注入し、そして２６羽のヒナが孵化した（表
６）。

【００５５】 表６：卵注入実験の要約

【００５６】

【表６】 。

【００５７】 孵化したヒナのキメラ現象を、内殻膜（孵化後）または、剖検の際の肝臓、腎
臓、および生殖器官から単離されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって試験した
（表７）。実験３２において試験された３羽のヒナのうちの２羽が内殻膜サンプ
ルにおいて強いＰＣＲシグナルを示した。成熟に際して、これらのヒナを飼育し
て、導入遺伝子の生殖細胞系伝達を確証した。実験３２および３３に由来する４
羽のヒナから取られた剖検サンプル（膜および生殖器官）のＰＣＲ分析は、４羽
のヒナのうちの１羽が、その生殖器官中での導入遺伝子の検出可能なレベルを有
することを示した。

【００５８】 表７は、上記のように産生されたキメラニワトリ中でのヒトインスリン導入遺
伝子の組織発現の代表的分析からの結果を示す。

【００５９】 表７：キメラヒナから単離したゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析

【００６０】

【表７】 。

【００６１】 マーカー導入遺伝子（例えば、ＭＴ−β−ＧａｌおよびＣＭＶ−ＧＦＰ）をま
た、インビボで胚盤葉細胞にトランスフェクトした。ヒナを、上記のように、産
生しそして導入遺伝子の組織発現について試験した。トランスジェニックＤＮＡ
を試験した以下の組織において検出した：心臓、肝臓、および腎臓。

【００６２】 これらのデータは、本明細書中に記載される方法および構築物が、鳥類胚盤葉
細胞をトランスフェクトするため、および所望のトランスジェニックポリペプチ
ドを産生するトランスジェニック鳥類動物を作製するために有用であることを示
す。

【００６３】 （実施例８：テトラマー抗体を産生するための方法） トランスジェニックニワトリの産生のための先行技術の方法とは違って、本発
明の方法は、レトロウイルス粒子を使用しない。先行技術の方法の多くは、発生
している卵に感染するために、目的の遺伝子を含む非複製レトロウイルスを使用
する。このプロセスはいくつかの制限（ウイルスコートにパッケージングされる
遺伝子のサイズの制限およびレトロウイルスベクターからの発現の不安定性を含
む）を有する。さらに、レトロウイルス遺伝子送達は、高レベルのマルチマータ
ンパク質を産生するその能力において厳しく制限されている。なぜなら、各々の
コード領域は、それ自体のプロモーターを最適には必要としているからである。
この問題を回避するために、何人かの研究者らは、ＩＲＥＳ配列の使用を提案し
た。この配列は二シストロン性のｍＲＮＡを許容する；しかし、これらの型の構
築物からの発現は、選択マーカーが使用されない限りは、一般的に低い。

【００６４】 これらの欠点を克服するために、トランスジェニックキメラニワトリを作製す
るためのインビトロ遺伝子送達方法を利用する技術が開発された。この方法は、
１００Ｋｂまでの導入遺伝子を送達し得るという利点を有し、そしてマルチマー
タンパク質（例えば、抗体）の高レベル産生を可能にする。ベクター設計におけ
る柔軟性は、乳腺発現系において使用されるもの（これは、全長プロモーター、
ゲノムコード領域、および３’隣接領域を使用する）と類似の導入遺伝子の構築
を可能にする。本明細書中に記載される方法は、全８Ｋｂオボアルブミンプロモ
ーター、ゲノムコード領域またはｃＤＮＡコード領域、および３’隣接領域を使
用する。さらに、マルチマータンパク質の高レベル産生が可能にされる。なぜな
ら、各サブユニットの発現は、それ自体のプロモーターによって指令されるから
である。その導入遺伝子は、個々にトランスフェクトされるか、または、すべて
のサブユニットの生殖細胞系伝達を非常に容易にする同時組込みを確実にするよ
うに互いに連結される（図２の工程１および２）。

【００６５】 抗体の両方のサブユニットの等しい発現を確実にするために、その導入遺伝子
は、マトリックス付着領域のようなエレメントを含むことにより、周囲のクロマ
チン構造の効果から遮断されている（図２の工程３）。マトリックス付着領域を
使用した先行技術の方法とは異なり、本明細書中に記載される構築物は、マルチ
マータンパク質の等しい発現を生じる。これらのエレメントは、Ａ−エレメント
、ＭＡＲ（マトリックス付着領域）、ＳＡＲ（足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）
付着領域）、ＤＣＲ（ドミナント制御領域）、およびインスレーター（ｉｎｓｕ
ｌａｔｏｒ）と呼ばれる。

【００６６】 本発明の他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲か
ら明白である。明細書および添付の特許請求の範囲において、文脈が明確に他を
指示していない限りは、単数形は複数形の言及を含む。他に定義していない場合
には、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明
が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
本明細書中に引用されるすべての特許および刊行物は、参考として援用される。

【００６７】 他の実施形態は、前出の特許請求の範囲の範囲内にある。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、雌鳥の受精卵の図である。

【図２】 図２は、導入遺伝子カセットの図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エバート， カール エム． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01527， ミルバリー， エルムウッド ストリート 83 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA02 BA03 BA40 BA80 CA02 DA02 FA02 GA13 GA14 4B065 AA90X AA93Y AB01 CA24 CA44

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 鳥類種のゲノムに核酸分子を導入する方法であって、受精卵
   の胚盤葉細胞を該核酸分子とインビボで接触させる工程を包含し、該核酸分子は
   ウイルスコートタンパク質と関係がなく、かつ該核酸分子が、１マイクロリット
   ルより大きくかつ０．５ミリリットルより小さい体積にて該卵の胚盤中に直接導
   入される、方法。
2. 【請求項２】 前記体積が５〜１００マイクロリットルである、請求項１に
   記載の方法。
3. 【請求項３】 前記体積が４０〜６０マイクロリットルである、請求項１に
   記載の方法。
4. 【請求項４】 前記体積が１０〜２０マイクロリットルである、請求項１に
   記載の方法。
5. 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、前記核酸分子が、前記胚盤
   の体積より小さい体積で前記卵に導入される、方法。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の方法であって、前記細胞をインビボで電流
   に曝す工程をさらに包含する、方法。
7. 【請求項７】 請求項１に記載の方法であって、前記鳥類種が、ニワトリ、
   ダチョウ、エミュー、シチメンチョウ、ガンカモ科の鳥、ガン亜科の鳥、ウズラ
   、オウム、インコ、バタン、およびオカメインコからなる群より選択される、方
   法。
8. 【請求項８】 請求項１に記載の方法であって、前記鳥類種がニワトリであ
   る、方法。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の方法であって、前記ニワトリの品種が、白
   色レグホン、白色プリマスロック、横斑プリマスロック、ロードアイランドレッ
   ド、ニューハンプシャー、およびダークコーニッシュからなる群より選択される
   、方法。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載の方法であって、前記胚盤葉細胞が、前記
    卵の発生ステージＸの間に前記核酸と接触される、方法。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載の方法であって、前記胚盤葉細胞が、前記
    卵の産卵後であるが孵卵の前の時間に前記核酸と接触される、方法。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載の方法であって、前記核酸が抗体またはそ
    のフラグメントをコードする配列を含む、方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法であって、前記抗体またはそのフ
    ラグメントがヒト抗体またはそのフラグメントである、方法。
14. 【請求項１４】 請求項１に記載の方法であって、前記核酸が、インスリン
    ポリペプチド、成長ホルモンポリペプチド、カルシトニンポリペプチド、または
    血清アルブミンポリペプチドをコードする配列を含む、方法。
15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の方法であって、前記インスリンポリペ
    プチドがブタ単鎖インスリンポリペプチドである、方法。
16. 【請求項１６】 請求項１に記載の方法であって、前記核酸が卵特異的転写
    調節エレメントを含む、方法。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の方法であって、前記調節エレメントが
    、ニワトリリゾチーム遺伝子のマトリックス付着領域を含む、方法。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法であって、前記領域が、前記ニワ
    トリリゾチーム遺伝子の配列−１１．７〜−８．８位または＋５．３〜＋９．０
    位を含む、方法。
19. 【請求項１９】 請求項１７に記載の方法であって、前記領域が抗体鎖また
    はそのフラグメントをコードする配列に作動可能に連結されている、方法。
20. 【請求項２０】 請求項１７に記載の方法であって、前記領域が、抗体軽鎖
    をコードする第１の配列および抗体重鎖をコードする第２の領域に作動可能に連
    結されている、方法。
21. 【請求項２１】 トランスジェニック鳥類動物であって、そのゲノムが非鳥
    類抗体ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、動物。
22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の動物であって、前記配列がヒト抗体ポ
    リペプチドをコードする、動物。
23. 【請求項２３】 トランスジェニック鳥類動物であって、そのゲノムが非鳥
    類インスリンポリペプチドをコードする核酸配列を含む、動物。
24. 【請求項２４】 トランスジェニック鳥類動物であって、そのゲノムが非鳥
    類ポリペプチドをコードする核酸を含み、該ポリペプチドが、カルシトニンポリ
    ペプチド、成長ホルモンポリペプチド、および血清アルブミンポリペプチドから
    なる群より選択される、動物。
25. 【請求項２５】 単離された鳥類胚盤葉細胞であって、抗体ポリペプチド、
    インスリンポリペプチド、成長ホルモンポリペプチド、血清アルブミンポリペプ
    チド、またはカルシトニンポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む、胚盤葉
    細胞。